CN102676427B

CN102676427B - 一种非解乳糖链球菌及其应用

Info

Publication number: CN102676427B
Application number: CN 201210141827
Authority: CN
Inventors: 张凯; 李建喜; 张景艳; 孟嘉仁; 杨志强; 王学智
Original assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Current assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Priority date: 2012-05-09
Filing date: 2012-05-09
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2032-05-09
Also published as: CN102676427A

Abstract

本发明首次公开了一种非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）LZMYFGM9，该菌株的保藏编号为CGMCC No.4227，同时公开了包含该菌株的发酵菌剂及其应用。本发明提出的非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）LZMYFGM9 CGMCC No.4227可用于黄芪多糖的提取，该方法具有实用性强、操作简便、效益高的优点，具有广阔的实际应用前景。

Description

一种非解乳糖链球菌及其应用

技术领域

本发明首次发现了一株非解乳糖链球菌LZMYFGM9，该菌株的拉丁文分类命名为Streptococcus alactolyticus ，该菌株已于2010年10月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏单位简称：CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.4227。

本发明涉及发酵领域，具体地，涉及一种非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）LZMYFGM9 CGMCC No.4227及其应用。

背景技术

对非解乳糖链球菌的相关研究还较少，《伯杰氏细菌鉴定手册》也没有收录非解乳糖链球菌，1984年由Farraw等首次发现。1984 年，Farrow 等人利用遗传学分类方法将马肠链球菌/ 牛链球菌复合群( Streptococcus bovis/Streptococcus equinus complex) 划分为6 个不同的DNA 群，其中，DNA 群1 包含马肠链球菌和牛链球菌。马肠链球菌与牛链球菌的全基因组和16SrDNA 序列高度同源，属于同一个种。但命名上却难以统一，因为马肠链球菌的命名较早，而在医学中广泛用于代表这类菌株的是牛链球菌。DNA 群2 、3 、4 则对应于三个不同的未命名的基因种。DNA群5 命名为解糖链球菌，DNA 群6 命名为非解乳糖链球菌。Schlegel等人将马肠链球菌/ 牛链球菌复合群进行了重新划分，认为该复合群包括7 个不同的种和亚种，即马肠链球菌(S.equinus) 、解没食子酸链球菌解没食子酸亚种(S. gallolyticus subsp.gallolyticus)、解没食子酸链球菌巴氏亚种( S.gallolyticus subsp. pasteurianus) 、解没食子酸链球菌马其顿亚种( S .gallolyticus subsp . macedonicus) 、婴儿链球菌婴儿亚种( S.infantarius subsp.infantarius) 、婴儿链球菌结肠亚种( S.infantariussubsp.coli) 和非解乳链球菌( S. alactolyticus) 。而对于非解乳链球菌的变异种及应用则少之又少。

黄芪多糖是中药黄芪有效成分，由α-糖甙键连接而成的分子量为37 500左右的植物多糖，水解后可检出葡萄糖、丰乳糖和阿拉伯糖，三种糖克分子比为：1:0.95:0.70。黄芪多糖是一种有效免疫增强剂，并能诱导机体益生菌增殖，促进机体微生态平衡。研究报道表明黄芪多糖还具有增强细胞新陈代谢、促进血液循环、抗病毒、抗肿瘤、抗应激等保健功效，已被广泛应用作功能性配料或直接服用。

目前，国内外市场上的黄芪多糖均靠提取而来，据资料查新可知的黄芪多糖提取方法有8种，包括传统的水提醇沉法、超微粉碎法、超声细胞粉碎法、超滤法、微波提取法、纤维素酶法、碱水提取法、醇碱提取法。传统水提醇沉法是目前最常用的提取方法，黄芪多糖的提取率平均为5.34%左右；超微粉碎法，超微粉中黄芪多糖的提取率为4.69%左右，而粗粉中黄芪多糖的提取率仅为2.16%左右；超声细胞粉碎法黄芪多糖的提取率为7.6%左右；微波提取法黄芪多糖的提取率为6.55%左右；超滤法提黄芪多糖得率低于水提醇沉法，但产物中多糖含量高；碱水提取法得黄芪多糖的提取率在4.7-19.2%之间，稳定性较差；醇碱提取法得黄芪多糖的提取率最高可达19.15%；纤维素酶法的黄芪多糖提取率高于水提醇沉法，提取物多糖含量高，但因提取不稳定而没有科学的提取率参考数据。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种非解乳糖链球菌及生产用的包含该菌株的发酵菌剂：

一种非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）LZMYFGM9，该菌株的保藏编号为CGMCC No.4227。

一种包含非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）LZMYFGM9 CGMCC No.4227的发酵菌剂，所述发酵菌剂经以下步骤制得：

（1）将非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）LZMYFGM9 CGMCC No.4227菌株接入MRS培养基斜面进行培养，接种量为10³cfu；

（2）将步骤（1）得到的培养物接入一级或二级种子培养基，培养后得到发酵菌剂，接种量为10³cfu。

具体地，所述步骤（1）的培养条件为：时间：16-20小时；环境：厌氧发酵；温度：36.5-37.5℃；初始pH：6.0-6.4。

具体地，所述步骤（2）的培养条件为：时间：16-20小时；环境：厌氧发酵；温度：36.5-37.5℃；初始pH：5.5-5.9。

非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）LZMYFGM9 CGMCC No.4227在提取黄芪多糖中的应用。

相关实验：

（一）非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）LZMYFGM9 CGMCC No.4227的分离和筛选：

准备6支无菌试管并编号后，分别加入9.5mL样品稀释液（质量浓度0.9%的生理盐水）。将兰州市上西园村16月龄健康蛋用土鸡宰杀后，从盲肠中取肠内容物，准确称取0.50g加入编号1的试管中快速振荡混匀。从1号试管中吸取0.5mL液体加入2号试管，快速振荡混匀后吸取0.5mL加入3号试管，以此类推。将样品稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6 6个稀释度。准确吸取10^-4、10^-5、10^-6 3个稀释度样品50??L接入事先准备好的改良GAM琼脂平板上，用涂布器快速涂布均匀后，放入厌氧罐。在厌氧罐中加入指示剂（美兰试纸）、催化剂（钯粒）和产气袋（产气袋中主要成分为硼氢化钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾）后密封培养，培养至平板长出成熟菌落。

鉴定并分离纯化（溶血试验出现α溶血，生化鉴定出现苦杏仁苷、纤维二糖、七叶灵、果糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、棉子糖、水杨苷、蔗糖和海藻糖的阳性反应；乳糖、接触酶、氧化酶、阿拉伯糖、葡萄糖酸钠、松三糖鼠李糖、核糖、山梨醇和木糖的阴性反应，并用划线培养挑单个菌落的方法纯化菌种）非解乳糖链球菌落，将菌落接种MRS琼脂斜面，并接种摇瓶，初筛利用硫酸-蒽酮法测定产黄芪多糖的转化率，根据摇瓶产黄芪多糖的转化率水平，选择转化率最高者，筛选出斜面出发菌种：非解乳糖链球菌种FGM1。

采用紫外线诱变处理，通过产黄芪多糖的转化率测定筛选得到优良的高产菌株，用于厌氧发酵黄芪多糖的生产。具体操作步骤如下：

菌种紫外诱变：接种环挑取非解乳糖链球菌种FGM1斜面菌种于装有无菌水的三角瓶中，置于磁力搅拌器振荡均匀。将菌悬液倒入无菌平皿。打开平皿盖，在事先预热好的15W的紫外灯下30cm处照射0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s、210s，不同照射剂量菌悬液稀释到10^-1，再用生理盐水分别稀释菌悬液到10^-3，吸取稀释好的菌悬液0.05mL涂布5%黄芪MRS平板，每个稀释度涂布3个平板。置于厌氧罐中培养至长出成熟菌落，统计致死率。

筛选：选取平板菌落进行摇瓶培养，利用硫酸-蒽酮法测定转化率。

转化率测定：以5%黄芪粉溶液为底物，加入适量菌体细胞，总体积为20mL，置于三角瓶中在最适反应温度，转速为120r/min的恒温摇床中反应48h，取出于4000r/min台式离心机离心10min，取上清液，乙醇沉淀，取沉淀作为测定黄芪多糖含量物。从中筛选出黄芪多糖提取率稳定在10.06%-15.46%的高转化率菌株非解乳糖链球菌种（Streptococcus alactolyticus）LZMYFGM9。

（二）利用非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）LZMYFGM9制备生产用的包含非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）LZMYFGM9 CGMCC No.4227的发酵菌剂：

（1）将非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）LZMYFGM9 CGMCC No.4227菌株（接种量为10³cfu）接入MRS培养基斜面进行培养：时间：16-20小时；环境：厌氧发酵；温度：36.5-37.5℃；初始pH：6.0-6.4。

MRS斜面培养基为市售商品，（生产厂家：广东环凯微生物科技有限公司；批号：200904172）其成份为：1%蛋白胨，1%牛肉浸膏，0.5%酵母粉，0.2%枸橼酸二铵，2%葡萄糖，0.5%乙酸钠，0.2%磷酸氢二钾，0.058%的MgSO₄·7H₂O，0.025%的MnSO₄·4H₂O，0.1%（V/V）的吐温80，pH6.5，3%琼脂。

（2）将上步得到的培养物（接种量为10³cfu）接入一级或二级种子培养基培养：时间：16-20小时；环境：厌氧发酵；温度：36.5-37.5℃；初始pH：5.5-5.9，培养后得到发酵菌剂。

种子培养基为市售商品（生产厂家：广东环凯微生物科技有限公司；批号：201106293），其成份为：1%蛋白胨，1%牛肉浸膏，0.5%酵母粉，0.2%枸橼酸二铵，2%葡萄糖，0.5%乙酸钠，0.2%磷酸氢二钾，0.058%的MgSO₄·7H₂O，0.025%的MnSO₄·4H₂O，0.1%（V/V）的吐温80，pH6.5。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次提出了非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）LZMYFGM9 CGMCC No.4227，并将其扩大培养为生产用的发酵菌剂，该菌剂能够用于提取黄芪多糖，具有较高的提取率。

本发明实用性强，操作简便，对发酵设备及生产条件没有特殊要求，利用一般发酵厂的设备和生产条件即可生产，投资少、见效快、效益高，不但适合于大规模的生产还适合于小批量的生产，具有广阔的实际应用前景。

保藏信息：

非解乳糖链球菌LZMYFGM9的拉丁文分类命名为Streptococcus alactolyticus ；

保藏日期：2010年10月19日；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位简称：CGMCC；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏编号：CGMCC No.4227。

具体实施方式

（一）菌种实施例

非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）LZMYFGM9，该菌株的保藏编号为CGMCC No.4227，其形态为：革兰氏阳性，镜检为球状或椭圆，呈链状排布，不形成芽孢。生理生化特性：溶血试验出现α溶血，生化鉴定出现苦杏仁苷、纤维二糖、七叶灵、果糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、棉子糖、水杨苷、蔗糖和海藻糖的阳性反应；乳糖、接触酶、氧化酶、阿拉伯糖、葡萄糖酸钠、松三糖鼠李糖、核糖、山梨醇和木糖的阴性反应。

（二）包含非解乳糖链球菌LZMYFGM9的发酵菌剂的制备实施例

实施例1

（1）将非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）LZMYFGM9 CGMCC No.4227菌株（接种量为10³cfu）接入MRS培养基斜面进行培养：时间：16小时；环境：厌氧发酵；温度： 37.5℃；初始pH：6.4。

（2）将上步得到的培养物（接种量为10³cfu）接入一级或二级种子培养基培养：时间：16小时；环境：厌氧发酵；温度： 37.5℃；初始pH：5.9，培养后得到发酵菌剂。

实施例2

（1）将非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）LZMYFGM9 CGMCC No.4227菌株（接种量为10³cfu）接入MRS培养基斜面进行培养：时间：20小时；环境：厌氧发酵；温度：36.5℃；初始pH：6.0。

（2）将上步得到的培养物（接种量为10³cfu）接入一级或二级种子培养基培养：时间：20小时；环境：厌氧发酵；温度：36.5℃；初始pH：5.5，培养后得到发酵菌剂。

实施例3

（1）将非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）LZMYFGM9 CGMCC No.4227菌株（接种量为10³cfu）接入MRS培养基斜面进行培养：时间：18小时；环境：厌氧发酵；温度：37℃；初始pH：6.2。

（2）将上步得到的培养物（接种量为10³cfu）接入一级或二级种子培养基培养：时间：18小时；环境：厌氧发酵；温度：37℃；初始pH：5.7，培养后得到发酵菌剂。

（三）应用实施例

非解乳糖链球菌LZMYFGM9用于在发酵反应中提取黄芪多糖，具体如下：

（1）将制备的包含非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）LZMYFGM9 CGMCC No.4227的发酵菌剂转入提取黄芪多糖的发酵培养基，接入量为2%（V/V体积百分数），置于厌氧罐中，于37摄氏度、120转/分条件下反应60小时，得到发酵产物。

上述提取黄芪多糖的发酵培养基的成分及指标为：乳清粉：5.158 g；蛋白胨：0.456 g；葡萄糖：0.12 g；酵母粉：0.312 g；无机盐（磷酸二氢钾和磷酸氢二钾）：0.194 g；黄芪粉：16 g；水：200 ml，加入500ml的三角瓶，于高压锅中121℃，20min灭菌，调整pH至6.9备用。

（2）发酵完毕后，将发酵产物离心法将固液分离，分离后，上清部分用95%乙醇沉淀2次；沉淀部分用水煮后离心，取液体部分浓缩，再用95%乙醇沉淀2次；两部分沉淀提取物合并后冰冻干燥，称得提取物的重量为2.365克，提取率为14.78%，黄芪多糖含量为31.22%。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）LZMYFGM9，该菌株的保藏编号为CGMCC No.4227。

2.一种包含非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）LZMYFGM9 CGMCC No.4227的发酵菌剂，所述发酵菌剂经以下步骤制得：

3.根据权利要求2所述的发酵菌剂，所述步骤（1）的培养条件为：时间：16-20小时；环境：厌氧发酵；温度：36.5-37.5℃；初始pH：6.0-6.4。

4.根据权利要求2所述的发酵菌剂，所述步骤（2）的培养条件为：时间：16-20小时；环境：厌氧发酵；温度：36.5-37.5℃；初始pH：5.5-5.9。

5.权利要求1所述非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）LZMYFGM9 CGMCC No.4227在提取黄芪多糖中的应用。