KR101928898B1 - 변형된 초유 단백질 및 그 어플리케이션 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 SEQ ID NO.: 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 변형된 초유 단백질을 개시하고 있고, 이것은 SEQ ID NO.: 2로 나타낸 야생형 초유 단백질의 아미노산 서열에 존재하는 위치 33에서의 Ile, 위치 101에서의 Glu 및 위치 175에서의 Arg를 각각 Ala, Cys 및 Cys로 대체함으로써 생성된다.
Description
본 발명은 초유 단백질에 관한 것이고, 보다 구체적으로 변형된 초유 단백질에 관한 것이다.
축산업은 농업 생산에 중요한 역할을 하고, 그 점에서 열화한 돼지 번식의 주원인은 돼지의 높은 사망률과 관련되어 있다. 일반적으로, 절대 병원체가 돼지의 질병의 주원인이고, 그 점에서 높은 사망률의 질병이 대부분 돼지 질병으로 구성되어 있다고 믿어진다. 그러나, 중싱 국립 대학에서 수의과 병리 생물학 대학원에서 행해진 혈청 검사 결과에 의해서 절대 병원체 질병, 예를 들면 돼지 콜레라 또는 돼지의 거짓 광견병의 발병이 나타나지 않았다. 상대적으로 저병원성(예를 들면, 마이코플라스마, 스투렐라 및 살모넬라)을 가진 병원체 중에서 단일 타입의 병원체로 감염되어 야기되는 돼지의 몇몇 질병은 심각하지 않다. 그러나, 낮은 면역력을 가진 돼지가 상대적으로 저병원성을 가진 복합 병원체에 의해 1차 및 2차적으로 감염될 경우, 질환의 상승적인 효과가 돼지 사망을 야기할 것이다. 따라서, 저병원성을 가진 병원체는 적은 수의 돼지를 가진 돼지군에 상당한 영향을 준다.
초유는 출생 후 첫 2-3일 내에 암컷의 포유류에 의해 분비되는 우유의 한 형태이고, 초유 분비 후에 분비되는 우유는 이행유 및 영구유이다.
초유는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM인 5종의 면역 글로불린을 함유하고, 상기 IgG 함량이 가장 높다. 이들 면역 글로불린은 바이러스 감염, 박테리아 감염, 기생충 및 효모를 막는데 중요하다.
그러나, 초유의 이로운 성분은 초유로부터 정제되고 이용되는 락토페린을 제외하고 거의 효과적으로 분리되지 않고 사용되지 않아서 형질 전환 동물 내에서 배양된다. 또한, 단기간의 초유 분비, 초유의 불안정 단백질, 및 초유를 수집하고 보존하는 어려움과 같은 요인으로 인해, 초유의 이점이 많이 있더라도 초유의 실제적인 어플리케이션에 아직 다수의 문제점이 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 생체 내 개선된 안정성을 가진 변형된 초유 단백질을 제공하는 것이고, 이것은 동물(예를 들면, 돼지)의 사망률을 감소시킬 수 있다.
선행 기술의 문제점을 해결하기 위해, 본 발명에 의해 채택된 기술적 수단은 변형된 초유 단백질을 제공하는 것이고, 이것은 SEQ ID NO.: 2로 나타낸 야생형 초유 단백질의 아미노산 서열에 존재하는 위치 33에서의 Ile, 위치 101에서의 Glu 및 위치 175에서의 Arg를 각각 Ala, Cys 및 Cys로 대체함으로써 생성된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상술한 변형된 초유 단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA를 제공하고, 상기 DNA는 SEQ ID NO.: 3으로 나타낸 염기 서열을 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 돼지 번식 호흡 장애 증후군(PRRS), 구제역(FMD), 돼지 유행성 설사(PED) 또는 조류 인플루엔자를 예방 또는 치료하기 위한 상술한 변형된 초유 단백질을 포함하는 경구 투여용 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상술한 변형된 초유 단백질을 포함하는 동물 사료 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 동물 사료 조성물을 제공하고, 상기 변형된 초유 단백질은 0.01 중량%~0.02 중량% 범위의 양으로 동물 사료 조성물 내에 존재한다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 약물 캐리어와 백신 보조제 및 상술한 변형된 초유 단백질을 포함하는 돼지 번식 호흡 장애 증후군(PRRS), 구제역(FMD), 돼지 유행성 설사(PED) 또는 조류 인플루엔자를 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 동물의 면역 반응을 향상시키기 위해 사료의 조제에 상술한 변형된 초유 단백질을 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 동물의 면역 반응은 상술한 방법에서 동물의 면역 글로불린 A(IgA)의 생성을 증가시킴으로써 향상된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 동물에 투여되도록 사료의 조제에 상술한 변형된 초유 단백질을 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 동물에 투여되도록 약학 조성물의 조제에 상술한 변형된 초유 단백질을 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 점막성 면역 반응을 야기할 수 있는 질병을 예방하거나 치료하기 위해 사료의 조제에 상술한 변형된 초유 단백질을 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상술한 방법의 질병은 돼지 번식 호흡 장애 증후군(PRRS), 구제역(FMD), 돼지 유행성 설사(PED) 또는 조류 인플루엔자이다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 점막성 면역 반응을 야기할 수 있는 질병을 예방하거나 치료하기 위해 사료의 조제에 상술한 변형된 초유 단백질을 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상술한 방법의 질병은 돼지 번식 호흡 장애 증후군(PRRS), 구제역(FMD), 돼지 유행성 설사(PED) 또는 조류 인플루엔자이다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 점막성 면역 반응을 야기할 수 있는 질병을 예방하거나 치료하기 위해 사료의 조제에 상술한 변형된 초유 단백질을 사용하는 방법을 제공한다.
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본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상술한 방법의 질병은 구제역(FMD), 돼지 유행성 설사(PED), 조류 인플루엔자 또는 인간 인플루엔자이다.
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본 발명의 기술을 사용하여, 본 발명의 변형된 초유 단백질의 3차 구조가 야생형 초유 단백질의 것에 비해 보다 안정하다. 또한, 변형된 초유 단백질과 사료의 혼합물을 돼지에게 공급한 후에 돼지의 면역 글로불린 IgA의 생성을 증가시킬 수 있으므로, 특정 병원체로 돼지의 감염을 더 예방할 수 있다.
도 1은 박테리아 막과 관련된 분리된 초유 단백질을 나타낸다.
도 2는 PGRP를 함유하는 돼지로부터의 초유 혈청을 나타낸다.
도 3은 효모 발현 시스템으로 발현된 돼지의 병리학적 인식 단백질을 도시한다.
도 4는 본 발명의 일 실시형태에 의해 변형된 초유 단백질 및 배양 배지에 50 ㎍/㎖ 사이클로헥시미드를 첨가함으로써 처리되는 야생형 초유 단백질을 도시하는 선 그래프를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시형태에 의해 변형된 초유 단백질의 단백질 발현 분석법의 결과를 나타낸다.
도 6은 대장균과 혼합되어 있는 본 발명의 일 실시형태에 의해 변형된 초유 단백질의 전자 현미경 관찰을 나타낸다.
도 7은 본 발명에 의해 변형된 초유 단백질이 위관 영양법에 의해 마우스에 투여된 후 마우스의 박테리아 개체군을 도시하는 선 그래프이다.
도 8은 변형된 초유 단백질이 마우스에 투여된 후 마우스 소화관의 면역 조직화학적 착색을 도시한다.
도 2는 PGRP를 함유하는 돼지로부터의 초유 혈청을 나타낸다.
도 3은 효모 발현 시스템으로 발현된 돼지의 병리학적 인식 단백질을 도시한다.
도 4는 본 발명의 일 실시형태에 의해 변형된 초유 단백질 및 배양 배지에 50 ㎍/㎖ 사이클로헥시미드를 첨가함으로써 처리되는 야생형 초유 단백질을 도시하는 선 그래프를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시형태에 의해 변형된 초유 단백질의 단백질 발현 분석법의 결과를 나타낸다.
도 6은 대장균과 혼합되어 있는 본 발명의 일 실시형태에 의해 변형된 초유 단백질의 전자 현미경 관찰을 나타낸다.
도 7은 본 발명에 의해 변형된 초유 단백질이 위관 영양법에 의해 마우스에 투여된 후 마우스의 박테리아 개체군을 도시하는 선 그래프이다.
도 8은 변형된 초유 단백질이 마우스에 투여된 후 마우스 소화관의 면역 조직화학적 착색을 도시한다.
본 발명의 바람직한 실시형태는 도 1~도 8을 참조하여 후술된다. 설명은 바람직한 실시형태의 설명일 뿐이고, 본 발명의 구현을 제한하지 않는다.
본 발명의 일 실시형태에 의해서, 변형된 초유 단백질은 SEQ ID NO.: 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖고, 이것은 SEQ ID NO.: 2로 나타낸 야생형 초유 단백질의 아미노산 서열에 존재하는 위치 33에서의 Ile, 위치 101에서의 Glu 및 위치 175에서의 Arg를 각각 Ala, Cys 및 Cys로 대체함으로써 생성된다. 변형된 초유 단백질의 아미노 서열은 SEQ ID NO.: 3으로 나타낸 염기 서열을 갖는 DNA에 의해 인코딩된다.
구체적으로, 본 발명의 변형된 초유 단백질은 박테리아 세포벽 내에 펩티도글리칸층과 관련된 단백질을 정제하고 그 염기 서열을 변형시킴으로써 얻어지고, 변형된 초유 단백질은 그 특징 후에 병리학적 인식 단백질(PRP)이라 명명된다.
또한, 변형된 초유 단백질은 경구 투여형, 예를 들면 고체 경구 투여형, 반고체 경구 투여형, 또는 액체 경구 투여형으로 조제될 수 있다. 구체적으로, 고체 경구 투여형은 정제, 다입자체, 분말, 또는 캡슐일 수 있다.
또한, 동물 사료 조성물은 본 발명의 변형된 초유 단백질을 동물 사료와 혼합함으로써 제조될 수 있고, 그 점에서 동물 사료 조성물은 0.01 중량%~0.02 중량%의 변형된 초유 단백질을 포함한다. 물론, 본 발명은 이것에 제한되지 않는다. 다른 실시형태에 있어서, 동물 사료 조성물의 변형된 초유 단백질의 백분율은 상이한 상황에 따라 달라질 수 있다.
또한, 본 발명의 변형된 초유 단백질은 동물의 면역 반응을 향상시키기 위해 사료의 조제에 어플리케이션될 수 있고, 그 점에서 동물의 면역 반응은 동물의 면역 글로불린 A(IgA)의 생성을 증가시킴으로써 향상된다. 구체적으로, 동물은 포유류, 예를 들면 돼지 또는 소일 수 있다.
또한, 본 발명의 변형된 초유 단백질은 동물에 투여되도록 약학 조성물의 조제에 어플리케이션될 수 있고, 그 점에서 약학 조성물은 질병 예방용 약물, 약물 캐리어, 및 백신 보조제를 포함한다.
또한, 본 발명의 변형된 초유 단백질은 조류 인플루엔자를 예방하거나 치료하기 위해 약학 조성물의 조제에 어플리케이션될 수 있다.
또한, 본 발명의 변형된 초유 단백질은 인간 인플루엔자를 예방하거나 치료하기 위해 약학 조성물의 조제에 어플리케이션될 수 있다.
또한, 본 발명의 변형된 초유 단백질은 돼지 번식 호흡 장애 증후군(PRRS)을 예방하거나 치료하기 위해 약학 조성물의 조제에 어플리케이션될 수 있다.
또한, 본 발명의 변형된 초유 단백질은 점막성 면역 반응을 야기할 수 있는 질병을 예방하거나 치료하기 위해 약학 조성물의 조제에 어플리케이션될 수 있다.
일반적으로, 본 실시형태에 있어서, 돼지 초유는 박테리아 세포벽 내에 펩티도글리칸층과 관련된 돼지 초유 내에서의 초유 단백질을 정제하기 위해서 소듐 도데실 황산염 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용하여 분석되는 샘플로서 사용된다. 다른 실시형태에 있어서, 다른 포유류에서의 초유, 예를 들면 소 초유는 분석 샘플로서 채택될 수도 있다. 이어서, 펩티도글리칸 관련 단백질의 식별 및 특성을 LC/MS/MS 분석 및 비교 유전자 연구를 통해 분석하고, 펩티도글리칸 관련 단백질을 병리학적 인식 단백질, PRP라 명명한다. PRP의 아미노 서열이 얻어진 후에, 복제된 돼지의 병리학적 인식 단백질 유전자는 pYES2.1V5-His TOPO 벡터에 삽입된 다음, 돼지의 복제된 병리학적 인식 단백질 유전자를 함유하는 pYES2.1V5-His TOPO 벡터를 사용하여 효모 세포를 변형시켰다. PRP의 활성은 하기 공정: PRP의 생체 내 발현 레벨의 평가; 발효 시험; 마우스 위관 영양법 후에 장내 박테리아 무리 분석; 대장균 및 살모넬라 등의 억제 시험을 통해 결정된다.
단백질의 정제:
그램 양성 개선제 매트릭스(GEM) 입자의 조제는: 무균 상태 하에서 락토코쿠스 락티스 액체를 스포팅하는 단계; 락토코쿠스 락티스 액체를 배양 배지로서 DifcoTM 젖산균 MRS 브로드에 접종하는 단계; 박테리아 콜로니를 선택하는 단계; 하나의 단일 박테리아 균주를 채집하여 25 ㎖ MRS 브로드에 접종하는 단계; 37℃에서 18시간 동안 혐기 상태 하에서 배양을 행하는 단계; 균주를 함유하는 배양 배지를 스플릿하고 50 ㎖ 원심 튜브로 전이시키는 단계; 원심 튜브를 13,000 xg에서 10분 동안 원심 분리하는 단계; 상청액을 제거하고 ddH20의 박테리아 액체의 원래 부피의 1/2로 박테리아 무리를 현탁시키는 단계; 원심 튜브를 13,000 xg에서 10분 동안 원심 분리하고 상청액을 제거하는 단계; 산 용액(0.6M TCA, pH=1)의 박테리아 액체의 원래 부피의 1/5를 첨가하는 단계; 캡을 개방하고 30분 동안 워터 배스에서 원심 튜브를 가열시키는 단계; 원심 튜브를 13,000 xg에서 10분 동안 원심 분리하고, 상청액을 제거하여 PBS의 원래 부피의 1/2를 사용하여 박테리아 무리를 현탁시키는 단계; 마지막 단계를 3회 반복하고 원심 튜브를 13,000 xg에서 10분 동안 원심 분리하는 단계; 상청액을 제거하는 단계; PBS의 박테리아 액체의 원래 부피의 1/10으로 박테리아 무리를 재용해하는 단계; 사이토미터를 사용하여 ㎜당 GEM 입자수를 산출하고, 최종적으로 향후 사용을 위해 -80℃에서 입자를 보존시키는 단계를 포함한다.
유청의 조제는: 얻어진 초유를 50 ㎖ 원심 튜브에 분배하는 단계; 원심 튜브를 10,000 xg에서 30분 동안 37℃에서 원심 분리한 다음, 초유의 하위층을 또 다른 50 ㎖ 원심 튜브에 가져와 전이시키는 단계; 100% 아세트산을 첨가하여 아세트산 농도를 1%로 제조하는 단계; 산성화가 행해질 수 있는 일정 온도의 캐비넷 내에 샘플을 10분 동안 37℃에 남겨두는 단계; 초유를 중화하기 위해서 산성화 후에 1/10 부피의 1M 아세테이트를 첨가하는 단계; 최종적으로, 10,000 xg의 4℃에서 10분 동안 원심 분리한 후에 상청액을 피펫팅하고, 그 회수된 상청액이 유청이다. 브래드퍼드법은 조제된 유청의 정량 분석에 대해 행해지고, 이것은 향후 사용을 위해 -20℃에서 보존된다.
GEM 입자와 유청의 결합은: 100 ㎕의 GEM 입자와 약 7 ㎎의 유청을 혼합시키는 단계; 혼합물을 발진기 상에 놓아 실온에서 30분 동안 진동을 행하는 단계; 혼합물을 13,000 xg에서 10분 동안 원심 분리하는 단계; 상청액을 제거하는 단계; 1 ㎖의 PBS 완충액으로 침전물을 현탁하고 13,000 x에서 10분 동안 원심 분리를 행하는 단계; 마지막 단계를 3회 반복하고, 1 ㎖의 용출 완충액(1M NaCl을 함유)으로 다시 현탁하시키는 단계; 13,000 xg에서 10분 동안 원심 분리를 행하고, 상청액을 제거하여 20 ㎕의 PBS 완충액으로 침전물을 재용해하는 단계; 샘플의 부피보다 2배의 부피를 가진 샘플 완충액으로 샘플을 균일하게 혼합시키는 단계; 95℃의 드라이 배스 내에서 10분 동안 가열시키는 단계; 13,000 xg에서 10분 동안 원심 분리를 행하는 단계; 상청액을 피펫팅하여 단백질 겔 전기영동법으로 상청액을 분석하는 단계를 포함한다.
마우스 면역은: 2.2×109 GEM 입자를 약 25 ㎎의 초유 혈청과 균일하게 혼합하고 혼합물을 진동시키는 단계; 13,000 xg에서 10분 동안 원심 분리를 행한 후에 상청액을 제거하는 단계; 1 ㎖ PBS 완충액으로 침전물을 현탁시키고 13,000 xg에서 10분 동안 원심 분리를 행하는 단계; 마지막 단계를 3회 반복하는 단계; 1 ㎖ NaCl로 침전물을 현탁시키고 13,000 xg에서 10분 동안 원심 분리를 행하는 단계; 상청액을 제거하고 50 ㎕ PBS 완충액으로 침전물을 재용해하는 단계; 원래 부피의 2배의 부피를 가진 단백질 샘플 완충액을 첨가하고 샘플 완충액과 샘플을 균일하게 혼합시키는 단계; 드라이 배스 내에서 10분 동안 95℃에서 가열시키는 단계; 13,000 xg에서 10분 동안 원심 분리를 행하는 단계; 100 ㎕에 이르기까지 PBS 완충액으로 상층을 피펫팅하여 정량하는 단계; 동일한 부피의 프로인트 완전 보조제를 첨가하는 단계; 4℃에서 12시간 동안 진동에 의해서 혼합하고, 그 혼합물을 1차 면역 주사에 사용하는 단계를 포함한다. 그 후, 프로인트 완전 보조제는 항원 단백질을 유화시키는데 사용한다. 면역력을 갖게 하는 항원 주사를 사용한 면역 접종 시험에 있어서, 면역 접종 사이클은 3주이다. 첫째 주 동안, 프로인트 완전 보조제와 혼합된 단백질 항원은 마우스의 복강 면역 주사에 사용된다. 마우스 혈액 샘플을 란셋을 사용하여 마우스의 볼에서 매주 수집하고, 혈액 샘플을 사용하여 혈청을 조제한 다음, 향후 사용하기 위해 -20℃에서 보존된다. 제 3 면역 접종 후에, 마우스 혈액을 얻어 특수 단백질 검출 검사법의 1차 항원으로서 사용하여 초유 혈청 내에서 펩티도글리칸 결합 단백질을 검출한다. 각각 1차 면역 및 2차 면역 접종 후 수집된 면역 접종된 혈청의 것에 비해 항체의 농도가 증가될 경우, 프로인트 불완전 보조제와 혼합된 항원 단백질의 제 4 면역 접종 주사가 행해지고, 마우스 전혈을 1주 후에 수집한다.
특수 단백질 검출 검사는: 15분 동안 무수 메탄올로 PVDF 막을 습윤시키고, 향후 사용을 위해 전이 완충액에 PVDF 막을 침지시키는 단계; 기포 형성의 방지와 함께 전이 장치에 각각 탈지면, 필러 종이, 전이되도록 단백질 전기영동 겔, PVDF 막, 여과지를 적층시키는 단계; 전이 장치를 전이 완충액으로 채우고 전이 장치를 아이스 배스 내에서 냉각시키는 단계; 100 volt의 전이 전압에서 1시간 동안 전이를 행하는 단계; 5%(w/v)의 탈지 분유를 함유하는 TBS 완충액 내에 PVDF 막을 침지시키는 단계; 적어도 2시간 동안 진동시켜 5분 동안 TBS 완충액으로 6회 산 세척하는 단계; 상술한 면역 접종 시험에서 마우스의 면역화된 초유 혈청으로부터 얻어진 펩티도글리칸 결합 단백질을 항체 프로브로서 사용하는 단계; 펩티도글리칸 결합 단백질을 TBS 완충액으로 1000배 희석시키고 실온에서 1시간 동안 PVDF 막과 반응하도록 진동시키는 단계; 5분 동안 TBS 완충액으로 6회 산 세척하는 단계; 알칼리성 포스파타아제를 운반하는 항체를 2차 항체로서 사용하는 단계; 알칼리성 포스파타아제를 운반하는 항체를 2차 항체로서 기능하도록 1500배 희석하여 실온에서 1시간 동안 PVDF 막과 반응하도록 진동시키는 단계; 5분 동안 TBS 완충액으로 6회 산 세척하는 단계; 최종적으로, 가시화를 위해 액체 기질로서 BCIP/NBT를 첨가하는 단계; 가시화가 달성될 때마다, 2회 세척하여 컬러 반응을 종결시키는 단계를 포함한다.
유전자의 회수:
LC-MS/MS: LC-MS/MS는 샘플을 분석하는데 사용되는 이중 질량 분석법(MS)과 병용된 액체 크로마토그래피(LC)이다. LC-MS/MS는 액체 크로마토그래피의 고도의 분석 능력을 이용하여 폴리펩티드 세그먼트를 함유하는 혼합물을 분리시킨 다음, 제 1 단계 MS를 진입하는 다양한 크기의 펩티드와 전하를 생성하는 질량 분석법에서 1차 이온을 사용하여 샘플을 이온으로 기화시키고, 그 분석되는 이온은 전자와 충돌하거나 충돌 가스에 의해 분열된다. 제 2 단계 질량 분석법에 있어서, 이온 단편이 대전되는 양을 고려하여 분석되는 물질의 질량을 유도할 수 있어 샘플 단편의 전하비에 대한 질량(m/z)이 측정된다. 액체 크로마토그래피에 의해 분리된 펩티드의 아미노산 서열을 2회 이온화, 분열, 및 마지막 유전 비교를 통해 얻는다. 그 다음, 대응하는 유전자는 마스코트 분석(영국 런던 Matrix Science)과 같은 생물학적 정보 검색 소프트웨어를 사용하여 DNA 서열 비교를 행함으로써 얻어진다.
돼지 병리학적 인식 단백질의 유전자 복제 및 활성화 분석은: LC-MS/MS로부터 얻어진 아미노산 서열은 고안되는 퇴행 프라이머의 기반으로서 사용된다. 프라이머는 돼지 유선 cDNA의 병리학적 인식 단백질 유전자용 Olgo-d(T)와 함께 치환으로서의 역할을 한다. RT-PCR 후, 전기영동 겔에 나타낸 단편은 TA 벡터에 하나씩 복제될 것이다. SEQ ID NO.: 3으로 나타낸 완전한 돼지 병리학적 인식 단백질 유전자는 DNA 시퀀싱 및 생물정보학 비교로 얻어질 수 있다. 변형된 서열을 가진 복제된 돼지 병리학적 인식 단백질 유전자를 대장균 세포를 변형시키는데 우선 사용해서 병리학적 인식 단백질의 발현을 유도한 다음, 병리학적 인식 단백질을 정제한다. GEM 입자와 결합되어 있는 병리학적 인식 단백질의 능력이 정제 후에도 여전히 존재되고 안정적일지 시험될 것이고 정제된 병리학적 인식 단백질과 GEM 입자가 결합한 후에 특수 단백질 검출 검사를 사용하여 분석한다.
효모 변형은: 대장균 발현 시스템이 돼지 양돈 환경을 오염시키는 것을 방지하기 위해서, 사료에 이미 사용되고 있는 효모 세포를 병리학적 인식 단백질을 발현시키기 위한 캐리어로서 사용한다. 복제, 변형, 및 서열화된 돼지 병리학적 인식 단백질 유전자는 pYES2.1V5-His TOPO 벡터(인비트로젠), 효모 균주 INVSc1에 추가 도입되는 일종의 효모 발현 벡터에 삽입된다. 이 효모 발현 시스템의 원래 발현 유도 메카니즘은 특정 온도 범위 또는 특정 영양 물질의 존재에서만 병리학적 인식 단백질을 발현하기 시작하도록 변형된다. 그러나, 기술이 특허권에 대해서 아직 적용되지 않았기 때문에, 배양 상태에 관한 정보가 본원에 개시되어 있지 않다.
마우스의 장내 미생물 시험은:
장내 박테리아 무리의 관찰: 병리학적 인식 단백질은 마우스 중량의 1/100인 단백질 중량으로 경구 위관 영양법에 의해 마우스마다 투여되는 단계; 대조군은 동일한 부피의 멸균수가 2회만 공급되는 반면, 6일 동안 1일에 2회 경구 위관 영양법을 행하는 단계; 마우스를 희생시키고 각 마우스의 소장(위 하에 1.5 ㎝~2.5 ㎝)을 분석용으로 취하는 단계; 마우스 장 내에 내용물은 멸균된 PBS를 사용하여 적절한 희석액에서 희석되고, 배양 기질을 사용하여 배양되는 단계; 24시간 후 박테리아 균주의 수를 산출하는 단계를 포함한다. 박테리아 무리는 log cfu의 박테리아 균주로 발현된다. 또한, 백테리아 식별 시스템 API 20E는 장내 세균 및 그램 음성 박테리아의 식별에 사용되고, 그 결과는 하기 표 1에 의해 해석된다.
발효 시험은: 변형된 효모를 Winpact 바이오리액터 및 발효기에서 배양한 다음, 온도, 회전 속도, pH 값 및 용존 산소와 같은 각각 다른 인자는 일정 범위 내에서 유지되는 동안 효모를 우선 활성화하여 현탁시키고, OD값에 따라 희석하며, 배양 배지의 대체 후 8시간 동안 배양시킨다. 배양된 효모의 각 패치를 샘플링하여 병리학적 인식 단백질의 발현을 분석한다. 발효 브로스의 효모는 발효 8시간 후에 분리된다. 9~10g의 재조합 효모는 약 1L의 발효 브로스로부터 얻어질 수 있다. 그 다음, 재조합 효모는 향후 사용을 위해 드라이 환경에서 보존된다.
박테리아 막 결합 단백질의 정제 및 단백질의 정성 분석: 미생물의 세포막 또는 세포벽에 이질 단백질이 결합하는 방식은 5개의 카테고리로 분류될 수 있다: (1) 막관통 단백질의 소수성 막관통 도메인을 통해 미생물의 세포막에 결합시키는 단계; (2) 지질 단백질의 아미노 말단을 통한 아세틸화에 의해 세포막의 장쇄 지방산에 공유 결합하는 단계; (3) 단백질을 LPCTG 모티프 앵커를 통해 일시적으로 세포벽에 머물도록 하여 공유 결합하는 단계; (4) 다양한 박테리아의 라이신 모티프(LysM)에 존재하는 세포벽 사이에서 비공유 결합하는 단계; 및 (5) 이질 단백질의 표면 단백질과 미생물 세포벽의 표면 단백질 사이에서 결합하는 단계를 포함한다. 크로마토그래피 칼럼은 조제된 GEM 입자로 채워지고 초유로 채워지며, 박테리아 막과 결합된 단백질은 SDS-PAGE법으로 분석된다. SDS-PAGE 시험에 있어서, 박테리아 막과 결합될 수 있는 하나 이상의 단백질이 있음을 발견했다. 박테리아 막으로부터 단백질을 분리하고 단백질을 시퀀싱한 후, 단백질은 총 7개이고, 그들 중 하나는 공지한 단백질인 락토페린이며, C7은 펩티도글리칸 인식 단백질 집단 중 하나인 것으로 식별된다. 도 1에서 C1~C7을 참조하라. (C7: RecName: 펩티도글리칸 인식 단백질; 플래그: 전구물, 명목 질량(Mr): 21024; 산출된 pI값: 9.62, 가변성 변형: 카르바미도메틸(C), 트립신에 의한 산화(M) 분열: 다음 잔기가 P가 아닌 한 C 말단 측을 절단, 서열 범위: 11%)
시장에서 PGRP 항체의 부족으로 인해, 본 실험에 있어서, 마우스는 복부 내에 우선 정제된 C7이 주사된 다음, 면역화된 복수는 돼지 초유와 영구유 내에 C7 단백질의 발현을 관찰하는데 사용된다. 우리의 연구에서 분자량 17 kDa를 가진 PGRP를 나타내는 *표시와 함께 노동 2-4일 후에 돼지 유청을 도시하는 도 2에 나타낸 바와 같이, 돼지 혈청도 PGRP를 함유하고, 돼지 초유의 유청 내에 PGRP 양이 돼지 영구유의 유청의 것보다 훨씬 높다는 것을 발견했다. 그러나, 본 실험의 과정에 있어서, C7 단백질이 매우 불안정하다는 것도 발견했다. -20℃에서 2일 보존 후, 샘플에서 C7 단백질이 사라질 것이다. 불안정성은 C7 단백질을 관련 산업에 적용시키는 것을 억제한다. 따라서, 후속 실시형태에 있어서, C7 단백질의 3차 구조를 안정화시키기 위해서 C7 단백질은 변형되고, C7 단백질은 그 특성 후 병리학적 인식 단백질, PRP, 즉 본 발명의 변형된 초유 단백질이라 명명되고, 이것을 도 4에 나타낸다.
돼지 병리학적 인식 단백질 복제, 효모 변형 및 생산 속도 모니터링: 개발자에 의해 재조합 단백질의 사용에 있어서 이전 경험에 의해서, 시장 가치가 있는 재조합 단백질이 실험실에서 개발될 수 있지만, 단백질의 발현 레벨, 안정성 및 생산 비용과 같은 몇몇 문제점으로 인해 시장 가치가 있는 재조합 단백질의 생산이 현실적으로 어렵다. 상기 문제점을 고려해서, 돼지 병리학적 인식 단백질 유전자는 효모 세포를 변형시키는데 사용된다. 배양 상태를 결정하는데 어려움이 있지만, 효모 세포가 상업적인 용도에서 이롭기 때문에 효모 세포는 돼지 병리학적 인식 단백질을 발현시키는데 사용된다(도 3에 나타낸 바와 같이). 돼지 병리학적 인식 단백질은 레시피 제형, 온도, 산소 용해 속도, 및 발효 시간이 여러 번 변경된 후 이제 꾸준하게 발현될 수 있다. 매월 수율은 280톤의 돼지 사료이다. 1 ㎜의 사료가 발효되기 전 샘플링되고, 발효 후 사료가 다시 샘플링된다. 샘플은 특수 단백질 검출 검사를 사용하여 분석되어 병리학적 인식 단백질의 성능과 수율을 결정한다. 도 5는 하나의 발효에 기초해서 단백질 발현 모니터링의 결과를 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 상이한 시점에서 수집된 샘플에 대한 분석을 분석하고 8시간 발효를 겪은 샘플이 17 kDA에서 화살표가 나타낸 바와 같이 최상 발현 레벨을 행한다는 것을 나타낸다. 발효 상태 및 균주가 최상의 상태에 있을 경우, 이러한 모니터링은 각 발효의 종결 직후 행해져서 확인된다. 발효 후 수집된 효모를 원심 분리한 후, 상청액을 제거하고, 고형물을 -50℃에서 즉시 냉동시켜 건조시킨 후, 습도를 피해 보존시킨다. 사료의 다른 성분과 혼합하기 전 보존된 효모를 사료 기질과 우선 혼합한다.
도 6~도 8을 참조하라. ICR(암 연구 협회) 균주 마우스는 각 마우스의 1/100 중량을 칭량하는 병리학적 인식 단백질이 2일마다 1번 위관 영양법으로 투여된다. 투여 기간은 총 6일이다. 대조군은 동일한 부피의 멸균수가 2번 공급된다. 실험 후, 동물을 희생시키고, 동물의 소장(위 하에 1.5~2.5 ㎝)은 분석용으로 샘플링된다. 각 실험에 있어서, 실험군 및 대조군은 각각 25마리의 동물을 포함한다. 위관 영양법으로 인해 실험 중에 여하의 동물이 사망할 경우, 사망한 동물의 데이터는 삭제될 것이다. 실험군, 즉 병리학적 인식 단백질을 공급한 군의 박테리아의 총량은 대조군의 박테리아 양보다 50% 적다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 청색 곡선은 PRP가 공급된 마우스를 가진 실험군이고, 시간이 지남에 따라 PRP는 50%까지 박테리아의 성장을 억제한다. 박테리아 무리의 식별 결과로부터, 억제된 박테리아는 대부분 그램 양성 박테리아이다. 게다가, 병리학적 인식 단백질이 박테리아 막에 부착되는 특성을 가지고 있기 때문에, 본 실험에 있어서 병리학적 인식 단백질에 의해 변형된 정제된 효모는 대장균과 혼합된다. 배양 배지를 2회 교체한 후, 대장균을 전자 현미경 하에 관찰하여 도 6에 나타낸 바와 같이 대장균에 결합하는 병리학적 인식 단백질이 존재하는지 여부를 결정하고, 원형 부분은 결합이 일어나는 부분이다.
하기 변형된 초유 단백질과 동물 사료의 혼합물을 새끼 돼지에게 투여하는 시험은:
동기 비교: 16주령 새끼 돼지를 2군으로 분류하고 인접한 양돈장에 유지시키는 단계; PRRS(IgG)에 대하여 항체의 적정을 조사하기 위해 혈액을 수집하는 단계; 0.02%의 PRP를 사료에 첨가한 후 PRRS(IgG)에 대하여 항체의 적정을 조사하기 위해 혈액을 수집하는 단계를 포함한다.
결과: 표 2는 실험군과 실험 전 대조군 모두에서 IgG에 대한 음성 결과를 나타낸다. 그러나, IgG 시험 결과가 대조군에서 모두 양성인 반면, 돼지가 8주령인 경우 PRP 첨가를 받은 실험군에서 IgG 시험 결과가 음성으로 잔류한다. 상기 결과는 PRP가 돼지의 점막 조직을 통해 침투하고 림프계를 추가로 활성화시켜 IgG를 생성하는 경향이 있는 PRRS 바이러스를 중화시키는 면역 글로불린 IgG의 생성을 증가시킬 수 있다는 것을 입증한다. PRRS 바이러스의 중화 반응은 점막 조직 내에서 발생된다.
<110> HUNG GUANG BIOTECH CO., LTD.
<120> Modified Colostrum Protein and Application Thereof
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 196
<212> PRT
<213> human
<400> 1
Met Ser Arg Arg Ser Met Leu Leu Ala Trp Ala Leu Pro Ser Leu Leu
1 5 10 15
Arg Leu Gly Ala Ala Gln Glu Thr Glu Asp Pro Ala Cys Cys Ser Pro
20 25 30
Ala Val Pro Arg Asn Glu Trp Lys Ala Leu Ala Ser Glu Cys Ala Gln
35 40 45
His Leu Ser Leu Pro Leu Arg Tyr Val Val Val Ser His Thr Ala Gly
50 55 60
Ser Ser Cys Asn Thr Pro Ala Ser Cys Gln Gln Gln Ala Arg Asn Val
65 70 75 80
Gln His Tyr His Met Lys Thr Leu Gly Trp Cys Asp Val Gly Tyr Asn
85 90 95
Phe Leu Ile Gly Cys Asp Gly Leu Val Tyr Glu Gly Arg Gly Trp Asn
100 105 110
Phe Thr Gly Ala His Ser Gly His Leu Trp Asn Pro Met Ser Ile Gly
115 120 125
Ile Ser Phe Met Gly Asn Tyr Met Asp Arg Val Pro Thr Pro Gln Ala
130 135 140
Ile Arg Ala Ala Gln Gly Leu Leu Ala Cys Gly Val Ala Gln Gly Ala
145 150 155 160
Leu Arg Ser Asn Tyr Val Leu Lys Gly His Arg Asp Val Gln Cys Thr
165 170 175
Leu Ser Pro Gly Asn Gln Leu Tyr His Leu Ile Gln Asn Trp Pro His
180 185 190
Tyr Arg Ser Pro
195
<210> 2
<211> 196
<212> PRT
<213> human
<400> 2
Met Ser Arg Arg Ser Met Leu Leu Ala Trp Ala Leu Pro Ser Leu Leu
1 5 10 15
Arg Leu Gly Ala Ala Gln Glu Thr Glu Asp Pro Ala Cys Cys Ser Pro
20 25 30
Ile Val Pro Arg Asn Glu Trp Lys Ala Leu Ala Ser Glu Cys Ala Gln
35 40 45
His Leu Ser Leu Pro Leu Arg Tyr Val Val Val Ser His Thr Ala Gly
50 55 60
Ser Ser Cys Asn Thr Pro Ala Ser Cys Gln Gln Gln Ala Arg Asn Val
65 70 75 80
Gln His Tyr His Met Lys Thr Leu Gly Trp Cys Asp Val Gly Tyr Asn
85 90 95
Phe Leu Ile Gly Glu Asp Gly Leu Val Tyr Glu Gly Arg Gly Trp Asn
100 105 110
Phe Thr Gly Ala His Ser Gly His Leu Trp Asn Pro Met Ser Ile Gly
115 120 125
Ile Ser Phe Met Gly Asn Tyr Met Asp Arg Val Pro Thr Pro Gln Ala
130 135 140
Ile Arg Ala Ala Gln Gly Leu Leu Ala Cys Gly Val Ala Gln Gly Ala
145 150 155 160
Leu Arg Ser Asn Tyr Val Leu Lys Gly His Arg Asp Val Gln Arg Thr
165 170 175
Leu Ser Pro Gly Asn Gln Leu Tyr His Leu Ile Gln Asn Trp Pro His
180 185 190
Tyr Arg Ser Pro
195
<210> 3
<211> 590
<212> DNA
<213> human
<400> 3
atgtcccgcc gctctatgct gcttgcctgg gctctcccca gcctccttcg actcggagcg 60
gctcaggaga cagaagaccc ggcctgctgc agccccgccg tgccccggaa cgagtggaag 120
gccctggcat cagagtgcgc ccagcacctg agcctgccct tacgctatgt ggtggtatcg 180
cacacggcgg gcagcagctg caacaccccc gcctcgtgcc agcagcaggc ccggaatgtg 240
cagcactacc acatgaagac actgggctgg tgcgacgtgg gctacaactt cctgattgga 300
tgcgacgggc tcgtatacga gggccgtggc tggaacttca cgggtgccca ctcaggtcac 360
ttatggaacc ccatgtccat tggcatcagc ttcatgggca actacatgga tcgggtgccc 420
acaccccagg ccatccgggc agcccagggt ctactggcct gcggtgtggc tcagggagcc 480
ctgaggtcca actatgtgct caaaggacac cgggatgtgc agtgcacact ctctccaggc 540
aaccagctct accacctcat ccagaattgg ccacactacc gctccccctg 590
Claims (14)
- SEQ ID NO.: 1로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 변형된 초유 단백질로서,
SEQ ID NO.: 2로 나타낸 야생형 초유 단백질의 아미노산 서열에 존재하는 위치 33에서의 Ile, 위치 101에서의 Glu 및 위치 175에서의 Arg를 각각 Ala, Cys 및 Cys로 대체함으로써 생성되는 것을 특징으로 하는 변형된 초유 단백질. - 제 1 항에 기재된 변형된 초유 단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA로서, SEQ ID NO.: 3으로 나타낸 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA.
- 돼지 번식 호흡 장애 증후군(PRRS), 구제역(FMD), 돼지 유행성 설사(PED) 또는 조류 인플루엔자를 예방 또는 치료하기 위한 제 1 항에 기재된 변형된 초유 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 경구 투여용 약학적 조성물.
- 제 1 항에 기재된 변형된 초유 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 사료 조성물.
- 제 4 항에 있어서,
상기 변형된 초유 단백질은 0.01 중량%~0.02 중량% 범위의 양으로 동물 사료 조성물에 존재하는 것을 특징으로 하는 동물 사료 조성물. - 돼지 번식 호흡 장애 증후군(PRRS), 구제역(FMD), 돼지 유행성 설사(PED) 또는 조류 인플루엔자를 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물로서,
약물 캐리어 및 백신 보조제, 및
제 1 항에 기재된 변형된 초유 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물. - 동물의 면역 반응을 향상시키기 위해서 사료의 조제에 제 1 항에 기재된 변형된 초유 단백질을 사용하는 방법.
- 제 7 항에 있어서,
상기 동물의 면역 반응은 동물의 면역글로불린 A(IgA)의 생성을 증가시킴으로써 향상되는 것을 특징으로 하는 방법. - 동물에 투여되도록 사료의 조제에 제 1 항에 기재된 변형된 초유 단백질을 사용하는 방법.
- 동물에 투여되도록 약학 조성물의 조제에 제 1 항에 기재된 변형된 초유 단백질을 사용하는 방법.
- 점막성 면역 반응을 야기할 수 있는 질병을 예방하거나 치료하기 위해 사료의 조제에 제 1 항에 기재된 변형된 초유 단백질을 사용하는 방법.
- 제 11 항에 있어서,
상기 질병은 돼지 번식 호흡 장애 증후군(PRRS), 구제역(FMD), 돼지 유행성 설사(PED) 또는 조류 인플루엔자인 것을 특징으로 하는 방법. - 점막성 면역 반응을 야기할 수 있는 질병을 예방하거나 치료하기 위해 약학 조성물의 조제에 제 1 항에 기재된 변형된 초유 단백질을 사용하는 방법.
- 제 13 항에 있어서,
상기 질병은 돼지 번식 호흡 장애 증후군(PRRS), 구제역(FMD), 돼지 유행성 설사(PED), 조류 인플루엔자 또는 인간 인플루엔자인 것을 특징으로 하는 방법.
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