CN110810174A - 哈茨木霉ltr-2在禾谷作物栽培中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及哈茨木霉LTR‑2在禾谷作物栽培中的应用。该哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株LTR‑2于2005年1月30日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.1498；该哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株LTR‑2在禾谷作物间作或轮作中的应用。该菌株具有促进禾谷作物生长和壮苗的作用，另外可防治禾谷作物间作或轮作过程中镰刀菌引起的相关植物病害，再者轮作中配套施用哈茨木霉LTR‑2使得玉米产量增产效果优于间作配套施用哈茨木霉LTR‑2的玉米，从而对禾谷作物的轮作或是间作栽培具有重大应用意义。
Description
技术领域
本发明涉及微生物的技术领域，特别是涉及哈茨木霉LTR-2在禾谷作物栽培中的应用。
背景技术
木霉菌是广泛分布的、重要的和典型的植物根系共生微生物，广泛存在于土壤当中的一类真菌。该菌属能与大多数陆生植物根系形成互惠共生体，促进共生植株对水分和矿质元素特别是氮、磷和钾的吸收利用，尤其对土壤中难溶性无机磷酸盐和难溶性钾盐具有释放能力，能促进植物生长和发育。另外，木霉菌也对许多植物病原菌有拮抗作用，也是生防菌中的一种。
禾谷作物作为种子植物中最有经济价值的分类，是人类粮食和动物饲料的主要来源，也是加工淀粉、制糖、酿酒等行业的重要原材料。除了荞麦以外，几乎所有的粮食都来自禾谷作物，如小麦、水稻、玉米等。
黄淮海地区是我国重要的禾谷作物种植区域，其中山东省在我国粮食种植方面占有重要地位。山东省作为重要的粮食生产地区，主要以生产小麦、水稻、玉米等禾本科粮食作物为主。近年来，我国农业随着对农业可持续发展的关注，对种植业、养殖业结构进行调整，但粮食总产量的增加主要依赖于种植面积的增加和大量施用化学肥料/化学农药实现控病增产，促使土壤的肥力下降和加剧土壤酸化板结。
本发明为提高该地区小麦、水稻、玉米等禾谷作物产量和保证其产品安全，提供哈茨木霉LTR-2在禾谷作物栽培中的应用。
发明内容
本发明提供了哈茨木霉LTR-2在禾谷作物栽培中的应用，该菌株具有促进禾谷作物生长和壮苗的作用，另外可防治禾谷作物栽培过程中镰刀菌引起的相关作物病害，从而可有效缓解禾谷作物种植过程中长期过量施用化学肥料和化学农药对农田环境产生的破坏。
本发明的技术方案如下：
哈茨木霉LTR-2在禾谷作物栽培中的应用，该哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株LTR-2是由山东省科学院生态研究所分离获得并保存，于2005年1月30日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：CGMCC NO.1498。
该哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株LTR-2，保藏编号：CGMCC NO.1498，在申请号为201811513101.3的专利申请文件中记载。
上述哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株LTR-2，菌丝纤细无色，多分枝；分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，对生或互生，形成二级和三级分枝；其孢子呈卵圆形，孢壁具小疣突，呈绿色；菌落在马铃薯固体培养基上初为白色絮状，待孢子产生后转为暗绿色。
该哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株LTR-2在禾谷作物栽培中的应用，包括促进禾谷作物生长和壮苗方面的应用，还包括防治禾谷作物栽培过程中镰刀菌引起的相关禾谷作物病害方面的应用，进一步的，该应用具体为防治禾谷作物栽培过程中禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌和尖孢镰刀菌引起的相关作物病害的应用。
该哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株LTR-2在禾谷作物栽培中的应用，还包括禾谷作物间作或轮作过程中的应用；更优的为，轮作中的玉米增产效果优于间作中的玉米。
所述的哈茨木霉LTR-2在禾谷作物栽培中的应用，具体为采用哈茨木霉LTR-2孢子在禾谷作物栽培中的应用，进一步的具体为采用孢子液。
上述哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2孢子液的制备方法如下：
(1)将保藏的哈茨木霉LTR-2接种于马铃薯固体培养基，30℃±1℃的温度条件下培养72h后，在超净工作台中取Φ＝6mm菌块接种至Φ＝90mm厚度1mm的马铃薯固体培养基，于30℃±1℃，培养10d，至哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2的孢子长满固体培养基；
(2)10d培养结束后，将长满哈茨木霉LTR-2孢子的马铃薯固体培养基用无菌水超声波震荡洗涤，获得含有菌丝的粗洗液；取粗洗液经高度为15mm～20mm无菌脱脂棉过滤柱压缩过滤，除去菌丝，用无菌水调节孢子浓度为2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichodermaharzianum LTR-2孢子液，该过程为无菌操作。
在上述哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2孢子液制备方法的步骤(1)中，马铃薯固体培养基配方：每1000mL中含有去皮马铃薯200g，加热煮沸20min，8层纱布过滤除滤渣，滤液补充去离子水至1000mL；每1000mL滤液含有葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉5g，磷酸二氢钾3.0g，七水硫酸镁1.50g，琼脂粉12g，pH7.2～7.5；0.1MPa，115℃灭菌30min，待温度降至50℃～60℃时于无菌工作台上分装至Φ＝90mm的无菌培养皿，冷却至室温条件下使用。
优选的，将2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2孢子液应用在促进禾谷作物生长和壮苗方面中时，使用2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichodermaharzianum LTR-2孢子液的10倍稀释液、100倍稀释液或200倍稀释液；进一步优选为使用2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2孢子液的100倍稀释液。
在玉米促生试验中2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2孢子液为100倍稀释液为最适浓度，对玉米的促生效果显著，将壮苗指数提升82％；在小麦促生试验中2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2孢子液为100倍稀释液为最适浓度，对玉米的促生效果显著，将壮苗指数提升48％；在水稻促生试验中2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2孢子液为100倍稀释液为最适浓度，对玉米的促生效果显著，将根冠比提升24％。
优选的，将2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2孢子液应用在镰刀菌引起的相关植物病害方面中时，根施2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichodermaharzianum LTR-2孢子液的10倍稀释液、100倍稀释液或200倍稀释液；进一步优选为使用2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2孢子液的100倍稀释液。
采用100倍稀释液，镰刀菌引起的玉米茎基腐病、小麦赤霉病和水稻恶苗病的发病均明显下降，哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2对玉米茎基腐病、小麦赤霉病和水稻恶苗病的相对防效达到72％、56％和45％，能够明显抑制镰刀菌引起的禾谷作物病害发病。
进一步的，将2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2孢子液应用在禾谷作物间作/或轮作耕作中，效果显著；尤其轮作中的玉米增产效果优于间作中的玉米。
本发明的有益效果：
本发明提供了哈茨木霉LTR-2禾谷作物栽培中的应用，包括促进禾谷作物生长和壮苗方面、防治镰刀菌引起的相关作物病害；利用固体马铃薯培养法获得促进禾谷作物生长和防治镰刀菌引起的禾谷作物病害的哈茨木霉LTR-2孢子的方法；该孢子应用于禾谷作物间作和/或轮作栽培中，再者轮作中配套施用哈茨木霉LTR-2使得玉米产量增产效果优于间作配套施用哈茨木霉LTR-2的玉米，为微生物源农药的应用及开发提供新的思路和开拓新的途径。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
本发明与生产常用化学肥料和/或化学农药相比，对禾谷作物生长促进和壮苗效果好，水稻根冠比促生效果在20％以上，玉米和小麦的壮苗效果分别达到82％和48％；对防治镰刀菌引起的禾谷作物病害效果显著，对玉米茎基腐病、小麦赤霉病和水稻恶苗病的相对防效分别为72.53％、56.68％和45.88％；对轮作中玉米增产效果优于间作栽培的玉米；用于禾谷作物栽培的2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2孢子制备方法简单，易操作。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例1哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2孢子液的制备
哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2孢子液的制备，由以下步骤进行：
(1)马铃薯固体培养基配方：每1000mL中含有去皮马铃薯200g，加热煮沸20min，8层纱布过滤除滤渣，滤液补充去离子水至1000mL；每1000mL滤液含有葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉5g，磷酸二氢钾3.0g，七水硫酸镁1.50g，琼脂粉12g，pH7.2～7.5；0.1MPa，115℃灭菌30min，待温度降至50℃～60℃时于无菌工作台上分装至Φ＝90mm的无菌培养皿，冷却至室温条件下使用。
(2)将保藏的哈茨木霉LTR-2接种于马铃薯固体培养基，30℃±1℃的温度条件下培养72h后，在超净工作台中取Φ＝6mm菌块接种至Φ＝90mm厚度1mm的马铃薯固体培养基，于30℃±1℃，培养10d，至哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2的孢子长满固体培养基。
(3)10d培养结束后，将长满哈茨木霉LTR-2孢子的马铃薯固体培养基用无菌水超声波震荡洗涤，获得含有菌丝的粗洗液；取粗洗液经高度为15mm～20mm无菌脱脂棉过滤柱压缩过滤，除去菌丝，用无菌水调节孢子浓度为2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichodermaharzianum LTR-2孢子液，该过程为无菌操作。
以下实施例2、3、4、5、6、7中所述哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2孢子液均为实施例1所制得；所述产品的百分含量均为质量体积比。
实施例2哈茨木霉LTR-2在玉米促生长中的应用
哈茨木霉LTR-2在玉米促生长中的应用，由以下步骤进行：
(1)按照常规方法在营养土(营养土购自皮德曼公司，营养土的配方：有机质含量≥45％，腐殖酸含量≥15％，PH值：5.5-6.8，游离水含量≤20％)中播种玉米，供试品种为“郑单958”，将2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2孢子液的10倍稀释液、100倍稀释液和200倍稀释液各0.5mL根施播种处；以营养土根施氮磷钾复合肥(氮：磷：钾＝1：0.5：1.5)的“郑单958”为复合肥对照(使用量为氮(N)2.5～2.7kg、磷(P205)1.1～1.4kg、钾(K20)3.7～4.2kg)，以直接使用营养土充当栽培基质的“郑单958”为空白对照，每组处理30株，重复3遍，进入七叶一心期后观察统计株高、茎粗、整株干重和壮苗指数。试验结果见表1。
壮苗指数＝茎粗(cm)/株高(cm)×整株干重(g)
表1哈茨木霉LTR-2对玉米的促生试验
结果显示，相较空白对照，使用哈茨木霉LTR-2的玉米株高、茎粗、整株干重(生物量积累)和壮苗指数均有显著增长，尤其是2.0×1010cfu/mL哈茨木霉LTR-2的100倍稀释液将玉米的壮苗指数增长82.46％；另外，2.0×1010cfu/mL哈茨木霉LTR-2的10倍稀释液和100倍稀释液对玉米的促生效果(株高和茎粗)明显优于复合肥(氮∶磷∶钾＝1∶0.5∶1.5)，200倍稀释液的促生效果接近复合肥处理组。这表明哈茨木霉LTR-2能够明显促进玉米生长，2.0×1010cfu/mL哈茨木霉LTR-2的100倍稀释液的促生效果与哈茨木霉LTR-2的10倍稀释液的效果相近，2.0×1010cfu/mL哈茨木霉LTR-2的100倍稀释液的促生效果可满足应用需要。
(2)进入七叶一心期后，将2.0×1010cfu/mL哈茨木霉LTR-2(100倍稀释液)处理组和空白对照组的玉米根系土壤进行有效氮、有效磷和有效钾含量的检测。有效氮检测采用碱解扩散法，有效磷检测采用0.5M碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法和有效钾检测采用NH4OAc浸提-火焰光度计法。上述有效氮、有效磷和有效钾含量的检测方法参考2008版中由国大地出版社的《土壤农化分析与环境监测》(杨剑虹，王成林，代亨林编著)。试验结果见表2。
表2哈茨木霉LTR-2对玉米根系有效氮、有效磷和有效钾含量的影响
| 处理 | 有效氮(mg/kg) | 有效磷(mg/kg) | 有效钾(mg/kg) |
| 哈茨木霉LTR-2组 | 1098.93±3.71 | 232.35±2.76 | 845.11±1.79 |
| 空白对照 | 144.21±2.07 | 105.20±3.22 | 109.37±1.07 |
结果显示，相较空白对照，使用哈茨木霉LTR-2的玉米根系土壤中的有效氮、有效磷和有效钾含量均提升显著，这表明哈茨木霉LTR-2能够通过提升玉米根系土壤中有效氮、有效磷和有效钾的含量，促进玉米生长。
实施例3哈茨木霉LTR-2在小麦促生长中的应用
哈茨木霉LTR-2在小麦促生长中的应用，由以下步骤进行：
(1)按照常规方法在营养土(营养土购自皮德曼公司，营养土的配方：有机质含量≥45％，腐殖酸含量≥15％，PH值：5.5-6.8，游离水含量≤20％)中播种小麦，供试品种为“鲁麦15”，将2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2孢子液的10倍稀释液、100倍稀释液和200倍稀释液各0.5mL根施播种处；以营养土根施氮磷钾复合肥(氮：磷：钾＝45：48：54)的“鲁麦15”为复合肥对照(使用量为氮(N)3.8～4.0kg、磷(P205)1.4～1.6kg、钾(K20)3.3～3.7kg)，以直接使用营养土充当栽培基质的“鲁麦15”为空白对照，每组处理30株，重复3遍，至抽穗期观察统计株高、茎粗、整株干重和壮苗指数。试验结果见表3。
壮苗指数＝茎粗(cm)/株高(cm)×整株干重(g)
表3哈茨木霉LTR-2对小麦的促生试验
结果显示，相较空白对照，使用哈茨木霉LTR-2的抽穗期小麦茎粗、整株干重和壮苗指数均有显著增长，增加壮苗指数有助于增强小麦的抗倒伏，其中2.0×1010cfu/mL哈茨木霉LTR-2的100倍稀释液将小麦壮苗指数提升48％；另外，2.0×1010cfu/mL哈茨木霉LTR-2的10倍稀释液和100倍稀释液对小麦的茎粗促生效果明显优于复合肥(氮∶磷∶钾＝45∶48∶54)，并且，2.0×1010cfu/mL哈茨木霉LTR-2的100倍稀释液的促生效果与2.0×1010cfu/mL哈茨木霉LTR-2的10倍稀释液的效果相近。这表明哈茨木霉LTR-2能够明显促进小麦生长，2.0×1010cfu/mL哈茨木霉LTR-2的100倍稀释液的促生效果可满足应用需要。
(2)抽穗期后，将2.0×1010cfu/mL哈茨木霉LTR-2处理组(100稀释液)和空白对照组的小麦根系土壤进行有效氮、有效磷和有效钾含量的检测。有效氮检测采用碱解扩散法，有效磷检测采用0.5M碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法和有效钾检测采用NH4OAc浸提-火焰光度计法。上述有效氮、有效磷和有效钾含量的检测方法参考2008版中由国大地出版社的《土壤农化分析与环境监测》(杨剑虹，王成林，代亨林编著)。试验结果见表4。
表4哈茨木霉LTR-2对小麦根系有效氮、有效磷和有效钾含量的影响
| 处理 | 有效氮(mg/kg) | 有效磷(mg/kg) | 有效钾(mg/kg) |
| 哈茨木霉LTR-2组 | 1014.76±1.88 | 217.06±1.48 | 872.47±1.86 |
| 空白对照 | 146.82±2.66 | 96.96±2.37 | 109.18±2.01 |
结果显示，相较空白对照，使用哈茨木霉LTR-2的小麦根系土壤中的有效氮、有效磷和有效钾含量均提升显著，这表明哈茨木霉LTR-2能够通过提升小麦根系土壤中有效氮、有效磷和有效钾的含量，促进小麦生长。
实施例4哈茨木霉LTR-2在水稻促生长中的应用
哈茨木霉LTR-2在水稻促生长中的应用，由以下步骤进行：
(1)按照常规方法在营养土(营养土购自皮德曼公司，营养土的配方：有机质含量≥45％，腐殖酸含量≥15％，PH值：5.5-6.8，游离水含量≤20％)中播种水稻，供试品种为“镇稻88”，将2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2孢子液的10倍稀释液、100倍稀释液和200倍稀释液各0.5mL根施播种处；以营养土根施水稻专用复合肥(氮：磷：钾＝20:13:12)的“镇稻88”为复合肥对照(使用量为磷肥用量一次性底施，氮肥底施50％，钾肥底施60％，氮肥20％分蘖肥，30％作为穗肥，钾肥40％作穗肥追施)，以直接使用营养土充当栽培基质的“镇稻88”为空白对照，每组处理30株，重复3遍，栽培过程保持土壤处于水分饱和但无积水状态，进入七叶一心期后观察统计株高、茎叶干重、根系干重和根冠比。试验结果见表5。
根冠比＝根系干重(g)/茎叶干重(g)
表5哈茨木霉LTR-2对水稻的促生试验
结果显示，相较空白对照，使用哈茨木霉LTR-2的水稻根冠比有显著增长，达到0.3629，比空白对照增加24.15％，优于水稻专用复合肥对照组；另外，2.0×1010cfu/mL哈茨木霉LTR-2的10倍稀释液和100倍稀释液对水稻根冠比的促进效果明显优于水稻专用复合肥(氮∶磷∶钾＝20∶13∶12)。这表明哈茨木霉LTR-2能够明显促进水稻根系生长，提高根冠比，从而提高水稻秧苗质量，且2.0×1010cfu/mL哈茨木霉LTR-2的100倍稀释液的促生效果与2.0×1010cfu/mL哈茨木霉LTR-2的10倍稀释液的效果相近，2.0×1010cfu/mL哈茨木霉LTR-2的100倍稀释液的促生效果可满足应用需要。
(2)进入七叶一心期后，将2.0×1010cfu/mL哈茨木霉LTR-2处理组(100倍稀释液)和空白对照组的水稻根系土壤进行有效氮、有效磷和有效钾含量的检测。有效氮检测采用碱解扩散法，有效磷检测采用0.5M碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法和有效钾检测采用NH4OAc浸提-火焰光度计法。上述有效氮、有效磷和有效钾含量的检测方法参考2008版中由国大地出版社的《土壤农化分析与环境监测》(杨剑虹，王成林，代亨林编著)。试验结果见表6。
表6哈茨木霉LTR-2对水稻根系有效氮、有效磷和有效钾含量的影响
| 处理 | 有效氮(mg/kg) | 有效磷(mg/kg) | 有效钾(mg/kg) |
| 哈茨木霉LTR-2组 | 1112.09±1.11 | 223.98±3.11 | 887.21±2.21 |
| 空白对照 | 145.13±1.57 | 95.42±2.22 | 108.07±2.77 |
结果显示，相较空白对照，使用哈茨木霉LTR-2的水稻根系土壤中的有效氮、有效磷和有效钾含量均提升显著，这表明哈茨木霉LTR-2能够通过提升水稻根系土壤中有效氮、有效磷和有效钾的含量，促进水稻生长。
实施例5哈茨木霉LTR-2对镰刀菌引起的禾谷作物病害的防治
哈茨木霉LTR-2对镰刀菌引起的禾谷作物病害的防治，由以下步骤进行：
(1)将每升营养土(营养土购自皮德曼公司，营养土的配方：有机质含量≥45％，腐殖酸含量≥15％，PH值：5.5-6.8，游离水含量≤20％)0.5g禾谷镰刀菌菌体混合，充分混匀后获得栽培基质，按照常规方法播种并常规管理禾谷作物(供试作物分别为：玉米“郑单958”、小麦“鲁麦15”和水稻“镇稻88”)，将2.0×1010cfu/mL哈茨木霉Trichodermaharzianum LTR-2孢子液的100倍稀释液0.5mL根施播种处，此为哈茨木霉LTR-2处理组；将栽培基质，按照常规方法播种并常规管理禾谷作物(供试作物分别为：玉米“郑单958”、小麦“鲁麦15”和水稻“镇稻88”)为对照组；每组处理30株，重复3遍，21d后观察统计感染镰刀菌引发的玉米茎基腐病、小麦赤霉病和水稻恶苗病的发病率和病级。试验结果见表7。
(2)玉米茎腐病分级标准参考“GB1353-2018-玉米国家标准”如下：0级：全株未发病；1级：全株生长正常，中下部叶片出现青枯/青黄枯症状，茎基生长正常病症占0.1％～5.0％；3级：全株叶片出现青枯症状,茎基生长正常病症占5.1％～10.0％；5级：全株叶片出现典型青枯症状,茎基部变色且稍有水浸状病症占10.1％～30.0％；7级：全株叶片出现典型青枯症状,茎基部明显变软但不倒状病症占30.1％～40.0％；9级：全株枯死且倒伏,茎基部维管束破裂，病症占40.1％～100％。
小麦赤霉病主要引起苗枯、穗腐、茎基腐、秆腐和穗腐，从幼苗到抽穗都可受害。苗期发病是由种子带菌或土壤中病残体侵染所致。先是芽变褐，然后根冠随之腐烂，轻者病苗黄瘦，重者死亡，枯死苗湿度大时产生粉红色霉状物。小麦苗期发作小麦赤霉病分级，如下：0级：全株未发病；1级：全株生长基本正常，病症占0.1％～10.0％；3级：全株生长基本正常，病症占10.1％～20.0％；5级：全株生长基本正常，病症占20.1％～30.0％；7级：全株生长基本正常，病症占30.1％～40.0％；9级：全株生长基本正常，病症占40.1％～100％。
水稻恶苗病苗期发病时，病苗比健苗细高，叶片叶鞘细长，叶色淡黄，根系发育不良，部分病苗在分蘖前死亡。在枯死苗上有淡红或白色霉粉状物，即病原菌的分生孢子。水稻苗期发作水稻恶苗病分级，如下：0级：全株未发病；1级：全株生长基本正常，病症占0.1％～10.0％；3级：全株生长基本正常，病症占10.1％～20.0％；5级：全株生长基本正常，病症占20.1％～30.0％；7级：全株生长基本正常，病症占30.1％～40.0％；9级：全株生长基本正常，病症占40.1％～100％。
计算公式如下：
发病率(％)＝(发病植株数/调查植株数)×100％
病情指数＝100×Σ(各级病叶数×相对病级)/(调查总叶数×最高病级)
相对防效(％)＝[(对照区病指-处理区病指)/对照区病指]×100％
数据统计分析：统计分析用EXCEL2007和SPSS19.0软件进行，多重比较采用邓肯氏新复极差检验法。
表7哈茨木霉LTR-2对玉米茎基腐病、小麦赤霉病和水稻恶苗病的防治试验
结果显示，相较对照组，使用哈茨木霉LTR-2的禾谷作物的发病均明显下降，对玉米茎基腐病、小麦赤霉病和水稻恶苗病的相对防效分别为72.53％、56.68％和45.88％，能够明显抑制镰刀菌引起的禾谷作物病害发病。
实施例6哈茨木霉LTR-2在禾谷作物轮作中的应用
哈茨木霉LTR-2在禾谷作物轮作中的应用，由以下步骤进行：
本应用试验于2018年6月在山东省德州市乐陵县进行，采用“夏玉米-冬小麦”轮作模式。试验地土壤为黄褐土，土壤肥力中等，地势平坦，具有灌溉条件。该地区于2016～2018年轮作种植“夏玉米-冬小麦”，并于2017～2018年种植过程中爆发过镰刀菌(经鉴定为镰刀菌属中的禾谷镰刀菌和尖孢镰刀菌)引起的玉米茎基腐病和小麦赤霉病，供试作物分别为：玉米“郑单958”和小麦“鲁麦15”。试验肥料用量与施用方法、田间栽培管理按当地最佳措施进行。
试验按农业部药检所田间试验准则设计，夏玉米种植共5个处理：哈茨木霉LTR-2处理组，氮磷钾复合肥(氮：磷：钾＝1：0.5：1.5)，75％百菌清粉剂和70％恶霉灵粉剂，清水对照。其中，2.0×1010cfu/mL哈茨木霉LTR-2孢子液用量450亿活菌/亩，氮磷钾复合肥(氮：磷：钾＝1：0.5：1.5，氮磷钾复合肥80kg/亩)，75％百菌清粉剂(3.0kg/亩)和70％恶霉灵粉剂(2.5kg/亩)采用穴施法施用，伴随播种期进行，每处理0.2亩，各3次重复，共15个小区面积3.0亩，各小区留2行保护行。随机区组设计，选取21d进行田间调查。每小区采用双对角线固定5点取样，每点调查6株，记录调查对象的生长情况，发病情况及病级(病级调查后将发病病株除去)。待夏玉米结实收获后，统计鲜重和结实率，产量换算为亩产。上述试验结果见表8和表9。
试验按农业部药检所田间试验准则设计，冬小麦种植共5个处理：哈茨木霉LTR-2处理组，氮磷钾复合肥(氮：磷：钾＝45：48：54)，75％百菌清粉剂和70％恶霉灵粉剂，清水对照。其中，2.0×1010cfu/mL哈茨木霉LTR-2孢子液用量450亿活菌/亩，氮磷钾复合肥(氮：磷：钾＝45：48：54，氮磷钾复合肥55kg/亩)，75％百菌清粉剂(3.0kg/亩)和70％恶霉灵粉剂(2.5kg/亩)采用穴施法施用，伴随播种期进行，返青时五个处理如上用量追加施用，每处理0.2亩，各3次重复，共15个小区面积3.0亩，各小区留2行保护行。随机区组设计，选取21d进行田间调查。每小区采用双对角线固定5点取样，每点调查6株，记录调查对象的生长情况，发病情况及病级(病级调查后将发病病株除去)。待冬小麦结实收获后，统计鲜重和结实率。上述试验结果见表8和表9。
病情严重度分级指标：分级标准参考“GB1353-2018-国家标准”标准中的玉米茎腐病和小麦赤霉病分级标准，以整株为单位进行分级。玉米茎腐病分级：0级：无病斑；1级：病斑0.1％～5.0％；3级：病斑5.1％～10.0％；5级：病斑10.1％～30.0％；7级：病斑30.1％～40.0％；9级：病斑40.1％～100％，植株严重畸形，甚至死亡。小麦苗期发作小麦赤霉病分级，如下：0级：全株未发病；1级：全株生长基本正常，病症占0.1％～10.0％；3级：全株生长基本正常，病症占10.1％～20.0％；5级：全株生长基本正常，病症占20.1％～30.0％；7级：全株生长基本正常，病症占30.1％～40.0％；9级：全株生长基本正常，病症占40.1％～100％。
计算公式如下：
发病率(％)＝(发病植株数/调查植株数)×100％
病情指数＝100×Σ(各级病叶数×相对病级)/(调查总叶数×最高病级)
相对防效(％)＝[(对照区病指-处理区病指)/对照区病指]×100％结实率＝(饱满谷粒数/颖花总数)×100％
数据统计分析：统计分析用EXCEL2007和SPSS19.0软件进行，多重比较采用邓肯氏新复极差检验法。
表8哈茨木霉LTR-2对“夏玉米-冬小麦”轮作中镰刀菌引发病害的防效
结果显示，“夏玉米-冬小麦”轮作中，相较对照组，使用哈茨木霉LTR-2的夏玉米和冬小麦的发病率明显下降，对玉米茎基腐病、小麦赤霉病的相对防效分别为68.67％和56.75％，相对防效能够达到或优于化学保护剂(百菌清和恶霉灵)的相对防效，能够明显抑制镰刀菌引起的玉米茎基腐病、小麦赤霉病发病，保证玉米和小麦的质量。
表9哈茨木霉LTR-2对轮作中“夏玉米-冬小麦”促生增产作用
结果显示，轮作过程中，相较清水对照，使用哈茨木霉LTR-2的玉米和小麦产量有所增长，增长率分别为11.90％和5.64％，略优于相对应的复合肥处理组；另外，哈茨木霉LTR-2提升玉米和小麦的结实率，可达到相对应的复合肥处理组的结实率。这表明哈茨木霉LTR-2能够明显促进玉米和小麦结实率提升，从而提高玉米和小麦产量。同“实施例7”相比，轮作中配套施用哈茨木霉LTR-2能使得玉米产量增长11.90％，增产效果优于“实施例7”中间作配套施用哈茨木霉LTR-2的玉米增产效果(8.27％)。
实施例7哈茨木霉LTR-2在禾谷作物间作中的应用
哈茨木霉LTR-2在禾谷作物间作中的应用，由以下步骤进行：
本应用试验于2018年6月在济宁市南郊水稻实验基地进行，采用“水稻-玉米”间作模式。试验地土壤为黄褐土，土壤肥力中等，地势平坦，具有灌溉条件。该地区于常年间作种植“水稻-玉米”，并于2017年种植过程中爆发过镰刀菌(经鉴定为镰刀菌属中的禾谷镰刀菌和串珠镰刀菌)引起的玉米茎基腐病和水稻恶苗病，供试作物分别为：玉米“郑单958”和水稻“镇稻88”。试验肥料用量与施用方法、田间栽培管理按当地最佳措施进行。
试验按农业部药检所田间试验准则设计，玉米种植共5个处理：哈茨木霉LTR-2处理组，氮磷钾复合肥(氮：磷：钾＝1：0.5：1.5)，75％百菌清粉剂和70％恶霉灵粉剂，清水对照。其中，2.0×1010cfu/mL哈茨木霉LTR-2孢子液用量450亿活菌/亩，氮磷钾复合肥(氮：磷：钾＝1：0.5：1.5，氮磷钾复合肥80kg/亩)，75％百菌清粉剂(3.0kg/亩)和70％恶霉灵粉剂(2.5kg/亩)采用穴施法施用，伴随播种期进行，每处理0.04亩，各3次重复，共15个小区面积0.6亩，各小区留2行保护行。随机区组设计，选取21d进行田间调查。每小区采用双对角线固定5点取样，每点调查6株，记录调查对象的生长情况，发病情况及病级(病级调查后将发病病株除去)。待玉米结实收获后，统计去壳干重和结实率，产量换算为亩产。上述试验结果见表10和表11。
试验按农业部药检所田间试验准则设计，水稻种植共5个处理：哈茨木霉LTR-2处理组，水稻专用复合肥(氮：磷：钾＝20:13:12)，75％百菌清粉剂和70％恶霉灵粉剂，清水对照。其中，2.0×1010cfu/mL哈茨木霉LTR-2孢子液用量450亿活菌/亩，氮磷钾复合肥(氮：磷：钾＝20:13:12，水稻专用复合肥50kg/亩)，75％百菌清粉剂(3.0kg/亩)和70％恶霉灵粉剂(2.5kg/亩)采用穴施法施用，伴随播种期进行，穗期时五个处理如上用量追加施用，每处理0.2亩，各3次重复，共15个小区面积3.0亩，各小区留2行保护行。随机区组设计，选取21d进行田间调查。每小区采用双对角线固定5点取样，每点调查6株，记录调查对象的生长情况，发病情况及病级(病级调查后将发病病株除去)。待水稻结实收获后，统计去壳干重和结实率。上述试验结果见表10和表11。
病情严重度分级指标：分级标准参考“GB1353-2018-国家标准”标准中的玉米茎腐病和小麦赤霉病分级标准，以整株为单位进行分级。玉米茎腐病分级：0级：无病斑；1级：病斑0.1％～5.0％；3级：病斑5.1％～10.0％；5级：病斑10.1％～30.0％；7级：病斑30.1％～40.0％；9级：病斑40.1％～100％，植株严重畸形，甚至死亡。小麦苗期发作小麦赤霉病分级，如下：0级：全株未发病；1级：全株生长基本正常，病症占0.1％～10.0％；3级：全株生长基本正常，病症占10.1％～20.0％；5级：全株生长基本正常，病症占20.1％～30.0％；7级：全株生长基本正常，病症占30.1％～40.0％；9级：全株生长基本正常，病症占40.1％～100％。
计算公式如下：
发病率(％)＝(发病植株数/调查植株数)×100％
病情指数＝100×Σ(各级病叶数×相对病级)/(调查总叶数×9)
相对防效(％)＝[(对照区病指-处理区病指)/对照区病指]×100％
结实率＝(饱满谷粒数/颖花总数)×100％
数据统计分析：统计分析用EXCEL2007和SPSS19.0软件进行，多重比较采用邓肯氏新复极差检验法。
表10哈茨木霉LTR-2对“玉米-水稻”间作中镰刀菌引发病害的防效
结果显示，在“玉米-水稻”间作中，相较对照组，使用哈茨木霉LTR-2的玉米和水稻发病率均明显下降，对玉米茎基腐病和水稻恶苗病的相对防效分别为70.12％和45.17％，相对防效能够达到或优于化学保护剂(百菌清和恶霉灵)的相对防效，能够明显抑制镰刀菌引起的玉米茎基腐病和水稻恶苗病发病，保证玉米和水稻的质量。
表11哈茨木霉LTR-2对间作中“玉米-水稻”促生增产作用
结果显示，间作过程中，相较清水对照，使用哈茨木霉LTR-2的玉米和水稻亩产显著增长，增长率分别为8.27％和13.27％，略优于相对应的复合肥处理组；另外，哈茨木霉LTR-2提升禾谷作物结实率，可达到相对应的复合肥处理组的结实率。这表明哈茨木霉LTR-2能够明显促进玉米和水稻结实率提升，从而提高玉米和水稻产量。
Claims (10)
1.哈茨木霉LTR-2在禾谷作物栽培中的应用，其特征在于，该哈茨木霉(Trichodermaharzianum)菌株LTR-2于2005年1月30日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.1498。
2.根据权利要求1所述的哈茨木霉LTR-2在禾谷作物栽培中的应用，其特征在于，包括促进禾谷作物生长和壮苗方面的应用，还包括防治禾谷作物栽培过程中镰刀菌引起的相关禾谷作物病害方面的应用。
3.根据权利要求2所述的哈茨木霉LTR-2在禾谷作物栽培中的应用，其特征在于，该应用进一步为防治禾谷作物栽培过程中禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌和尖孢镰刀菌引起的相关作物病害的应用。
4.根据权利要求1所述的哈茨木霉LTR-2在禾谷作物栽培中的应用，其特征在于，该应用还包括禾谷作物间作或轮作过程中的应用；更优的为，轮作中的玉米增产效果优于间作中的玉米。
5.根据权利要求1-4任一权利要求所述的哈茨木霉LTR-2在禾谷作物栽培中的应用，其特征在于，具体为采用哈茨木霉LTR-2孢子在禾谷作物栽培中的应用。
6.根据权利要求5所述的哈茨木霉LTR-2在禾谷作物栽培中的应用，其特征在于，具体为采用哈茨木霉LTR-2孢子液。
7.根据权利要求5所述的哈茨木霉LTR-2在禾谷作物栽培中的应用，其特征在于，哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2孢子液由以下步骤制得：
(1)将保藏的哈茨木霉LTR-2接种于马铃薯固体培养基，30℃±1℃的温度条件下培养72h后，在超净工作台中取Φ＝6mm菌块接种至Φ＝90mm厚度1mm的马铃薯固体培养基，于30℃±1℃，培养10d，至哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2的孢子长满固体培养基；
(2)10d培养结束后，将长满哈茨木霉LTR-2孢子的马铃薯固体培养基用无菌水超声波震荡洗涤，获得含有菌丝的粗洗液；取粗洗液经高度为15mm～20mm无菌脱脂棉过滤柱压缩过滤，除去菌丝，用无菌水调节孢子浓度为2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichodermaharzianum LTR-2孢子液，该过程为无菌操作。
8.根据权利要求7所述的哈茨木霉LTR-2在禾谷作物栽培中的应用，其特征在于，步骤(1)中，马铃薯固体培养基配方：每1000mL中含有去皮马铃薯200g，加热煮沸20min，8层纱布过滤除滤渣，滤液补充去离子水至1000mL；每1000mL滤液含有葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉5g，磷酸二氢钾3.0g，七水硫酸镁1.50g，琼脂粉12g，pH7.2～7.5；0.1MPa，115℃灭菌30min，待温度降至50℃～60℃时于无菌工作台上分装至Φ＝90mm的无菌培养皿，冷却至室温条件下使用。
9.根据权利要求6-8任一权利要求所述的哈茨木霉LTR-2在禾谷作物栽培中的应用，其特征在于，将2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2孢子液应用在促进禾谷作物生长和壮苗方面中时，使用2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichodermaharzianum LTR-2孢子液的10倍稀释液、100倍稀释液或200倍稀释液；进一步优选为使用2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2孢子液的100倍稀释液。
10.根据权利要求6-8任一权利要求所述的哈茨木霉LTR-2在禾谷作物栽培中的应用，其特征在于，将2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2孢子液应用在镰刀菌引起的相关植物病害方面中时，根施2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichodermaharzianum LTR-2孢子液的10倍稀释液、100倍稀释液或200倍稀释液；进一步优选为使用2.0×1010cfu/mL的哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2孢子液的100倍稀释液。
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