TW202411248A - 經修飾之初乳蛋白質組合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
一種經修飾之初乳蛋白質組合物，包含：經修飾之初乳蛋白質載體，其胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示；以及抗原片段，係連接於經修飾之該初乳蛋白質載體。
Description
本發明相關於一種初乳蛋白，特別是相關於一種經修飾之初乳蛋白質組合物。
免疫球蛋白（抗體），係為一種主要由漿細胞分泌，並可被免疫系統用來識別以及中和外來物質，例如細菌或病毒等病原體的蛋白質。免疫球蛋白包括IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其中IgA可在母乳、唾液、眼淚以及支氣管中的黏液被發現，對於作為身體抵禦外來病原體之第一道防線的黏膜免疫十分重要。
黏膜組織是人體與自然界各種抗原接觸溝通的主要部位，包括： 1） 多層鱗狀上皮細胞構成的口腔黏膜、鼻咽（含扁桃腺）食道上端、泌尿道以及生殖道；與 2） 單層柱狀上皮細胞構成的胃腸黏膜、呼吸道黏膜以及食道下端。所有黏膜組織的共同特徵係為皆會分泌黏液與分泌性免疫球蛋白A（secretary IgA, SIgA）。
面對腸道細菌及各種顆粒性抗原（particulate antigens）的入侵，生物體之應對機制首先係為啟動腸道免疫反應，該免疫反應主要是刺激專一性SIgA之形成，再將該專一性SIgA分泌到黏膜外，以使該專一性SIgA與該抗原形成免疫附合體（immune complex），從而阻止該抗原靠近黏膜，達到免疫阻隔作用（immune exclusion）。此作用係能防止病原體在黏膜層長期停留，從而使該病原體形成菌落（colony）的機會隨之大幅減少。換言之，生物體藉由不斷分泌的專一性SIgA可以有效防止菌落形成而達到保護黏膜組織的功能。
雌性哺乳動物於產後2-3天內所初分泌的乳汁稱之為初乳（colostrum），其後再分泌的乳汁則被稱為常乳。初乳中亦含有IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM等免疫球蛋白，而該些免疫球蛋白對於病毒、細菌、寄生蟲及酵母菌等病原體皆能發揮良好的防禦作用。
雖然初乳的潛在效益極高，然而，由於初乳的分泌時程過短，以及初乳中的蛋白不穩定、收集不易及保存困難等因素，使得針對初乳蛋白於實際應用層面上之發展至今仍甚為遲緩。
因此，本發明的目的即在提供一種經修飾之初乳蛋白質組合物，係具有預防外來病原體之功效。
本發明為解決習知技術之問題所採用之技術手段係提供一種經修飾之初乳蛋白質組合物，包含：經修飾之初乳蛋白質載體，其胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示；以及抗原片段，係連接於經修飾之該初乳蛋白質載體。
在本發明的一實施例中係提供一種經修飾之初乳蛋白質組合物，該抗原片段之胺基酸序列係選自引發黏膜免疫之疾病的致病菌及／或病毒之部分胺基酸序列。
在本發明的一實施例中係提供一種經修飾之初乳蛋白質組合物，該抗原片段之胺基酸序列係選自腫瘤標記之部分胺基酸序列。
在本發明的一實施例中係提供一種經修飾之初乳蛋白質組合物，經修飾之該初乳蛋白質組合物更包括載劑、賦形劑或佐劑。
在本發明的一實施例中係提供一種如上述的經修飾之初乳蛋白質組合物用於製備誘導黏膜免疫系統針對該抗原片段而產生抗原專一性免疫球蛋白IgA的醫藥組成物的用途。
經由本發明的經修飾之初乳蛋白質組合物所採用之技術手段，使得生物體得以藉由連接有抗原片段的經修飾之該初乳蛋白質組合物，促進並增強黏膜免疫反應，提高對抗該抗原片段之抗原專一性免疫球蛋白IgA之生成，進而達到預防特定病原體之感染的目的。本發明的經修飾之該初乳蛋白質組合物係用於製備誘導黏膜免疫系統針對該抗原片段而產生抗原專一性免疫球蛋白IgA的醫藥組成物的用途，使經修飾之該初乳蛋白質組合物作為疫苗相關之醫藥組成物，為預防各式病原體所造成之疾病提供了更多元的疫苗種類選擇。
以下根據第1圖至第2圖，而說明本發明的實施方式。該說明並非為限制本發明的實施方式，而為本發明之實施例的一種。
依據本發明的一實施例的一種經修飾之初乳蛋白質組合物，包含：經修飾之初乳蛋白質載體，其胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示；以及抗原片段，係連接於經修飾之該初乳蛋白質載體。
依據本發明的實施例的經修飾之該初乳蛋白質組合物，其中該抗原片段之胺基酸序列係選自引發黏膜免疫之疾病的致病菌及／或病毒之部分胺基酸序列。
依據本發明的實施例的經修飾之該初乳蛋白質組合物，其中經修飾之該初乳蛋白質組合物更包括載劑、賦形劑或佐劑。
依據本發明的實施例的經修飾之該初乳蛋白質組合物，係用於製備誘導黏膜免疫系統針對該抗原片段而產生抗原專一性免疫球蛋白IgA的醫藥組成物的用途。
詳細而言，經修飾之該初乳蛋白質載體，其胺基酸序列係如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列，為自如SEQ ID NO：2所示之野生型初乳蛋白質之胺基酸序列之第33位置的異白胺酸被丙胺酸取代，第101位置的麩胺酸被半胱胺酸取代，以及第175位置的精胺酸被半胱胺酸取代而產生。
進一步而言，經修飾之該初乳蛋白質載體之三級結構相較於野生型初乳蛋白質更為穩定。
詳細而言，本發明之經修飾之該初乳蛋白質載體係為純化結合於細菌之細胞壁上的胜肽聚醣的蛋白質，且該蛋白質載體經修飾其序列而得，並依其特性命名為病原辨識蛋白（Pathological Recognition Protein, PRP）。
本發明的實施例的經修飾之該初乳蛋白質組合物所包含之該抗原片段之胺基酸序列係為第二型豬鏈球菌（S. suis serotype 2）之部分胺基酸序列。當然，本發明之經修飾之該初乳蛋白質組合物所包含之該抗原片段之胺基酸序列並不以此為限，該抗原片段之胺基酸序列係可選自各式病原體之胺基酸序列。
詳細而言，豬鏈球菌之各血清型中，以第二型最常存於健康帶菌或發病豬群，因此較難以針對該菌所造成之疾病進行流行病學分析以及追查感染源。豬鏈球菌主要引起離乳豬的腦膜炎、敗血症、心內膜炎、關節炎甚至之氣管肺炎，亦會引起人類的腦膜炎、心內膜炎及敗血症，其他症狀包括關節炎、支氣管肺炎及發熱，嚴重時會導致敗血性休克、瀰漫性血管內凝血……等，屬於重要之人畜共通傳染病。
本發明之實施例係使用間接酵素結合免疫吸附分析法（Indirect enzyme-linked immunosorbent assay, Indirect ELISA）偵測血清中抗原專一性免疫球蛋白之存在。實驗方法係如下所示：
採用約4週齡之無特定病原（specific pathogen free, SPF）級雌性BALB/c小鼠，將小鼠分為免疫組（即，經口服餵食含有經修飾之該初乳蛋白質組合物之酵母菌後之小鼠）以及控制組（即，免疫接種前，未經口服餵食含有經修飾之該初乳蛋白質組合物之酵母菌之小鼠）各40隻，每10隻小鼠成1組且口服餵食接種25 μg之該初乳蛋白質組合物，於口服餵時含有該初乳蛋白質組合物之酵母菌後的第1、3、5以及第7天係藉由尾靜脈抽取小鼠血液樣本，並透過間接酵素結合免疫吸附分析法偵測專一性免疫球蛋白IgA之濃度變化。
首先，96孔微量多孔盤（96-well microplates）於4°C下以透過碳酸鹽緩衝液（15 mmol/1 Na
2CO
3、35 mmol/1 NaHCO
3[pH 9.6]）稀釋至1 μg/ml的純化重組蛋白包覆過夜。
使用含有0.05% Tween-20（PBST）的PBS洗滌3次後，該微量多孔盤係於37°C下用含有5%脫脂奶粉的PBST阻斷1小時。
隨後將使用PBST進行序列稀釋（自1:400至1:3276800的兩倍稀釋梯度）的控制組和免疫組的小鼠血清以每孔100 μl添加到適當的孔中，並將該微量多孔盤於37°C下孵育1小時。
洗滌3次後，以1:5000稀釋度添加二級抗體（結合過氧化物酶之山羊抗小鼠IgA抗體（Santa Cruz Biotechnology, CA）），以每孔100 μl添加到適當的孔中，將該微量多孔盤於37°C下孵育30分鐘。
最後，將該微量多孔盤與作為山葵過氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）之受質的鄰苯二胺一起孵育，以觀察反應。
終點效價係定義為血清的最高稀釋度，此時免疫組之血清於490 nm處的吸光值（OD 490）比控制組之血清的平均OD 490高2.1 倍。
針對IgA1以及IgA2之偵測，係以1:2000之稀釋度的免疫組的小鼠血清以每孔100 μl添加。結合過氧化物酶之山羊抗小鼠IgA1以及IgA2（Santa Cruz Biotechnology）係作為二級抗體。結果表示為平均值±標準差。
如第1圖所示，免疫組之專一性免疫球蛋白IgA1以及IgA2皆高於控制組，專一性免疫球蛋白IgA1以及IgA2於口服餵食含有經修飾之該初乳蛋白質組合物之酵母菌後的第3天以及第5天時達到最高濃度，而口服餵食後的第7天則快速下降，此可能是因為口服餵食後的第1天時所測得的專一性免疫球蛋白部分為IgM，直到第三天方轉化為IgA，而第7天時的快速下降是因為IgA只可在血液中存在7天之故。
依據本發明的另一實施例的經修飾之該初乳蛋白質組合物，其中該抗原片段之胺基酸序列係選自腫瘤標記之部分胺基酸序列。
本發明之另一實施例係使用間接酵素結合免疫吸附分析法（Indirect enzyme-linked immunosorbent assay, Indirect ELISA）偵測血清中抗原專一性免疫球蛋白之存在。實驗方法係如下所示：
癌胚胎抗原序列片段設計與質體建構：
本發明之另一實施例係將癌胚胎抗原（Carcinoembryonic Antigen, CEA）之整個抗原片段分切成17個長度為9~15個胺基酸的抗原片段，從中篩選最適合的片段進行試驗。CEA片段經合成後，分別建構在帶有經修飾之初乳蛋白質基因的pDONR質體上，所建構的質體最後以定序分析的方式確認序列無誤。建構好的17個質體以大腸桿菌放大培養後，再轉殖到酵母菌中，質體篩選條件為：1. 不產生有毒物質，能在酵母菌生長的質體；2. 能在URA-培養基上生長的菌株；3. 定序沒有發生變異的質體；4. 能使小鼠產生較多中和抗體的菌株。最後再以軟體分析依據期待電性、結構、穩定度、化學性，找出適合的包含經修飾之初乳蛋白質載體以及CEA抗原片段的經修飾之初乳蛋白質組合物（以下簡稱為PRP癌抗原複合胜肽）。
IgA中和抗體測試：
目的為檢測小鼠餵食PRP癌抗原複合胜肽後，專一性IgA表現量是否增加。C57BL/6J小鼠分別餵食未含有PRP癌抗原複合胜肽之空酵母菌以及含有PRP癌抗原複合胜肽的酵母菌，餵食未含有PRP癌抗原複合胜肽之空酵母菌之小鼠係屬於控制組，餵食含有PRP癌抗原複合胜肽的酵母菌之小鼠係屬於免疫組；餵食劑量為2500 mg/kg，控制組及免疫組於餵食後第1天、第3天以及第5天以臉頰採血的方式收集小鼠血清。收集的血清檢體以ELISA的方式進行IgA中和抗體檢測，流程如下：將CEA蛋白附著於微量多孔盤上（50 ng/孔），清洗後加入稀釋後的血清檢體（100 µl/孔），清洗後加入抗IgA抗體，洗去多餘的檢測抗體並添加HRP耦合物，添加HRP受質以間接檢測結合蛋白，並以ELISA微盤分析儀以吸光值OD 450 nm測量。
第2圖為控制組及免疫組中各一隻小鼠於餵食各自的酵母菌後第3天的結果，小鼠血清經序列稀釋後檢測其IgA中和抗體的含量。詳細而言，免疫組之小鼠經餵食含有PRP癌抗原複合胜肽的酵母菌的第3天後，在20倍稀釋的小鼠血清中，專一性辨識CEA抗原片段的IgA抗體含量顯著的高於控制組（即，餵食空酵母菌的小鼠），顯示本發明之該初乳蛋白質組合物確實能夠誘導老鼠產生專一性IgA，且其IgA具有辨識CEA抗原的能力。
本案之經修飾之該初乳蛋白質組合物，係能幫助生物體藉由經修飾之該初乳蛋白質載體所連接之抗原片段，促進並增強黏膜免疫反應，提高對抗該抗原片段之抗原專一性免疫球蛋白IgA之生成，進而達到預防特定病原體之感染的目的。本發明的經修飾之該初乳蛋白質組合物係用於製備誘導黏膜免疫系統針對該抗原片段而產生抗原專一性免疫球蛋白IgA的醫藥組成物的用途，使經修飾之該初乳蛋白質組合物作為疫苗相關之醫藥組成物，為預防各式病原體所造成之疾病提供了更多元的疫苗種類選擇。
以上之敘述以及說明僅為本發明之較佳實施例之說明，對於此項技術具有通常知識者當可依據以下所界定申請專利範圍以及上述之說明而作其他之修改，惟此些修改仍應是為本發明之發明精神而在本發明之權利範圍中。
第1圖為顯示根據本發明的一實施例的未經口服餵食含有經修飾之初乳蛋白質組合物之酵母菌之小鼠；以及經口服餵食含有經修飾之該初乳蛋白質組合物之該酵母菌後之小鼠於第1、3、5、7天所分別測得之血清中免疫球蛋白IgA1以及IgA2的吸光值長條圖；以及
第2圖為顯示根據本發明的另一實施例的經口服餵食未含有經修飾之初乳蛋白質組合物之酵母菌之小鼠；以及經口服餵食含有經修飾之該初乳蛋白質組合物之該酵母菌後之小鼠於第3天所測得之血清中免疫球蛋白IgA，經序列稀釋後的吸光值長條圖。
Claims (5)
- 一種經修飾之初乳蛋白質組合物，包含： 經修飾之初乳蛋白質載體，其胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示；以及 抗原片段，係連接於經修飾之該初乳蛋白質載體。
- 如請求項1所述的經修飾之初乳蛋白質組合物，其中該抗原片段之胺基酸序列係選自引發黏膜免疫之疾病的致病菌及／或病毒之部分胺基酸序列。
- 如請求項1所述的經修飾之初乳蛋白質組合物，其中該抗原片段之胺基酸序列係選自腫瘤標記之部分胺基酸序列。
- 如請求項1所述的經修飾之初乳蛋白質組合物，其中經修飾之該初乳蛋白質組合物更包括載劑、賦形劑或佐劑。
- 一種將如請求項1所述之經修飾之初乳蛋白質組合物用於製備誘導黏膜免疫系統針對該抗原片段而產生抗原專一性免疫球蛋白IgA的醫藥組成物的用途。
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| TW111134606A TW202411248A (zh) | 2022-09-14 | 2022-09-14 | 經修飾之初乳蛋白質組合物及其用途 |
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