JP2003511698A - 便中の酸耐性微生物の改良された検出方法 - Google Patents

便中の酸耐性微生物の改良された検出方法

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コンネクス・ゲゼルシャフト・ツーア・オプティミエルング・フォン・フォルシュング・ウント・エントヴィックルング・エムベーハー
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、酸耐性微生物での哺乳動物の感染を検出するための方法であって、（ａ）哺乳動物の便試料を、（ａａ）１種類の受容体と、酸耐性微生物由来の抗原と当該受容体との複合体形成を可能にするような条件下でインキュベートする、又は（ｂ）２種類の異なる受容体群と、酸耐性微生物由来の抗原と当該２種類の受容体との複合体形成を可能にするような条件下でインキュベートする、そして、ここにおいて、（ａａ）の受容体又は（ａｂ）の受容体群は、抗原と特異的に結合し、当該抗原は少なくともいくつかの哺乳動物において、天然の構造、又は酸耐性微生物で感染されたもしくは免疫化された後に哺乳動物が抗体を産生するような構造、又は、酸耐性微生物の抽出物若しくは溶解物、又はそれ由来のタンパク質若しくはその断片若しくは合成ペプチドが抗体を産生するような構造、に相当する構造を、腸を通過後に示す；そして（ｂ）（ａ）による少なくとも１種類の抗原−受容体複合体の形成を検出することを含む、前記方法に関する。好ましくは、酸耐性微生物は細菌であり、特に、ヘリコバクター・ピロリ、ヘリコバクター・ヘパティクス、カンピロバクター・ジェジュニまたはヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）である。さらに、単数または複数の受容体（群）は、好ましくは、カタラーゼの単数または複数のエピトープに結合する。さらに、本発明は、前記成分を含む、診断および医薬組成物、及び試験装置、並びに前記成分を含むパッケージングに関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明の記載は、いくつかの公表された文献に言及する。これらの文書の主題
は、本明細書に援用される。
【０００２】 本発明は、酸耐性微生物での哺乳動物の感染を検出するための方法であって、
（ａ）哺乳動物の便試料を、（ａａ）酸耐性微生物由来の抗原と受容体の複合体
形成を可能にする条件下で、受容体と；または（ａｂ）酸耐性微生物の抗原と２
つの受容体群の複合体形成を可能にする条件下で、２つの異なる受容体群とイン
キュベーションし、ここで（ａａ）記載の受容体または（ａｂ）記載の受容体群
は、少なくともいくつかの哺乳動物で、天然構造、あるいは該酸耐性微生物に感
染したまたは該微生物で免疫感作された後、それに対して哺乳動物が抗体を産生
する構造、あるいは該酸耐性微生物の抽出物もしくは溶解物、またはそれに由来
するタンパク質もしくはその断片、または合成ペプチドが抗体を産生するような
構造に相当する構造を、腸通過後に示す抗原に、特異的に結合する；そして（ｂ
）（ａ）記載の少なくとも１つの抗原受容体複合体の形成を検出する、前記方法
に関する。好ましくは、酸耐性微生物は、細菌、特にヘリコバクター・ピロリ（
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、ヘリコバクター・ヘパティクス（
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｈｅｐａｔｉｃｕｓ）、カンピロバクター・ジェジ
ュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）またはヒト型結核菌（Ｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）である。さらに、単数ま
たは複数の受容体（群）は、好ましくは、カタラーゼ、メタロプロテイナーゼ又
はウレアーゼの単数または複数のエピトープに結合する。さらに、本発明は、前
記成分を含む、診断および医薬組成物、並びに前記成分を含む試験装置および該
成分を含むパッケージングに関する。
【０００３】 今日、微生物病原体または寄生虫での哺乳動物生物の感染を検出するための多
様な侵襲性、半侵襲性または非侵襲性の方法がある。すべての侵襲性の方法は、
内視鏡検査および生検を前提とする。侵襲性の技術を用いる場合、例えば生検で
は、検査される被験者の物理的完全性が侵される。生検によって標本を得るのは
、時間がかかり、費用がかかり、そして一般に患者に緊張を強いる。特定の微生
物、例えばＨ．ピロリでの感染は、胃粘膜全体に渡って分布する必要はないため
、非感染部位での生検によって標本を得ると、偽陰性結果を伝える可能性がある
。すべての侵襲性の方法の別の不都合な点は、すべての検査結果が、プロトン−
ポンプ阻害剤、ビスマスまたは抗生物質での先の処置によって影響を受けること
である。
【０００４】 半侵襲性または非侵襲性の診断法は、生物において、干渉することなく測定す
ることが可能なパラメーターにおける変化に注目する。この目的のため、好まし
くは体液および分泌物、例えば血清、呼吸、尿、唾液、汗または便の試料を採取
し、そして解析する。
【０００５】 直接法では、病原体または寄生虫、その成分または分解産物の存在を、電子顕
微鏡、光学特性、質量分析、放射能壊変産物または特定の酵素反応の測定によっ
て検出する。しかし、これらの方法は、しばしば、高価でそして洗練された装置
を必要とする（例えば呼吸試験）。対照的に、間接法は、病原体または寄生虫に
対する宿主生物の反応、例えば宿主の血清または唾液中の病原体の抗原に対する
抗体の存在を検出するのに用いられる。侵襲性技術を用いて生物に干渉するのは
、ほとんどの場合、生物に緊張を強い、そしてまた高価でそして洗練された装置
を必要とし、そして健康上の危険を伴うため、上述の体液および分泌物の試料を
採取するのが比較的単純であるので、非侵襲性技術が選択される方法である。さ
らに、必ずしもすべての宿主が、特定の病原体または寄生虫に、同一の方式で反
応するわけではなく、そして宿主の反応が遅延し、そして該生物から病原体また
は寄生虫が除去された後であっても持続する可能性があるため、直接法が常に好
まれるべきである。したがって、理想的には、診断は、体液または分泌物におけ
る病原体または寄生虫の非侵襲性直接検出によって行われる。間接的方法と対照
的に、これは現在の感染状態を決定することを可能にする。
【０００６】 さらに、診断法はまた、他の側面に関しても最適化されるべきであり：高再現
性、感度および特異性、保証される入手可能性および用いられる材料の一定の品
質、方法を作成しそして実行するための低コスト、および高価でそして洗練され
た装置と独立の単純な適用が考慮すべきパラメーターである。
【０００７】 上述の理由のため、医学的診断法において、解析しようとする対応する物質に
関して、非常に特異的であるように、選択することが可能である、分子構造に対
する特定の種類の物質（例えば抗体、受容体、レクチン、アプタマー）の高い選
択性および結合親和性に基づく方法の使用が増加している。これは、体に天然に
存在する、または体に対して異質の（ｆｏｒｅｉｇｎ）物質を検出するための、
安価で、単純でそしてより時間がかからない方法の開発につながる、主に、これ
らの物質の固体表面上の固定、並びに、放射性核種カップリング、適切な基質と
の発色反応を誘発する酵素のカップリング、または非常に特異的な結合親和性を
持つ有色粒子のカップリング（例えば、ＥＬＩＳＡ＝酵素連結免疫吸着アッセイ
における）の可能性であった。
【０００８】 これらの検出法の開発の最初の段階において、もっぱらポリクローナル抗体が
用いられた。しかしこれらは、当業者に公知のいくつかの不都合な点を有し、こ
れらの主なものは、限定された入手可能性およびしばしば交差反応性である。モ
ノクローナル抗体を調製するための方法の開発（Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎ（１９７５））、受容体の単離および細胞宿主系におけるその指示された
発現における進歩、特定の炭水化物に高い親和性を持つレクチンの開発、および
一本鎖核酸分子（アプタマー）が分子構造に特異的に結合することが可能である
という発見によって、これらの不都合な点の大部分を排除することが可能になっ
た。今日、検出法の特異性および感度は、比較的単純な方法で最適化することが
可能である。
【０００９】 高い特異性のため、こうした方法は、認識されている構造要素が、調べようと
する標本集団内で一定であり、そして検出しようとする物質に特異的である限り
、ハプテン、ペプチドまたはタンパク質などの、個々の定義される物質に特に適
している。さらに、これらは、体液における測定によく適しており、そしてした
がって標本マトリックスの病原体の直接検出の明らかなオプションである。した
がって、先行技術は、便由来の、例えば赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈ
ｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）（Ｈａｇｕｅ（１９９３）， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ．
Ｄｉｓ． １６７：２４７−９）、腸管出血性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）（ＥＨＥＣ、Ｐａｒｋ（１９９６）， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ． ３４：９８８−９９０）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌ
ｅｒａｅ）（Ｈａｓａｎ（１９５４）， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌ
ｅｔｔ． １２０：１４３−１４８）、トロウイルス（Ｔｏｒｏ ｖｉｒｕｓ）
様粒子（Ｋｏｏｐｍａｎｓ（１９９３）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
． ３１：２７３８−２７４４）または無鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ ｓａｇｉｎａ
ｔａ）（Ｍａｃｈｎｉｃｋａ（１９９６）， Ａｐｐｌ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ
． ３７：１０６−１１０）を診断するための方法を記載する。
【００１０】 上述の病原体が共通に有する特徴は、これらが、すべての場合、ヒトにおいて
、宿主の腸中で生存可能であり、そして繁殖可能であることである。したがって
、これらは、腸において活性である分解および消化系の存在下で、生き残り、そ
して増殖することを可能にする機構を有する。したがって、多数の損なわれてい
ない（ｉｎｔａｃｔ）またはほぼ損なわれていない病原体または寄生虫が、便と
共に排出される可能性がある。概して、検出試薬、例えば損なわれていない病原
体または寄生虫を認識する抗体によって、便または調製された便試料において、
これらを検出するのは容易である。
【００１１】 しかし、一方、胃腸管に対する罹患組織（例えば肺、胃、膵臓、十二指腸、肝
臓）の関連のため、便に存在する可能性があり、そして一方、腸自体において、
生存可能でなくそして／または繁殖可能でない、いくつかの病原体または寄生虫
がある。これらの病原体および寄生虫には、例えばヘリコバクター・ピロリ（Ｈ
．ピロリ）およびヘリコバクター・ヘパティス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｈ
ａｐａｔｉｓ）、ヒト型結核菌および他のミコバクテリウム、肺炎クラミジア（
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、レジオネラ・ニューモフィラ（
Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａｅ）、ニューモシスティス・カ
リニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）および他のものが含まれる
。これらの病原体は、例えば、痰中において検出されうる。しかしながら、痰に
おけるヒト型結核菌の検出が可能なのは、短い期間のみ、即ち、病原体を含む洞
が開かれてからである。さらに、調べたい態様の痰試料は常に得られるものでは
ないという事実により、検出はより困難となる。このことは、例えば、乳児、混
乱状態の（ｃｏｎｆｕｓｅｄ）患者、又は動物に当てはまる。他の病原体、例え
ばレジオネラ・ニューモフィラは、腎臓を介して尿に入る抗原によって、特異的
に検出することが可能である。それでも、これは、尿に存在する量が、検出に十
分である場合にのみ可能である。便中の検出は、優れた代替法であるだろう。し
かし、これらの生物では、腸通過は、腸フロラの消化および分解機構による強い
攻撃と組み合わされる。この場合、観察される病原体に特異的な分子構造が破壊
される可能性があるか、またはその濃度が非常に減少する可能性がある。
【００１２】 他の酸耐性細菌でもまた、腸における病原体の分解が、便試料中の信頼できる
検出のため問題となることがわかった。感染患者の胃における微生物の数は、腸
における他の細菌定着の数に比較して小さい。さらに、微生物および微生物断片
は、胃を離れた後、プロテアーゼが豊富な腸を、長い間、通過しなければならな
い。これらの状況のため、損なわれていないタンパク質は、少量しか便に見出す
ことができない。しかし、常に特定のタンパク質の同一断片が、腸管を損なわれ
ずに通過すると仮定することは不可能である。この別の結果は、ＥＬＩＳＡに必
要な、１つの抗原上の２つのエピトープの組み合わせが、もはや必ずしも天然タ
ンパク質に存在するものと同様ではなく、そして互いに近接して位置するエピト
ープが、同一分子上の２つのエピトープを必要とする検出法において、陽性の結
果を示す可能性が最も高いことである。理想的には、同一分子上の１つのエピト
ープのみが検出に必要とされる。さらに、感染患者の便中に検出される抗原の分
布は、腸通過中の抗原のプロセシングにおける個々の特徴を示唆する。この問題
を減少させる第一のアプローチは、ＥＰ−Ａ ０ ８０６ ６６７の開示に提供
されている。この出願において、特定のＨ．ピロリ株の溶解物で、ポリクローナ
ル抗体を誘導することが可能であることが示された。これらの抗体は、異なる地
理的領域由来のより広い多様性の株を認識する。しかし、この出願は、血清によ
って、どの抗原が認識されるかを示さない。免疫血清が、すべての標準化のため
の努力にも関わらず多様であるという事実を考慮し、上述の出願で開発された方
法は、広い適用には最適以下であると認識しなくてはならない。さらに、ポリク
ローナル血清を提供するため、新たな動物を免疫しつづける必要がある。対応す
る方法は、時間がかかり、そして費用もかかる。
【００１３】 理想的には、この病原性生物／寄生虫に特異的な、単一のまたは限定された数
の試薬（群）が、上に広げられたような酸耐性病原性生物／寄生虫の感染の信頼
できる検出を可能にするべきである。そのような可能性は、最終的には、対応す
る検出方法の費用をかなり削減するであろう。したがって、本発明の根底にある
技術的問題は、対応する検出方法又は対応する試薬をを提供することであった。
【００１４】 この技術的問題は、請求項に特徴付けられる態様を提供することによって、解
決された。 したがって、本発明は、酸耐性微生物での哺乳動物の感染を検出するための方
法であって、（ａ）哺乳動物の便試料を、（ａａ）酸耐性微生物由来の解析物ま
たは抗原と受容体の複合体形成を可能にする条件下で、受容体と；または（ａｂ
）酸耐性微生物の解析物または抗原と２つの受容体群の複合体形成を可能にする
条件下で、２つの異なる受容体群とインキュベーションし、ここで（ａａ）記載
の受容体または（ａｂ）記載の受容体群は、少なくともいくつかの哺乳動物で、
天然構造、あるいは該酸耐性微生物に感染したまたは該微生物で免疫感作された
後、それに対して哺乳動物が抗体を産生する構造、あるいは該酸耐性微生物の抽
出物もしくは溶解物、またはそれに由来するタンパク質もしくはその断片、また
は合成ペプチドが抗体を産生するような構造に相当する構造を、腸通過後に示す
抗原に、特異的に結合する；そして（ｂ）（ａ）記載の少なくとも１つの抗原−
受容体複合体の形成を検出する、前記方法に関する。
【００１５】 本発明の意味内で、用語「酸耐性微生物」は、宿主に適応する特性／機構のた
め、好ましくは免疫学的試験によって、またはアプタマーの使用によって、検出
することが可能な効果を持ち、消化管の物理的および化学的影響に抵抗するいか
なる微生物も含む。こうした酸耐性微生物の例は、ヘリコバクター・ピロリ、ヘ
リコバクター・ヘパティクム（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｈａｐａｔｉｃｕｍ
）、ヒト型結核菌、偽結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびミコバクテリウム・カンサシ（Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｃａｎｓａｓｓｉｉ）である。
【００１６】 本発明において、用語「哺乳動物の便試料」は、本発明の検出法に用いること
が可能ないかなる便試料も意味する。特に、該用語は、基本的に既知の方法にし
たがった診断試験のため調製されている便試料を含む。調製は、例えば、ＲＩＤ
ＡＳＣＲＥＥＮ（登録商標）エントアメーバ属酵素免疫アッセイ（Ｒ−Ｂｉｏｐ
ｈａｒｍ ＧｍｂＨ、ダルムシュタット）にしたがって行ってもよい。
【００１７】 当業者は、容易に「複合体形成を可能にする条件」を調整することが可能であ
り、またＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、同書も参照されたい。これらの条件は、
例えば、生理学的条件である。
【００１８】 本発明において、用語「天然構造（・・・）に対応する構造を、腸通過後に示す
」は、抗原のエピトープが、腸を通過しない同一抗原／エピトープに対して得ら
れるか、またはそれに結合する受容体、例えばモノクローナル抗体、その誘導体
もしくは断片あるいはアプタマーによって、腸通過後、認識されることを意味す
る。言い換えると、上述の受容体に特異的に結合されるエピトープ／抗原は、構
造に関して、損なわれないかまたは本質的に損なわれずに通過し、そして分解さ
れていない。エピトープ／抗原の天然構造の供給源は、例えばフレンチプレスに
よって破壊され、そしてさらに標準法にしたがって精製された細菌抽出物（例え
ばＳａｍｂｒｏｏｋら， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， 第２版， １９８９， ＣＳＨ Ｐｒｅ
ｓｓ， 米国コールドスプリングハーバーを参照されたい）、または標準法にし
たがってさらに精製された細菌溶解物（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、同書）であ
ってもよい。
【００１９】 本発明において、用語「（・・・）該酸耐性微生物に感染したまたは該微生物で
免疫感作された後、それに対して哺乳動物が抗体を産生する構造、あるいはその
抽出物もしくは溶解物、またはそれに由来するタンパク質もしくはその断片、ま
たは合成ペプチドが抗体を産生するような構造に相当する構造を、腸通過後に示
す」は、受容体に認識されるエピトープが、哺乳動物、好ましくはヒトの免疫系
によって提示されるエピトープに対応することを意味する。抗原提示の機構と共
に、抗原のプロセシングおよびそこから生じる多様な抗体を導く機構は、先行技
術に知られ、そして例えばＪａｎｅｗａｙおよびＴｒａｖｅｒｓ， Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｉｅ， 第２版 １９９７， Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃ
ｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ， ハイデルベルグに記載されている。これら
のエピトープは天然エピトープと異なる可能性がある。哺乳動物と微生物または
タンパク質または断片または合成ペプチドとの接触は、天然感染（合成ペプチド
を除く）によって、または免疫感作によって、達成されてもよい。免疫感作に関
しては、微生物／タンパク質の抽出物、溶解物、合成ペプチドなどもまた、用い
てもよい。適切な免疫感作法は、先行技術に知られ、そして例えばＨａｒｌｏｗ
およびＬａｎｅ、同書に記載されている。適切な抗体はまた、例えば、免疫感作
および／または合成ペプチド、組換え産生タンパク質、抽出物、溶解物または部
分的消化タンパク質などの代理（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）に関するスクリーニング
によって、得ることも可能である。
【００２０】 「合成ペプチド」は、天然抗原または腸を通過した抗原の少なくとも１つのエ
ピトープを有するペプチドを含む。ペプチドは、抗原またはその断片と同一の一
次構造を有してもよい。しかし、これらはまた、異なる一次構造（一次アミノ酸
配列、例えば保存的交換）を有してもよい。
【００２１】 用語「特異的に結合する」は、本明細書において、受容体が、非感染哺乳動物
の試料中の他のエピトープとまったくまたは本質的にまったく反応性を示さない
ことを意味する。通常、受容体は、便試料に存在する抗原のエピトープのみに結
合する。
【００２２】 本発明の本態様において、調製された便試料は、例えば、固相に結合させるこ
とが可能であり、そして感染病原体は標識受容体で検出することが可能である。
腸通過後に存在する抗原が、（なお）（ホモ）二量体または多量体型で存在する
場合、同一受容体を、捕捉因子および検出因子両方として用いてもよい。
【００２３】 さらに、本発明の方法には、検出の成功が、本質的に一定の方式で、腸通過後
に、抗原性タンパク質の１つのエピトープのみが検出されることを必要とするこ
とが重要である。このエピトープは、ホモ二量体または多量体上に何度も存在し
てもよい。しかし、このエピトープが検出可能型で見出される可能性は、１つ以
上のエピトープが検出されることに頼らなければならない検出試験の場合より、
有意により高い。
【００２４】 最後に、１つの受容体のみを必要とする本発明の方法は、費用および標準化に
関して、利点を伴う。 前記微生物由来の特定の抗原が、検出のため、本質的に一定である、腸通過後
のエピトープ構造を有するという、本発明にしたがった、驚くべき知見に基づき
、第二の態様もまた、本発明に本質的であるとみなさなければならない。本態様
は、異なる受容体が、同一抗原の異なるエピトープに結合するという事実に基づ
く。ここで、用語「本質的に」は、単数または複数のエピトープおよびしたがっ
て微生物での対応する感染が、７０％以上、好ましくは少なくとも７５％、より
好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５
％以上、そして最も好ましくは９８％以上の感染個体で検出することが可能であ
ることを意味する。理想的には、感染は、感染個体の１００％で検出される。
【００２５】 本発明にしたがい、驚くべきことに、酸耐性微生物の抗原のエピトープに特異
的に結合するただ１つの単一の受容体、または同一抗原の２つのエピトープに特
異的に結合する２つの受容体群によって、これらの細菌／病原体での感染は、比
較的信頼できる方式で診断することが可能である、ということが発見された。本
発明は、前記の特性を有する他のエピトープが、他の受容体によって、例えばモ
ノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体あるいはアプタマーによって、
認識される態様を含む。後者の態様は、診断の信頼性をさらに増加させるのに適
している。好適には、これらの他の受容体は、すべて好ましくはＨ．ピロリ由来
である、ウレアーゼ、好ましくはβ−ウレアーゼ、２６ｋＤａタンパク質または
Ｈｓｐ ６０を特異的に認識する抗体、断片または誘導体であってもよい。これ
らのタンパク質／タンパク質断片の１つまたはそれ以上の検出は、同一の試験ま
たは同一試料の異なる部分での別個の試験で行ってもよい。
【００２６】 本発明の結果は、主に、当該技術分野が異なって教授していたため、驚くべき
ことである。例えばＨ．ピロリの場合、主要抗原がＥＬＩＳＡで望ましい特異性
および感度を示さないことが見出された； Ｎｅｗｅｌｌら， Ｓｅｒｏｄｉａ
ｇ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． ３（１９８９），
１−６を参照されたい。さらに、ＥＰ−Ａ−０ ８０６ ６６７は、Ｈ．ピロ
リ株の遺伝的多様性のため、モノクローナル抗体などの受容体で、Ｈ．ピロリ感
染を信頼可能に検出するのは不可能であると解説する。
【００２７】 上述の当該技術分野に比較し、本発明の方法は、主に、ただ１つの受容体で比
較的信頼できる診断を可能にするため、好適である。ＥＬＩＳＡにおいて、例え
ば抗体、その断片、誘導体またはアプタマーなどの受容体の対が検出に用いられ
、対の２つの受容体群が同一抗原上の同一のまたは異なるエピトープに結合する
。例えばＨ．ピロリ・カタラーゼは、いくつかの同一サブユニットの多量体構造
を形成する。したがって、ＥＬＩＳＡまたは他のアッセイにおいて、同一受容体
を捕捉受容体および検出受容体両方として用いることが可能である。本発明の方
法の別の利点は、該方法が、直接的で、そして非侵襲性の方法であり、患者に対
する上述の利点および決定されるべき疾患の段階に関する信頼性を増加させると
いう事実である。
【００２８】 好ましい態様において、酸耐性微生物は酸耐性細菌である。 いくつかの酸耐性細菌が、当該技術分野において知られている。特に好ましい
態様において、酸耐性細菌は、ヘリコバクター、カンピロバクター属、またはミ
コバクテリウム属に属する。
【００２９】 別の特に好ましい態様において、細菌は、ヘリコバクター・ピロリ、ヘリコバ
クター・ヘパティクム、カンピロバクター・ジェジュニ種に属する細菌またはヒ
ト型結核菌種に属する細菌である。
【００３０】 別の特に好ましい態様において、単数または複数の受容体（群）は、抗体（群
）、その断片（群）または誘導体（群）、あるいはアプタマー（群）である。 本発明の意味内で、モノクローナル抗体の「断片（群）」または「誘導体（群
）」は、モノクローナル抗体と同一の結合特異性を有する。こうした断片または
誘導体は、標準法にしたがって産生することが可能である；例えばＨａｒｌｏｗ
およびＬａｎｅ， “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ”， ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ， 米国コールドスプリングハーバー，
１９８８を参照されたい。断片の例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、またはＦｖ
断片が含まれる。ｓｃＦｖ断片は誘導体の例である。誘導体はまた、抗体と同一
の結合特性、または改善された結合特性を有する、化学的に産生された物質であ
ってもよい。こうした物質は、例えば、ペプチド擬似体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍ
ｅｔｉｃｓ）によって、または異なる周期のファージディスプレーおよび改善さ
れた結合特性に関する続く選択によって、生成してもよい。本発明にしたがい、
アプタマーは、高い特異性および親和性を持って、多数の標的配列に結合する、
ＲＮＡ；ｓｓＤＮＡ（ｓｓ＝一本鎖）、修飾ＲＮＡまたは修飾ｓｓＤＮＡなどの
核酸である。用語「アプタマー」は、先行技術に知られ、そして例えばＯｓｂｏ
ｒｎｅら， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １（１９９７
）， ５−９に、またはＳｔｕｌｌおよびＳｚｏｋａ， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ
． １２（１９９５）， ４６５−４８３に定義されている。
【００３１】 用語「抗原−抗体複合体」は、本発明の意味内で、抗原が天然抗体と形成する
複合体のみでなく、その断片群または誘導体群と形成するものも含む。 本発明は、モノクローナル抗体（群）またはその断片（群）もしくは誘導体（
群）のみが、あるいはアプタマーのみが用いられる態様と共に、１つの試験中に
異なる種類の検出試薬が用いられる態様を含む。したがって、２例のみを挙げる
と、第一のモノクローナル抗体を第二の抗体誘導体と共に用いるか、または第一
のアプタマーを第二の抗体断片と用いることが可能である。この観点で、用語「
第一」および「第二」は、第一および第二の検出試薬を指す。しかし、これは、
２つの抗体群、その誘導体群または断片群あるいは２つのアプタマー群が常に用
いられることを意味しない。
【００３２】 モノクローナル抗体群、その断片群または誘導体群の、あるいはアプタマー群
の使用は、診断法の信頼性において、規格の容易な維持を確実にし、これは、こ
れまでに知られており、そしてこの目的で導入されている診断法に比較した、大
きな利点を意味する。さらに、例えばＥＰ−Ａ ０ ８０６ ６６７にしたがっ
た方法で必要とされるように、新規の試験動物を免疫感作し、そして続いて試験
しつづける必要はもはやない。
【００３３】 別の好ましい態様において、抗原は、好ましくはＨ．ピロリ由来の、カタラー
ゼである。カタラーゼは、これまでに知られる酸耐性細菌のすべてで検出するこ
とが可能であるという特別の利点を有する。本発明にしたがい、別の利点として
、カタラーゼが腸管における消化に非常に耐性であることが見出され、このこと
は、検出をかなり単純にする。結局、カタラーゼまたはその断片群は、腸通過後
も、なお上位の構造、例えば四量体型で存在し、これは１つの受容体型のみでの
検出を容易にする。
【００３４】 本発明にしたがい、驚くべきことに、便を酸耐性細菌での感染に関して試験し
た、哺乳動物集団において、特にヒト患者で、この集団の本質的にすべてのメン
バーが、便中に一貫して頻発するカタラーゼ・エピトープを示しことが見出され
たので、１つの対応する受容体、好ましくはモノクローナル抗体群、その断片群
または誘導体群、あるいはアプタマー群での比較的信頼できる診断法を作成する
可能性が非常に高い。特に、カタラーゼは四量体抗原性構造を有するため、この
診断法は、例えば、ＥＬＩＳＡまたは同様に配置された固体系に、好適に作成す
ることが可能である。
【００３５】 カタラーゼは、Ｈ．ピロリのカタラーゼであることが特に好ましい。 別の好ましい態様において、抗原はメタロプロテイナーゼ、特に好ましくはＨ
．ピロリのメタロプロテイナーゼである。
【００３６】 別の好ましい態様において、抗原は、好ましくはＨ．ピロリ由来の、ウレアー
ゼである。 別の好ましい態様において、さらなる使用は、検出のための受容体の混合物と
、受容体が抗原の検出因子として用いられる場合、抗原の捕捉因子の機能を有す
る受容体の混合物、および受容体が抗原の捕捉因子として用いられる場合、抗原
の検出因子の機能を有する混合物で行われる。本発明の本態様は、特に信頼可能
な診断を可能にし、抗原が腸通過後、二量体または多量体コンホメーションで存
在しない場合、特にそうである。本態様は、標準化免疫学的検出法の大部分で用
いられている２つの受容体種のうち、１つのみをモノクローナル抗体とすること
を可能にし、一方、例えば第二の受容体種は、ポリクローナル血清であってもよ
い。
【００３７】 特に好ましい態様において、受容体混合物は、ポリクローナル抗血清である。 さらに特に好ましい態様において、微生物、好ましくはＨ．ピロリの溶解物に
対するポリクローナル抗血清が得られた。
【００３８】 別の特に好ましい態様において、溶解物は、富化された抗原を含む溶解物であ
る。 別の好ましい態様において、溶解物は、免疫ドミナント抗原が枯渇した溶解物
である。
【００３９】 ２つの上述の態様はまた、溶解物が富化された抗原、好ましくは富化されたカ
タラーゼを含む溶解物、および免疫ドミナント抗原、好ましくは主に抗原性ウレ
アーゼが枯渇した溶解物であるという事実も含む。特に、前記の組み合わせは、
高免疫感作収量を得る可能性を提供し、これは本発明の方法に特に適切である。
対応する富化されたおよび枯渇法を行う方法は、実施例により詳細に記載される
。
【００４０】 別の特に好ましい態様において、好ましくはＨ．ピロリ由来の精製または（半
）合成産生抗原に対するポリクローナル抗血清が得られた。 本発明において、受容体、好ましくはモノクローナル抗体、その断片または誘
導体あるいはアプタマーは、直鎖またはコンホメーション・エピトープを認識し
、そして特異的に結合することが可能である。別の好ましい態様において、少な
くとも１つの受容体は、コンホメーション・エピトープに結合する。
【００４１】 特に好ましい態様において、すべての受容体は、コンホメーション・エピトー
プに結合する。 特に好ましい態様において、カタラーゼ・エピトープに結合する抗体［ＨＰ２
５．２ｍ／２Ｈ１０］の重鎖は、少なくとも１つの以下のＣＤＲ、好ましくはＣ
ＤＲ３そしてさらにより好ましくは以下のＣＤＲの３つのすべて： ＣＤＲ１： ＮＹＷＩＨ ＣＤＲ２： ＹＩＮＰＡＴＧＳＴＳＹＮＱＤＦＹＤ ＣＤＲ３： ＥＧＹＤＧＦＤＳ を有する。
【００４２】 別の特に好ましい態様において、カタラーゼ・エピトープに結合する抗体［Ｈ
Ｐ２５．２ｍ／２Ｈ１０］の重鎖をコードするＤＮＡ配列は、少なくとも１つの
以下のＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ３そしてさらにより好ましくは以下のＣＤＲの
すべて： ＣＤＲ１： ＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡ ＴＴＣＡＣ ＣＤＲ２： ＴＡＣＡＴＴＡＡＴＣ ＣＴＧＣＣＡＣＴＧＧ ＴＴＣＣＡＣＴＴ
ＣＴ ＴＡＣＡＡＴＣＡＧＧ ＡＣＴＴＴＣＡＧＧＡ Ｃ ＣＤＲ３： ＧＡＧＧＧＧＴＡＣＧ ＡＣＧＧＧＴＴＴＧＡ ＣＴＣＣ を有する。
【００４３】 別の特に好ましい態様において、カタラーゼ・エピトープに結合する抗体［Ｈ
Ｐ２５．２ｍ／２Ｈ１０］の軽鎖は、少なくとも１つの以下のＣＤＲ、好ましく
はＣＤＲ３そしてさらにより好ましくは以下のＣＤＲのすべて： ＣＤＲ１： ＳＡＳＳＳＶＮＹＭＹ ＣＤＲ２： ＤＴＳＫＬＡＳ ＣＤＲ３： ＱＱＷＳＳＮＰＹＴ を有する。
【００４４】 さらに、別の特に好ましい態様において、抗体［ＨＰ２５．２ｍ／２Ｈ１０］
の軽鎖をコードするＤＮＡ配列は、少なくとも１つの以下のＣＤＲ、好ましくは
ＣＤＲ３そしてさらにより好ましくは以下のＣＤＲの３つのすべて： ＣＤＲ１： ＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴ ＣＡＡＧＴＧＴＡＡＡ ＴＴＡＣＡＴＧＴ
ＡＣ ＣＤＲ２： ＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡ ＡＡＴＴＧＧＣＴＴＣ Ｔ ＣＤＲ３： ＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡ ＧＴＡＧＴＡＡＴＣＣ ＧＴＡＣＡＣＧ を有する。
【００４５】 特に好ましい態様において、カタラーゼ・エピトープに結合する抗体［ＨＰ２
５．６ｍ／１Ｂ５］の重鎖は、少なくとも１つの以下のＣＤＲ、好ましくはＣＤ
Ｒ３そしてさらにより好ましくは以下のＣＤＲのすべて： ＣＤＲ１： ＤＴＹＶＨ ＣＤＲ２： ＫＩＤＰＡＮＧＫＴＫＹＤＰＩＦＱＡ ＣＤＲ３： ＰＩＹＹＡＳＳＷＦＡＹ を有する。
【００４６】 別の特に好ましい態様において、カタラーゼ・エピトープに結合する抗体［Ｈ
Ｐ２５．６ｍ／１Ｂ５］の重鎖をコードするＤＮＡ配列は、少なくとも１つの以
下のＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ３そしてさらにより好ましくは以下のＣＤＲのす
べて： ＣＤＲ１： ＧＡＣＡＣＣＴＡＴＧＴＧＣＡＣ ＣＤＲ２： ＡＡＧＡＴＴＧＡＴＣＣＴＧＣＧＡＡＴＧＧＴＡＡＡＡＣＴＡＡＡ
ＴＡＴＧＡＣＣＣＧＡＴＡＴＴＣ ＣＡＧＧＣＣ ＣＤＲ３： ＣＣＣＡＴＴＴＡＴＴＡＣＧＣＴＡＧＴＴＣＣＴＧＧＴＴＴＧＣＴ
ＴＡＣ を有する。
【００４７】 別の特に好ましい態様において、カタラーゼ・エピトープに結合する抗体［Ｈ
Ｐ２５．６ｍ／１Ｂ５］の軽鎖は、少なくとも１つの以下のＣＤＲ、好ましくは
ＣＤＲ３そしてさらにより好ましくは以下のＣＤＲのすべて： ＣＤＲ１： ＫＡＳＱＤＶＧＴＳＶＡ ＣＤＲ２： ＷＴＳＴＲＨＴ ＣＤＲ３： ＱＱＹＳＳＳＰＴ を有する。
【００４８】 さらに、特に好ましい態様において、カタラーゼ・エピトープに結合する抗体
［ＨＰ２５．６ｍ／１Ｂ５］の軽鎖をコードするＤＮＡ配列は、少なくとも１つ
の以下のＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ３そしてさらにより好ましくは以下のＣＤＲ
のすべて： ＣＤＲ１： ＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＧＧＴＡＣＴＴＣＴＧＴＴ
ＧＣＣ ＣＤＲ２： ＴＧＧＡＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＧＣＡＣＡＣＴ ＣＤＲ３： ＣＡＧＣＡＡＴＡＴＡＧＣＡＧＣＴＣＴＣＣＣＡＣＧ を有する。
【００４９】 別の好ましい態様において、β−ウレアーゼに特異的な抗体は、ブダペスト条
約制定法にしたがって、１９９８年６月２３日に、ドイツ微生物および細胞培養
コレクション（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒ
ｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＤＳＭＺ）に、寄託番
号ＤＳＭ ＡＣＣ２３６０またはＤＳＭ ＡＣＣ２３６２下で寄託された、ハイ
ブリドーマＨＰ８ｍ／４Ｈ５−Ｄ４−Ｃ９またはＨＰ９．１ｍ／３Ｃ２−Ｆ８−
Ｅ２によって生成された抗体である。図に記載される、βウレアーゼに特異的な
抗体［ＨＰ８ｍ／１Ｈ５−Ｇ２−Ｂ４］は、寄託ハイブリドーマＨＰ８ｍ／４Ｈ
５−Ｄ４−Ｃ９の娘クローンによって産生される。親および娘クローンによって
産生される抗体はどちらも、同一のＤＮＡ配列にコードされ、そして同一の特性
を有する。
【００５０】 本発明の方法の別の特に好ましい態様において、β−ウレアーゼのエピトープ
に結合する抗体の重鎖は、少なくとも１つの以下のＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ３
そしてさらにより好ましくは以下のＣＤＲのすべて： ＣＤＲ１： ＧＦＴＦＳＳＨＦＭＳ ＣＤＲ２： ＳＩＳＳＧＧＤＳＦＹＰＤＳＬＫＧ ＣＤＲ３： ＤＹＳＷＹＡＬＤＹ または： ＣＤＲ１： ＧＹＡＦＳＴＳＷＭＮ ＣＤＲ２： ＲＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ ＣＤＲ３： ＥＤＡＹＹＳＮＰＹＳＬＤＹ を有する。
【００５１】 別の特に好ましい態様において、β−ウレアーゼのエピトープに結合する抗体
の重鎖をコードするＤＮＡ配列は、少なくとも１つの以下のＣＤＲ、好ましくは
ＣＤＲ３そしてさらにより好ましくは以下のＣＤＲのすべて： ＣＤＲ１： ＧＧ ＣＴＡＣＧＣＡＴＴＣ ＡＧＴＡＣＣＴＣＣＴ ＧＧＡＴＧ
ＡＡＣ ＣＤＲ２： ＣＧＧＡＴＴＴＡＴＣ ＣＴＧＧＡＧＡＴＧＧ ＡＧＡＴＡＣＴＡ
ＡＣ ＴＡＣＡＡＴＧＧＧＡ ＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧ Ｃ ＣＤＲ３： ＧＡＧ ＧＡＴＧＣＣＴＡＴＴ ＡＴＡＧＴＡＡＣＣＣ ＣＴＡＴ
ＡＧＴＴＴＧ ＧＡＣＴＡＣ または： ＣＤＲ１： ＧＧ ＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣ ＡＧＴＡＧＣＣＡＴＴ ＴＣＡＴＧ
ＴＣＴ ＣＤＲ２： ＴＣＣＡＴＴＡＧＴＡ ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡ ＣＡＧＴＴＴＣＴ
ＡＴ ＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣ ＴＧＡＡＧＧＧＣ ＣＤＲ３： ＧＡＣＴＡＣ ＴＣＴＴＧＧＴＡＴＧ ＣＴＴＴＧＧＡＣＴＡ Ｃ
を有する。
【００５２】 本発明の方法の別の特に好ましい態様において、β−ウレアーゼのエピトープ
に結合する抗体の軽鎖は、少なくとも１つの以下のＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ３
そしてさらにより好ましくは以下のＣＤＲのすべて： ＣＤＲ１： ＲＡＳＱＳＩＧＴＲＩＨ ＣＤＲ２： ＹＧＳＥＳＩＳ ＣＤＲ３： ＱＱＳＮＴＷＰＬＴ または： ＣＤＲ１： ＨＡＳＱＮＩＮＶＷＬＳ ＣＤＲ２： ＫＡＳＮＬＨＴ ＣＤＲ３： ＱＱＧＲＳＹＰＬＴ を有する。
【００５３】 さらに、前記抗体の軽鎖をコードするＤＮＡ配列は、好ましくは以下のＣＤＲ
： ＣＤＲ１： Ａ ＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡ ＧＡＧＣＡＴＴＧＧＣ ＡＣＡＡＧＡ
ＡＴＡＣ ＡＣ ＣＤＲ２： ＴＡＴ ＧＧＴＴＣＴＧＡＧＴ ＣＴＡＴＣＴＣＴ ＣＤＲ３： ＣＡＡＣＡＡ ＡＧＴＡＡＴＡＣＣＴ ＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣ Ｇ
または： ＣＤＲ１： Ｃ ＡＴＧＣＣＡＧＴＣＡ ＧＡＡＣＡＴＴＡＡＴ ＧＴＴＴＧＧ
ＴＴＡＡ ＧＣ ＣＤＲ２： ＡＡＧ ＧＣＴＴＣＣＡＡＣＴ ＴＧＣＡＣＡＣＡ ＣＤＲ３： ＣＡＡＣＡＧ ＧＧＴＣＧＡＡＧＴＴ ＡＴＣＣＴＣＴＣＡＣ Ｇ
を有する。
【００５４】 さらに、前記ＣＤＲを有する重鎖および軽鎖が、好ましくはＨ．ピロリ由来の
、カタラーゼまたはβ−ウレアーゼあるいはその断片に特異的に結合する、１つ
の抗体、その断片または誘導体と共に発生することが好ましい。さらに、本発明
はまた、これらの重鎖または軽鎖が、他の軽鎖または重鎖と組み合わされ、これ
らの結合特性が、本質的に維持されていてもまたは改善されていてもよい態様も
含む。対応する方法は、先行技術に知られる。特に好ましい抗体は、軽鎖および
重鎖の可変領域に、図１および２、３および４、５および６または７および８に
示されるアミノ酸配列を有するか、または該領域は、そこに示されるＤＮＡ配列
にコードされる。当該技術分野に知られる方法にしたがい、ＣＤＲを多様なＦＲ
（フレームワーク領域）に組み込んでもよい。
【００５５】 好ましい態様において、抗体とのインキュベーション前に、便試料を用いて、
以下の工程を行う：便試料を１：３ないし１：２５、好ましくは１：１０、特に
好ましくは１：５の比で、再懸濁緩衝液に再懸濁し、ボルテックス混合器上で混
合する。試料緩衝液の例は： １５０ｍＭ ＰＢＳ、０．１％ ＳＤＳである。
好ましい態様において、再懸濁緩衝液は、１５０ｍＭ ＰＢＳ、０．５％ 動物
血清および０．１％ 界面活性剤からなる。動物血清は、ウシ、マウス、ラット
又はブタから選択してよく、そして界面活性剤は、イオン性（好ましくはＴｗｅ
ｅｎ ２０）および非イオン性界面活性剤（好ましくはＳＤＳ）又は両性イオン
界面活性剤（特に好ましくはＣｈａｐｓ）の群より選択してもよい。
【００５６】 別の態様において、本発明にしたがった検出はまた、胃ガス、呼気濃縮物、唾
液、歯垢、粘膜スメア、生検、全血または血清中のＨ．ピロリの検出のために用
いてもよい。呼吸ガスは、患者に冷たいＣＯ2含有飲料を与え、「げっぷ」の形
での胃ガスの放出を引き起こすことによって得てもよい。前記ガスは、適切な容
器に収集してもよいし、または呼気濃縮物を、当業者に知られる方式で、例えば
ＤＥ １９７１８９２５にしたがった装置またはＤＥ １９５０５５０４にした
がった装置によって、回収してもよい。こうした方式で得られた濃縮物は、その
後、ここに記載される試料を便試料の代わりに用いることを除き、先に記載され
たような本発明の方法のすべての工程を用いて、本発明の試験に、液体型で導入
してもよい。歯垢および粘膜スメアは、当該技術分野に知られる方法にしたがっ
て得てもよく、そして唾液同様、全血および血清を、適切な濃度で、それと共に
再懸濁緩衝液の修飾を伴い、本発明にしたがった検出に用いてもよい。
【００５７】 別の好ましい態様において、工程（ｂ）における、少なくとも１つの抗原−受
容体複合体／抗原−受容体−受容体混合物複合体の形成は、免疫学的法によって
検出される。
【００５８】 別の好ましい態様において、工程（ｂ）における、少なくとも１つの抗原−受
容体複合体／抗原−受容体−受容体混合物複合体の形成は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ
、ウエスタンブロット又はイムノクロマトグラフィー法によって検出される。こ
のような方法は、当該技術分野において基本的に公知である；ｃｆ．Ｈａｒｌｏ
ｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、ｌｏｃ．ｃｉｔ。
【００５９】 本発明の方法の特に好ましい態様において、免疫学的方法、特にＲＩＡ又はＥ
ＬＩＳＡで、固相への結合およびエピトープの検出両方に、同一の受容体を用い
る。捕捉因子受容体を、固相、例えばマイクロタイタープレートに非修飾型で結
合させてもよい一方、検出に用いた受容体を、所望により標識してもよい。一方
、前記受容体は、標識されていなくてもよく、そして微生物のエピトープ、好ま
しくは細菌エピトープは、第三の標識受容体を介して検出してもよく、この受容
体は、好ましくは抗体、その断片もしくは誘導体、またはアプタマー、あるいは
、種特異的またはＩｇクラス特異的抗体あるいは対応するアプタマーである。抗
体の標識、例えば、放射活性マーカー又は蛍光マーカーによる標識は、当該技術
分野に知られる；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記引用文中を参照されたい。
同じことがアプタマー群にもあてはまる。先に記載される態様は、場合により腸
通過後も四量体として存在する可能性があるカタラーゼの検出に特に好適である
。この態様において、もちろん、抗体群、断片群、誘導体群およびアプタマー群
の組み合わせ、例えば同一抗原の異なるエピトープに結合する抗体等の組み合わ
せも使用することが可能である。
【００６０】 三工程ＥＬＩＳＡは、ＥＬＩＳＡプレートの捕捉抗体でのコーティング、試料
及びコンジュゲート（例えば、標識された検出抗体群）の添加、そして間の洗浄
工程、の工程を含む方法である。一工程ＥＬＩＳＡは、一工程において、捕捉抗
体で予めコートされているＥＬＩＳＡプレート上に、試料及びコンジュゲートが
添加され適用される点で、三工程ＥＬＩＳＡと相違する。
【００６１】 本発明の方法の別の好ましい態様において、モノクローナル抗体はネズミ抗体
である。 さらに、別の好ましい態様において、受容体は、支持体に固定されている。日
常的なチェックを行う場合、受容体、好ましくは抗体、その断片または誘導体あ
るいはアプタマーを支持体に固定することが特に好適である。さらに、抗体−支
持体／アプタマー−支持体の組み合わせは、ツールセットまたはキットの形でパ
ッケージングしてもよい。
【００６２】 別の特に好ましい態様において、支持体材料は、有孔支持材料である。別の特
に好ましい態様において、支持体材料は、試験ストリップである。 さらに、好ましい態様において、支持体材料は、セルロースまたはセルロース
誘導体からなる。
【００６３】 便、胃ガス、呼気濃縮物を本発明の方法によって解析してもよい哺乳動物は、
動物、例えば飼われている動物、例えばネコまたはイヌ、有用動物、例えばブタ
、あるいは別の種類の動物、例えばマウス、トラ（ｔｉｇｅｒ）、アレチネズミ
（ｇｅｒｂｉｌ）、またはフェレット（ｆｅｒｒｅｔ）であってもよい。
【００６４】 別の好ましい態様において、哺乳動物はヒトである。 別の好ましい態様において、本発明の方法は自動化法である。自動化法は、例
えば、ロボットによって行ってもよく、ロボットが方法のいくつかまたはすべて
の工程を行う。相当するロボットは、当該技術分野に知られる。
【００６５】 さらに、本発明は、前述のＣＤＲの組み合わせを有するＶ領域を有する、また
は前述のハイブリドーマの１つによって産生されるモノクローナル抗体、その断
片または誘導体に関する。
【００６６】 この場合、図１および２、３および４、５および６または７および８に示され
るＶ領域の少なくとも１つを有する、モノクローナル抗体、その断片または誘導
体が好ましい。好ましくは、この抗体は、図１および２、３および４、５および
６または７および８に示されるＶ領域の２つを有する。さらに、これらのＶ領域
が、図１および２、３および４、５および６または７および８に示されるＤＮＡ
配列にコードされることが好ましい。
【００６７】 本発明の特に好ましい態様において、モノクローナル抗体、その断片または誘
導体は、ネズミ抗体またはその断片または誘導体、あるいはキメラ、好ましくは
ヒト化抗体またはその断片または誘導体である。誘導体はまた、融合タンパク質
であってもよい。さらに、抗体は、例えばコロイドで、放射能、蛍光、燐光また
は化学発光標識で、標識されていることが好ましい。キメラヒト化およびヒト抗
体の、並びに他の誘導体の産生は、当該技術分野に公知である（例えばＶａｕｇ
ｈａｎら、１９９８； Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９、ＨａｒｌｏｗおよびＬａ
ｎｅ、ｌｏｃ．ｃｉｔ）。
【００６８】 本発明はまた、モノクローナル抗体、その断片または誘導体と同一のエピトー
プに特異的に結合するアプタマーにも関する。こうしたアプタマーは、当該技術
分野に知られる方法にしたがって、産生してもよい。
【００６９】 さらに、本発明は、上述の抗体、その断片または誘導体、あるいはアプタマー
の１つによって特異的に結合されるエピトープに関する。 さらに、本発明は、本発明のエピトープに特異的に結合する、さらなる抗体群
、その誘導体群または断片群に関する。これらの抗体は、例えば、ハプテン／抗
原の成分としてエピトープを用いる標準法にしたがって産生してもよい、モノク
ローナル抗体であってもよい。
【００７０】 さらに、本発明は、所望により支持体材料に固定された、少なくとも１つの受
容体、好ましくは、上に定義されるような、少なくとも１つのモノクローナル抗
体、その断片または誘導体、あるいはアプタマーを含む、診断組成物に関する。
【００７１】 さらに、本発明は、（ａ）支持体材料に固定された、上に定義されるような、
少なくとも１つのモノクローナル抗体、その断片または誘導体、あるいはアプタ
マーであることが好ましい、少なくとも１つの受容体；（ｂ）便試料を調整し、
そして解析するための装置、および所望により上に定義されるような受容体の混
合物を含む、少なくとも１つの上述のエピトープを検出するための試験装置に関
する。
【００７２】 本発明のさらなる主題は、（ａ）少なくとも１つの受容体、好ましくは、上に
定義されるような、モノクローナル抗体、その断片または誘導体、あるいはアプ
タマーであって、サイズが典型的には５ｎｍないし１００ｎｍ、好ましくは４０
ｎｍないし６０ｎｍの範囲である（金に関しては４０ｎｍないし６０ｎｍの粒子
サイズ、そしてラテックスに関しては２００ｎｍないし５００ｎｍが特に好まし
い）、コロイド状金、ラテックス粒子または他の有色粒子とコンジュゲート化さ
れている、前記受容体；（ｂ）便試料を調製し、そして解析するための装置；お
よび所望により（ｃ）上に定義されるような受容体の混合物を含む試験装置であ
る。
【００７３】 さらに、本発明は、（ａ）好ましくは、上に定義され、そして所望により支持
体材料に固定されているような、少なくとも１つのモノクローナル抗体、その断
片または誘導体、あるいはアプタマーであり、そして支持体材料に固定されてい
る、少なくとも１つの受容体；所望によりまた、（ｂ）便試料を調製し、そして
解析するための装置；および所望により（ｃ）上に定義されるような受容体の混
合物を含むキットに関する。
【００７４】 便試料を調製し分析するための装置の代わりに、組成物及び試験装置及びキッ
トは、胃ガス、呼気濃縮物、唾液等を調製し（必要であれば）分析するための装
置を有していてもよい。
【００７５】 本発明はまた、上述した受容体の少なくとも一つを、所望により医薬的に受容
可能な支持体及び／又は希釈剤と組み合わせて含む組成物に関する。組成物は、
医薬用の調製物であることが好ましい。
【００７６】 当業者は、適当な医薬的に受容可能な支持体の例を知っている。これは、リン
酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水エマルジョン等のエマルジョン、種々の界面
活性剤、無菌溶液などを含む。このような支持体を含む医薬調製物は、既知の慣
用された手段によって処方することが可能である。これらの医薬調製物は、適当
な服用量範囲、例えば、１日患者一人当たり１μｇないし１００ｍｇにおいて、
個体に投与することが可能である。いろいろな型の投与方法、例えば、静脈内、
腹腔内、皮下、筋肉内、局所又は皮内がある。担当の医師は、臨床因子に応じて
用量を選択するであろう。当業者は、用量は、患者のサイズ、体表面、年齢、性
別又は一般的状態等の種々の因子に依存するが、しかしながら、投与された特定
の医薬調製物、適用の継続期間及び種類、並びにおそらく同時に投与される他の
医薬調製物にも依存する、ことを知っている。
【００７７】 最後に、本発明は、本発明の診断用組成物、本発明の試験装置又は本発明のキ
ットを含むパッケージに関する。本発明の診断用組成物の成分、本発明の試験装
置、及び／又は本発明のキットは、バイアル又は細管等の容器に、所望により緩
衝液及び／又は溶液中に、パッケージングされうる。あるいは、一つまたはそれ
より多くの成分を一つの容器にペーッケージングしてもよい。
【００７８】 実施例は本発明を例示する。
【００７９】
【実施例】
実施例１：Ｈ．ピロリ抗原の単離 Ｈ．ピロリの培養 Ｈ．ピロリ（株ＮＣＴＣ １１６３７）は、ペトリ皿中、１０％ ウマ血液お
よびアンホテリシンＢ、バンコマイシンおよびセフソルジン（Ｃｅｆｓｏｌｕｄ
ｉｎ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を添加したＷｉｌｋｉｎｓ ｃｈａ
ｌｋｅｒｓ寒天上にプレーティングし、そして微好気性大気中で（Ａｎａｅｒｏ
ｃｕｌｔ ＧａｓＰＡｋ、Ｍｅｒｃｋ）、３７℃で３または４日間インキュベー
ションした。２つのペトリ皿の内容物を、１ｌビン（Ｓｃｈｏｔｔ）中の、上述
のように抗生物質を添加した３５０ ｍｌのＢＨＩＢ培地に懸濁し、培地を１０
％ ＣＯ2、５％ Ｏ2、８５％ Ｎ2のガス混合物で、１０分間、燻蒸し、そし
てビンを密封した。培養を、回転震蘯装置上で、３７℃で２日間、震蘯した。そ
の後、ビンの内容物を、無菌的に１０ｌビンに入れ、そして４．７ｌのＢＨＩＢ
培地で満たした。これを回転震蘯装置上で、３７℃でさらに２日間、インキュベ
ーションした。続いて、全体積を、５，０００ｇで１５分間、遠心分離し、上清
をデカントし、そして細菌ペレットの重量を測定した。ペレットを保存するため
、２：１（ｗ／ｖ）の比で１５％グリセリンを添加した生理食塩水に再懸濁し、
そして−８０℃で凍結した。培養した細菌の同一性をチェックするため、細菌の
顕微鏡検査と共に、ウレアーゼ、酸化酵素およびカタラーゼに関する試験を行っ
た。
【００８０】 実施例２：Ｈ．ピロリ抗原の調製 Ｈ．ピロリ溶解物の調製 ＰＢＳ、ｐＨ ７．５を１：１０の比でＨ．ピロリ細菌ペレット（実施例１）
に添加し、そして氷上で再懸濁した。細菌細胞を、氷上で、各６０秒の中断をは
さみ、２５−３０％の強度で、１０ｘ６０秒、小さい超音波検出装置（Ｓｏｎｉ
ｆｅｒ 、Ｂｒａｎｓｏｎ）を用いて、超音波処理した。破壊された細菌細胞を
、４℃で２ｘ２０分間、そして１０，０００ ｒｐｍ（Ｓｏｒｖａｌｌ、ＳＳ３
４）で遠心分離した。上清を、ポリクローナル抗血清の産生のための抗原調製と
して用いた。
【００８１】 Ｈ．ピロリ・カタラーゼの調製 破壊緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ
、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、０．０５％ ア
ジ化ナトリウムおよび１０％（ｖ／ｖ）イソブタノール）を、１：２（ｗ／ｖ）
の比で凍結細菌ペレットに添加し、そして完全に融解するまで、室温（ＲＴ）で
、オーバーヘッド震蘯装置中で震蘯し、そしてさらにおよそ１５分間、続いて震
蘯した。２０，０００ ｒｐｍ（Ｓｏｒｖａｌｌ、ＳＳ−３４）、４℃で２０分
間の遠心分離後、上清をデカントし、そして０．４５μｍフィルターを通じてろ
過した。
【００８２】 清澄な上清を、１：３の比で、緩衝液Ａ（２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐ
Ｈ ７．０、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、１ ｍＭ ＰＭＳＦ、０．０５％ アジ化ナ
トリウム）で希釈し、そして緩衝液Ａで平衡化したＳｏｕｒｃｅＱカラム（１６
／１０）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に移した。ＳｏｕｒｃｅＱカラムを通じる流
れは、酵素カタラーゼを含み、そしてウレアーゼ、Ｈｓｐ６０およびアルキルヒ
ドロペルオキシドレダクターゼなどのＨ．ピロリ主要抗原を含まなかった。
【００８３】 カタラーゼを単離するため、ＳｏｕｒｃｅＱカラムを通じる流れを、分子ふる
いクロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）（１６／６０）に供した。
カタラーゼは、およそ１５０ ｋＤａの大きさの別のタンパク質（好中球活性化
タンパク質、ＮＡＰ）と共に、ほぼ同程度の割で、単離された。
【００８４】 より高い純度のカタラーゼは、ＳｏｕｒｃｅＱカラムを通じる流れを、４０
ｍＭ 酢酸ナトリウム上の２ Ｍ 酢酸ナトリウム溶液、ｐＨ ４．９に入れ、
そしてＳｏｕｒｃｅＳカラム（８／２８）に移した際に得られた。緩衝液Ａで洗
浄し、結合していないタンパク質を除いた後、直線ＮａＣｌ勾配（緩衝液Ａに加
えた０％から１００％の緩衝液Ｂ）を用い、緩衝液Ｂ（４０ ｍＭ 酢酸ナトリ
ウム、１ Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ４．９）でカタラーゼを溶出した。カタラーゼ
は、およそ３７０ ｍＭ ＮａＣｌで溶出する。
【００８５】 実施例３：カタラーゼの性質決定 ＳＤＳ ＰＡＧＥ中の還元条件下では、精製タンパク質は、およそ５８ ｋＤ
ａの分子量および９０％以上の純度を有した。
【００８６】 単離タンパク質を同定するため、微量配列決定を行った。タンパク質を、ＳＤ
Ｓ ＰＡＧＥゲル中で、ＬｙｓＣプロテアーゼで切断した。抽出タンパク質混合
物は、ＲＰ−ＨＰＬＣを介して分離した。ＬｙｓＣペプチドの配列解析は、以下
のアミノ酸配列を生じた： ＥＲＬＨＤＴＩＧＥＳＬＡＨＶＴＨＫ この配列は、Ｈ．ピロリ・カタラーゼ由来の対応するＬｙｓＣペプチド（Ｍａ
ｎｏｓ Ｊ．ら（１９９８）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ３（１）， ２８−３
８； Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＡＣ１６０６８．１）に同一である。
【００８７】 実施例４：ポリクローナルおよびモノクローナル抗体（ｐａｂ；ｍａｂ）の産 生 ポリクローナル抗血清の産生 Ｈ．ピロリ溶解物、ウレアーゼ、Ｈｓｐ６０およびアルキルヒドロペルオキシ
ドレダクターゼなどの主要抗原が枯渇したＨ．ピロリ溶解物（実施例２：単離お
よび精製を参照されたい）、富化されたカタラーゼを含むＨ．ピロリ溶解物（例
えば溶解物にカタラーゼを添加することによるもの）に対するポリクローナル抗
血清と共に、精製カタラーゼに対するポリクローナル抗血清は、選択された哺乳
動物（例えばマウス、ウサギ、ヤギなど）を、カタラーゼ・エピトープを含む、
対応する免疫原性調製で免疫感作することによって、得ることが可能である。
【００８８】 抗体は、血清のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製
してもよく、そして患者の便における抗原検出にモノクローナル抗体が適してい
るかどうか評価するため、サンドイッチＥＬＩＳＡ（実施例９を参照されたい）
における捕捉抗体として用いてもよい。
【００８９】 ポリクローナルウサギ抗血清は、Ｈ．ピロリ溶解物からのｐａｂ産生（Ｈｅｒ
ｂｅｒｔｓｈａｕｓｅｎ）によって精製した。プロテインＡアフィニティークロ
マトグラフィーによって、これらの抗血清から、ポリクローナル抗体を精製し、
そして患者の便における抗原検出にモノクローナル抗体が適しているかどうか評
価するため、サンドイッチＥＬＩＳＡ（実施例９を参照されたい）における捕捉
抗体として用いた。
【００９０】 モノクローナル抗体の産生 モノクローナル抗体は、当業者に知られる方法にしたがい（Ｈａｒｌｏｗ ＆
Ｌａｎｅ、１９８９； Ｐｅｔｅｒｓ ＆ Ｂａｕｍｇａｒｔｅｎ、１９９０
）、生成した。
【００９１】 免疫感作 Ｈ．ピロリ溶解物から産生された抗原調製（実施例２を参照されたい）を、ネ
ズミ（ＢＡＬＢ／ｃ ｘ Ｃ５７／Ｂｌａｃｋ、Ｆ１世代、８−１２週齢）を免
疫感作するのに用いた。基本的免疫感作では、５０μｇの抗原を、フロイントの
完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）で１：１の割合で乳化し、そして腹腔内注射し
た（２００μｌ／マウス）。４ヶ月ごとの追加免疫注射では、マウスに、フロイ
ント不完全アジュバントと共に、各々２５μｇの抗原を投与した。ＥＬＩＳＡ（
例えば融合スクリーニング）の陽性対照としての抗血清は、マウス後眼窩から採
取した血液から得た。
【００９２】 融合 最後の免疫感作の２日後、マウス脾臓を除去し、そしてポリエチレングリコー
ル４０００を用いて、５：１の比で、脾臓細胞を骨髄腫細胞Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．
６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０； Ｋｅａｒｎｅｙら、１９７９）と融合
させた。融合細胞を、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン
補足剤（１００×濃縮物；Ｓｉｇｍａ）を含むクローニング培地（＝ＲＰＭＩ
１６４０培地、２０％ ＦＣＳ、２００ Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ−６））に懸濁し
、そして２−６ｘ１０4細胞／ウェルの細胞密度で、９６ウェルマイクロタイタ
ープレートに蒔いた。ハイブリドーマは、３７℃、５％ ＣＯ2および９５％相
対湿度で培養した。
【００９３】 直接ＥＬＩＳＡによる融合スクリーニング コロニー化プレート（融合およそ１０日後）由来の抗体含有培養上清のスクリ
ーニングは、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｂ、Ｎｕｎ
ｃ）上の直接ＥＬＩＳＡで行った。
【００９４】 ＥＬＩＳＡプレートを炭酸緩衝液、ｐＨ ９．６中の２μｇ／ｍｌの免疫感作
抗原で被覆した（１００μｌ／ウェル、一晩、５℃）。被覆溶液を吸い取り、そ
してなお未結合である結合部位を、ＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳でブロッ
キングした（２００μｌ／ウェル、１時間、室温）。プレートを、０．０２５％
Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）を含むＰＢＳ、ｐＨ ７．３で２回洗浄した後、一
次クローンの培養上清を、プレート中で希釈せずにピペッティングし（１００μ
ｌ／ウェル）、そしてプレートを室温で１−２時間インキュベーションした。抗
血清を陽性対照として用い、培地を陰性対照として用いた。再び洗浄した後、結
合抗体の検出は、ペルオキシダーゼ標識二次抗体を用いて行った（０．１％ ウ
シ血清アルブミンを含むＰＢＳ中のウサギ−抗マウスＩｇ−ＰＯＤ（ＤＡＫＯ）
、２０分間、室温）。ペルオキシダーゼは、無色基質テトラメチルベンジジン（
ＴＭＢ、Ｓｉｇｍａ）を、有色複合体に変える。プレートを４回洗浄し、そして
たたいた後、基質溶液（ＴＭＢ＋Ｈ2Ｏ2を含むＫ−Ｂｌｕｅ、Ｎｅｏｇｅｎまた
はクエン酸緩衝液、ｐＨ ４．５）を添加した。１０分後、１Ｎ 硫酸を添加す
ることによって、反応を停止した。抗原特異的抗体を産生するクローンの培養上
清は、無色陰性培養上清に比較して、かなり色がついていた。
【００９５】 ハイブリドーマの樹立および培養 陽性クローンは、モノクローンを得るため、限界希釈解析の原理にしたがい、
２回再クローニングした（Ｃｏｌｌｅｒ ＆ Ｃｏｌｌｅｒ、１９８３）。第一
の再クローニングは、ヒポキサンチン・チミジン補足剤（１００×濃縮物；Ｓｉ
ｇｍａ）を含むクローニング培地中で行い、第二の再クローニングは、クローニ
ング培地中で行った。再クローンは、直接ＥＬＩＳＡによって、抗原特異性に関
して調べた。最終的に、最終クローンを、平底ビン中の産生培地（５％ ＩｇＧ
減少ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地）に適応させた。該細胞を凍結保存し
、そして抗体精製のため、培養上清を産生した。
【００９６】 実施例５：培養上清由来の抗体の性質決定 １０のクローンを、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける、Ｈ．ピロリに感染した
患者の便試料の優れた反応性によって、３０の特異的（免疫感作抗原に対する抗
体を産生する）クローンのレパートリーから選択した。
【００９７】 アイソタイプ決定 培養上清において、モノクローナル抗体のアイソタイプ決定は、アイソタイプ
決定キットＩｓｏＳｔｒｉｐ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて
、樹立クローンで行った。結果は：８種類のＩｇＧ１クローンおよび１種類のＩ
ｇＧ２ａクローンであった（表２を参照されたい）。
【００９８】 ウェスタンブロット ウェスタンブロットにおいて、免疫感作抗原を特異的に認識する能力に関して
、培養上清を調べた。ゲル当たり１５μｇの精製抗原を、還元試料緩衝液（Ｌａ
ｅｍｍｌｉ、１９７０）中で煮沸し、そして１２％ ＳＤＳポリアクリルアミド
ミニゲル（８．６ ｃｍ ｘ ７．７ ｃｍ ｘ ０．１ ｃｍ、Ｂｉｏｍｅｔ
ｒａ）に適用した。２５−３０ ｍＡでの電気泳動分離後、タンパク質（抗原）
を、半乾燥ブロット技術によって、ニトロセルロース上に固定した。
【００９９】 膜を、ＰＢＳ中の２％脱脂粉乳でブロッキングし（３０分間、室温）、そして
ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０（０．２％）で５分間、３回洗浄した。以下のインキ
ュベーション工程では、３４のクロスチャンネルを備えたグリッドプレートを用
いて、膜をＡｃｃｕｔｒａｎクロスブロットスクリーニングユニット（Ｓｃｈｌ
ｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｌ）内にクランプで締めた。形成されるトレ
ース各々において、２５０μｌのＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０および試験しようと
する２５０μｌのハイブリドーマ培養上清を添加する。震蘯しながら、室温で２
時間、インキュベーションを行った。
【０１００】 ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄した後、ＰＯＤ−コンジュゲート化二次
抗体（ウサギ−抗マウスＩｇ−ＰＯＤ、ＤＡＫＯ）で、膜を１時間インキュベー
ションした。膜を３回洗浄し、そして３，３−ジアミノベンジジン基質溶液（Ｄ
ＡＢ、Ｓｉｇｍａ）を添加することによって、免疫複合体を視覚化した。続いて
、不溶性ペルオキシダーゼ基質によって、抗体に結合しているタンパク質バンド
を視覚化した。
【０１０１】 ６つのハイブリドーマ培養上清が、カタラーゼに対応するバンド（５８ ｋＤ
ａ）を示し、３つがウェスタンブロットで陰性であったが、ＥＬＩＳＡにおいて
、天然抗原と陽性反応を示した。これらは、コンホメーション・エピトープを認
識する可能性がある。表２は、結果の要約を示す。
【０１０２】 実施例６：ハイブリドーマ培養上清からのモノクローナル抗体の精製 血清不含ハイブリドーマ培養上清からのｍａｂの精製は、修飾プロテインＧア
フィニティークロマトグラフィーによって行った（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ、１９９４）。
【０１０３】 ろ過した（０．４５μｍ）培養上清を、プロテインＧマトリックス上に直接導
いた。フロースルー中または溶出物中のタンパク質の検出は、２８０ｎｍの光学
密度を測定することを介して行った。１５０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．２で洗浄し
た後、検出装置のバックグラウンド値になるまで、０．１Ｍ グリシン／ＨＣｌ
、ｐＨ３．３で溶出を行った。タンパク質マトリックスは、０．１Ｍ グリシン
／ＨＣｌ、ｐＨ２．７で再生した。
【０１０４】 実施例７：コンジュゲートの産生 ＥＬＩＳＡでの使用のためのｍａｂのペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）への連結 （ｃｏｕｐｌｉｎｇ） ｍａｂを（ＰＯＤ）に外部から連結した。Ｐｏｌｙ−ＰＯＤコンジュゲートは
ＭｉｃｒｏＣｏａｔ（ベルンリード、ドイツ）から入手し、ＨＰＲ（西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ）−デキストランコンジュゲートは、ＤＡＫＯ（コペンハーゲ
ン、デンマーク）より入手した ＥＬＩＳＡでの使用のためのｍａｂのビオチンへの連結 精製後、モノクローナル抗体をビオチニル化して、ＥＬＩＳＡでの抗体の検出
に使用できるようにする。モノクローナル抗体のビオチン及びＰＯＤへの連結は
、公知の方法に従って行った（Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、１９８８）。
【０１０５】 モノクローナル抗体は、約１−２ｍｇ／ｍｌの濃度で結合させた。連結の前に
、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．３及び０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム
緩衝液、ｐＨ８．３中での透析によって、抗体を再緩衝した。抗体の各１ｍｇに
、５０μｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン（ＮＨＳ−ｄ−ビオチン；
シグマ）をピペットしＤＭＳＯ中で混合した。混合物を室温中で１時間インキュ
ベートした。次いで、０．１５Ｍ ＰＢＳ、０．０５％ ＮａＮ3、ｐＨ７．５
に対する大量の透析によって、ビオチン化抗体を非連結ＮＨＳ−ｄ−ビオチンか
ら遊離した。
【０１０６】 免疫学的迅速試験での使用のためのｍａｂのコロイド状金への連結 免疫学的迅速実験に使用するために、モノクローナル抗体（ｍａｂ）をコロイ
ド状金にコンジュゲートした。これは、標準的な方法（Ｆｒｅｎｓ，１９７３；
Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ ａｎｄ Ａｃｋｅｒｍａｎ，１９７７；Ｓｌｏｔ ｅｔ
ａｌ．，１９８５）に従って行う。コロイド状金の産生のために、２００ｍｌの
０．０１％金亜塩素酸−（ＨＡｕＣｌ4）−溶液を沸騰するまで熱し、そして、
さらに沸騰を行っている間に、２ｍｌの１％クエン酸ナトリウムを加えることに
よって還元した。
【０１０７】 ｍａｂのコロイド状金への連結のために、安定化に必要な量のＩｇＧを金溶液
と混合し、そして、室温で１５分間インキュベートする。連結のために最適なＩ
ｇＧ濃度及び適当なｐＨ値は各ｍａｂに個別に決定した。金ＩｇＧコンジュゲー
トを安定化させるために、ポリマー又はタンパク質、例えばウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）を１％の濃度で連結調製物に加えた。次いで、ＩｇＧに連結しなかっ
た金コロイド及び遊離のＩｇＧを、遠心によって、連結調製物から、金ＩｇＧコ
ンジュゲートから除去した。好ましくは４℃における保存のために、０．０５％
のＮａＮ3を、金ＩｇＧコンジュゲートの溶液緩衝液に加えた。
【０１０８】 実施例８：精製モノクローナル抗体の性質決定 表面プラズモン共鳴分光（ＳＰＲ分光）による、抗体−抗原相互作用の性質 決定 ＳＰＲ分光によって、モノクローナル抗体の親和性定数を決定することが可能
である。したがって、ＥＬＩＳＡおよび迅速試験の発展に適した抗体を見出すこ
とが可能である。
【０１０９】 Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢＩＡｃｏｒｅでの表面プラズモン共鳴分光の伝導 すべての工程は、製造者の指示（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕ
ａｌ）にしたがい、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉａｃｏｒｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎ
ｇ Ｕｎｉｔ ＣＡ １８６で行った。
【０１１０】 カタラーゼは、ＢＩＡｃｏｒｅ ＣＭ５センサーチップのデキストランマトリ
ックス上へのアミンカップリングを通じて固定した。デキストランマトリックス
の活性化のため、０．０５ Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およ
び０．２ Ｍ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド（ＥＤＣ）溶液の１：１混合物４５μｌを、流速５μｌ／分で、センサーチッ
プ上に導いた。その後、カタラーゼ（３５μｌ； １０ ｍＭ 酢酸ナトリウム
、ｐＨ ５．０中の５０μｇ／ｍｌ）を、デキストランマトリックスに結合させ
た。残ったＮＨＳエステルを、１ Ｍ エタノールアミン（３５μｌ）で不活性
化した。デキストランマトリックスに共有結合していないカタラーゼは、ＨＣｌ
（１０ｍＭ； １５μｌ）でセンサーチップを再生することによって、除去した
。
【０１１１】 カタラーゼ特異的モノクローナル抗体を添加することによって、これらを固定
化カタラーゼと反応させ、そして検出因子への質量付着を測定した。２０ないし
６７０ｎＭの範囲の異なる濃度の抗体溶液を用いた。これらは、各々、流速２５
μｌ／分で、センサーチップ上に固定されたカタラーゼを介して注入された。
【０１１２】 結果 抗体の吸着（Ｋon）および脱離（Ｋoff）の速度定数値は、共鳴シグナルの時
間経過の手段によって、を計算することが可能であった（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔ
ｉｏｎソフトウェア３．０）。カタラーゼに対する６つのモノクローナル抗体を
その親和性について試験した。
【０１１３】
【表１】
【０１１４】 ヒト便のＥＬＩＳＡにおいて使用するための抗体対の選択 培養上清を測定した場合に、最も低い検出限界を示す抗体群を、表面プラズ共
鳴エピトープ重複の手段によって決定し、そして、親和訂正を測定した。有望と
思われる組合せ（エピトープ重複なし、吸着の高い速度定数、脱離の低い速度定
数）を、サンドイッチ便ＥＬＩＳＡにおけるその抗原検出限界について試験した
。
【０１１５】 実施例９：患者試料中のｍａｂ培養上清のスクリーニング（混合ポリクローナ ル／モノクローナル系） 直接ＥＬＩＳＡ（実施例４）の手段により特異的な抗原認識を示すモノクロー
ナル抗体を、患者認識および抗原検出限界に関して、サンドイッチＥＬＩＳＡで
培養上清として解析した。
【０１１６】 内部発生試料として、組織学的解析および／または13Ｃ−尿素呼吸試験によっ
て感染状態が決定されている（群０および４）便試料を用いた。群０の患者では
、Ｈ．ピロリ陰性結果を示し、対照試験では、群４の患者はＨ．ピロリ陽性結果
を示した。
【０１１７】 ＥＬＩＳＡプレート（マイクロタイタープレート ＭａｘｉＳｏｒｂ； Ｎｕ
ｎｃ）の被覆は、１００μｌのポリクローナルウサギ抗カタラーゼ抗体またはポ
リクローナルウサギ抗Ｈ．ピロリ抗体溶液（ｐａｂ；およそ２０μｇ ＩｇＧ／
ｍｌ ０．１Ｍ 炭酸緩衝液、ｐＨ ９．５）を用いて、５℃で一晩、行った。
なお未結合である結合部位のブロックのため、ウェル当たり、０．２％の魚ゼラ
チン（ｗ／ｖ）を含む２００μｌの１５０ ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ ７．２を添加
し、そして室温で３０分間インキュベーションした。その後、０．０２５％ Ｔ
ｗｅｅｎ−２０を添加した２５０μｌ ＰＢＳ（洗浄緩衝液１）でＥＬＩＳＡプ
レートを２回洗浄した。ヒト便は、２％脱脂粉乳および１ ｍＭ ＥＤＴＡを添
加しながら、１５０ ｍＭ ＰＢＳで、１：１０（ｗ／ｖ）の比に懸濁した。
【０１１８】 抗原検出限界の決定のため、５０ｎｇ／ｍｌのカタラーゼ（実施例３を参照さ
れたい）を、Ｈ．ピロリ陰性便懸濁物に添加し、そしてＨ．ピロリ陰性便懸濁物
で、１：２段階で希釈した。プレート当たり各々１００μｌの便懸濁物を、１時
間インキュベーションした（患者試料で二重測定）。ＥＬＩＳＡプレートをノッ
クアウトし、洗浄緩衝液２（０．２％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）でリン
スし、そして、洗浄緩衝液２で４回洗浄した。その後、ハイブリドーマ由来の１
００μｌ培養上清（ＰＢＳ中１：５希釈）を添加し、そして室温で６０分間イン
キュベーションした。結合抗体の検出は、ペルオキシダーゼ−コンジュゲート化
二次抗体（ウサギ抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ、ＤＡＫＯ）を添加することによって
、行った。次の工程では、ペルオキシダーゼは、加えられた無色ＰＯＤ基質テト
ラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｓｉｇｍａ）を青い産物に変える。５ないし１０
分後、好ましくは１０分後、１Ｎ 硫酸の添加（１００μｌ／ウェル）によって
、反応を停止した。発色反応の強度は、ＥＬＩＳＡ読取装置（ＭＷＧ Ｓｐｅｋ
ｔｒａｌ）で測定した。測定は、参照波長６２０ｎｍ、好ましくは６３０ｎｍに
対して４５０ｎｍで行った。検出抗体または基質溶液を添加する前に、ＥＬＩＳ
Ａプレートは、洗浄緩衝液１で、３−４回洗浄した。
【０１１９】 ゼロ値（抗原を添加しない、Ｈ．ピロリ陰性便試料）がまだ検出されうる２倍
より大きいかまたはそれに等しい、消光値を検出限界とするために決定した。 Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ溶解物に対して作成されたポリクローナル捕捉抗体を用いて
、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、モノクローナル抗体ＨＰ２５．２ｍ／２Ｈ
１０は、６８％の感度（２５のうち１７の陽性試料が正しく認識された）および
８２％の特異性（１７ＨＰ陰性試料のうち、３が擬陽性となった）を示した。さ
らなるモノクローナル抗体群（培養上清）の患者認識は、表３からみることがで
きる。
【０１２０】
【表２】
【０１２１】
【０１２２】
【表３】
【０１２３】 結果 表３は、アイソタイプ決定、ウェスタンブロット解析、検出限界の決定および
患者におけるカタラーゼに対するモノクローナル抗体（ｍａｂ）認識を要約する
。データは、ｍａｂによる天然カタラーゼの良好な検出は、患者における良好な
検出とは関連しないことを示す。
【０１２４】 混合ポリクローナル−モノクローナルサンドイッチＥＬＩＳＡ系において、ｍ
ａｂ ＨＰ２５．２ｍ／２Ｈ１０は、６８％の感度および８２％の特異性を示し
た。感度および特異性は、純粋なモノクローナルＥＬＩＳＡ系において、（培養
上清の代わりに）精製ｍａｂを用いることによって改善されると期待される。こ
の場合において、、同一のエピトープに対して向けられるモノクローナル抗体（
実施例１０を参照されたい）または同一抗原の異なるエピトープに対して向けら
れる２つの異なるモノクローナル抗体（実施例１２を参照されたい）を、捕捉お
よび検出抗体として用いてもよい。
【０１２５】 実施例１０：ＥＬＩＳＡ（純粋なモノクローナル系）の手段によるヒト便中の Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの検出 試験のために、１０の異なる病院または胃腸手術室の患者由来の便試料が自由
に使用可能であった。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの状態は、13Ｃ−尿素呼吸試験および／
または胃生検の組織学的解析によって決定した。試験しようとする便試料は、実
験室スタッフが感染状態に関して知ることがないように、分類した。
【０１２６】 Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ便サンドイッチＥＬＩＳＡ（三工程ＥＬＩＳＡ） ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｂ； Ｎｕｎｃ）の被覆は、１００μｌ
のｍａｂ溶液（２．０μｇ ＨＰ２５．２ｍ／２Ｈ１０／ｍｌ、０．１Ｍ 炭酸
緩衝液、ｐＨ ９．５）で、３７℃で１時間行った。なお未結合である結合部位
のブロッキングのため、プレート当たり２００μｌの、０．２％ 魚ゼラチン（
ｗ／ｖ）を伴う１５０ ｍＭ ＰＢＳ、ピペッティングし、そして室温で３０分
間インキュベーションした。続いて、２５０μｌの洗浄緩衝液１（０．０２５％
Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ）で２回洗浄した。ヒト便は、２％脱脂粉乳および１
ｍＭ ＥＤＴＡを添加した１５０ｍＭ ＰＢＳに１：１０（ｗ／ｖ）の比で懸濁
した。抗原検出限界の決定のため、精製Ｈ．ピロリ・カタラーゼを、既知の濃度
で、Ｈ．ピロリ陰性患者の便懸濁物に添加した。便試料懸濁物を７０００ｇで５
分間遠心分離した。ウェル当たり１００μｌの上清を、１時間インキュベーショ
ンした。プレートをノックし、、洗浄緩衝液２（０．２％ Ｔｗｅｅｎを添加し
た２５０μｌ ＰＢＳ）で、リンスし、そして４回洗浄した。次いで、１００μ
ｌのビオチン連結ｍａｂの溶液（ＰＢＳ；０．１％ ＢＳＡ中の１μｇ／ｍｌ
ＨＰ２５．２ｍ／２Ｈ１０−Ｂｉｏ）を添加し、そして室温で６０分間インキュ
ベーションした。結合抗体の検出は、ＰＯＤ（Ｄｉａｎｏｖａ）とストレプトア
ビジンのコンジュゲートを添加することによって、行った。続く工程で、ＰＯＤ
は、無色基質ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）を青い産物に変える。５ないし１０分後、好
ましくは１０分後、１Ｎ 硫酸（１００μｌ／ウェル）を添加することによって
、反応を停止した。発色反応の強度は、ＥＬＩＳＡ読取装置（ＭＷＧ Ｓｐｅｋ
ｔｒａｌ）で測定した。測定は、６２０ｎｍ又は６３０ｎｍの参照波長に対して
、４５５ｎｍで行った。
【０１２７】
【表４】
【０１２８】
【０１２９】
【０１３０】 表４は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陰性及びＨ．ｐｙｌｏｒｉ陽性便試料の、便サンド
イッッチＥＬＩＳＡの手段による結果を示す。ここにおいて、便試料からのＨ．
ｐｙｌｏｒｉ抗原カタラーゼの検出のために、モノクローナル抗体、好ましくは
ＨＰ２５．２ｍ／２Ｈ１０は捕捉用抗体及び検出用抗体（ＰＯＤ−標識された）
の双方として使用される。カタラーゼは、消化管をほとんど変化さずに通過する
非常に安定な抗原であり、よって、便試料において検出することが可能である。
一つのカタラーゼ特異的抗体のみに基づく、純粋なモノクローナルＥＬＩＳＡ系
における１８２便試料の解析は、９４．７％の感度および９３．２％の特異性を
示した。この感度及び特異性は、このように高い陽性及び陰性予測値を導くので
、根治処置を決定するのに、単に簡便、安価そして非侵襲性の便試料解析によっ
て、十分な信頼性をもってＨ．ｐｙｌｏｒｉの感染の検出が可能になる。あるい
は、カタラーゼの異なるエピトープに対して作成された異なるｍａｂの組合せに
よって、又は、異なる抗原（例えば、カタラーゼ／ウレアーゼ）に対する２種の
検出系の組合せによって、感度及び特異性を向上させることがが可能である。
【０１３１】 後述するように（実施例１１及び１２）一工程ＥＬＩＳＡの開発によって、三
工程ＥＬＩＳＡ試験と比較して向上された応用が達成された。
【０１３２】 実施例１１：三工程ＥＬＩＳＡにおける適当な抗体対の発見 試験は実施例１０に従って行われた。
【０１３３】 適当な抗体対を発見するために、精製されており、そしていくつかはビオチニ
ル化されている（実施例７参照）、カタラーゼに対するモノクローナル抗体群（
表３参照）が使用可能である。先ず、捕捉用及び検出用抗体として使用するため
の最適濃度を見出すために、抗体群を互いに力価測定した。次いで、そのように
最適化されたＥＬＩＳＡ系を用いて患者の便試料を試験し、ヒトＨ，ｐｙｌｏｒ
ｉ陰性便（ゼロ便）におけるカタラーゼの検出限界を決定した（表５）。
【０１３４】 患者の認識及び抗原検出の限界に関する適当なｍａｂの組合せを表５に示す。
【０１３５】
【表５】
【０１３６】 一工程ＥＬＩＳＡにおける適当な抗体対の発見 適当な抗体対を発見するために、精製されており、そしていくつかはペルオキ
シダーゼで標識されている（実施例７参照）、カタラーゼに対するモノクローナ
ル抗体群（表９参照）が使用可能である。２７のＨ．ｐｙｌｏｒｉ陽性試料及び
１７のＨ．ｐｙｌｏｒｉ陰性試料を用いた一工程ＥＬＩＳＡにおいて、捕捉用抗
体と検出用抗体（表６参照）の種々の組合せを試験した。
【０１３７】 一工程サンドイッチＥＬＩＳＡ ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｂ Ｌｏｃｋｗｅｌｌ； Ｎｕｎｃ）の
被覆は、１００μｌのｍａｂ溶液（２．０μｇ 捕捉用抗体／ｍｌ、０．１Ｍ
炭酸緩衝液、ｐＨ ９．５）で、２−８℃で一晩行った。このように被覆したＥ
ＬＩＳＡプレートをＰＢＳで２回洗浄し、そして、１ウェル当たり２００μｌの
ブロック用緩衝液（０．３％ＢＳＡ；ＰＢＳ中の２０％ソルビトール）を添加し
、そして、２−８℃で一晩インキュベーションすることにより、なお未結合であ
る結合部位をブロッキングした。ＥＬＩＳＡプレートを吸引し（ｓｕｃｋ ｏｆ
ｆ）、２８℃の循環乾燥オーブン中で一晩乾燥させ、そして、次いで、乾燥バッ
クとともに２−８℃で保存した。
【０１３８】 患者の便を、試料緩衝液（１５０ｍＭ ＰＢＳ＋０．５％ 動物血清＋ １ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ＋０．１％界面活性剤）中に、１：５の割合で（０．１ｇ便試料＋
５００μｌ 試料緩衝液）、約３０秒（Ｖｏｒｔｅｘ）懸濁し、次いで、３００
０ｇで５分間遠心した。１ウェル当たり５０μｌの上清をプレートに加えた。続
いて、試料緩衝液中に希釈してあるＰＯＤ標識抗体（０．５ｎＭ ａｂ−デキス
トラン ＰＯＤ又は０．２μｇ／ｍｌ ＨＰ２５．２ｍ／２Ｈ１０−ＰＯＤ−Ｐ
）の５０μｌを試料懸濁液に直接加えた。プレートを振盪器で１時間インキュベ
ートした。洗浄緩衝液（７５ｍＭ ＰＢＳ、０．２５％ Ｔｗｅｅｎ）で５回洗
浄した後、ペルオキシダーゼ基質ＴＭＢ（テトラミチルベンチジン）を、一成分
基質（Ｎｅｏｇｅｎ）（１００μｌ／ウェル）に加えた。１０分後、１Ｎ 塩酸
（１００μｌ／ウェル）を添加することによって、酵素反応を停止した。ついで
、発色反応の強度を、６３０ｎｍの参照波長に対して、４５０ｎｍで測定した。
【０１３９】
【表６】
【０１４０】 ＨＰ２５．６ｍ／１Ｂ５（捕捉用抗体）及びＨＰ２５．２ｍ／２Ｈ１０−ＰＯ
Ｄ（検出用抗体）の抗体組合せは、良好な患者認識（２７のＨ．ｐｙｌｏｒｉ陽
性試料のうち２４及び１７のＨ．ｐｙｌｏｒｉ陰性試料のうち１４）、並びに、
ヒト便におけるＨ．ｐｙｌｏｒｉｌ抗原（カタラーゼ）の検出のための良好なシ
グナル強度のために、最も有利であることが証明された
【０１４１】 実施例１２：一工程ＥＬＩＳＡの手段によるヒト便におけるＨ．ｐｙｌｏｒｉ の検出 試験のために、１０の異なる病院または胃腸手術室の患者由来の便試料が自由
に使用可能であった。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陰性又はＨ．ｐｙｌｏｒｉ陽性の状態は
、13Ｃ−尿素呼吸試験および／または胃生検の組織学的解析によって決定した。
【０１４２】 Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ便サンドイッチＥＬＩＳＡ（一工程試験） ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｂ Ｌｏｃｋｗｅｌｌ； Ｎｕｎｃ）の
被覆は、１００μｌのＨＰ２５．６ｍ／１Ｂ５／ｍｌ、０．１Ｍ 炭酸緩衝液、
ｐＨ ９．５で、２−８℃で一晩行った。このように被覆したＥＬＩＳＡプレー
トをＰＢＳで２回洗浄した。１ウェル当たり２００μｌのブロック用緩衝液（０
．３％ＢＳＡ；ＰＢＳ中の２０％ソルビトール）を添加し、そして、２−８℃で
一晩インキュベーションすることにより、なお未結合である結合部位をブロッキ
ングした。ＥＬＩＳＡプレートを吸引し（ｓｕｃｋ ｏｆｆ）、２８℃の循環乾
燥オーブン中で一晩乾燥させ、そして、次いで、乾燥バックとともに２−８℃で
保存した。
【０１４３】 患者の便を、試料緩衝液（１５０ｍＭ ＰＢＳ＋０．５％ 動物血清＋ １ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ＋０．１％界面活性剤）中に、１：５の割合で（０．１ｇ便試料＋
５００μｌ 試料緩衝液）、約３０秒（Ｖｏｒｔｅｘ）懸濁し、次いで、３００
０ｇで５分間遠心した。１ウェル当たり５０μｌの上清（決定限界の２倍）をプ
レートに加えた。続いて、試料緩衝液中に希釈してあるＰＯＤ標識抗体、即ち、
ＨＰ２５．２ｍ／２Ｈ１０−デキストラン ＰＯＤの５０μｌを試料懸濁液に直
接加えた。プレートを振盪器で１時間インキュベートした。
【０１４４】 洗浄緩衝液（７５ｍＭ ＰＢＳ、０．２５％ Ｔｗｅｅｎ）で５回洗浄した後
、ペルオキシダーゼ基質ＴＭＢ（テトラミチルベンチジン）を、一成分基質（Ｎ
ｅｏｇｅｎ）（１００μｌ／ウェル）に加えた。１０分後、１Ｎ 塩酸（１００
μｌ／ウェル）を添加することによって、酵素反応を停止した。ついで、発色反
応の強度を、６３０ｎｍの参照波長に対して、４５０ｎｍで測定した。
【０１４５】
【表７】
【０１４６】
【０１４７】
【０１４８】
【０１４９】
【０１５０】 結果： 表７は、一工程便サンドイッチＥＬＩＳＡを用いたＨ．ｐｙｌｏｒｉ陰性及び
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陽性便試料の試験の結果を示す。モノクローナル抗体群（ＨＰ
２５．６ｍ／１Ｂ５；ＨＰ２５．２ｍ／２Ｈ１０）を用いて、便試料由来のＨ．
ｐｙｌｏｒｉ抗原カタラーゼを検出した。上述したカタラーゼ特異的ｍａｂに基
づく、純粋なモノクローナルＥＬＩＳＡ系における１９９の便試料の試験は、９
４％の感度及び９７％の特異性を有する。
【０１５１】 実施例１３：最適化された一工程ＥＬＩＳＡの手段によるヒト便におけるＨ． ｐｙｌｏｒｉの検出 試験のために、１０の異なる病院または胃腸手術室の患者由来の３５７の便試
料が自由に使用可能であった。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの状態は胃生検の組織学的解析
によって決定した。試験は、実験室スタッフが試料の感染状態に関して知ること
がないように、外部ＧＬＰ研究室において、コードされた試験試料を用いて行わ
れた。
【０１５２】 最適化された一工程サンドイッチＥＬＩＳＡ ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｂ Ｌｏｃｋｗｅｌｌ； Ｎｕｎｃ）の
被覆は、１００μｌのｍａｂ溶液（２．０μｇ ＨＰ２５．６ｍ／１Ｂ５／ｍｌ
、０．１Ｍ 炭酸緩衝液、ｐＨ ９．５）で、２−８℃で一晩行った。このよう
に被覆したＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳで２回洗浄した。１ウェル当たり２００
μｌのブロック用緩衝液（０．３％ＢＳＡ；ＰＢＳ中の５％ソルビトール）を添
加し、そして、２−８℃で一晩インキュベーションすることにより、なお未結合
である結合部位をブロッキングした。ＥＬＩＳＡプレートを吸引し（ｓｕｃｋ
ｏｆｆ）、２８℃の循環乾燥オーブン中で一晩乾燥させ、そして、次いで、乾燥
バックとともに２−８℃で保存した。
【０１５３】 患者の便を、試料緩衝液（１５０ｍＭ ＰＢＳ＋０．５％ 動物血清＋ １ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ＋０．１％界面活性剤）中に、１：５の割合で（０．１ｇ便試料＋
５００μｌ 試料緩衝液）、約３０秒（Ｖｏｒｔｅｘ）懸濁し、次いで、３００
０ｇで５分間遠心した。１ウェル当たり５０μｌの上清をプレートに加えた。続
いて、試料緩衝液中に希釈してあるＰＯＤ標識抗体、（２００ｆｍｏｌ／ｍｌの
ＨＰ２５．２ｍ／２Ｈ１０−デキストラン ＰＯＤ標識）の５０μｌを試料懸濁
液に直接加えた。プレートを振盪器で１時間インキュベートした。洗浄緩衝液（
７５ｍＭ ＰＢＳ、０．２５％ Ｔｗｅｅｎ）で５回洗浄した後、ペルオキシダ
ーゼ基質ＴＭＢ（テトラミチルベンチジン）を、一成分基質（Ｓｒａｍｕｎ）（
１００μｌ／ウェル）に加えた。１０分後、１Ｎ 硫酸（１００μｌ／ウェル）
を添加することによって、酵素反応を停止した。ついで、発色反応の強度を、６
３０ｎｍの参照波長に対して、４５０ｎｍで測定した。
【０１５４】
【表８】
【０１５５】
【０１５６】
【０１５７】
【０１５８】
【０１５９】
【０１６０】
【０１６１】 結果： 表８は、便サンドイッチＥＬＩＳＡの手段による、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陰性及び
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陽性便試料（第一診断）の試験の結果を示す。モノクローナル
抗体群（捕捉用抗体：ＨＰ２５．６ｍ／１Ｂ５；検出用抗体ＨＰ２５．２ｍ／２
Ｈ１０−ＰＯＤ）を用いて、便試料由来のＨ．ｐｙｌｏｒｉ抗原カタラーゼを検
出した。カタラーゼ特異的ｍａｂに基づく、純粋なモノクローナルＥＬＩＳＡ系
における便試料の試験は、９５％の感度及び９７％の特異性を有する。
【０１６２】 実施例１４：根治／根治制御の経過 根治制御は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗原群の直接的検出のみを介して行うことがで
き、血清中の抗原の検出によっては行うことができない。なぜなら、感染後、Ｈ
．ｐｙｌｏｒｉ抗体は何ヶ月もさらに血中に存在するからである。よって、血清
学的なＨ．ｐｙｌｏｒｉ試験と対照的に、記載されたサンドイッチ便ＥＬＩＳＡ
は根治の成功の評価の可能性を提供する。図９は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陽性患者へ
のオメプラゾール、メトロニダゾール及びクラリトロマイシン適用後の根治処置
の経過を示す。処置の開始から６日後、便中に、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗原はもう検
出されなくなった。
【０１６３】 表９は、根治研究におけるＨＰ便ＥＬＩＳＡの結果を示す。根治処置から４な
いし６週間後、便試料を採取した。13Ｃ−息試験を対照試験として行った。 試験は、実施例１２に従って行った（一工程ＥＬＩＳＡ）。
【０１６４】
【表９】
【０１６５】
【０１６６】 対照試験と比較して、研究（９７患者）は、９４％の感度及び９５％の特異性
を示す（カットオフ：ＯＤ450-630：０．１５）。 実施例１４は、ＨＰ便ＥＬＩＳＡはＨ．ｐｙｌｏｒｉの第一診断のみでなく、
根治の制御及び根治の経過の詳細のためにも使用できることを示す。
【０１６７】 実施例１５：ハイブリドーマ細胞株由来の免疫グロブリンの機能する可変領域 のクローニングおよび配列決定 総ＲＮＡは、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、１９８７）
にしたがい、抗体産生ハイブリドーマ細胞株から単離した。
【０１６８】 その後、対応するｃＤＮＡを、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）にし
たがって合成した。 それぞれの抗体群のカッパ軽鎖と共に重鎖Ｆｄ部分（ＶＨまたはＣＨ１）をコ
ードするＤＮＡ領域は、ＰＣＲによって増幅した。表１０に示されるオリゴヌク
レオチドプライマーセットを用い、単一ハイブリドーマ細胞株から単離したｃＤ
ＮＡがテンプレートとして働いた。
【０１６９】 用いたプライマーセットは、重鎖Ｆｄ断片中の５’−ＸｈｏＩおよび３’−Ｓ
ｐｅＩ切断部位と共に、カッパ軽鎖中の５’−ＳａｃＩおよび３’−ＸｂａＩ切
断部位を導いた。重鎖Ｆｄ１１をコードするＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のため、異
なる５’−ＶＨプライマー（ＭＶＨ １−８およびＭＵＬＨ １−３）を各々、
３’−ＶＨプライマーＭＩｇＧ２ａ（ＨＰ２５．２ｍ／２Ｈ１０）または３’−
ＶＨプライマーＭＩｇＧ１（ＨＰ２５．６ｍ／１Ｂ５）と組み合わせた。カッパ
軽鎖をコードするＤＮＡ断片の増幅のため、１１の異なる５’−ＶＫプライマー
（ＭＵＶＫ １−７およびＭＵＬＫ １−４）を、各々、３’−ＶＫプライマー
３’ＭＵＣＫと組み合わせた。
【０１７０】 以下の温度プログラムをすべてのＰＣＲ増幅で用いた：９４℃３０秒の変性、
５２℃６０秒のプライマー付着、７２℃９０秒の重合。このプログラムを４０周
期の間、維持し、その後、７２℃１０分間で断片を最終的に完了させた。
【０１７１】 ＰＣＲ増幅の結果は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして期待さ
れる分子量のＤＮＡバンドを単離した。抗体２５．２ｍ／２Ｈ１０に関しては、
その後、酵素ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ（重鎖）またはＳａｃＩおよびＸｂａＩ（
軽鎖）を用いて、単離されたバンドを制限消化に供した。ベクターをまず、制限
酵素ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩまたはＳａｃＩおよびＸｂａＩで切断した後、上記
得られた断片を、プラスミドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ）にクローニングした。
【０１７２】 続いて、クローニングされた重鎖および軽鎖断片のプラスミド調製を配列決定
した。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の機能する可変領域（ＶＨまたはＶＬ）
をコードする配列を選択した。この方式で、各ハイブリドーマ細胞株に関して、
１つの機能するＶＨおよび１つの機能するＶＬ領域を正確に同定することが可能
であった。図１および図２は、機能するＶＨおよびＶＬ配列を示す。ＶＨ領域の
最初の４アミノ酸は、再クローニングすることによって、完了させた。クローニ
ングおよび配列決定は、標準法にしたがって行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９
８９）。
【０１７３】 抗体２５．６ｍ／１Ｂ５に関しては、単離されたバンドをその後、直接配列決
定し、そして機能する軽鎖および機能する重鎖を同定した。その後、重鎖Ｆｄ断
片および軽鎖を、酵素ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ（重鎖）並びにＳａｃＩおよびＸ
ｂａＩ（軽鎖）を用いた制限消化に供した。上記得られた断片を、酵素ＸｈｏＩ
およびＳｐｅＩおよび／またはＳａｃＩおよびＸｂａＩによって各々切断されて
いる、プラスミドベクターｐＢＳＩＩＩＨｉｓＥｘ（Ｃｏｎｎｅｘ）にクローニ
ングした。そして再び配列決定した。
【０１７４】 この方式で、このハイブリドーマ細胞株に関し、正確に１つの機能するＶＨお
よび１つの機能するＶＬ領域を同定することが可能であった。機能するＶＨおよ
びＶＬ配列は、図３／図４に提供される。ＶＨおよびＶＬ配列において、成熟Ｎ
末端は、リーダープライマーによる配列決定によって決定されたように示される
。クローニングおよび配列決定は、標準法にしたがって行った（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、１９８９）。
【０１７５】
【表１０】
【０１７６】
【表１１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 カタラーゼに特異的なモノクローナル抗体［ＨＰ２５．２ｍ／２
Ｈ１０］の重鎖のＶ領域をコードするクローニングされたＤＮＡ配列。コードさ
れるアミノ酸配列は、一文字暗号で示される。Ｋａｂａｔらにしたがって決定さ
れたＣＤＲ領域１−３は下線で示す。
【図２】 カタラーゼに特異的なモノクローナル抗体［ＨＰ２５．２ｍ／２
Ｈ１０］の軽鎖のＶ領域をコードするクローニングされたＤＮＡ配列。コードさ
れるアミノ酸配列は、一文字暗号で示される。Ｋａｂａｔらにしたがって決定さ
れたＣＤＲ領域１−３は下線で示す。
【図３】 カタラーゼに特異的なモノクローナル抗体［ＨＰ２５．６ｍ／１
Ｂ５］の重鎖のＶ領域をコードするクローニングされたＤＮＡ配列。コードされ
るアミノ酸配列は、一文字暗号で示される。Ｋａｂａｔらにしたがって決定され
たＣＤＲ領域１−３は下線で示す。
【図４】 カタラーゼに特異的なモノクローナル抗体［ＨＰ２５．６ｍ／１
Ｂ５］の軽鎖のＶ領域をコードするクローニングされたＤＮＡ配列。コードされ
るアミノ酸配列は、一文字暗号で示される。Ｋａｂａｔらにしたがって決定され
たＣＤＲ領域１−３は下線で示す。
【図５】 ウレアーゼに特異的な第一のモノクローナル抗体（ＤＳＭ ＡＣ
Ｃ２３６０）の軽鎖をコードするＤＮＡ配列。コードされるアミノ酸配列は、一
文字暗号で示される。Ｋａｂａｔらにしたがって決定されたＣＤＲ領域１−３は
下線で示す。
【図６】 ウレアーゼに特異的な第一のモノクローナル抗体（ＤＳＭ ＡＣ
Ｃ２３６０）の重鎖をコードするＤＮＡ配列。コードされるアミノ酸配列は、一
文字暗号で示される。Ｋａｂａｔらにしたがって決定されたＣＤＲ領域１−３は
下線で示す。
【図７】 ウレアーゼに特異的な第二のモノクローナル抗体（ＤＳＭ ＡＣ
Ｃ２３６２）の軽鎖をコードするＤＮＡ配列。コードされるアミノ酸配列は、一
文字暗号で示される。Ｋａｂａｔらにしたがって決定されたＣＤＲ領域１−３は
下線で示す。
【図８】 ウレアーゼに特異的な第二のモノクローナル抗体（ＤＳＭ ＡＣ
Ｃ２３６２）の重鎖をコードするＤＮＡ配列。コードされるアミノ酸配列は、一
文字暗号で示される。Ｋａｂａｔらにしたがって決定されたＣＤＲ領域１−３は
下線で示す。
【図９】 オメプラゾール、メトロニダゾール及びクラリトロマイシンを投
与した後のＨ．ｐｙｌｏｒｉ陽性患者の根治処置の経過。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年９月１２日（２００２．９．１２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/543 ５２１ 33/543 ５２１ 33/545 Ａ 33/545 33/553 33/553 33/573 Ａ 33/573 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ００１０７０２８．３ (32)優先日 平成12年３月31日(2000．3．31) (33)優先権主張国 欧州特許庁（ＥＰ） (31)優先権主張番号 ００１１０１１０．４ (32)優先日 平成12年５月10日(2000．5．10) (33)優先権主張国 欧州特許庁（ＥＰ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 カルマン，ゲーアハルト ドイツ連邦共和国 81371 ミュンヘン， アルラムシュトラーセ 28 (72)発明者 ヘプナー，ペトラ ドイツ連邦共和国 82049 プラハ，シラ ーシュトラーセ ９ (72)発明者 リンガイス，アヒム ドイツ連邦共和国 82166 グレーフェル フィング，ヴァッツマンシュトラーセ ２ (72)発明者 ミューラー，ハイデマリエ ドイツ連邦共和国 81475 ミュンヘン， イェーガーフーバーシュトラーセ ９ (72)発明者 ハインドル，エヴァ ドイツ連邦共和国 82349 ペンテンリー ト，レーシュタイク ３ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA13 BA50 GA03 HA04 HA15 4B064 AG27 CC24 DA15 4H045 AA11 AA30 AA40 BA10 CA42 DA76 EA34

Claims (54)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 哺乳動物の酸耐性微生物による感染を検出するための方法であって、 （ａ）哺乳動物の便試料を、（ａａ）１種類の受容体と、酸耐性微生物由来の
    抗原と当該受容体との複合体形成を可能にするような条件下でインキュベートす
    る、又は（ｂ）２種類の異なる受容体群と、酸耐性微生物由来の抗原と当該２種
    類の受容体との複合体形成を可能にするような条件下でインキュベートする、そ
    して、 ここにおいて、（ａａ）の受容体又は（ａｂ）の受容体群は、抗原と特異的に
    結合し、当該抗原は少なくともいくつかの哺乳動物において、天然の構造、又は
    酸耐性微生物で感染されたもしくは免疫化された後に哺乳動物が抗体を産生する
    ような構造、又は、酸耐性微生物の抽出物若しくは溶解物、又はそれ由来のタン
    パク質若しくはその断片若しくは合成ペプチドが抗体を産生するような構造、に
    相当する構造を、腸を通過後に示す；そして （ｂ）（ａ）による少なくとも１種類の抗原−受容体複合体の形成を検出する
    ことを含む、前記方法。
  2. 【請求項２】 微生物が酸耐性細菌である、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 酸耐性細菌が、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属、カンピロバ
    クター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、又はミコバクテリウウム（Ｍｙｃｏ
    ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌である、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 細菌が、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ
    ）、ヘリコバクター・ヘパティカス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｈｅｐａｔｉ
    ｃｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅ
    ｊｕｎｉ）又はミコバクテリウウム・チュバキュロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
    ｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）種の細菌である、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 抗原が、好ましくはヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）の、カタラ
    ーゼ、ウレアーゼ又はメタロプロテナーゼの抗原である、請求項１ないし４のい
    ずれか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 受容体／受容体群が、抗体（単数若しくは複数）、その断片（単数若しくは複
    数）若しくは誘導体（単数若しくは複数）、又はアプタマ−（単数又は複数）で
    ある、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 検出のために、さらに受容体群の混合物が使用される、ここにおいて、受容体
    を抗原の検出因子として使用する場合、受容体の混合物は抗原を捕捉する機能を
    有し、そして、受容体を抗原の捕捉因子として使用する場合、受容体の混合物は
    抗原を検出する機能を有する、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 受容体群の混合物がポリクローナル抗血清である、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 ポリクローナル抗血清が、微生物の溶解物に対して得られたものである、請求
    項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 溶解物が、富化された抗原を含む溶解物である、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 溶解物が、枯渇化された免疫ドミナント抗原を含む溶解物である、請求項９
    又は１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 ポリクローナル抗血清が、精製された又は（半）合成により産生された抗原に
    対して得られたものである、請求項８に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 抗原が、カタラーゼ、ウレアーゼ又はメタロプロテナーゼの抗原である、請求
    項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 受容体、及び／又は受容体群の混合物が、コンフォメーションエピトープ（単
    数又は複数）に結合する、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 カタラーゼエピトープに結合する抗体の重鎖が、以下のＣＤＲの少なくとも１
    つ、好ましくはＣＤＲ３、そしてより好ましくは、以下の３つのＣＤＲの全て、
    を有する請求項５ないし１４のいずれか１項に記載の方法。 ＣＤＲ１： ＮＹＷＩＨ ＣＤＲ２： ＹＩＮＰＡＴＧＳＴＳＹＮＱＤＦＱＤ ＣＤＲ３： ＥＧＹＤＧＦＤＳ
  16. 【請求項１６】 抗体の重鎖をコードするＤＮＡ配列が、以下のＣＤＲの少なくとも１つ、好ま
    しくはＣＤＲ３、そしてより好ましくは、以下の３つのＣＤＲの全て、を有する
    請求項１５に記載の方法。 ＣＤＲ１： ＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡ ＴＴＣＡＣ ＣＤＲ２： ＴＡＣＡＴＴＡＡＴＣ ＣＴＧＣＣＡＣＴＧＧ ＴＴＣＣＡＣＴＴＣＴ ＴＡＣＡＡＴＣＡＧＧ ＡＣＴＴＴＣＡＧＧＡ Ｃ ＣＤＲ３： ＧＡＧＧＧＧＴＡＣＧ ＡＣＧＧＧＴＴＴＧＡ ＣＴＣＣ
  17. 【請求項１７】 カタラーゼエピトープに結合する抗体の軽鎖が、以下のＣＤＲの少なくとも１
    つ、好ましくはＣＤＲ３、そしてより好ましくは、以下の３つのＣＤＲの全て、
    を有する請求項５ないし１４のいずれか１項に記載の方法。 ＣＤＲ１： ＳＡＳＳＳＶＮＹＭＹ ＣＤＲ２： ＤＴＳＫＬＡＳ ＣＤＲ３： ＱＱＷＳＳＮＰＹＴ
  18. 【請求項１８】 抗体の軽鎖をコードするＤＮＡ配列が、以下のＣＤＲの少なくとも１つ、好ま
    しくはＣＤＲ３、そしてより好ましくは、以下の３つのＣＤＲの全て、を有する
    請求項１７に記載の方法。 ＣＤＲ１： ＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴ ＣＡＡＧＴＧＴＡＡＡ ＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣ ＣＤＲ２： ＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡ ＡＡＴＴＧＧＣＴＴＣ Ｔ ＣＤＲ３： ＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡ ＧＴＡＧＴＡＡＴＣＣ ＧＴＡＣＡＣＧ
  19. 【請求項１９】 カタラーゼエピトープに結合する抗体の重鎖が、以下のＣＤＲの少なくとも１
    つ、好ましくはＣＤＲ３、そしてより好ましくは、以下の３つのＣＤＲの全て、
    を示す請求項５ないし１４のいずれか１項に記載の方法。 ＣＤＲ１： ＤＴＹＶＨ ＣＤＲ２： ＫＩＤＰＡＮＧＫＴＫＹＤＰＩＦＱＡ ＣＤＲ３： ＰＩＹＹＡＳＳＷＦＡＹ
  20. 【請求項２０】 抗体の重鎖をコードするＤＮＡ配列が、以下のＣＤＲの少なくとも１つ、好ま
    しくはＣＤＲ３、そしてより好ましくは、以下の３つのＣＤＲの全て、を示す請
    求項１９に記載の方法。 ＣＤＲ１： ＧＡＣＡＣＣＴＡＴＧ ＴＧＣＡＣ ＣＤＲ２： ＡＡＧＡＴＴＧＡＴＣ ＣＴＧＣＧＡＡＴＧＧ ＴＡＡＡＡＣＴＡＡＡ ＴＡＴＧＡＣＣＣＧＡ ＴＡＴＴＣＣＡＧＧＣ Ｃ ＣＤＲ３： ＣＣＣＡＴＴＴＡＴＴ ＡＣＧＣＴＡＧＴＴＣ ＣＴＧＧＴＴＴＧＣＴ ＴＡＣ
  21. 【請求項２１】 カタラーゼエピトープに結合する抗体の軽鎖が、以下のＣＤＲの少なくとも１
    つ、好ましくはＣＤＲ３、そしてより好ましくは、以下の３つのＣＤＲの全て、
    を示す請求項５ないし１４のいずれか１項に記載の方法。 ＣＤＲ１： ＫＡＳＱＤＶＧＴＳＶＡ ＣＤＲ２： ＷＴＳＴＲＨＴ ＣＤＲ３： ＱＹＳＳＳＰＴ
  22. 【請求項２２】 抗体の軽鎖をコードするＤＮＡ配列が、以下のＣＤＲの少なくとも１つ、好ま
    しくはＣＤＲ３、そしてより好ましくは、以下の３つのＣＤＲの全て、を示す請
    求項２１に記載の方法。 ＣＤＲ１： ＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣ ＡＧＧＡＴＧＴＧＧＧ ＴＡＣＴＴＣＴＧＴＴ ＧＣＣ ＣＤＲ２： ＴＧＧＡＣＡＴＣＣＡ ＣＣＣＧＧＣＡＣＡＣ Ｔ ＣＤＲ３： ＣＡＧＣＡＡＴＡＴＡ ＧＣＡＧＣＴＣＴＣＣ ＣＡＣＧ
  23. 【請求項２３】 β−ウレアーゼエピトープに結合する抗体の重鎖が、以下のＣＤＲの少なくと
    も１つ、好ましくはＣＤＲ３を示す請求項５ないし１４のいずれか１項に記載の
    方法。 ＣＤＲ１： ＧＦＴＦＳＳＨＦＭＳ ＣＤＲ２： ＳＩＳＳＧＧＤＳＦＹＰＤＳＬＫＧ ＣＤＲ３： ＤＹＳＷＹＡＬＤＹ 又は： ＣＤＲ１： ＧＹＡＦＳＴＳＷＭＮ ＣＤＲ２： ＲＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ ＣＤＲ３： ＥＤＡＹＹＳＮＰＹＳＬＤＹ
  24. 【請求項２４】 抗体の重鎖をコードするＤＮＡ配列が、以下のＣＤＲの少なくとも１つ、好ま
    しくはＣＤＲ３、そしてより好ましくは、以下の３つのＣＤＲ全て、を示す請求
    項２３に記載の方法。 ＣＤＲ１： ＧＧ ＣＴＡＣＧＣＡＴＴＣ ＡＧＴＡＣＣＴＣＣＴ ＧＧＡＴ
    ＧＡＡＣ ＣＤＲ２： ＣＧＧＡＴＴＴＡＴＣ ＣＴＧＧＡＧＡＴＧＧ ＡＧＡＴＡＣＴ
    ＡＡＣ ＴＡＣＡＡＴＧＧＧＡ ＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧ Ｃ ＣＤＲ３： ＧＡＧ ＧＡＴＧＣＣＴＡＴＴ ＡＴＡＧＴＡＡＣＣＣ ＣＴＡ
    ＴＡＧＴＴＴＧ ＧＡＣＴＡＣ 又は： ＣＤＲ１： ＧＧ ＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣ ＡＧＴＡＧＣＣＡＴＴ ＴＣＡＴ
    ＧＴＣＴ ＣＤＲ２： ＴＣＣＡＴＴＡＧＴＡ ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡ ＣＡＧＴＴＴＣ
    ＴＡＴ ＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣ ＴＧＡＡＧＧＧＣ ＣＤＲ３： ＧＡＣＴＡＣ ＴＣＴＴＧＧＴＡＴＧ ＣＴＴＴＧＧＡＣＴＡ
    Ｃ
  25. 【請求項２５】 β−ウレアーゼエピトープに結合する抗体の軽鎖が、以下のＣＤＲの少なくと
    も１つ、好ましくはＣＤＲ３、そしてより好ましくは、以下の３つのＣＤＲの全
    て、を示す請求項５ないし１４のいずれか１項に記載の方法。 ＣＤＲ１： ＲＡＳＱＳＩＧＴＲＩＨ ＣＤＲ２： ＹＧＳＥＳＩＳ ＣＤＲ３： ＱＱＳＮＴＷＰＬＴ 又は： ＣＤＲ１： ＨＡＳＱＮＩＮＶＷＬＳ ＣＤＲ２： ＫＡＳＮＬＨＴ ＣＤＲ３： ＱＱＧＲＳＹＰＬＴ
  26. 【請求項２６】 抗体の軽鎖をコードするＤＮＡ配列が、以下のＣＤＲの少なくとも１つ、好ま
    しくはＣＤＲ３、そしてより好ましくは、以下の３つのＣＤＲの全て、を示す請
    求項２５に記載の方法。 ＣＤＲ１： Ａ ＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡ ＧＡＧＣＡＴＴＧＧＣ ＡＣＡＡＧ
    ＡＡＴＡＣ ＡＣ ＣＤＲ２： ＴＡＴ ＧＧＴＴＣＴＧＡＧＴ ＣＴＡＴＣＴＣＴ ＣＤＲ３：ＣＡＡＣＡＡ ＡＧＴＡＡＴＡＣＣＴ ＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣ Ｇ
    又は： ＣＤＲ１： Ｃ ＡＴＧＣＣＡＧＴＣＡ ＧＡＡＣＡＴＴＡＡＴ ＧＴＴＴＧ
    ＧＴＴＡＡ ＧＣ ＣＤＲ２： ＡＡＧ ＧＣＴＴＣＣＡＡＣＴ ＴＧＣＡＣＡＣＡ ＣＤＲ３： ＣＡＡＣＡＧ ＧＧＴＣＧＡＡＧＴＴ ＡＴＣＣＴＣＴＣＡＣ
    Ｇ
  27. 【請求項２７】 抗体が、軽鎖及び重鎖の可変領域において、図１及び２、図３及び４、図５及
    び６、又は図７及び８に示されたアミノ酸配列を有する、請求項５ないし２６の
    いずれか１項に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 軽鎖及び重鎖の可変領域のコード領域が、図１及び２、図３及び４、図５及び
    ６、又は図７及び８に示されたＤＮＡ配列を有する、請求項５ないし２７のいず
    れか１項に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 抗体でのインキュベーションの前に、便試料に以下の工程： （ａ）便試料を、１：３ないし１：２５の割合で、好ましくは約１：５ないし
    １：１０の割合で、特に好ましくは１：５の割合で、再懸濁緩衝液中に再懸濁し
    、そして （ｂ）攪拌混合器（ｖｏｒｔｅｘ ｍｉｘｅｒ）で混合する を施す、請求項１ないし２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 工程（ｂ）における、抗原−受容体複合体／抗原−受容体／受容体混合物 複
    合体の少なくとも一つの形成の検出が、免疫学的方法の手段によって行われる、
    請求項１ないし２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 工程（ｂ）における、抗原−受容体複合体／抗原−受容体／受容体混合物 複
    合体の少なくとも一つの形成の検出が、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロッ
    ト又はイムノクロマトグラフィー法の手段によって行われる、請求項１ないし３
    ０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 ＲＩＡ又はＥＬＩＳＡにおいて、固相への結合とエピトープの検出と双方に同
    じ受容体が使用される、請求項３０又は３１に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 受容体が支持体に固定されている、請求項１ないし３２のいずれか１項に記載
    の方法。
  34. 【請求項３４】 受容体がマウスのモノクローナル抗体である、請求項１ないし３３のいずれか
    １項に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 方法が、一工程ＥＬＩＳＡである、請求項１ないし３４のいずれか１項に記載
    の方法。
  36. 【請求項３６】 方法が、三工程ＥＬＩＳＡである、請求項１ないし３４のいずれか１項に記載
    の方法。
  37. 【請求項３７】 支持体の材料が、有孔性の材料である、請求項３３に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 支持体の材料が試験ストリップである、請求項３３及び３７に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 支持体の材料が、セルロース又はセルロースの誘導体からなる、請求項３３、
    ３７又は３８に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 便試料のかわりに、呼気濃縮物、胃ガス、歯垢、唾液、粘膜スメア、生検、全
    血液又は血清を使用する、請求項１ないしい３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 方法が、自動化された方法である請求項１ないし４０のいずれか１項に記載の
    方法。
  42. 【請求項４２】 哺乳動物がヒトである、請求項１ないし４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 請求項１５ないし２６のいずれか１項に記載のＣＤＲの組合せを示すＶ領域を
    有する、モノクローナル抗体、又はその断片若しくは誘導体。
  44. 【請求項４４】 図１及び２、図３及び４、図５及び６、又は図７及び８に示されたＶ領域の少
    なくとも一つを有する、請求項４３に記載のモノクローナル抗体、又はその断片
    若しくは誘導体。
  45. 【請求項４５】 マウスの抗体、又はその断片若しくは誘導体、又はキメラの好ましくはヒト化
    抗体、又はその断片若しくは誘導体である、請求項４３及び４４に記載のモノク
    ローナル抗体、又はその断片若しくは誘導体。
  46. 【請求項４６】 請求項４３ないし４５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、又はその
    断片若しくは誘導体と同じエピトープと特異的に結合する、アプタマー。
  47. 【請求項４７】 請求項４３ないし４５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、又はその
    断片若しくは誘導体、あるいは請求項４６に記載のアプタマーによって特異的に
    結合されるアプタマー。
  48. 【請求項４８】 請求項４７のエピトープによって特異的に結合される、抗体、又はその断片若
    しくは誘導体。
  49. 【請求項４９】 所望により支持体材料に固定された、上記いずれかの１項に定義された少なく
    とも一つの受容体を含む診断用組成物であって、所望により支持体材料に固定さ
    れた、上記いずれかの１項に定義された受容体の混合物を、所望によりさらに含
    んでもよい、前記診断用組成物。
  50. 【請求項５０】 上記いずれかの１項に定義されたエピトープの少なくともいずれか１つの検出
    のための試験装置であって、 （ａ）指示材料に固定化された、上記いずれかの１項に定義された少なくとも
    一つの受容体 （ｂ）便試料を調製し、分析するための装置；及び所望により （ｃ）上記いずれかの１項に定義された受容体の混合物 を含む、試験装置。
  51. 【請求項５１】 上記いずれかの１項に定義された少なくとも一つのエピトープの検出のための
    試験装置であって、 （ａ）コロイド状金、ラテックス粒子又はその他のカラー粒子と結合した、上
    記いずれかの１項に定義された少なくとも一つの受容体、ここにおいて、前記コ
    ロイド状金、ラテックス粒子又はその他のカラー粒子のサイズは、典型的には５
    ｎｍと１００ｎｍの間の範囲、好ましくは２０ｎｍと６０ｎｍの間、特に好まし
    くは４０ｎｍと６０ｎｍの間（金）、そして、２００ｎｍと５００ｎｍの間（ラ
    テックス）である； （ｂ）便試料を調製し、分析するための装置；及び所望により （ｃ）上記いずれかの１項に定義された受容体の混合物 を含む、試験装置。
  52. 【請求項５２】 以下の （ａ）所望により支持体材料に固定された、上記いずれかの１項に定義された
    少なくとも一つの受容体；所望によりさらに、 （ｂ）便試料を調製し、分析するための装置；及び所望により （ｃ）上記いずれかの１項に定義された受容体の混合物 を含むキット。
  53. 【請求項５３】 上記に記載された受容体の少なくとも一つを、所望により医薬的に受容可能な
    支持体及び／又は希釈剤と組合せて含む、組成物、好ましくは医薬組成物。
  54. 【請求項５４】 請求項４９に記載の診断用組成物、請求項５０、５１に記載の試験装置、又は
    請求項５２に記載のキットを含む、パッケージ。
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