CN104805041B - 一株非解乳糖链球菌菌株及其应用 - Google Patents
一株非解乳糖链球菌菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一株非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）UN10‑1菌株，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.9022。本发明还提供上述菌株在发酵黄芪中的应用。本发明的菌株具有发酵黄芪性能好，多糖产量高，安全性高等特点，可用于生产发酵型黄芪多糖。
Description
技术领域
本发明属于微生物菌种选育技术领域，具体涉及一株自鸡盲肠分离筛选出的非解乳糖链球菌菌株。
背景技术
随着遗传学和分子生物学领域的飞速发展,许多新型复杂的技术被应用于菌种选育,如原生质体融合育种技术和基因工程育种技术等,但是诱变育种技术仍是提供菌株生产能力的重要有效手段。它获得的正突变率相对较高,可以得到多种优良突变体和新的有益基因类型。另一方面,诱变育种存在一定的盲目性和随机性,在实际应用中,研究者应根据出发菌株及实验室条件等具体情况来选择合适的诱变方法。陈凤莲等[2009年，哈尔滨商业大学学报]通过采用紫外线诱变的方法结合平板培养基得到一产木聚糖酶活力高的黑曲霉菌株A3,活力可达到58.305U/mL。徐同宝等(2009年)以黑曲霉XE6为出发菌株,经微波和硫酸二乙酯诱变处理,选育出一株高产木聚糖酶菌株mAnl,该菌株遗传性状稳定,并且利用单因素轮换法和正交试验法对菌株进行发酵研究,发现木聚糖酶的酶活为81.151U/g,比出发菌株的酶活提高了34.88％。
发明内容
为了进一步选育生产发酵黄芪多糖性能更好的菌株，本申请将紫外线和亚硝基胍结合起来，对非解乳糖链球菌CGMCC No.4227进行复合诱变,得到了一种发酵生产黄芪多糖更为理想的菌株--非解乳糖链球菌(Streptococcus alactolyticus)UN10-1菌株，并将其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏时间2014年04月08日，保藏号CGMCC No.9022。
本发明的第二个目的是提供一种包含非解乳糖链球菌(Streptococcusalactolyticus)UN10-1 CGMCC No.9022的发酵菌剂，其特征在于：所述发酵菌剂由以下步骤制备得到：
(1)将非解乳糖链球菌(Streptococcus alactolyticus)UN10-1 CGMCC No.9022接入MRS培养基进行斜面培养；接种量为培养基体积分数的2％；
(2)将步骤(1)得到的培养物进行发酵培养，得到发酵菌剂，接种量为培养基体积分数的3％。
优选地，所述步骤(1)的培养条件为：温度37℃，厌氧培养，时间为24h，pH值6.4～7.4。
优选地，所述步骤(2)的培养条件为：温度37℃，厌氧培养，转速120r/min，时间48小时，pH值6.4～7.4。
本发明的第三个目的是提供上述非解乳糖链球菌UN10-1的筛选方法，是先进行紫外线诱变再进行亚硝基胍诱变得到的。
优选地，所述紫外线诱变的条件为：波长为254nm，功率为15W，时间为10s；所述亚硝基胍诱变的条件为1.0mg/ml。
本发明的第四个目的是提供上述菌株在提取多糖中的应用。
本发明的第五个目的是提供上述菌株在发酵黄芪中的应用。
本发明采用紫外线(UV)诱变和亚硝基胍(NTG)诱变相结合的复合诱变方法(UV-NTG)对非解乳糖链球菌CGMCC No.4227对数期菌悬液进行诱变筛选,最终获得了一株遗传稳定性好、安全的非解乳糖链球菌UN10-1CGMCC No.9022。利用其发酵黄芪后，多糖产量为293.39mg/g，较原始出发菌株提高了94.99％，具有良好的开发前景。
本发明的菌株具有发酵黄芪性能好，多糖产量高，安全性高等特点，可用于生产发酵型黄芪多糖。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为不同的UV+NTG诱变条件与非解乳糖链球菌LZMYFGM9菌株CGMCC No.4227致死率的关系图；
图2为UV-NTG复合诱变对非解乳糖链球菌LZMYFGM9菌株CGMCC No.4227诱变后多糖产量的影响图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1
1.菌种的复苏与活化
将中国专利201210141827.5中提供的非解乳糖链球菌LZMYFGM9菌株(该菌株的分类命名为非解乳糖链球菌Streptococcus alactolyticus，保藏编号为CGMCC No.4227，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏时间2010年10月19日)在37℃快速复苏，然后在无菌操作台内将解冻的菌株接入灭菌MRS肉汤培养基中，在37℃厌氧条件下培养18-24h。按2％接种量将种子液加至新的灭菌MRS肉汤培养基中，将复苏好的菌进行传代培养。
取出已经活化并传4代培养至对数期的培养液，3500r/min离心15min，弃上清，加等体积无菌PBS(100mmol/L，pH7)，重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复上述步骤2次，用PBS恢复成菌悬液，菌悬液浓度控制为106个/ml左右，将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内，振荡20-30min，打散细胞。
2.诱变处理
申请人共设计了三种不同的诱变处理方法，具体如下：
(1)紫外线(UV)诱变
波长为254nm，功率为15W的紫外灯预热30min后，取6.0mL菌悬液分别铺于7个直径为9cm的无菌培养皿中，将盛有菌悬液的平皿放在磁力搅拌器上，距离紫外灯20cm，分别照射0s、10s、30s、60s、90s、120s、150s，边照射边搅拌，使菌体均匀接受紫外线光波。在红光下取0.1mL菌悬液，用无菌生理盐水梯度稀释后涂布灭菌MRS琼脂培养基平板,每个稀释度涂布3个平板，37℃厌氧避光培养，72h后观察统计菌落总数，以未经紫外线处理的稀释液涂布平板为对照，计算致死率。
(2)亚硝基胍(NTG)诱变
准确称取20mg亚硝基胍于棕色瓶中，加0.2ml丙酮使其溶解，溶解后加PBS溶液10ml，配制成2.0mg/ml亚硝基胍(NTG)母液。将NTG母液与菌悬液按比例混合，使NTG的最终浓度分别为0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL，30℃水浴，分别处理10min、20min、30min、60min，将NTG处理过的菌体3500r/min离心15min，用PBS冲洗3次以除去NTG残留，用PBS将菌悬液振荡悬浮，用无菌水稀释到适合稀释度，涂布于平板上，培养基为灭菌MRS肉汤培养基，37℃厌氧培养48h，计算致死率。
(3)紫外线和亚硝基胍复合诱变
先将菌悬液在波长为254nm，功率为15W紫外灯下距离20cm分别照射10s、30s，然后将其分别用0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL亚硝基胍30℃水浴处理10min。用PBS洗涤3次除去NTG残留，振荡悬浮菌体沉淀，用无菌生理盐水梯度稀释，每个稀释度涂布3个灭菌MRS琼脂培养基平板，37℃厌氧培养72h。用未经诱变的稀释液涂布平板作对照，计算致死率。
(4)菌株的筛选
在上述确定的诱变条件下诱变非解乳糖链球菌CGMCC No.4227，选择在MRS培养基上生长速率快、菌落较大的突变菌接入MRS肉汤培养基，37℃厌氧培养18-24h，pH值6.4～7.4。按2％接种量继续培养3-4代后，以体积分数3％(菌量约4.5×108个/mL)的接菌量接入含有100mL发酵培养基的三角瓶中，120r/min、37℃、pH值6.4～7.4厌氧摇床发酵培养48h。发酵结束后，测定多糖产量，每株重复3次，筛选出每个诱变条件下多糖产量最高的突变株。
其中，MRS肉汤培养基购自广东环凯微生物科技有限公司，批号：201106293，其成分为：1％蛋白胨，1％牛肉浸膏，0.5％酵母粉，0.2％枸橼酸二铵，2％葡萄糖，0.5％乙酸钠，0.2％磷酸二氢钾，0.058％的MgSO4·7H2O，0.025％的MnSO4·4H2O，0.1％(V/V)的吐温80，用Na2CO3调初始pH值至7.4。
发酵培养基为：按照乳清粉：5.158g；蛋白胨：0.456g；葡萄糖：0.12g；酵母粉：0.312g；无机盐：0.194g；黄芪粉：16g；水：200mL的重量配比称量各组分，加入500ml的三角瓶，于高压锅中121℃,20min灭菌，调整pH至7.4备用。
测定多糖产量的具体方法为：发酵结束后，4000r/min离心10min进行固液分离，上清转入另一洁净器皿保存；沉淀加入100mL的蒸馏水煮沸1.5h，冷却到室温后，离心取上清。混合两次的上清，沸水浴中浓缩至35mL，加入3倍体积的95％乙醇，边加边搅拌，4℃静置24h，收集沉淀；将醇沉过夜后的上清，再4000r/min离心10min，将两次沉淀混合，回收乙醇。沉淀干燥后用100mL蒸馏水溶解，再稀释400倍，取2.0mL稀释好的粗多糖溶液置于具塞试管中，用苯酚硫酸法测定多糖的含量，每个样品3个重复，每个重复测定3次OD值，根据标准曲线计算多糖含量。
结果表明：当UV+NTG复合诱变的条件为UV照射10s、NTG浓度1.0mg/mL时，诱变后的正突变株多糖产量达到最高，为293.39mg/g，较原始出发菌株提高了94.99％；将该正突变株命名为非解乳糖链球菌UN10-1，并将其送至保藏中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.9022。
一、对非解乳糖链球菌UN10-1CGMCC No.9022的显微观察和生化鉴定结果如下：
形态为：菌落呈圆形、扁平、表面光滑、奶白色不透明、边缘整齐，在1～2mm之间。显微镜下：革兰氏阳性，镜检单个菌体呈圆形或卵圆形、无芽孢、无鞭毛，菌体成对，呈链状排列。生化鉴定：出现苦杏仁苷、纤维二糖、七叶灵、果糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、棉子糖、水杨苷、蔗糖、海藻糖、核糖、乳糖和阿拉伯糖的阳性反应，乳糖、接触酶、氧化酶、葡萄糖酸钠、松三糖、鼠李糖、山梨醇和木糖的阴性反应。
二、非解乳糖链球菌UN10-1 CGMCC No.9022的遗传性状稳定性试验：
对非解乳糖链球菌UN10-1 CGMCC No.9022进行遗传性状稳定性实验。将UN10-1记为第0代，连续传代5次，对第1、3、5代分别进行厌氧摇瓶发酵培养，传代培养条件和厌氧摇瓶发酵培养条件同上，测定其多糖含量。结果表明：诱变株非解乳糖链球菌UN10-1CGMCCNo.9022连续5代的多糖产量较原始菌株平均提高了98.76％，具有较好的遗传稳定性。表1
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一株非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）UN10-1菌株，其特征在于：所述菌株的保藏编号为CGMCC No.9022。
2.一种包含非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）UN10-1 CGMCC No.9022的发酵菌剂，其特征在于：所述发酵菌剂由以下步骤制备得到：
（1）将非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）UN10-1 CGMCC No.9022接入MRS培养基进行斜面培养；接种量为培养基体积分数的2%；
（2）将步骤（1）得到的培养物进行发酵培养，得到发酵菌剂，接种量为培养基体积分数的3%。
3.根据权利要求2所述的发酵菌剂，其特征在于：所述步骤（1）的培养条件为：温度37℃，厌氧培养，时间为24h，pH值6.4～7.4。
4.根据权利要求2所述的发酵菌剂，其特征在于：所述步骤（2）的培养条件为：温度37℃，厌氧培养，转速120r/min，时间为48小时，pH值6.4～7.4。
5.权利要求1所述的非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）UN10-1菌株在提取多糖中的应用。
6.权利要求1所述的非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）UN10-1菌株在发酵黄芪中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述应用是发酵黄芪后，转化多糖含量达293.39mg/g。
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Citations (2)
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| CN104152491A (zh) * | 2014-08-18 | 2014-11-19 | 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 | 一种发酵黄芪的制备方法及其总皂苷的提取方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
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| "Streptococcus alactolyticus is the dominating culturable lactic acid bacterium species in canine jejunum and feces of four fistulated dogs";Minna L.Rinkinen et al.;《FEMS Microbiology Letters》;20040131;第230卷(第1期);第35-39页 * |
| "来源于益生菌FGM的aga2基因在黄芪发酵过程中的表达";郝桂娟等;《畜牧兽医学报》;20131231;第44卷(第4期);第642-648页 * |
| "紫外线与亚硝基胍复合诱变选育高效降解亚硝酸盐乳酸菌";李文涛等;《食品安全质量检测学报》;20131231;第4卷(第6期);第1721-1724页 * |
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