CN111533793A

CN111533793A - 非解乳糖链球菌表面粘附蛋白EF-Tu基因、氨基酸序列、原核表达蛋白和多克隆抗体

Info

Publication number: CN111533793A
Application number: CN202010157065.2A
Authority: CN
Inventors: 张景艳; 张凯; 王磊; 张康; 李建喜; 王学智; 仇正英; 王贵波; 辛蕊华; 张丽娟; 张宏
Original assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Current assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Priority date: 2020-03-09
Filing date: 2020-03-09
Publication date: 2020-08-14

Abstract

本发明提供非解乳糖链球菌表面粘附蛋白EF‑Tu基因序列，所述非解乳糖链球菌表面粘附蛋白EF‑Tu基因序列为序列表中SEQ ID No.1。本发明还提供相应的氨基酸序列、原核表达蛋白、多克隆抗体及多克隆抗体的制备方法。利用本发明所提供的方法制备的多克隆抗体，能够特异性识别FGM菌EF‑Tu蛋白，而不能识别FGM菌其他蛋白，在EF‑Tu蛋白的检测和功能研究、菌株鉴别及乳酸菌益生性机制研究中具有广泛用途。

Description

非解乳糖链球菌表面粘附蛋白EF-Tu基因、氨基酸序列、原核表达蛋白和多克隆抗体

技术领域

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及非解乳糖链球菌表面粘附蛋白EF-Tu蛋白多克隆抗体及其制备方法。

背景技术

非解乳糖链球菌LZMYFGM9菌株(中国专利号No.201210141827.5中获得的菌株，该菌株的保藏编号为CGMCC No.4227)，在本文中称“非解乳糖链球菌FGM菌株”，是分离于鸡肠道并经含黄芪的培养驯化出的可发酵黄芪的1株乳酸菌菌株，其具有安全、多糖转化率高、可抑制大肠杆菌对机体的损伤、促进肠粘膜免疫等特性。研究表明，乳酸菌表面粘附蛋白及其外源性物质的介导作用，对改善动物肠道微生态环境，提高机体免疫力和增强抗病力，以及阐述中药有效成分的生物学作用机制具有重要意义。目前，尚未见对乳酸菌表面粘附蛋白EF-Tu的体外表达和特异性抗体的制备。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了非解乳糖链球菌表面粘附蛋白EF-Tu蛋白多克隆抗体及其制备方法。

本发明提供非解乳糖链球菌表面粘附蛋白EF-Tu基因序列，所述非解乳糖链球菌表面粘附蛋白EF-Tu基因序列为序列表中SEQ ID No.1。

本发明提供非解乳糖链球菌表面粘附蛋白EF-Tu蛋白的氨基酸序列，其为序列表中SEQ ID No.2。

本发明提供非解乳糖链球菌表面粘附蛋白EF-Tu原核表达蛋白，构建含有序列表中SEQ ID No.3所示核苷酸序列的重组表达载体，将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞获得原核表达蛋白。

本发明提供非解乳糖链球菌表面粘附蛋白EF-Tu蛋白多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)构建含有序列表中SEQ ID No.3所示核苷酸序列的重组表达载体，将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞获得重组蛋白抗原；

(2)将所述重组蛋白抗原免疫动物，经血清分离纯化获得非解乳糖链球菌表面粘附蛋白EF-Tu蛋白多克隆抗体。

优选地，所述重组表达载体是将序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列克隆至原核表达载体获得的。

优选地，所述原核表达载体为PET-B2M。

在本发明中，可以利用本领域常规适合于重组蛋白抗原的原核表达载体，优选的情况下，当所述原核表达载体为PET-B2M时，重组蛋白抗原的表达效果更好。

优选地，所述重组蛋白抗原的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2。

优选地，所述大肠杆菌感受态细胞为Rosetta(DE3)感受态细胞。

本发明对于所使用的大肠杆菌感受态细胞的种类没有特别的限制，只要能够适合重组表达载体在细胞中有效表达即可，优选的情况下，为了获得更好的表达效果，大肠杆菌感受态细胞为Rosetta(DE3)感受态细胞。

优选地，所述重组蛋白抗原免疫动物的具体步骤包括：将重组蛋白抗原乳化后免疫动物，一免3周后进行二免，间隔2周后进行三免，三免间隔2周后进行四免，四免间隔2周后进行五免，最多进行6次免疫提高抗血清效价。

免疫的动物包括但不限于新西兰白兔、小白鼠和大白鼠。

本发明还提供利用上述的制备方法制备得到的非解乳糖链球菌表面粘附蛋白EF-Tu蛋白多克隆抗体。所述多克隆抗体能够特异性的识别EF-Tu蛋白中的特异性氨基酸片段SEQ ID No.2，为EF-Tu蛋白的特异性抗体。

本发明通过LC-MS-MS技术确定FGM表面蛋白中参与细菌粘附定植的EF-Tu的存在，并利用FGM全基因序列，确定该蛋白的基因序列，进而利用了PCR方法克隆得到FGM菌EF-Tu蛋白中特异性DNA片段，构建重组表达载体。利用原核表达的EF-Tu重组蛋白免疫新西兰大白兔，获得特异性的多克隆抗体。利用本发明所提供的方法制备的多克隆抗体，能够特异性识别FGM菌EF-Tu蛋白，而不能识别FGM菌其他蛋白，在EF-Tu蛋白的检测和功能鉴定、研究中具有广泛用途。

因此，本发明的FGM菌株表面粘附蛋白EF-Tu基因序列、氨基酸序列、重组蛋白及其多克隆抗体具有创新性，推进益生菌及其蛋白在动物饲料添加剂中的应用，对我国抗生素减量行动有重要意义。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为经碱性LiCl处理后FGM菌株电镜分析结果。

图2为FGM表面蛋白及全蛋白SDS-PAGE电泳结果。

图3为质谱鉴定结果。

图4为疏水性分析。

图5为无序序列分析。

图6为抗原性分析。

图7为同源性分析。

图8为结构域分析。

图9为FGM菌株EF-Tu基因的扩增。

图10为阳性转化子PCR电泳分析图。

图11为EF-Tu蛋白纯化后的SDS-PAGE分析。

图12为抗血清效价曲线图。

图13为兔抗EF-Tu蛋白得多克隆抗体纯化分析图。

图14为重组蛋白Western blot鉴定结果。

图15为FGM表面蛋白EF-Tu的鉴定结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1

1方法

1.1FGM菌株

非解乳糖链球菌LZMYFGM9菌株(中国专利号No.201210141827.5中获得的菌株，该菌株的保藏编号为CGMCC No.4227)，在本文中称“非解乳糖链球菌FGM菌株”，GenBank登录号JX435470，由中国农科院兰州畜牧与兽药研究所中兽医室保存。

1.2FGM菌的复苏与传代

取-80℃含有小磁珠的FGM菌株冻存管(含细菌液1mL)，放置37℃水浴锅中快速解冻，在无菌操作台内将解冻的细菌接入50mLMRS肉汤培养基中(接菌量为2％)，置于恒温振荡培养箱37℃、100r/min培养24h，即F1代FGM；取F1代FGM细菌菌液并按2％的接种量，同样培养条件下连续传代至第四代，即F2-F4代FGM。

1.3FGM表面蛋白的提取

取第4代FGM菌液以2％接种到MRS培养基中，37℃培养48h后，取1LFGM菌液4750r/min在4℃下离心10min收集菌体；收集的菌体用无菌预冷(4℃)的PBS缓冲溶液(pH7.4)洗涤两次，离心收集菌体，每0.1g湿菌加入0.5mL 5mol/L碱性LiCl(pH＝10.0)后，冰水混合液中作用15min，4℃下10000r/min离心10min收集上清，上清液用自来水充分透析48h(透析袋截留分子量7000KD)。收集菌体表面蛋白，4℃下进行蛋白浓缩，BCA试剂盒测定蛋白浓度，保存于-20℃；脱离表面蛋白后的FGM菌体制作切片，进行电镜观察。

1.4FGM全蛋白的提取方法

取第4代FGM菌液以2％接种到MRS培养基中，37℃培养48h后，取40mL菌液4750r/min在4℃下离心10min收集菌体；加入20mL PBS缓冲液重悬，超声波间隔破碎(功率为900W，间隔9.9s)1h，10000r/min离心10min收集上清，BCA试剂盒测定蛋白浓度，保存于-20℃。

1.5菌体及表面蛋白的SDS-PAGE分析

取5μL marker、15μL FGM表面蛋白和20μLFGM全蛋白，12％的预制分离胶放置至室温10min。将自带电泳液装入电泳槽，浸没分离胶胶块，150v 1h。用考马斯亮蓝染色液，震荡染色1-2h，再用考马斯亮蓝脱色液震荡脱色4h，切取蛋白条带。

1.6蛋白条带的LC-MS-MS分析

采用以下方法对蛋白条带进行处理和酶解，使用LC-MS-MS(nanoLC-OE)对酶解后的样品进行分析，最后使用MASCOT等质谱匹配软件对LC-MS-MS数据进行分析，获得目标蛋白质多肽分子的定性鉴定信息。质谱鉴定的前操作步骤如下：

1)供试品酶解：供试品经过还原和烷基化处理后，加入Trypsin(质量比1:50)，在37℃条件下酶解20小时。酶解产物脱盐后冻干，复溶于重量百分比0.1％FA溶液中，-20℃保存待用。

2)质谱分析：A液为重量百分比0.1％甲酸的水溶液，B液为重量百分比0.1％甲酸的乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱以95％的A液平衡后，样品由自动进样器上样至Trap柱。

3)质谱数据采集：多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描(full scan)后采集20个碎片图谱(MS2 scan)。

4)数据分析：质谱测试原始文件(raw file)用Mascot2.2软件检索相应的数据库，最后得到鉴定的蛋白质结果。

1.7目的蛋白多克隆抗体的制备

1.7.1FGM基因组DNA的提取

DNA提取参考革兰氏阳性菌DNA提取试剂盒手册(杭州新捷生物技术有限公司)。

1.7.2EF-Tu基因的扩增

(1)引物设计

pET-R：GCGAAATTAATACGACTCAC；T7T-3：TCAAGACCCGTTTAGAGG。

(2)PCR反应体系

以提取的FGM基因组DNA为模板进行扩增。PCR反应体系如表1所示。

表1PCR反应体系

(3)PCR扩增条件

反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，56.7℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物冷藏备用。

1.7.3EF-Tu在大肠杆菌中的表达

37℃水浴酶切4h，电泳(1％凝胶)检测目的条带，并对酶切产物进行清洗回收，纯化后使用天根生化的DNA回收试剂盒中的限制性内切酶进行酶切，然后连接至PET-B2M载体扩增(测序验证)，转化至感受态细胞Rosetta(DE3)感受态细胞中，抽提重组质粒并筛选阳性转化子(测序验证)，诱导表达重组目的蛋白，并采用Western Blot法鉴定；利用抗His标签抗体检测发现含His标签的粘附性蛋白，经镍胶亲和层析法纯化后，并采用SDS-PAGE电泳法鉴定。

其中，感受态转化及阳性克隆筛选的具体方法为：

(1)、从超低温冰箱中取出Rosetta(DE3)感受态细胞，置于冰上融化；

(2)、加入质粒(5μg)，轻轻吹吸充分混匀，冰上放置30min；

(3)、水浴锅42℃热击90s，冰上放置1-2min；

(4)、加入800μL预热LB液体培养基，37℃158rpm培养50-60min；

(5)、6000rpm离心4min，去部分上清(650μL体积)，剩余菌液(150μL体积)重悬混匀后涂至卡那抗性LB平板上；

(6)、倒置平板，37℃培养12～16h可见出现单菌落(阳性克隆)。

其中，阳性克隆表达与鉴定的方法：

(1)、挑选含重组质粒的单菌落至5mL LB液体培养基(卡那抗性)中，37℃培养过夜后-20℃保种；

(2)、再挑选含重组质粒的单菌落至5mL LB液体培养基(卡那抗性)中，37℃震荡培养至OD₆₀₀约0.6；

(3)、取部分菌液作为对照组，余下菌液加入IPTG诱导剂(终浓度1mM)，37℃震荡培养4h；

(4)、分别取两组菌液0.15mL，12000×g离心2min，菌体沉淀以40μL 1×loadingbuffer重悬裂解，取10μl，SDS-PAGE检测。

其中，使用镍胶亲和层析法纯化条件为：

(1)、上清蛋白溶液用0.22μm过滤器过滤备用；

(2)、准备Ni-NTA柱；

(3)、以1mL/min的流速上样上清蛋白溶液；

(4)、以NTA-0缓冲液(pH8.0)洗柱至流出液不含蛋白(G250检测液不变色)；

(5)、分别以20mM、60mM、200mM和500mM咪唑洗脱，分段收集洗脱液至G250检测液不变色；

(6)、以3倍柱体积去离子水洗涤柱料，以20％乙醇封柱；

(7)、对收集的洗脱液透析浓缩，取10μl进行SDS-PAGE电泳检测。

1.7.4目的蛋白兔抗多克隆抗体的制备

抗原乳化后免疫新西兰白兔2只，免疫方式为：背部皮内多点注射进行免疫。一免3周后进行二免，间隔2周后进行三免，三免间隔2周后进行四免，四免间隔2周后进行五免。五免后第七天，耳缘静脉取血测抗体效价，免疫期间分别取血清WB检测阳性组织裂解液。采用ProteinA/G亲和纯化抗体，采用WB检测重组蛋白或者阳性组织裂解液。

2结果

2.1FGM表面及全蛋白的提取及蛋白浓度测定

依照BCA蛋白浓度测定试剂盒中说明进行操作，绘制标准曲线，测定提取的FGM表面蛋白及全蛋白的浓度分别为1.10mg/mL，49.94mg/mL。

表2提取蛋白的浓度测定结果

2.2经碱性LiCl处理后FGM菌株的电镜观察

取碱性LiCl处理后FGM菌液，观察表面形态的变化。

图1为经碱性LiCl处理后FGM菌株电镜分析结果。

如图1所示，5M LiCl溶液的作用，可使FMG菌株表面蛋白从菌体脱落下来，菌体的基本形态并未遭到破环。

2.3FGM表面蛋白及全蛋白的SDS-PAGE分析

图2为FGM表面蛋白及全蛋白SDS-PAGE电泳结果。其中，泳道1为蛋白Marker；泳道2为酸性LiCl提取的蛋白样本；泳道3为碱性LiCl提取的蛋白样本；泳道4为中性LiCl提取的蛋白样本；泳道5为全蛋白样本。

如图2所示，在12％分离胶、20微升上样量的条件下，碱性LiCl条件下提取的FGM表面蛋白样本的凝胶电泳在75-65KD、63-48KD、48-35KD、25-17KD、11KD出现清晰条带，且与该菌株全蛋白样本中的条带一致。将条带送至上海中科新生命生物科技有限公司进行质谱分析(MALDI-TOF-TOF)。

2.4FGM表面蛋白的质谱鉴定结果

将割取的碱性氯化锂法提取的FGM表面蛋白条带进行质谱鉴定结果如图3所示。将3个平行样本的质谱测试原始文件(raw file)用Mascot2.2软件检索相应的数据库，确定FGM表面蛋白条带类型。结果如表3所示，其中包括Elongation factor Tu(简称EF-Tu，分子量约为43KD)、50S核糖体蛋白(分子量约为15KD)、伴侣蛋白(分子量约为60KD)及一些中间代谢产物等。但通过在NCBI数据库中搜索发现，分子量在17-11KD左右的蛋白条带中多数为转运功能的蛋白和中间代谢产物，其中以核糖体蛋白占多数，这些蛋白质经常在细菌表面存在。

图3为质谱鉴定结果。

表3FGM菌株表面蛋白的鉴定

通过参阅大量文献发现，延伸因子EF-Tu是一种保守度很高的蛋白质，广泛存在于原核生物中，是细菌在翻译、表达过程中的重要蛋白因子，参与细胞的信号传导、转录翻译、细胞凋亡以及细胞骨架组成等。同时值得注意的是，EF-Tu还与细菌的粘附性有关。因此，本申请人进一步分析了菌株FGM全基因组测序数据，发现该菌的全基因组基因、蛋白注释文件中也有EF-Tu基因、蛋白氨基酸序列及功能的注释，在Uniprot数据库进行比对后显示FGM表面蛋白EF-Tu与Streptococcus gallolyticus subsp.gallolyticus TX20005(登录号为A0A0E1XE74)的EF-Tu蛋白具有99.7％同源性，分子量为43.952KDa，等电点5.41。生物学功能为GTP binding、GTPase activity。

2.5FGM表面蛋白EF-Tu的基因序列

atggcaaaagaaaaatacgatcgtagtaaaccacacgttaacattggtacaatcggacacgttgaccatggtaaaactactttgacagctgcaattacaacagttcttgctcgtcgtcttccaagcgcagttaaccaaccaaaagactacgcttctatcgatgctgctcctgaagaacgcgaacgcggtatcacaatcaacactgcacacgttgagtacgaaactgctaaacgtcactacgctcacatcgacgctccaggacacgcggactacgttaaaaacatgatcactggtgctgcccaaatggatggtgctatccttgtagtagcttcaactgacggtccaatgccacaaacacgtgaacacatccttctttcacgtcaagtaggtgttaaataccttatcgtcttcatgaacaaaatcgaccttgttgatgacgaagaattgcttgaattggttgaaatggaaatccgtgaccttctttcagaatacgacttcccaggtgacgatcttccagttatccaaggttcagctcttaaagcccttgaaggtgacactcactacgaagacatcatcatggaattgatggacactgttgatgaatacattccagaaccagaacgtgatactgacaaaccattgcttcttccagtcgaagacgtattctcaatcactggtcgtggtactgtagcatcaggacgtatcgaccgtggtactgttaaagtcaacgacgaagttgaaatcgttggtatccgtgacgacatccaaaaagctgttgttactggtgttgaaatgttccgtaaacaacttgatgaaggtcttgcaggggacaacgttggtgtgcttcttcgtggtatccaacgtgatgaaatcgaacgtggtcaagttcttgctaaaccaggttcaatccacccacacactaaattcaaaggtgaagtttacatccttactaaagaagaaggtggacgtcacactccattcttcaacaactaccgtcctcaattctacttccgtacaactgacgttacaggttcaatcgaacttccagcaggtactgaaatggtaatgcctggtgataacgtaactatcgacgttgaattgattcacccaatcgccgttgaacaaggtactacattctcaatccgtgaaggtggacgtactgttggttcaggtatcgtttcagaaatcgaagcttaa，共计1197个bp。

2.6FGM表面蛋白EF-Tu的氨基酸序列

MAKEKYDRSKPHVNIGTIGHVDHGKTTLTAAITTVLARRLPSAVNQPKDYASIDAAPEERERGITINTAHVEYETAKRHYAHIDAPGHADYVKNMITGAAQMDGAILVVASTDGPMPQTREHILLSRQVGVKYLIVFMNKIDLVDDEELLELVEMEIRDLLSEYDFPGDDLPVIQGSALKALEGDTHYEDIIMELMDTVDEYIPEPERDTDKPLLLPVEDVFSITGRGTVASGRIDRGTVKVNDEVEIVGIRDDIQKAVVTGVEMFRKQLDEGLAGDNVGVLLRGIQRDEIERGQVLAKPGSIHPHTKFKGEVYILTKEEGGRHTPFFNNYRPQFYFRTTDVTGSIELPAGTEMVMPGDNVTIDVELIHPIAVEQGTTFSIREGGRTVGSGIVSEIEA，分子量为43.952KDa。

2.7EF-Tu蛋白的理化特性及结构分析

作为重组蛋白表达来看，该基因编码398个氨基酸，无跨膜区，无信号肽序列，局部亲水性较好，可进行全长表达；作为免疫原来看，全长蛋白抗原指数得分也适中，所以理论上是可以引起较好的免疫；从同源性分析及抗体制备要求来看，该蛋白在同物种中保守性较好，同物种的其他蛋白主要集中在1-120aa，与兔子同源性很低，理论上具有很高的免疫原性；综上所述，采用目的基因片段，构建大肠表达载体，进行重组蛋白的制备。

图4为疏水性分析。

图5为无序序列分析。

图6为抗原性分析。

图7为同源性分析。

图8为结构域分析。

2.8FGM表面蛋白EF-TU多克隆抗体的制备

2.8.1FGM表面蛋白EF-Tu基因的扩增

用FGM表面蛋白EF-Tu引物，以FGM基因组为母版，扩增EF-Tu基因，扩增片段的电泳检测图如图9所示(箭头所指处为扩增片段的大小)。

图9为FGM菌株EF-Tu基因的扩增。

2.8.2载体与目的基因的酶切

表4载体与目的基因的酶切

37℃1-2h；酶切产物电泳检测以及回收，步骤参照DNA回收试剂盒说明书。

2.8.3载体与目的基因的连接

表5载体与目的基因的连接

16℃，0.5-1h。

2.8.4菌落PCR验证

连接质粒转化至感受态细胞Rosetta(DE3)并将其加至LB琼脂培养基上。待平板上长出菌落，随机挑取若干个，进行菌落PCR验证，检测转化子。采用质粒提取试剂盒提取阳性克隆，并送武汉金开瑞生物工程有限公司测序平台测序验证，确定获得的基因片段与目的基因EF-Tu为100％吻合。菌落PCR电泳检测图如图10所示(箭头所指处为基因片段的大小)。

图10为阳性转化子PCR电泳分析图。

测序获得的基因片段的核苷酸序列如下：

2.8.5纯化EF-Tu蛋白SDS-PAGE分析

FGM表面蛋白EF-Tu蛋白经镍胶亲和层析纯化后，得到纯化的EF-Tu蛋白，测定蛋白浓度为3mg/mL。SDS-PAGE分析显示，EF-Tu的特异性条带位于43kDa标准蛋白附近(图11中与理论分子量相差约18kDa，是由于目的条带上含标签蛋白)，纯度为90％。抗His-tag标签抗体和EF-Tu抗体检查显示目的蛋白被成功表达。

图11为EF-Tu蛋白纯化后的SDS-PAGE分析。其中，M.Marker分子量为116、66.2、45、35、25、18.4、14.5kDa(5μL，0.1mg/mL)；泳道1.纯化抗原(10倍稀释)。

2.9纯化EF-Tu蛋白多克隆抗体的制备及重组蛋白Westernblot鉴定

如图12所示，按OD抗血清/OD免疫前≥2.1的条件，确定以EF-Tu蛋白免疫的两只兔子的血清效价分别为64k、128k，选择效价更高的兔血清进行抗体纯化，制备抗体19mg，测得纯化后的抗体浓度为10mg/mL，纯度为95％。兔抗蛋白多克隆抗体制备后，Western-blot分析法被用于检测目的蛋白EF-Tu蛋白，如图14所示在约61kDa处有特异性识别，条带单一，信号强烈，表面目的蛋白被检测到，说明EF-Tu蛋白的抗体制备成功。

图12为两只新西兰白兔的抗血清效价曲线图。

图13为兔抗EF-Tu蛋白得多克隆抗体纯化分析图。其中，M.Marker分子量为116、66.2、45、35、25、18.4、14.5kDa(5μL，0.1mg/mL)；泳道1.纯化抗体(4倍稀释)。

图14为重组蛋白Western blot鉴定结果。其中，Marker的分子量依次为180、130、95、72、55、43、34、26、17kDa，泳道1为重组蛋白10ng，免前血孵育；泳道2为重组蛋白25ng，抗血清1孵育；泳道3为重组蛋白25ng，抗血清2孵育；二抗为羊抗兔IgG(H&L)-HRP(1:10000)。

3FGM菌株EF-Tu蛋白的验证

采用兔抗EF-Tu蛋白多克隆抗体检测FGM表面蛋白中EF-Tu的表达。如图15所示，FGM表面蛋白和全蛋白中存在EF-Tu蛋白，蛋白条带的分子量与目标蛋白基本一致(分子量为45KDa)。

图15为FGM表面蛋白EF-Tu的鉴定结果。其中，泳道1、5为蛋白Marker；泳道2、泳道3为FGM表面蛋白；泳道4为FGM全蛋白样本。

由图15可知：本发明所制备的多克隆抗体，能够识别FGM菌株中的EF-Tu蛋白，而且能够特异性地与FGM菌株EF-Tu蛋白结合(泳道3和4均仅有一条单一清晰的杂交条带)。

上述实验结果表明：制备的FGM菌株EF-Tu蛋白多克隆抗体能够识别FGM菌株中的EF-Tu蛋白，能够检测EF-Tu蛋白，而不与菌株中的其他蛋白发生作用。该多克隆抗体，可以作为EF-Tu蛋白检测试剂，对EF-Tu蛋白的功能鉴定具有重要的意义。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所

<120> 非解乳糖链球菌表面粘附蛋白EF-Tu基因、氨基酸序列、原核表达蛋白和多克隆抗体

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1197

<212> DNA

<213> 非解乳糖链球菌表面粘附蛋白EF-Tu(Streptococcus alactolyticus Surfaceadhesive protein EF-Tu)

<400> 1

atggcaaaag aaaaatacga tcgtagtaaa ccacacgtta acattggtac aatcggacac 60

gttgaccatg gtaaaactac tttgacagct gcaattacaa cagttcttgc tcgtcgtctt 120

ccaagcgcag ttaaccaacc aaaagactac gcttctatcg atgctgctcc tgaagaacgc 180

gaacgcggta tcacaatcaa cactgcacac gttgagtacg aaactgctaa acgtcactac 240

gctcacatcg acgctccagg acacgcggac tacgttaaaa acatgatcac tggtgctgcc 300

caaatggatg gtgctatcct tgtagtagct tcaactgacg gtccaatgcc acaaacacgt 360

gaacacatcc ttctttcacg tcaagtaggt gttaaatacc ttatcgtctt catgaacaaa 420

atcgaccttg ttgatgacga agaattgctt gaattggttg aaatggaaat ccgtgacctt 480

ctttcagaat acgacttccc aggtgacgat cttccagtta tccaaggttc agctcttaaa 540

gcccttgaag gtgacactca ctacgaagac atcatcatgg aattgatgga cactgttgat 600

gaatacattc cagaaccaga acgtgatact gacaaaccat tgcttcttcc agtcgaagac 660

gtattctcaa tcactggtcg tggtactgta gcatcaggac gtatcgaccg tggtactgtt 720

aaagtcaacg acgaagttga aatcgttggt atccgtgacg acatccaaaa agctgttgtt 780

actggtgttg aaatgttccg taaacaactt gatgaaggtc ttgcagggga caacgttggt 840

gtgcttcttc gtggtatcca acgtgatgaa atcgaacgtg gtcaagttct tgctaaacca 900

ggttcaatcc acccacacac taaattcaaa ggtgaagttt acatccttac taaagaagaa 960

ggtggacgtc acactccatt cttcaacaac taccgtcctc aattctactt ccgtacaact 1020

gacgttacag gttcaatcga acttccagca ggtactgaaa tggtaatgcc tggtgataac 1080

gtaactatcg acgttgaatt gattcaccca atcgccgttg aacaaggtac tacattctca 1140

atccgtgaag gtggacgtac tgttggttca ggtatcgttt cagaaatcga agcttaa 1197

<210> 2

<211> 398

<212> PRT

<400> 2

Met Ala Lys Glu Lys Tyr Asp Arg Ser Lys Pro His Val Asn Ile Gly

1 5 10 15

Thr Ile Gly His Val Asp His Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Ala Ile

20 25 30

Thr Thr Val Leu Ala Arg Arg Leu Pro Ser Ala Val Asn Gln Pro Lys

35 40 45

Asp Tyr Ala Ser Ile Asp Ala Ala Pro Glu Glu Arg Glu Arg Gly Ile

50 55 60

Thr Ile Asn Thr Ala His Val Glu Tyr Glu Thr Ala Lys Arg His Tyr

65 70 75 80

Ala His Ile Asp Ala Pro Gly His Ala Asp Tyr Val Lys Asn Met Ile

85 90 95

Thr Gly Ala Ala Gln Met Asp Gly Ala Ile Leu Val Val Ala Ser Thr

100 105 110

Asp Gly Pro Met Pro Gln Thr Arg Glu His Ile Leu Leu Ser Arg Gln

115 120 125

Val Gly Val Lys Tyr Leu Ile Val Phe Met Asn Lys Ile Asp Leu Val

130 135 140

Asp Asp Glu Glu Leu Leu Glu Leu Val Glu Met Glu Ile Arg Asp Leu

145 150 155 160

Leu Ser Glu Tyr Asp Phe Pro Gly Asp Asp Leu Pro Val Ile Gln Gly

165 170 175

Ser Ala Leu Lys Ala Leu Glu Gly Asp Thr His Tyr Glu Asp Ile Ile

180 185 190

Met Glu Leu Met Asp Thr Val Asp Glu Tyr Ile Pro Glu Pro Glu Arg

195 200 205

Asp Thr Asp Lys Pro Leu Leu Leu Pro Val Glu Asp Val Phe Ser Ile

210 215 220

Thr Gly Arg Gly Thr Val Ala Ser Gly Arg Ile Asp Arg Gly Thr Val

225 230 235 240

Lys Val Asn Asp Glu Val Glu Ile Val Gly Ile Arg Asp Asp Ile Gln

245 250 255

Lys Ala Val Val Thr Gly Val Glu Met Phe Arg Lys Gln Leu Asp Glu

260 265 270

Gly Leu Ala Gly Asp Asn Val Gly Val Leu Leu Arg Gly Ile Gln Arg

275 280 285

Asp Glu Ile Glu Arg Gly Gln Val Leu Ala Lys Pro Gly Ser Ile His

290 295 300

Pro His Thr Lys Phe Lys Gly Glu Val Tyr Ile Leu Thr Lys Glu Glu

305 310 315 320

Gly Gly Arg His Thr Pro Phe Phe Asn Asn Tyr Arg Pro Gln Phe Tyr

325 330 335

Phe Arg Thr Thr Asp Val Thr Gly Ser Ile Glu Leu Pro Ala Gly Thr

340 345 350

Glu Met Val Met Pro Gly Asp Asn Val Thr Ile Asp Val Glu Leu Ile

355 360 365

His Pro Ile Ala Val Glu Gln Gly Thr Thr Phe Ser Ile Arg Glu Gly

370 375 380

Gly Arg Thr Val Gly Ser Gly Ile Val Ser Glu Ile Glu Ala

385 390 395

<210> 3

<211> 1197

<212> DNA

<400> 3

atggcaaaag aaaaatacga tcgtagtaaa ccacacgtta acattggtac aatcggacac 60

gttgaccatg gtaaaactac tttgacagct gcaattacaa cagttcttgc tcgtcgtctt 120

ccaagcgcag ttaaccaacc aaaagactac gcttctatcg atgctgctcc tgaagaacgc 180

gaacgcggta tcacaatcaa cactgcacac gttgagtacg aaactgctaa acgtcactac 240

gctcacatcg acgctccagg acacgcggac tacgttaaaa acatgatcac tggtgctgcc 300

caaatggatg gtgctatcct tgtagtagct tcaactgacg gtccaatgcc acaaacacgt 360

gaacacatcc ttctttcacg tcaagtaggt gttaaatacc ttatcgtctt catgaacaaa 420

atcgaccttg ttgatgacga agaattgctt gaattggttg aaatggaaat ccgtgacctt 480

ctttcagaat acgacttccc aggtgacgat cttccagtta tccaaggttc agctcttaaa 540

gcccttgaag gtgacactca ctacgaagac atcatcatgg aattgatgga cactgttgat 600

gaatacattc cagaaccaga acgtgatact gacaaaccat tgcttcttcc agtcgaagac 660

gtattctcaa tcactggtcg tggtactgta gcatcaggac gtatcgaccg tggtactgtt 720

aaagtcaacg acgaagttga aatcgttggt atccgtgacg acatccaaaa agctgttgtt 780

actggtgttg aaatgttccg taaacaactt gatgaaggtc ttgcagggga caacgttggt 840

gtgcttcttc gtggtatcca acgtgatgaa atcgaacgtg gtcaagttct tgctaaacca 900

ggttcaatcc acccacacac taaattcaaa ggtgaagttt acatccttac taaagaagaa 960

ggtggacgtc acactccatt cttcaacaac taccgtcctc aattctactt ccgtacaact 1020

gacgttacag gttcaatcga acttccagca ggtactgaaa tggtaatgcc tggtgataac 1080

gtaactatcg acgttgaatt gattcaccca atcgccgttg aacaaggtac tacattctca 1140

atccgtgaag gtggacgtac tgttggttca ggtatcgttt cagaaatcga agcttaa 1197

Claims

1.非解乳糖链球菌表面粘附蛋白EF-Tu基因序列，其特征在于：所述非解乳糖链球菌表面粘附蛋白EF-Tu基因序列为序列表中SEQ ID No.1。

2.非解乳糖链球菌表面粘附蛋白EF-Tu蛋白的氨基酸序列，其特征在于：所述氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2。

3.非解乳糖链球菌表面粘附蛋白EF-Tu原核表达蛋白，其特征在于：构建含有序列表中SEQ ID No.3所示核苷酸序列的重组表达载体，将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞获得原核表达蛋白。

4.非解乳糖链球菌表面粘附蛋白EF-Tu蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述重组表达载体是将序列表中SEQID No.3所示的核苷酸序列克隆至原核表达载体获得的。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述重组蛋白抗原的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述大肠杆菌感受态细胞为Rosetta(DE3)感受态细胞。

8.根据权利要求4-7任一项所述的制备方法，其特征在于：所述重组蛋白抗原免疫动物的具体步骤包括：将重组蛋白抗原乳化后免疫动物，一免3周后进行二免，间隔2周后进行三免，三免间隔2周后进行四免，四免间隔2周后进行五免，最多进行6次免疫提高抗血清效价。

9.利用权利要求4-8任一项所述的制备方法制备得到的非解乳糖链球菌表面粘附蛋白EF-Tu蛋白多克隆抗体。