CN103911322B - 环状芽孢杆菌及其在共生发酵技术制低聚半乳糖中的应用 - Google Patents
环状芽孢杆菌及其在共生发酵技术制低聚半乳糖中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种环状芽孢杆菌及其在共生发酵技术制低聚半乳糖中的应用。环状芽孢杆菌菌株（Bacillus circulans）BLB‑32已于2014年2月27日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.8864。采用本发明的环状芽孢杆菌菌株产酶活力高达150u/ml以上，采用共生发酵技术转化生产低聚半乳糖，可以实现一个罐反应达到大于57%纯度的纯度，替代传统的酶反应和发酵反应两步实施的技术，得到的低聚半乳糖反应液经过色谱分离即可得到大于90%的高纯度的不同低聚半乳糖含量的系列产品。该技术可以节省掉菌体破碎机和离心机以及配套设施投资，节省占地空间，减少大量的能源消耗。同时制备的酶充分利用，减少了损失，酶利用率提升10%以上，提高了原料的利用率。
Description
技术领域
本发明涉及低聚半乳糖制备技术领域，特别涉及一种环状芽孢杆菌菌株，还涉及所述环状芽孢杆菌菌株在共生发酵技术制备低聚半乳糖中的应用。
背景技术
低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides，简称GOS），是一种具有天然属性的功能性低聚糖，是由半乳糖基和葡萄糖基构成的聚合度为 2～8 的低聚糖。本技术是以乳糖为原料，利用环状芽孢杆菌产生的β-半乳糖苷酶催化水解半乳糖苷键，生成半乳糖和葡萄糖，并通过转半乳糖苷的作用，生成含有半乳低聚二糖到半乳低聚八糖的低聚半乳糖产品，并利用共生发酵技术和色谱分离技术生产高纯度低聚半乳糖。
低聚半乳糖具有下列优良的生理学特性：①在大肠内能被对人体有保健作用的一类菌，包括双歧杆菌，有选择性地利用，每日摄取10g低聚半乳糖后，体内双歧杆菌即可成为优势菌群；②它不被人体消化道酶水解，因而是一种低热量糖；③能缓解乳糖不耐症，促进矿物质吸收；④适用于糖尿病患者服用；⑤防龋齿；⑥抑制肠内腐败菌和其它有害菌的生长，促进肠胃功能。低聚半乳糖产品广泛应用于婴幼儿食品、乳制品、饮料、焙烤食品、糖果等。
目前，国内外工业化生产的方法主要是通过选出高活性菌种放大培养，然后破碎菌体、菌体和酶分离制备液体酶制剂，或将液体酶制剂依托载体物质通过干燥方式制成粉体，进行低聚半乳糖的生产，相关的制备工艺存在工艺路线较长，可利用的酶存在损失，酶的综合利用率低，能耗高。原工业化生产低聚半乳糖50吨转化罐，需要配备菌体破碎机和离心机以及配套设施，每小时耗电量240度以上，能源消耗大，而且生产量越大，能源消耗越大。
发明内容
为了解决以上低聚半乳糖生产中工艺路线较长，可利用的酶存在损失，酶的综合利用率低，能耗高的问题，本发明提供了一种可以缩短生产工艺路线、减少设备投入、提高酶利用效率的环状芽孢杆菌菌株。
本发明还提供了所述环状芽孢杆菌菌株共生发酵技术制备低聚半乳糖。
一种环状芽孢杆菌菌株，所述环状芽孢杆菌BLB-32（Bacillus circulans BLB-32）已于2014年 2月27日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.8864。
本发明是通过以下措施实现的：一种环状芽孢杆菌在共生发酵技术制低聚半乳糖中的应用，其特征是它包括如下步骤：
（1）菌种扩大培养
将环状芽孢杆菌BLB-32（CGMCC No.8864）斜面接种在摇瓶种子培养基中，30－37℃，100-250rpm 的振荡速度下培养10-24h，获得扩大的菌种培养液；种子培养基：葡萄糖5-20g/L，酵母膏5-20g/L，蛋白胨5-20g/L，硫酸镁0.3 g/L，pH7.0，种子培养基进行121℃和15分钟的灭菌；
（2）放大培养产酶
制酶培养基：乳糖5-20g/L，酵母膏5-20g/L，蛋白胨5-20g/L，硫酸镁0.3g/L，磷酸氢二钠0.01－0.2g/L，磷酸二氢钠0.01－0.2g/L，pH7.0，制酶培养基进行121℃和15分钟的灭菌；
将步骤（1）得到的扩大的菌种培养液倒入盛有制酶培养基的发酵罐中接种培养，30－37℃，搅拌速度100-300rpm，通入空气培养30-72h，得到放大培养的环状芽孢杆菌BLB-32培养液及其释放的β- 半乳糖苷酶用于生产低聚半乳糖；
（3）共生发酵乳糖转化制备低聚半乳糖
将放大培养的环状芽孢杆菌BLB-32培养液及其释放的β-半乳糖苷酶按接种量50-500ml/L移种于乳糖溶液中，乳糖溶液pH值4～7，反应温度30～50℃，菌种边生长边产酶发酵；或者加入活性酵母共生发酵，活性酵母加入量1-10g/L；
在厌氧条件下转化60～120h，经过组分检测低聚半乳糖达到57％以上时放罐，然后进行活性炭脱色处理，脱色温度60～90℃，脱色30～90分钟，然后经过离子交换精制、浓缩，得到低聚半乳糖组分大于57%的低聚半乳糖浓缩液。
本方案的具体特点还有，乳糖溶液质量浓度为250g～500g/L。
将低聚半乳糖浓缩液经过真空干燥，得到含量大于57%的低聚半乳糖粉末产品。
低聚半乳糖组分大于57%的低聚半乳糖浓缩液通过色谱分离得到含量大于90%的低聚半乳糖液体，组分含量大于90%的低聚半乳糖液体经过真空干燥得到含量大于90%的低聚半乳糖粉体，实现低聚半乳糖不同组分含量的系列化产品制备。
本发明的有益效果：采用本发明的环状芽孢杆菌菌株及共生发酵转化技术生产低聚半乳糖，该技术可以节省掉菌体破碎机和离心机以及配套设施投资，同时制备的酶充分利用，减少了损失，酶利用率提升10%以上，提高了原料的利用率。菌种产酶大于20u/ml为活力标准,低聚半乳糖产率测定采用AOAC 法定方法 2001.02 食品中 GOS 的检测方法测定低聚半乳糖含量，低聚半乳糖含量以57%为基准（国家新资源食品2008年第20号标准） 。
保藏信息：本发明所用菌株为环状芽孢杆菌BLB-32，拉丁文学名Bacilluscirculans BLB-32，该菌株已于2014年2月27日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.8864。
本发明环状芽孢杆菌菌株筛选方法
1）细胞菌悬液的制备
将菌体加入筛选培养基中培养，然后将培养好的菌悬液置于80℃水浴中加热10～20分钟，随后将加热处理过的菌悬液适当稀释接种于芽孢杆菌分离培养基，置于37℃培养10～24小时，进一步作分离纯化。准备6支装有9mL无菌水的试管，编号1—6，用移液枪移取1000μL悬浊液置于1 号试管，再移取1000μL 1号试管悬浊液置于2号试管，依次做六个试管梯度稀释。
2）平板制作
将分离培养基熔化后冷至45℃左右倒平板，凝固后待用。
3）菌种筛选
用移液枪分别取4、5、6号试管溶液各200μL（每个试管取2—4份）置于合适的培养基平板，用涂抹棒均匀涂抹，30－37℃培养2－3天，培养至平板长出成熟菌落。
4）菌种斜面培养
挑取单菌落接种于斜面培养基，30－37℃培养2－3天，获得生长成熟的斜面菌种。
5）菌种扩大培养
将生长成熟的斜面菌种接种在25ml/500mL摇瓶种子培养基中接种，30－37℃，100-250r/min培养10-24小时，获得扩大的菌种培养液。
6）放大培养产酶
将菌种扩大培养的菌种培养液接种在15升发酵罐接种培养，30－37℃，培养2-3天，进行产酶测定，已获得高效产酶菌株，根据培养酶活力大小选出优良斜面出发菌株环状芽孢杆菌（编号为BLB-32）于生产低聚半乳糖。
经过放大产酶，发现菌种产酶活力可以达到155单位以上，具备很高的产业化应用能力。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。
环状芽孢杆菌菌株（Bacillus circulans ）BLB-32经一级培养后，接入二级培养物中培养，得到放大培养的产酶菌种液体。
实施例1：
一种环状芽孢杆菌在共生发酵技术制低聚半乳糖中的应用，它包括如下步骤：
（1）菌种扩大培养
将环状芽孢杆菌BLB-32（CGMCC No.8864）斜面接种在摇瓶种子培养基中，30℃，250rpm 的振荡速度下培养10h，获得扩大的菌种培养液；种子培养基：葡萄糖5g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，硫酸镁0.3 g/L，pH7.0，种子培养基进行121℃和15分钟的灭菌；；
（2）放大培养产酶
制酶培养基：乳糖5g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，硫酸镁0.3g/L，磷酸氢二钠0.01g/L，磷酸二氢钠0.01g/L，pH7.0，制酶培养基进行121℃和15分钟的灭菌；
将步骤（2）得到的扩大的菌种培养液倒入盛有制酶培养基的15升发酵罐中接种培养，30℃，搅拌速度100rpm，通入空气培养72h，得到放大培养的环状芽孢杆菌BLB-32及其释放的β- 半乳糖苷酶用于生产低聚半乳糖；经产酶测定，获得酶活力160u/ml的环状芽孢杆菌BLB-32培养液。
（3）共生发酵乳糖转化制备低聚半乳糖
将4000g乳糖加入15升发酵罐中，加水4000克，加热溶解后，调解料液pH值7.0，然后接入放大培养获得的酶活力160u/ml的环状芽孢杆菌BLB-32培养液，放大培养的环状芽孢杆菌BLB-32培养液接入量500ml/L，酶液和菌体一起作用，边转化边产酶，温度控制在50℃，反应时间100小时，经过检测组分低聚半乳糖达到59.5％，膜过滤去除菌体，清液加入5g/L活性炭进行脱色处理，脱色温度60℃，脱色处理时间60分钟，后经离子交换、浓缩得到低聚半乳糖组分含量大于59.5%的低聚半乳糖浓缩液。低聚半乳糖浓缩液经过真空干燥得到低聚半乳糖粉体。
低聚半乳糖浓缩液经过色谱分离、浓缩得到组分含量为91%的低聚半乳糖液体。
组分含量91%的低聚半乳糖液体经过真空干燥得到含量91%的低聚半乳糖粉体。
实施例2：
一种环状芽孢杆菌在共生发酵技术制低聚半乳糖中的应用，它包括如下步骤：
（1）菌种扩大培养
将环状芽孢杆菌BLB-32（CGMCC No.8864）斜面接种在摇瓶种子培养基中，35℃，100rpm 的振荡速度下培养24h，获得扩大的菌种培养液；种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏20g/L，蛋白胨20g/L，硫酸镁0.3 g/L，pH7.0，种子培养基进行121℃和15分钟的灭菌；；
（2）放大培养产酶
制酶培养基：乳糖20g/L，酵母膏20g/L，蛋白胨20g/L，硫酸镁0.3g/L，磷酸氢二钠0.21g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，pH7.0，制酶培养基进行121℃和15分钟的灭菌；
将步骤（2）得到的扩大的菌种培养液倒入盛有制酶培养基的15升发酵罐中接种培养，35℃，搅拌速度300rpm，通入空气培养30h，得到放大培养的环状芽孢杆菌BLB-32及其释放的β- 半乳糖苷酶用于生产低聚半乳糖；经产酶测定，获得酶活力170u/ml的环状芽孢杆菌BLB-32培养液。
（3）共生发酵乳糖转化制备低聚半乳糖
取5000克乳糖加入15升发酵罐中，加水6000克，加热溶解后，调解料液pH值6.0，然后接入放大培养获得的酶活力170u/ml的环状芽孢杆菌BLB-32培养液，放大培养的环状芽孢杆菌BLB-32培养液接入量200ml/L，酶液和菌体一起作用，边转化边产酶，温度控制在50℃，反应时间96小时，经过组分检测低聚半乳糖达到62.3％，立即用微滤膜去除菌体，清液加入10g/L活性炭进行脱色处理，脱色温度60℃，脱色处理时间30分钟。后经精制、浓缩得到62.3%的低聚半乳糖浓缩液。
低聚半乳糖浓缩液经过干燥得到含量62%的低聚半乳糖粉体。
低聚半乳糖浓缩液经过色谱分离、浓缩得到组分含量95%的低聚半乳糖液体。
组分含量95%低聚半乳糖液体经过干燥得到组分含量95%的低聚半乳糖粉体。
实施例3：
一种环状芽孢杆菌在共生发酵技术制低聚半乳糖中的应用，它包括如下步骤：
（1）菌种扩大培养
将环状芽孢杆菌BLB-32（CGMCC No.8864）斜面接种在摇瓶种子培养基中，37℃，100rpm 的振荡速度下培养24h，获得扩大的菌种培养液；种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，硫酸镁0.3 g/L，pH7.0，种子培养基进行121℃和15分钟的灭菌；；
（2）放大培养产酶
制酶培养基：乳糖10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，硫酸镁0.3g/L，磷酸氢二钠0.2g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，pH7.0，制酶培养基进行121℃和15分钟的灭菌；
将步骤（2）得到的扩大的菌种培养液倒入盛有制酶培养基的15升发酵罐中接种培养，37℃，搅拌速度200rpm，通入空气培养40h，得到放大培养的环状芽孢杆菌BLB-32及其释放的β- 半乳糖苷酶用于生产低聚半乳糖；经产酶测定，获得酶活力165u/ml的环状芽孢杆菌培养液。
（3）共生发酵乳糖转化制备低聚半乳糖
取6000克乳糖加入15升发酵罐中，加水6000克，加热溶解后，调解料液pH值5.0，然后接入扩大培养获得的酶活力165u/ml的环状芽孢杆菌培养液，酶活力165 u/ml的环状芽孢杆菌培养液接入量100ml/L，酶液和菌体一起作用，温度控制在60℃，反应时间100小时，经过组分检测低聚半乳糖达到64.5％，立即用微滤膜去除菌体，清液加入5g/L活性炭进行脱色处理，脱色温度60℃，脱色处理时间90分钟。后经精制、浓缩得到64.5%的低聚半乳糖浓缩液。
低聚半乳糖浓缩液经过干燥得到含量64%的低聚半乳糖粉体。
低聚半乳糖浓缩液经过色谱分离、浓缩得到组分含量99％的低聚半乳糖液体。
组分含量99％的低聚半乳糖液体经过干燥得到含量99%的低聚半乳糖粉体。
实施例4：
一种环状芽孢杆菌在共生发酵技术制低聚半乳糖中的应用，它包括如下步骤：
（1）菌种扩大培养
将环状芽孢杆菌BLB-32（CGMCC No.8864）斜面接种在摇瓶种子培养基中，35℃，100rpm 的振荡速度下培养24h，获得扩大的菌种培养液；种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏20g/L，蛋白胨20g/L，硫酸镁0.3 g/L，pH7.0，种子培养基进行121℃和15分钟的灭菌；；
（2）放大培养产酶
制酶培养基：乳糖10g/L，酵母膏20g/L，蛋白胨20g/L，硫酸镁0.3g/L，磷酸氢二钠0.01g/L，磷酸二氢钠0.01g/L，pH7.0，制酶培养基进行121℃和15分钟的灭菌；
将步骤（2）得到的扩大的菌种培养液倒入盛有制酶培养基的15升发酵罐中接种培养，35℃，搅拌速度200rpm，通入空气培养40h，得到放大培养的环状芽孢杆菌BLB-32及其释放的β- 半乳糖苷酶用于生产低聚半乳糖；经产酶测定，获得酶活力170u/ml的环状芽孢杆菌培养液。
（3）共生发酵乳糖转化制备低聚半乳糖
取6000克乳糖加入15升发酵罐中，加水5000克，加热溶解后，调解料液pH值5.0，然后接入扩大培养获得的酶活力168 u/ml的环状芽孢杆菌培养液，酶活力168 u/ml的环状芽孢杆菌培养液接入量100ml/L，酶液和菌体一起作用，边转化边产酶，温度控制在30℃，反应时间80小时，然后加入10g/L的面包酵母进行共生发酵，经过组分检测低聚半乳糖达到73.6％，立即用微滤膜去除菌体，清液加入10g/L活性炭进行脱色处理，脱色温度90℃，脱色处理时间60分钟。后经精制、浓缩得到73.6%的低聚半乳糖浓缩液。
低聚半乳糖浓缩液经过干燥得到含量73%的低聚半乳糖粉体。
低聚半乳糖浓缩液经过色谱分离、浓缩得到组分含量99％的低聚半乳糖液体。
组分含量99％的低聚半乳糖液体经过干燥得到含量99%的低聚半乳糖粉体。
Claims (5)
1.一种环状芽孢杆菌BLB-32(Bacillus circulans BLB-32）,已于2014年2月27日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.8864。
2.一种环状芽孢杆菌在共生发酵技术制低聚半乳糖中的应用，其特征是它包括如下步骤：
（1）菌种扩大培养
将保藏号为CGMCC No.8864的环状芽孢杆菌BLB-32斜面接种在摇瓶种子培养基中，30－37℃，100-250rpm 的振荡速度下培养10-24h，获得扩大的菌种培养液；种子培养基：葡萄糖5-20g/L，酵母膏5-20g/L，蛋白胨5-20g/L，硫酸镁0.3 g/L，pH7.0，种子培养基进行121℃和15分钟的灭菌；
（2）放大培养产酶
制酶培养基：乳糖5-20g/L，酵母膏5-20g/L，蛋白胨5-20g/L，硫酸镁0.3g/L，磷酸氢二钠0.01－0.2g/L，磷酸二氢钠0.01－0.2g/L，pH7.0，制酶培养基进行121℃和15分钟的灭菌；
将步骤（1）得到的扩大的菌种培养液倒入盛有制酶培养基的发酵罐中接种培养，30－37℃，搅拌速度100-300rpm，通入空气培养30-72h，得到放大培养的环状芽孢杆菌BLB-32培养液及其释放的β- 半乳糖苷酶用于生产低聚半乳糖；
（3）共生发酵乳糖转化制备低聚半乳糖
将放大培养的环状芽孢杆菌BLB-32培养液及其释放的β-半乳糖苷酶按接种量50-500ml/L移种于乳糖溶液中，乳糖溶液pH值4～7，反应温度30～50℃，菌种边生长边产酶发酵；或者加入活性酵母共生发酵，活性酵母加入量1-10g/L；
在厌氧条件下转化60～120h，经过组分检测低聚半乳糖达到57％以上时放罐，然后进行活性炭脱色处理，脱色温度60～90℃，脱色30～90分钟，然后经过离子交换精制、浓缩，得到低聚半乳糖组分大于57%的低聚半乳糖浓缩液。
3.根据权利要求2所述的环状芽孢杆菌在共生发酵技术制低聚半乳糖中的应用，其特征是乳糖溶液质量浓度为250g/L～500g/L。
4.根据权利要求2所述的环状芽孢杆菌在共生发酵技术制低聚半乳糖中的应用，其特征是将低聚半乳糖组分大于57%的低聚半乳糖浓缩液通过色谱分离得到低聚半乳糖组分大于90%的低聚半乳糖液体。
5.根据权利要求2所述的环状芽孢杆菌在共生发酵技术制低聚半乳糖中的应用，其特征是将低聚半乳糖浓缩液经过真空干燥，得到含量大于57%的低聚半乳糖粉末产品。
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