CN117700563A - 经修饰的初乳蛋白质组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种经修饰的初乳蛋白质组合物，包含：经修饰的初乳蛋白质载体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；以及抗原片段，连接于经修饰的该初乳蛋白质载体。
Description
技术领域
本发明涉及一种初乳蛋白，特别是涉及一种经修饰的初乳蛋白质组合物。
背景技术
免疫球蛋白(抗体)，为一种主要由浆细胞分泌，并可被免疫系统用来识别以及中和外来物质，例如细菌或病毒等病原体的蛋白质。免疫球蛋白包括IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其中IgA可在母乳、唾液、眼泪以及支气管中的黏液被发现，对于作为身体抵御外来病原体的第一道防线的黏膜免疫十分重要。
黏膜组织是人体与自然界各种抗原接触沟通的主要部位，包括：1)多层鳞状上皮细胞构成的口腔黏膜、鼻咽(含扁桃腺)食道上端、泌尿道以及生殖道；与2)单层柱状上皮细胞构成的胃肠黏膜、呼吸道黏膜以及食道下端。所有黏膜组织的共同特征为皆会分泌黏液与分泌性免疫球蛋白A(secretary IgA，SIgA)。
面对肠道细菌及各种颗粒性抗原(particulate antigens)的入侵，生物体的应对机制首先为启动肠道免疫反应，该免疫反应主要是刺激专一性SIgA的形成，再将该专一性SIgA分泌到黏膜外，以使该专一性SIgA与该抗原形成免疫附合体(immune complex)，从而阻止该抗原靠近黏膜，达到免疫阻隔作用(immune exclusion)。此作用能防止病原体在黏膜层长期停留，从而使该病原体形成菌落(colony)的机会随之大幅减少。换言之，生物体通过不断分泌的专一性SIgA可以有效防止菌落形成而达到保护黏膜组织的功能。
雌性哺乳动物于产后2-3天内所初分泌的乳汁称之为初乳(colostrum)，其后再分泌的乳汁则被称为常乳。初乳中亦含有IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM等免疫球蛋白，而该些免疫球蛋白对于病毒、细菌、寄生虫及酵母菌等病原体皆能发挥良好的防御作用。
虽然初乳的潜在效益极高，然而，由于初乳的分泌时程过短，以及初乳中的蛋白不稳定、收集不易及保存困难等因素，使得针对初乳蛋白于实际应用层面上的发展至今仍甚为迟缓。
发明内容
因此，本发明的目的即在提供一种经修饰的初乳蛋白质组合物，具有预防外来病原体的功效。
本发明为解决现有技术的问题所采用的技术手段提供一种经修饰的初乳蛋白质组合物，包含：经修饰的初乳蛋白质载体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；以及抗原片段，连接于经修饰的该初乳蛋白质载体。
在本发明的一实施例中提供一种经修饰的初乳蛋白质组合物，该抗原片段的氨基酸序列选自引发黏膜免疫的疾病的致病菌及/或病毒的部分氨基酸序列。
在本发明的一实施例中提供一种经修饰的初乳蛋白质组合物，该抗原片段的氨基酸序列选自肿瘤标记的部分氨基酸序列。
在本发明的一实施例中提供一种经修饰的初乳蛋白质组合物，经修饰的该初乳蛋白质组合物还包括载剂、赋形剂或佐剂。
在本发明的一实施例中提供一种如上述的经修饰的初乳蛋白质组合物用于制备诱导黏膜免疫系统针对该抗原片段而产生抗原专一性免疫球蛋白IgA的医药组成物的用途。
经由本发明的经修饰的初乳蛋白质组合物所采用的技术手段，使得生物体得以通过连接有抗原片段的经修饰的该初乳蛋白质组合物，促进并增强黏膜免疫反应，提高对抗该抗原片段的抗原专一性免疫球蛋白IgA的生成，进而达到预防特定病原体的感染的目的。本发明的经修饰的该初乳蛋白质组合物用于制备诱导黏膜免疫系统针对该抗原片段而产生抗原专一性免疫球蛋白IgA的医药组成物的用途，使经修饰的该初乳蛋白质组合物作为疫苗相关的医药组成物，为预防各式病原体所造成的疾病提供了更多元的疫苗种类选择。
附图说明
图1为显示根据本发明的一实施例的未经口服喂食含有经修饰的初乳蛋白质组合物的酵母菌的小鼠；以及经口服喂食含有经修饰的该初乳蛋白质组合物的该酵母菌后的小鼠于第1、3、5、7天所分别测得的血清中免疫球蛋白IgA1以及IgA2的吸光值直方图；以及
图2为显示根据本发明的另一实施例的经口服喂食未含有经修饰的初乳蛋白质组合物的酵母菌的小鼠；以及经口服喂食含有经修饰的该初乳蛋白质组合物的该酵母菌后的小鼠于第3天所测得的血清中免疫球蛋白IgA，经序列稀释后的吸光值直方图。
具体实施方式
以下根据图1至图2，而说明本发明的实施方式。该说明并非为限制本发明的实施方式，而为本发明的实施例的一种。
依据本发明的一实施例的一种经修饰的初乳蛋白质组合物，包含：经修饰的初乳蛋白质载体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；以及抗原片段，连接于经修饰的该初乳蛋白质载体。
依据本发明的实施例的经修饰的该初乳蛋白质组合物，其中该抗原片段的氨基酸序列选自引发黏膜免疫的疾病的致病菌及/或病毒的部分氨基酸序列。
依据本发明的实施例的经修饰的该初乳蛋白质组合物，其中经修饰的该初乳蛋白质组合物还包括载剂、赋形剂或佐剂。
依据本发明的实施例的经修饰的该初乳蛋白质组合物，用于制备诱导黏膜免疫系统针对该抗原片段而产生抗原专一性免疫球蛋白IgA的医药组成物的用途。
详细而言，经修饰的该初乳蛋白质载体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，为自如SEQ ID NO：2所示的野生型初乳蛋白质的氨基酸序列的第33位置的异白氨酸被丙氨酸取代，第101位置的谷氨酸被半胱氨酸取代，以及第175位置的精氨酸被半胱氨酸取代而产生。
进一步而言，经修饰的该初乳蛋白质载体的三级结构相较于野生型初乳蛋白质更为稳定。
详细而言，本发明的经修饰的该初乳蛋白质载体为纯化结合于细菌的细胞壁上的胜肽聚醣的蛋白质，且该蛋白质载体经修饰其序列而得，并依其特性命名为病原辨识蛋白(Pathological Recognition Protein,PRP)。
本发明的实施例的经修饰的该初乳蛋白质组合物所包含的该抗原片段的氨基酸序列为第二型猪链球菌(S.suis serotype 2)的部分氨基酸序列。当然，本发明的经修饰的该初乳蛋白质组合物所包含的该抗原片段的氨基酸序列并不以此为限，该抗原片段的氨基酸序列可选自各式病原体的氨基酸序列。
详细而言，猪链球菌的各血清型中，以第二型最常存于健康带菌或发病猪群，因此较难以针对该菌所造成的疾病进行流行病学分析以及追查感染源。猪链球菌主要引起离乳猪的脑膜炎、败血症、心内膜炎、关节炎甚至之气管肺炎，亦会引起人类的脑膜炎、心内膜炎及败血症，其他症状包括关节炎、支气管肺炎及发热，严重时会导致败血性休克、弥漫性血管内凝血……等，属于重要的人畜共通传染病。
本发明的实施例使用间接酵素结合免疫吸附分析法(Indirect enzyme-linkedimmunosorbent assay,Indirect ELISA)侦测血清中抗原专一性免疫球蛋白的存在。实验方法如下所示：
采用约4周龄的无特定病原(specific pathogen free,SPF)级雌性BALB/c小鼠，将小鼠分为免疫组(即，经口服喂食含有经修饰的该初乳蛋白质组合物的酵母菌后的小鼠)以及控制组(即，免疫接种前，未经口服喂食含有经修饰的该初乳蛋白质组合物的酵母菌的小鼠)各40只，每10只小鼠成1组且口服喂食接种25μg的该初乳蛋白质组合物，于口服喂时含有该初乳蛋白质组合物的酵母菌后的第1、3、5以及第7天通过尾静脉抽取小鼠血液样本，并通过间接酵素结合免疫吸附分析法侦测专一性免疫球蛋白IgA的浓度变化。
首先，96孔微量多孔盘(96-well microplates)于4℃下以通过碳酸盐缓冲液(15mmol/1Na2CO3、35mmol/1NaHCO3[pH 9.6])稀释至1μg/ml的纯化重组蛋白包覆过夜。
使用含有0.05％Tween-20(PBST)的PBS洗涤3次后，该微量多孔盘于37℃下用含有5％脱脂奶粉的PBST阻断1小时。
随后将使用PBST进行序列稀释(自1:400至1:3276800的两倍稀释梯度)的控制组和免疫组的小鼠血清以每孔100μl添加到适当的孔中，并将该微量多孔盘于37℃下孵育1小时。
洗涤3次后，以1:5000稀释度添加二级抗体(结合过氧化物酶的山羊抗小鼠IgA抗体(Santa Cruz Biotechnology,CA))，以每孔100μl添加到适当的孔中，将该微量多孔盘于37℃下孵育30分钟。
最后，将该微量多孔盘与作为山葵过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)的受质的邻苯二胺一起孵育，以观察反应。
终点效价定义为血清的最高稀释度，此时免疫组的血清于490nm处的吸光值(OD490)比控制组的血清的平均OD 490高2.1倍。
针对IgA1以及IgA2的侦测，以1:2000的稀释度的免疫组的小鼠血清以每孔100μl添加。结合过氧化物酶的山羊抗小鼠IgA1以及IgA2(Santa Cruz Biotechnology)作为二级抗体。结果表示为平均值±标准差。
如图1所示，免疫组的专一性免疫球蛋白IgA1以及IgA2皆高于控制组，专一性免疫球蛋白IgA1以及IgA2于口服喂食含有经修饰的该初乳蛋白质组合物的酵母菌后的第3天以及第5天时达到最高浓度，而口服喂食后的第7天则快速下降，此可能是因为口服喂食后的第1天时所测得的专一性免疫球蛋白部分为IgM，直到第三天方转化为IgA，而第7天时的快速下降是因为IgA只可在血液中存在7天之故。
依据本发明的另一实施例的经修饰的该初乳蛋白质组合物，其中该抗原片段的氨基酸序列选自肿瘤标记的部分氨基酸序列。
本发明的另一实施例使用间接酵素结合免疫吸附分析法(Indirect enzyme-linked immunosorbent assay,Indirect ELISA)侦测血清中抗原专一性免疫球蛋白的存在。实验方法如下所示：
癌胚胎抗原序列片段设计与质体建构：
本发明的另一实施例将癌胚胎抗原(Carcinoembryonic Antigen,CEA)的整个抗原片段分切成17个长度为9～15个氨基酸的抗原片段，从中筛选最适合的片段进行试验。CEA片段经合成后，分别建构在带有经修饰的初乳蛋白质基因的pDONR质体上，所建构的质体最后以定序分析的方式确认序列无误。建构好的17个质体以大肠杆菌放大培养后，再转殖到酵母菌中，质体筛选条件为：1.不产生有毒物质，能在酵母菌生长的质体；2.能在URA-培养基上生长的菌株；3.定序没有发生变异的质体；4.能使小鼠产生较多中和抗体的菌株。最后再以软件分析依据期待电性、结构、稳定度、化学性，找出适合的包含经修饰的初乳蛋白质载体以及CEA抗原片段的经修饰的初乳蛋白质组合物(以下简称为PRP癌抗原复合胜肽)。
IgA中和抗体测试：
目的为检测小鼠喂食PRP癌抗原复合胜肽后，专一性IgA表现量是否增加。C57BL/6J小鼠分别喂食未含有PRP癌抗原复合胜肽的空酵母菌以及含有PRP癌抗原复合胜肽的酵母菌，喂食未含有PRP癌抗原复合胜肽的空酵母菌的小鼠属于控制组，喂食含有PRP癌抗原复合胜肽的酵母菌的小鼠属于免疫组；喂食剂量为2500mg/kg，控制组及免疫组于喂食后第1天、第3天以及第5天以脸颊采血的方式收集小鼠血清。收集的血清检体以ELISA的方式进行IgA中和抗体检测，流程如下：将CEA蛋白附着于微量多孔盘上(50ng/孔)，清洗后加入稀释后的血清检体(100μl/孔)，清洗后加入抗IgA抗体，洗去多余的检测抗体并添加HRP耦合物，添加HRP受质以间接检测结合蛋白，并以ELISA微盘分析仪以吸光值OD450nm测量。
图2为控制组及免疫组中各一只小鼠于喂食各自的酵母菌后第3天的结果，小鼠血清经序列稀释后检测其IgA中和抗体的含量。详细而言，免疫组的小鼠经喂食含有PRP癌抗原复合胜肽的酵母菌的第3天后，在20倍稀释的小鼠血清中，专一性辨识CEA抗原片段的IgA抗体含量显著的高于控制组(即，喂食空酵母菌的小鼠)，显示本发明的该初乳蛋白质组合物确实能够诱导老鼠产生专一性IgA，且其IgA具有辨识CEA抗原的能力。
本案的经修饰的该初乳蛋白质组合物，能帮助生物体通过经修饰的该初乳蛋白质载体所连接的抗原片段，促进并增强黏膜免疫反应，提高对抗该抗原片段的抗原专一性免疫球蛋白IgA的生成，进而达到预防特定病原体的感染的目的。本发明的经修饰的该初乳蛋白质组合物用于制备诱导黏膜免疫系统针对该抗原片段而产生抗原专一性免疫球蛋白IgA的医药组成物的用途，使经修饰的该初乳蛋白质组合物作为疫苗相关的医药组成物，为预防各式病原体所造成的疾病提供了更多元的疫苗种类选择。
以上的叙述以及说明仅为本发明的较佳实施例的说明，对于本领域技术人员当可依据以上权利要求书以及上述的说明而作其他的修改，只是这些修改仍应是为本发明的发明精神而在本发明的保护范围中。
Claims (5)
1.一种经修饰的初乳蛋白质组合物，其特征在于，包含：
经修饰的初乳蛋白质载体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；以及
抗原片段，连接于经修饰的该初乳蛋白质载体。
2.根据权利要求1所述的经修饰的初乳蛋白质组合物，其特征在于，所述的抗原片段的氨基酸序列选自引发黏膜免疫的疾病的致病菌及/或病毒的部分氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的经修饰的初乳蛋白质组合物，其特征在于，所述的抗原片段的氨基酸序列选自肿瘤标记的部分氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的经修饰的初乳蛋白质组合物，其特征在于，经修饰的该初乳蛋白质组合物还包括载剂、赋形剂或佐剂。
5.一种将如权利要求1所述的经修饰的初乳蛋白质组合物用于制备诱导黏膜免疫系统针对该抗原片段而产生抗原专一性免疫球蛋白IgA的医药组成物的用途。
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