JP2003511697A - 便中の酸耐性微生物を検出するためのイムノクロマトグラフィー迅速試験 - Google Patents

便中の酸耐性微生物を検出するためのイムノクロマトグラフィー迅速試験

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、酸耐性微生物での哺乳動物の感染を検出するための方法であって、以下の工程：（ａ）抗原を含む哺乳動物の便試料を適用するための試料適用領域を持つイムノクロマトグラフィー迅速試験の提供および便試料の適用、（ｂ）（ｉ）酸耐性微生物由来の抗原と受容体との複合体形成を可能にする条件下で、第一の受容体を用いた；または（ｉｉ）酸耐性微生物由来の抗原と少なくとも２つの第一の受容体群との複合体形成を可能にする条件下で、少なくとも２つの異なる第一の受容体群を用いた、便試料のインキュベーション、ここで（ｉ）記載の第一の受容体または（ｉｉ）記載の第一の受容体群が、少なくともいくつかの哺乳動物で、天然構造、あるいは該酸耐性微生物に感染したまたは該微生物で免疫感作された後、それに対して哺乳動物が抗体を産生する構造、あるいは該酸耐性微生物の抽出物もしくは溶解物、またはそれに由来するタンパク質もしくはその断片、または合成ペプチドが抗体を産生するような構造に相当する構造を、腸通過後に示す抗原に、特異的に結合する、；および（ｃ）解析領域に固定された第二の受容体の提供、ここで第二の受容体は、（ｂ）記載の抗原受容体複合体に結合する、および（ｄ）解析領域の第二の受容体に抗原受容体複合体を集積させることによる、（ｂ）記載の少なくとも１つの抗原受容体複合体の輸送および形成の検出、を含む、前記方法に関する。本発明はさらに、本発明の方法を実行するのに特に適しており、そして該方法を実行するために設計されている、イムノクロマトグラフィー試験に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明の記載は、いくつかの公表された文献に言及する。これらの文書の主題
は、本明細書に援用される。
【０００２】 本発明は、イムノクロマトグラフィー迅速試験、特に、酸耐性微生物での哺乳
動物の感染を検出するための試験ストリップであって、（ａ）哺乳動物の便試料
を、（ａａ）酸耐性微生物由来の解析物または抗原と受容体の複合体形成を可能
にする条件下で、受容体と；または（ａｂ）酸耐性微生物の解析物または抗原と
少なくとも２つの受容体群の複合体形成を可能にする条件下で、少なくとも２つ
の異なる受容体群とインキュベーションし、ここで（ａａ）記載の受容体または
（ａｂ）記載の受容体群は、少なくともいくつかの哺乳動物で、天然構造、ある
いは該酸耐性微生物に感染したまたは該微生物で免疫感作された後、それに対し
て哺乳動物が抗体を産生する構造、あるいは該酸耐性微生物の抽出物もしくは溶
解物、またはそれに由来するタンパク質もしくはその断片、または合成ペプチド
が抗体を産生するような構造に相当する構造を、腸通過後に示す解析物又は抗原
に、特異的に結合する；そして（ｂ）（ａ）記載の少なくとも１つの抗原−また
は解析物−受容体複合体の形成を検出する、前記試験に関する。好ましくは、酸
耐性微生物は、細菌、特にヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ
ｐｙｌｏｒｉ）、ヘリコバクター・ヘパティクス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ
ｈｅｐａｔｉｃｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａ
ｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）またはヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）である。さらに、単数または複数の受容体（群）は
、好ましくは、カタラーゼ、ウレアーゼまたはメタロプロテイナーゼの単数また
は複数のエピトープに結合する。さらに、本発明は、前記成分を含む、診断およ
び医薬組成物、並びに前記成分を含む試験装置および該成分を含むパッケージン
グに関する。
【０００３】 今日、微生物病原体または寄生虫での哺乳動物生物の感染を検出するための多
様な侵襲性、半侵襲性または非侵襲性の方法がある。すべての侵襲性の方法は、
内視鏡検査および生検を前提とする。これらの技術を用いる場合、例えば生検で
は、検査される被験者の物理的完全性が侵される。生検によって標本を得るのは
、時間がかかり、費用がかかり、そして一般に患者に緊張を強いる。特定の微生
物、例えばＨ．ピロリでの感染は、胃粘膜全体に渡って分布する必要はないため
、非感染部位での生検によって標本を得ると、偽陰性結果を伝える可能性がある
。すべての侵襲性の方法の別の不都合な点は、すべての検査結果が、プロトン−
ポンプ阻害剤、ビスマスまたは抗生物質での先の治療によって影響を受けること
である。
【０００４】 半侵襲性または非侵襲性の診断法は、生物において、干渉することなく測定す
ることが可能なパラメーターにおける変化に注目する。この目的のため、好まし
くは体液および分泌物、例えば血清、呼吸、尿、唾液、汗または便の試料を採取
し、そして解析する。
【０００５】 検出されたパラメーターによって、診断法は、直接および間接法に分けられる
。直接法では、病原体または寄生虫、その成分または分解産物の存在を、電子顕
微鏡、光学特性、質量分析、放射能壊変産物または特定の酵素反応の測定によっ
て検出する。しかし、これらの方法は、しばしば、高価でそして洗練された装置
を必要とする（例えば呼吸試験）。対照的に、間接法は、病原体または寄生虫に
対する宿主生物の反応、例えば宿主の血清または唾液中の病原体の抗原に対する
抗体の存在を検出するのに用いられる。
【０００６】 侵襲性技術を用いて生物に干渉するのは、ほとんどの場合、生物に緊張を強い
、そしてまた高価でそして洗練された装置を必要とし、そして健康上の危険を伴
うため、上述の体液および分泌物の試料を採取するのが比較的単純であるので、
非侵襲性技術が選択される方法である。さらに、必ずしもすべての宿主が、特定
の病原体または寄生虫に、同一の方式で反応するわけではなく、そして宿主の反
応が遅延し、そして該生物から病原体または寄生虫が除去された後であっても持
続する可能性があるため、直接法が常に好まれるべきである。したがって、理想
的には、診断は、体液または分泌物における病原体または寄生虫の非侵襲性直接
検出によって行われる。間接的方法と対照的に、これは現在の感染状態を決定す
ることを可能にする。
【０００７】 さらに、診断法はまた、他の側面に関しても最適化されるべきであり：高再現
性、感度および特異性、保証される入手可能性および用いられる材料の一定の品
質、方法を作成しそして実行するための低コスト、および高価でそして洗練され
た装置と独立の単純な適用が考慮すべきパラメーターである。
【０００８】 上述の理由のため、医学的診断法において、解析しようとする対応する物質に
関して、非常に特異的であるように、選択することが可能である、分子構造に対
する特定の種類の物質（例えば抗体、受容体、レクチン、アプタマー）の高い選
択性および結合親和性に基づく方法の使用が増加している。これは、体に天然に
存在する、または体に対して異質の（ｆｏｒｅｉｇｎ）物質を検出するための、
安価で、単純でそしてより時間がかからない方法の開発につながる、主に、これ
らの物質の固体表面上の固定、並びに、放射性核種カップリング、適切な基質と
の発色反応を誘発する酵素のカップリング、または非常に特異的な結合親和性を
持つ有色粒子のカップリング（例えばＥＬＩＳＡ＝酵素連結免疫吸着アッセイ）
の可能性であった。
【０００９】 これらの検出法の開発の最初の段階において、もっぱらポリクローナル抗体が
用いられた。しかしこれらは、当業者に公知のいくつかの不都合な点を有し、こ
れらの主なものは、限定された入手可能性およびしばしば交差反応性である。モ
ノクローナル抗体を調製するための方法の開発（Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎ（１９７５））、受容体の単離および細胞宿主系におけるその指示された
発現における進歩、特定の炭水化物に高い親和性を持つレクチンの開発、および
一本鎖核酸分子（アプタマー）が分子構造に特異的に結合することが可能である
という発見によって、これらの不都合な点の大部分を排除することが可能になっ
た。今日、検出法の特異性および感度は、比較的単純な方法で最適化することが
可能である。
【００１０】 高い特異性のため、こうした方法は、認識されている構造要素が、調べようと
する標本集団内で一定であり、そして検出しようとする物質に特異的である限り
、ハプテン、ペプチドまたはタンパク質などの、個々の定義される物質に特に適
している。さらに、これらは、体液における測定によく適しており、そしてした
がって標本マトリックスの病原体の直接検出の明らかなオプションである。した
がって、先行技術は、便由来の、例えば赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈ
ｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）（Ｈａｇｕｅ（１９９３）， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ．
Ｄｉｓ． １６７：２４７−９）、腸管出血性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）（ＥＨＥＣ、Ｐａｒｋ（１９９６）， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ． ３４：９８８−９９０）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌ
ｅｒａｅ）（Ｈａｓａｎ（１９９４）， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌ
ｅｔｔ． １２０：１４３−１４８）、トロウイルス（Ｔｏｒｏ ｖｉｒｕｓ）
様粒子（Ｋｏｏｐｍａｎｓ（１９９３）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
． ３１：２７３８−２７４４）または無鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ ｓａｇｉｎａ
ｔａ）（Ｍａｃｈｎｉｃｋａ（１９９６）， Ａｐｐｌ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ
． ３７：１０６−１１０）を診断するための方法を記載する。
【００１１】 上述の病原体が共通に有する特徴は、これらが、すべての場合、ヒトにおいて
、宿主の腸中で生存可能であり、そして繁殖可能であることである。したがって
、これらは、腸において活性である分解および消化系の存在下で、生き残り、そ
して増殖することを可能にする機構を有する。したがって、多数の損なわれてい
ない（ｉｎｔａｃｔ）またはほぼ損なわれていない病原体または寄生虫が、便と
共に排出される可能性がある。概して、検出試薬、例えば損なわれていない病原
体または寄生虫を認識する抗体によって、便または調製された便試料において、
これらを検出するのは容易である。
【００１２】 しかし、一方、胃腸管に対する罹患組織（例えば肺、胃、膵臓、十二指腸、肝
臓）の関連のため、便に存在する可能性があり、そして一方、腸自体において、
生存可能でなくそして／または繁殖可能でない、いくつかの病原体または寄生虫
がある。これらの病原体および寄生虫には、例えばヘリコバクター・ピロリ（Ｈ
．ピロリ）およびヘリコバクター・ヘパティス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｈ
ａｐａｔｉｓ）、ヒト型結核菌および他のミコバクテリウム、肺炎クラミジア（
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、レジオネラ・ニューモフィラ（
Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａｅ）、ニューモシスティス・カ
リニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）および他のものが含まれる
。
【００１３】 他の病原体、例えばレジオネラ・ニューモフィラは、腎臓を介して尿に入る抗
原によって、特異的に検出することが可能である。それでも、これは、尿に存在
する量が、検出に十分である場合にのみ可能である。便中の検出は、優れた代替
法であるだろう。しかし、これらの生物では、腸通過は、腸フロラの消化および
分解機構による強い攻撃と組み合わされる。この場合、観察される病原体に特異
的な分子構造が破壊される可能性があるか、またはその濃度が非常に減少する可
能性がある。
【００１４】 酸耐性細菌でもまた、腸における病原体の分解が、便試料中の信頼できる検出
のため問題となることがわかった。感染患者の胃における微生物の数は、腸にお
ける他の細菌定着の数に比較して小さい。さらに、微生物および微生物断片は、
胃を離れた後、プロテアーゼが豊富な腸を、長い間、通過しなければならない。
これらの状況のため、損なわれていないタンパク質は、少量しか便に見出すこと
ができない。しかし、常に特定のタンパク質の同一断片が、腸管を損なわれずに
通過すると仮定することは不可能である。この別の結果は、ＥＬＩＳＡまたはイ
ムノクロマトグラフィー迅速試験に必要な、１つの抗原上の２つのエピトープの
組み合わせが、もはや必ずしも天然タンパク質に存在するものと同様ではなく、
そして互いに近接して位置するエピトープが、同一分子上の２つのエピトープを
必要とする検出法において、陽性の結果を示す可能性が最も高いことである。理
想的には、同一分子上の１つのエピトープのみが検出に必要とされ、このエピト
ープがモノマーである場合、前記分子上に２倍存在しなければならない。二量体
の場合、エピトープが各サブユニット上に１回存在すれば十分であろう。さらに
、個々に異なる可能性がある、感染患者の便中に検出される抗原の分布は、腸通
過中の抗原のプロセシングにおける個々の特徴を示唆する。この問題を減少させ
る第一のアプローチは、ＥＰ−Ａ ０ ８０６ ６６７の開示に提供されている
。この出願において、特定のＨ．ピロリ株の溶解物で、ポリクローナル抗体を誘
導することが可能であることが示された。これらの抗体は、異なる地理的領域由
来のより広い多様性の株を認識する。しかし、この出願は、血清によって、どの
抗原が認識されるかを示さない。免疫血清が、すべての標準化のための努力にも
関わらず多様であるという事実を考慮し、上述の出願で開発された方法は、広い
適用には最適以下であると認識しなくてはならない。さらに、ポリクローナル血
清を提供するため、新たな動物を免疫しつづける必要がある。対応する方法は、
時間がかかり、そして費用もかかる。
【００１５】 理想的には、この病原性生物／寄生虫に特異的な、単一のまたは限定された数
の試薬（群）が、上に広げられたような酸耐性病原性生物／寄生虫の感染の信頼
できる検出を可能にするべきである。
【００１６】 ＥＰ ２０１ １９４は、湿った条件中で可動性の、解析物に特異的に結合す
る試薬を含む有孔キャリアー、および同一解析物に特異的に結合する、固定化未
標識試薬を含む解析試験装置を記載する。
【００１７】 したがって、本発明の根底にある技術的問題は、対応する単純でそして費用効
率のよい試験を提供することである。 この技術的問題は、請求項に特徴付けられる態様を提供することによって、解
決された。
【００１８】 したがって、本発明は、酸耐性微生物での哺乳動物の感染を検出するための方
法であって、（ａ）哺乳動物の便試料を、（ａａ）酸耐性微生物由来の解析物ま
たは抗原と受容体の複合体形成を可能にする条件下で、受容体と；または（ａｂ
）酸耐性微生物の解析物または抗原と少なくとも２つの受容体群の複合体形成を
可能にする条件下で、少なくとも２つの異なる受容体群とインキュベーションし
、ここで（ａａ）記載の受容体または（ａｂ）記載の受容体群は、少なくともい
くつかの哺乳動物で、天然構造、あるいは該酸耐性微生物に感染したまたは該微
生物で免疫感作された後、それに対して哺乳動物が抗体を産生する構造、あるい
は該酸耐性微生物の抽出物もしくは溶解物、またはそれに由来するタンパク質も
しくはその断片、または合成ペプチドが抗体を産生するような構造に相当する構
造を、腸通過後に示す抗原に、特異的に結合する；そして（ｂ）（ａ）記載の少
なくとも１つの抗原−受容体複合体の形成を検出する、前記方法に関する。
【００１９】 本発明はさらに、上述の感染の１つの検出に適した試験ストリップなどのイム
ノクロマトグラフィー迅速試験を提供する目的に基づく。 便迅速試験は、好ましくは所望によって異なる有孔材料からなる、いくつかの
層または領域を含む。試験ストリップは、試料適用領域、試験キャリアーそれ自
体（試験または解析領域）、および吸収因子層（吸収領域）を有する。好ましい
態様において、いくつかの層または領域は、ポリエステル・キャリアー上に固定
されている。好ましい態様において、検出に必要な特異的免疫学的受容体、また
は、より好ましくは、抗原に対する特異的抗体が、試料適用領域に、乾燥条件下
で存在する。好ましくは、これらは、可視有色粒子、例えばコロイド状金または
ポリスチレン（ラテックス）などで標識されている。
【００２０】 より好ましくは、試験キャリアーは、特定の試験膜、例えばニトロセルロース
からなる。この試験膜上に、特に好ましくは、該抗原に対して向けられる、さら
なる特異的受容体を、試験ラインとして固定する。機能の対照として、さらなる
捕捉ライン、例えば標識受容体または抗体に対して向けられる受容体を固定して
もよい。試験ストリップの末端での吸収因子層は、好適には、接触する有孔材料
の毛管効果に基づく試料流が維持されるようにする。
【００２１】 本発明にしたがったサンドイッチイムノアッセイの方法において、１つの態様
において、解析物および／または抗原に特異的な第一の標識受容体、例えば標識
抗体（抗体コンジュゲート）を、試料適用領域に沈着させ、又は乾燥させる。試
験ラインとして、解析物および／または抗原に特異的な第二の受容体を固定する
。試験中、第一の特異的受容体、例えば抗体コンジュゲートを分離し、そして試
験膜を介して輸送する。特異的解析物または抗原が試料に存在する場合、第一の
標識受容体または抗体コンジュゲートおよび抗原または解析物の複合体が、試験
中に形成される。この複合体は、捕捉ラインで、第二の特異的受容体に結合し、
そしていわゆるサンドイッチ複合体を形成する。試験ラインでの標識受容体また
は抗体コンジュゲートの集積が生じることによって、可視試験シグナルが生成さ
れる。試料中に解析物または抗原がまったく存在しなければ、サンドイッチ複合
体はまったく形成されず、そしてシグナルはまったく誘発されない。
【００２２】 サンドイッチ法の好ましい態様において、特異的受容体の代わりに、ストレプ
トアビジンが試験ラインで固定される。単純なサンドイッチ法において、抗原に
対する捕捉抗体として用いた特異的受容体を、ビオチンにコンジュゲート化し、
そして標識された特異的受容体と共に、試験ストリップの試料適用領域に置く。
特に好ましい態様において、標識は、コロイド状金である。標識受容体、抗原お
よびビオチン標識受容体からなる試験中、試料適用領域および試験膜を通過する
間にサンドイッチ複合体が形成され、そしてその部位に固定されたストレプトア
ビジンによって、ビオチン標識特異的受容体を介して、試験ラインに結合される
。
【００２３】 別の好ましい態様において、金標識特異的受容体は、試験ストリップの試料適
用領域の第一のコンジュゲート領域に位置し、そしてビオチン標識特異的受容体
は、試料適用領域の第二のコンジュゲート領域に置かれる。
【００２４】 別の好ましい態様において、標識された第一の特異的受容体の代わりに、標識
されていない第一の特異的受容体、例えば抗体を用いてもよい。その後、前記の
第一の特異的受容体に特異的に結合する別の標識受容体と共に、試験ラインとし
て固定されている第二の特異的受容体に結合しない他の標識受容体によって、前
記の第一の特異的受容体を検出する。
【００２５】 さらに好ましい態様において、試験ラインで固定されている第二の特異的受容
体の代わりに、固定されていない第二の特異的受容体、例えば抗体を用いてもよ
い。その後、解析物−受容体複合体が、試験ラインで固定された受容体であって
、そして前記の固定されていない第二の特異的受容体と結合する該受容体に、第
一の標識された特異的受容体と結合しない他の固定受容体と共に、結合される。
【００２６】 別の特に好ましい態様において、第二の非固定特異的受容体が、試験ラインで
固定された受容体に結合される。 抗体を用いる場合、これは、例えば、第一および第二の特異的抗体が、異なる
種に由来するという事実によって、達成してもよい。
【００２７】 第一の特異的非標識受容体は、例えばマウス抗体であってもよく、一方、第二
の特異的受容体はウサギ抗体であり、そして他の標識受容体は、抗マウス抗体で
ある。
【００２８】 特に好ましい態様において、特異的非標識受容体は、試験ストリップの試料適
用領域の第一のコンジュゲート領域に位置し、そして特異的非標識受容体に結合
する標識受容体は、試験ストリップの試料適用領域の第二のコンジュゲート領域
に位置する。
【００２９】 別の特に好ましい態様において、第一のコンジュゲート領域は、第二のコンジ
ュゲート領域前のまたは該領域上の流方向に位置する。 イムノクロマトグラフィー迅速試験は、本発明を実施するのに特に適している
。前記試験は、いくつかの有孔材料からなる試験ストリップに、好ましくは乾燥
状態で含まれる、解析に必要なすべての特異的試薬を含む乾燥試薬試験である。
こうした試験は、解析が液体試料を添加することによって開始し、そして試料液
体が毛管力により、いくつかの有孔材料からなる試験ストリップを通じて移動す
るという原理に基づく。試料液体の移動中、特異的結合試薬が溶解され、そして
試料に含まれる解析物および特異的結合試薬の間の複合体形成が行われる。解析
物および特異的結合試薬からなる複合体は、好ましくは試験部位に固定された特
異的結合試薬による、試験ラインの型を有する、明示ゾーンで捕捉される。捕捉
された複合体はその後、結合試薬とカップリングした可視粒子、例えば染色ポリ
スチレン（ラテックス）、コロイド状金などの凝集により、可視化される。その
結果、本発明の試験はまた、当該技術分野で熟練していない個人によって行うこ
とも可能である。さらに、本発明の試験は、単純でそして衛生的な使用の可能性
を提供する。該試験を行う場合、特に好ましい態様において、１つの工程、すな
わち試料の適用のみが必要とされる。視覚的に解析可能な結果は、非常に迅速に
、すなわち数分（２−３０分）以内に得られる。
【００３０】 別の好ましい態様において、本発明のイムノクロマトグラフィー迅速試験は、
ＷＯ９８／５８５８７に記載される試験装置で用いられる。この組み合わせによ
り、迅速でそして単純な方式で、試料が吸収され、調製され、そして解析される
ことが可能になる。
【００３１】 さらに、本発明にしたがった迅速試験は、現在まで存在していた不都合な点、
すなわち、便試料を解析する際、緩衝液中に溶解された試料が、試験ストリップ
の細かい有孔材料を通じた試料の流れを妨げるかまたは複雑にする、多数の固体
物質を有することを回避する。
【００３２】 さらに、当該技術分野における不都合な点、すなわち便試料をかなりな度合い
に希釈しなければならないという事実を、回避することが可能である。さらに、
本発明の方法を実行する際、１：５および１：２０の範囲で希釈された便試料は
、試験前に遠心分離し、そしてより大きい固体物質を除く必要がない。さらに、
本発明は、実験室独立に用いることが可能な高感度試験を可能にする。
【００３３】 抗原（解析物）への捕捉抗体（第二の受容体）の結合のための有意に延長され
たインキュベーション時間、および抗体／抗原結合に比較したストレプトアビジ
ン／ビオチン結合のより高い親和性の両方、およびしたがって試験ラインでの改
善された結合動力学は、特に、好ましいビオチン化受容体を、試験ラインから適
用領域に移動させることにより、達成することが可能であるが、試験ストリップ
は−その次元に関し−ほぼ変化しないままであってもよい。
【００３４】 本発明の意味内で、用語「酸耐性微生物」は、宿主に適応する特性／機構のた
め、好ましくは免疫学的試験によって、またはアプタマーの使用によって、検出
することが可能な効果を持ち、消化管の物理的および化学的影響に抵抗するいか
なる微生物も含む。こうした酸耐性微生物の例は、ヘリコバクター・ピロリ、ヘ
リコバクター・ヘパティクム（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｈａｐａｔｉｃｕｍ
）、ヒト型結核菌、偽結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびミコバクテリウム・カンサシ（Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｃａｎｓａｓｓｉｉ）である。
【００３５】 本発明において、用語「哺乳動物の便試料」は、本発明の検出法に用いること
が可能ないかなる便試料も意味する。特に、該用語は、基本的に既知の方法にし
たがった診断試験のため調製されている便試料を含む。調製は、例えば、ＲＩＤ
ＡＳＣＲＥＥＮ（登録商標）エントアメーバ属酵素免疫アッセイ（Ｒ−Ｂｉｏｐ
ｈａｒｍ ＧｍｂＨ、ダルムシュタット）にしたがって行ってもよい。
【００３６】 当業者は、容易に「複合体形成を可能にする条件」を調整することが可能であ
り、またＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、同書も参照されたい。これらの条件は、
例えば、生理学的条件である。
【００３７】 本発明において、用語「天然構造（・・・）に対応する構造を、腸通過後に示す
」は、抗原のエピトープが、腸を通過しない同一抗原／エピトープに対して得ら
れるか、またはそれに結合する受容体、例えばモノクローナル抗体、その誘導体
もしくは断片あるいはアプタマーによって、腸通過後、認識されることを意味す
る。言い換えると、上述の受容体に特異的に結合されるエピトープ／抗原は、構
造に関して、損なわれないかまたは本質的に損なわれずに通過し、そして分解さ
れていない。エピトープ／抗原の天然構造の供給源は、例えばフレンチプレスに
よって破壊され、そしてさらに標準法にしたがって精製された細菌抽出物（例え
ばＳａｍｂｒｏｏｋら， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， 第２版， １９８９， ＣＳＨ Ｐｒｅ
ｓｓ， 米国コールドスプリングハーバーを参照されたい）、または標準法にし
たがってさらに精製された細菌溶解物（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、同書）であ
ってもよい。
【００３８】 用語「（・・・）該酸耐性微生物に感染したまたは該微生物で免疫感作された後
、それに対して哺乳動物が抗体を産生する構造、あるいはその抽出物もしくは溶
解物、またはそれに由来するタンパク質もしくはその断片、または合成ペプチド
が抗体を産生するような構造に相当する構造を、腸通過後に示す」は、本発明に
したがい、受容体に認識されるエピトープが、哺乳動物、好ましくはヒトの免疫
系によって提示されるエピトープに対応することを意味する。抗原提示の機構と
共に、抗原のプロセシングおよびそこから生じる多様な抗体を導く機構は、先行
技術に知られ、そして例えばＪａｎｅｗａｙおよびＴｒａｖｅｒｓ， Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｉｅ， 第２版 １９９７， Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓ
ｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ， ハイデルベルグに記載されている。これ
らのエピトープは天然エピトープと異なる可能性がある。哺乳動物と微生物また
はタンパク質または断片または合成ペプチドとの接触は、天然感染（合成ペプチ
ドを除く）によって、または免疫感作によって、達成されてもよい。免疫感作に
関しては、微生物／タンパク質の抽出物、溶解物、合成ペプチドなどもまた、用
いてもよい。適切な免疫感作法は、先行技術に知られ、そして例えばＨａｒｌｏ
ｗおよびＬａｎｅ、同書に記載されている。適切な抗体はまた、例えば、免疫感
作および／または合成ペプチド、組換え産生タンパク質、抽出物、溶解物または
部分的消化タンパク質などの代理（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）に関するスクリーニン
グによって、得ることも可能である。
【００３９】 「合成ペプチド」は、天然抗原または腸を通過した抗原の少なくとも１つのエ
ピトープを有するペプチドを含む。ペプチドは、抗原またはその断片と同一の一
次構造を有してもよい。しかし、これらはまた、異なる一次構造（一次アミノ酸
配列、例えば保存的交換）を有してもよい。
【００４０】 用語「特異的に結合する」は、本明細書において、受容体が、非感染哺乳動物
の試料中の他のエピトープとまったくまたは本質的にまったく反応性を示さない
ことを意味する。通常、受容体は、便試料に存在する抗原のエピトープのみに結
合する。
【００４１】 用語「免疫複合体」は、本明細書において、モノクローナルおよび／またはポ
リクローナル抗体を含む複合体を含む。 したがって、本発明の本態様において、調製された便試料は、例えば、捕捉受
容体を介して固相に結合させることが可能であり、そして感染病原体は標識受容
体で検出することが可能である。腸通過後に存在する抗原が、（なお）（ホモ）
二量体または多量体型で存在する場合、同一受容体を、捕捉因子および検出因子
両方として用いてもよい。
【００４２】 さらに、本発明の方法には、検出の成功が、本質的に一定の方式で、腸通過後
に、抗原性タンパク質の１つのエピトープのみが検出されることを必要とするこ
とが重要である。このエピトープは、ホモ二量体またはマルチ二量体上に何度も
存在してもよい。しかし、このエピトープが検出可能型で見出される可能性は、
１つ以上のエピトープが検出されることに頼らなければならない検出試験の場合
より、有意により高い。
【００４３】 最後に、１つの受容体のみを必要とする本発明の方法は、費用および標準化に
関して、利点を伴う。 前記微生物由来の特定の抗原が、検出のため、本質的に一定である、腸通過後
のエピトープ構造を有するという、本発明にしたがった、驚くべき知見に基づき
、第二の態様もまた、本発明に本質的であるとみなさなければならない。本態様
は、異なる受容体が、同一抗原の異なるエピトープに結合するという事実に基づ
く。ここで、用語「本質的に」は、単数または複数のエピトープおよびしたがっ
て微生物での対応する感染が、７０％以上、好ましくは少なくとも７５％、より
好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５
％以上、そして最も好ましくは９８％以上の感染個体で検出することが可能であ
ることを意味する。理想的には、感染は、感染個体の１００％で検出される。
【００４４】 本発明にしたがい、驚くべきことに、酸耐性微生物の抗原のエピトープに特異
的に結合するただ１つの単一の受容体、または同一抗原の２つのエピトープに特
異的に結合する２つの受容体群によって、これらの細菌／病原体での感染は、比
較的信頼できる方式で診断することが可能である。本発明は、前記の特性を有す
る他のエピトープが、他の受容体によって、例えばモノクローナル抗体またはそ
の断片もしくは誘導体あるいはアプタマーによって、認識される態様を含む。後
者の態様は、診断の信頼性をさらに増加させるのに適している。好適には、これ
らの他の受容体は、すべて好ましくはＨ．ピロリ由来である、ウレアーゼ、好ま
しくはβ−ウレアーゼ、２６ｋＤａタンパク質またはＨｓｐ ６０を特異的に認
識する抗体、断片または誘導体であってもよい。これらのタンパク質／タンパク
質断片の１つまたはそれ以上の検出は、同一の試験または同一試料の異なる部分
での別個の試験で行ってもよい。
【００４５】 本発明の結果は、主に、当該技術分野が異なって教授しているため、驚くべき
ことである。例えばＨ．ピロリの場合、主要抗原がＥＬＩＳＡで望ましい特異性
および感度を示さないことが見出された； Ｎｅｗｅｌｌら， Ｓｅｒｏｄｉａ
ｇ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． ３（１９８９），
１−６を参照されたい。さらに、ＥＰ−Ａ−０ ８０６ ６６７は、Ｈ．ピロ
リ株の遺伝的多様性のため、モノクローナル抗体などの受容体で、Ｈ．ピロリ感
染を信頼可能に検出するのは不可能であると解説する。
【００４６】 上述の当該技術分野に比較し、本発明の方法は、主に、ただ１つの受容体で比
較的信頼できる診断を可能にするため、好適である。ＥＬＩＳＡまたは迅速試験
において、例えば抗体、その断片、誘導体またはアプタマーなどの受容体の対は
、好ましくは検出に用いられ、対の２つの受容体群が同一抗原上の同一のまたは
異なるエピトープに結合する。例えばＨ．ピロリ・カタラーゼは、いくつかの同
一サブユニットの多量体構造を形成する。したがって、ＥＬＩＳＡ、迅速試験ま
たは他のアッセイにおいて、同一受容体を捕捉受容体および検出受容体両方とし
て用いることが可能である。
【００４７】 カタラーゼの異なるエピトープに対して向けられる、異なるモノクローナル抗
体を組み合わせることによって、または異なる抗原（例えばカタラーゼ／ウレア
ーゼ）の２つの検出系を組み合わせることによって、感度および特異性の増加を
、好ましくは達成することが可能である。本発明の方法の別の利点は、該方法が
、直接的で、そして非侵襲性の方法であり、患者に対する上述の利点および決定
されるべき疾患の段階に関する信頼性を増加させるという事実である。
【００４８】 本発明の好ましい態様は、図によって以下に例示的に記載される。 図１：カタラーゼに特異的なモノクローナル抗体（ＨＰ２５．２ｍ／２Ｈ１０
）の重鎖のＶ領域をコードするクローニングされたＤＮＡ配列。
【００４９】 図２：カタラーゼに特異的なモノクローナル抗体（ＨＰ２５．２ｍ／２Ｈ１０
）の軽鎖のＶ領域をコードするクローニングされたＤＮＡ配列。 図３：カタラーゼに特異的なモノクローナル抗体（ＨＰ２５．６ｍ／１Ｂ５）
の重鎖のＶ領域をコードするクローニングされたＤＮＡ配列。
【００５０】 図４：カタラーゼに特異的なモノクローナル抗体（ＨＰ２５．６ｍ／１Ｂ５）
の軽鎖をコードするクローニングされたＤＮＡ配列。 図５：β−ウレアーゼに特異的なモノクローナル抗体の軽鎖のＶ領域をコード
するクローニングされたＤＮＡ配列。
【００５１】 図６：β−ウレアーゼに特異的なモノクローナル抗体の重鎖のＶ領域をコード
するクローニングされたＤＮＡ配列。 図７：β−ウレアーゼに特異的なさらなるモノクローナル抗体の軽鎖のＶ領域
をコードするクローニングされたＤＮＡ配列。
【００５２】 図８：β−ウレアーゼに特異的なさらなるモノクローナル抗体の重鎖のＶ領域
をコードするクローニングされたＤＮＡ配列。 図９：本発明にしたがった好ましい試験ストリップの調製。
【００５３】 図１０：対照ラインを有する、本発明にしたがった好ましい試験ストリップの
調製。 図１０記載の本発明の迅速便試験は、試料適用領域（１、２）、試験領域（試
験膜）（３）および吸収領域（４）からなる。
【００５４】 好ましい態様において、試料適用領域（１）は、２つの重なるコンジュゲート
領域からなる。上部コンジュゲート領域またはコンジュゲート・フリースは、好
ましくは、例えば金で標識された特異的受容体を含む。下部コンジュゲート領域
またはコンジュゲート・フリース（未提示）は、例えばビオチンで標識された特
異的受容体を含む。
【００５５】 試験中の試料の優れた流れおよび試料懸濁物中の免疫試薬の分布さえも、イム
ノクロマトグラフィー迅速試験の感度に関し、非常に重要である。両パラメータ
ーは、用いられる有孔成分の特性と共に、測定および互いに関する設定によって
、主に影響を受ける。
【００５６】 さらに、便試料を解析するための迅速試験は、試験膜を通過させる前に、試料
溶液に含まれる固体物質をろ過することが必要である。 試験の試料適用領域は、コンジュゲート・フリース（１）と、続くフィルター
（２）からなる。試料が試験膜上を流れることを妨げるであろう、便懸濁物の固
体物質を分離する。高感度を達成することが可能である試験膜は、２ないし２０
μｍの範囲の孔サイズの分布を有し、好ましくは、サイズは５μｍである。フィ
ルターは、１−２μｍの分離サイズを有する。ガラス繊維またはポリエステルガ
ラス繊維混合物で出来ている材料が特に適している。血液分離のために開発され
た天然および合成繊維の混合物もまた、用いてもよい。
【００５７】 例えば、以下のフィルターが適切である： Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ａ、ＧＦ
／Ｂ、ＧＦ／Ｃ、ＧＦ／Ｄ、Ｆ１４５、Ｆ１４７、Ｆ４８７、ＧＦ／ＤＶＡ；
Ａｈｌｓｔｒｏｍ １１１、１４１、１４２、１５１、１６４； Ｐａｌｌ Ａ
／Ｂ、Ａ／Ｃ、Ａ／Ｄ、Ａ／Ｅ、Ａ／Ｆ。コンジュゲート・フリースに関しては
、Ｗｈａｔｍａｎ Ｆ ０７５−１４； Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃ
ｈｕｅｌｌ ＧＦ １０、ＧＦ ５３、Ａｃｃｕｆｌｏｗ Ｐ、Ａｃｃｕｆｌｏ
ｗ Ｇ、Ａｈｌｓｔｒｏｍ ８９８０、２０３３、２０４０、８９７５； Ｍｉ
ｌｌｉｐｏｒｅ ＱＲ ０１、ＱＲ ３５、ＱＲ ５１； ＱＲ ６１などのガ
ラス繊維、ポリエステルまたはポリプロピレンの開孔材料が適している。
【００５８】 コンジュゲート−キャリアー層としての機能は別にして、この設定中のコンジ
ュゲート・フリースは、フィルターに到達する前に、懸濁便試料の粗い固体物質
を保持する予備フィルターの機能を有する。この設定において、試料液体および
溶解コンジュゲート流が、共に、続くフィルターを通じて流れ、そしてしたがっ
て解析物または抗原およびコンジュゲートのインキュベーション時間が延長され
ることもまた、好適である。
【００５９】 コンジュゲート・フリース、フィルターおよび試験膜の寸法と共に試料適用領
域の材料間の変化は、便懸濁物の十分なろ過が達成されるような方式で設定され
る。
【００６０】 試料を適用する間、試料液体は、コンジュゲート・フリースにのみ接触し、フ
ィルターと接触しないようにされる。 本発明の設定は、十分に広いフィルター領域が、コンジュゲート・フリースを
通じて流れる試料液体と接触することが可能であることを保証する。さらに、本
発明の設定は、コンジュゲート・フリースおよび試験膜間の距離を最小にするこ
とを可能にし、十分にろ過されていない試料液体が、試験膜を通過しないことを
確実にする。
【００６１】 個々の領域または材料の寸法は、以下の値に相当する： 試験ストリップの好ましい幅は、３ｍｍおよび１０ｍｍの間、好ましくは５ｍ
ｍである。試験ストリップの好ましい長さは、５０ないし１００ｍｍであり、７
５ｍｍの長さが特に好ましい。コンジュゲート・フリースの好ましい長さは、５
ないし３０ｍｍの間であり、２５ｍｍの長さが特に好ましい。コンジュゲート・
フリースおよびフィルターの重複は、５および１５ｍｍの間であることが好まし
く、１０ｍｍの重複が特に好ましい。１０および２０ｍｍの間のフィルターが好
ましく、１５ｍｍのフィルターが特に好ましい。フィルターおよび試験膜の間の
重複は、１ないし３ｍｍの範囲であることが好ましく、１ｍｍの重複が好ましい
。
【００６２】 本発明にしたがい、試験ストリップの末端の吸収層（４）は、試験ストリップ
を通過した試験液体を吸収するのに十分な能力および毛管力を維持するための比
較的細かい孔を有する構造両方を有する。Ｗｈａｔｍａｎ １７ ＣＨＲ、３
ＭＭ、３１ ＥＴ、ＷＦ１−５、Ｄ２８、ＣＤ ４２７−０５、ＣＤ ４２７−
０７、ＣＤ ４２７−０８； Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ
２９９２、ＧＢ ００３、ＧＢ ００４； Ｐａｌｌ １１１、１１、１３３
、１６５、１９７、Ａｈｌｓｔｒｏｍ ３２０、２２２、２３８、２３７などの
セルロースガラス繊維材料は、特に適切であることが立証された。５ ｍｍの幅
を有する試験ストリップでは、解析領域の１０−３０ ｍｍの寸法が特に好まし
い。吸収層上の試験膜の重複は、好ましくは、少なくとも１ ｍｍである。
【００６３】 本発明の迅速試験は、ＷＯ ９８／５８５８７（ＰＣＴ／ＥＰ９８／０３７６
４）に記載されるような、試料を採取しそして解析するための装置で用いられる
ことが特に好ましい。この文書の主題は、本明細書に援用される。
【００６４】 好ましい態様において、酸耐性微生物は酸耐性細菌である。 いくつかの酸耐性細菌が、当該技術分野において知られている。特に好ましい
態様において、酸耐性細菌は、ヘリコバクター、カンピロバクター属、またはミ
コバクテリウム属に属する。
【００６５】 別の特に好ましい態様において、細菌は、ヘリコバクター・ピロリ、ヘリコバ
クター・ヘパティクム、カンピロバクター・ジェジュニ種に属する細菌またはヒ
ト型結核菌種に属する細菌である。
【００６６】 別の特に好ましい態様において、単数または複数の受容体（群）は、抗体（群
）、その断片（群）または誘導体（群）、あるいはアプタマー（群）である。 しかし、用語「受容体」は、本明細書において、アビジン、ストレプトアビジ
ンまたはポリストレプトアビジンおよびビオチンなどの、さらなる結合パートナ
ーを含む。
【００６７】 本発明の意味内で、モノクローナル抗体の「断片（群）」または「誘導体（群
）」は、モノクローナル抗体と同一の結合特異性を有する。こうした断片または
誘導体は、標準法にしたがって産生することが可能である；例えばＨａｒｌｏｗ
およびＬａｎｅ， “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ”， ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ， 米国コールドスプリングハーバー，
１９８８を参照されたい。断片の例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、またはＦｖ
断片が含まれる。ｓｃＦｖ断片は誘導体の例である。誘導体はまた、抗体と同一
の結合特性、または改善された結合特性を有する、化学的に産生された物質であ
ってもよい。こうした物質は、例えば、ペプチド擬似体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍ
ｅｔｉｃｓ）によって、または異なる周期のファージディスプレーおよび改善さ
れた結合特性に関する続く選択によって、生成してもよい。本発明にしたがい、
アプタマーは、特異性および親和性を持って、多数の標的配列に結合する、ＲＮ
Ａ；ｓｓＤＮＡ（ｓｓ＝一本鎖）、修飾ＲＮＡまたは修飾ｓｓＤＮＡなどの核酸
である。用語「アプタマー」は、先行技術に知られ、そして例えばＯｓｂｏｒｎ
ｅら， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １（１９９７），
５−９に、またはＳｔｕｌｌおよびＳｚｏｋａ， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．
１２（１９９５）， ４６５−４８３に定義されている。
【００６８】 用語「抗原−抗体複合体」は、本発明の意味内で、抗原が天然抗体と形成する
複合体のみでなく、その断片または誘導体と形成するものも含む。 本発明は、モノクローナル抗体（群）またはその断片（群）もしくは誘導体（
群）のみが、あるいはアプタマーのみが用いられる態様と共に、１つの試験中に
異なる種類の検出試薬が用いられる態様を含む。したがって、２例のみを挙げる
と、第一のモノクローナル抗体を第二の抗体誘導体と共に用いるか、または第一
のアプタマーを第二の抗体断片と用いることが可能である。この観点で、用語「
第一」および「第二」は、第一および第二の検出試薬を指す。しかし、これは、
２つの抗体群、その誘導体群または断片群あるいは２つのアプタマー群が常に用
いられることを意味しない。
【００６９】 モノクローナル抗体群、その断片群または誘導体群の、あるいはアプタマー群
の使用は、診断法の信頼性において、規格の容易な維持を確実にし、これは、こ
れまでに知られており、そしてこの目的で導入されている診断法に比較した、大
きな利点を意味する。さらに、例えばＥＰ−Ａ ０ ８０６ ６６７にしたがっ
た方法で必要とされるように、新規の試験動物を免疫感作し、そして続いて試験
しつづける必要はもはやない。
【００７０】 別の好ましい態様において、抗原は、好ましくはＨ．ピロリ由来の、カタラー
ゼである。カタラーゼは、これまでに知られる酸耐性細菌のすべてで検出するこ
とが可能であるという特別の利点を有する。本発明にしたがい、別の利点として
、カタラーゼが腸管における消化に非常に耐性であることが見出され、このこと
は、検出をかなり単純にする。結局、カタラーゼまたはその断片群は、腸通過後
も、なお上位の構造、例えば四量体型で存在し、これは１つの受容体型のみでの
検出を容易にする。
【００７１】 本発明にしたがい、驚くべきことに、便を酸耐性細菌での感染に関して試験し
た、哺乳動物集団において、特にヒト患者で、この集団の本質的にすべてのメン
バーが、便中に一貫して頻発するカタラーゼ・エピトープを示し、１つの対応す
る受容体、好ましくはモノクローナル抗体、その断片または誘導体、あるいはア
プタマーでの比較的信頼できる診断法を作成する可能性が非常に高いという結果
が見出された。特に、カタラーゼは四量体抗原性構造を持つため、この診断法は
、例えば、ＥＬＩＳＡ、イムノクロマトグラフィー迅速試験に、または同様に配
置された固体系に、好適に作成することが可能である。
【００７２】 カタラーゼは、Ｈ．ピロリのカタラーゼであることが特に好ましい。 別の好ましい態様において、抗原はメタロプロテイナーゼであり、Ｈ．ピロリ
のメタロプロテイナーゼが特に好ましい。
【００７３】 別の好ましい態様において、抗原は、好ましくはＨ．ピロリ由来の、ウレアー
ゼである。 別の好ましい態様において、さらなる使用は、検出のための受容体の混合物と
、受容体が抗原の検出因子として用いられる場合、抗原の捕捉因子の機能を有す
る受容体の混合物、および受容体が抗原の捕捉因子として用いられる場合、抗原
の検出因子の機能を有する混合物で行われる。検出のため、単数または複数の、
受容体の異なる混合物（群）および同一の混合物（群）両方を抗原の捕捉因子お
よび検出因子として用いてもよい：同一混合物を、抗原の捕捉因子および検出因
子両方として用いる場合、捕捉因子は、好ましくは標識され、そして検出因子は
、試験ラインに固定される。
【００７４】 本発明の本態様は、特に信頼可能な診断を可能にし、抗原が腸通過後、二量体
または多量体コンホメーションで存在しない場合、特にそうである。本態様は、
標準化免疫学的検出法の大部分で用いられている２つの受容体種のうち、１つの
みをモノクローナル抗体とすることを可能にし、一方、例えば第二の受容体種は
、ポリクローナル血清であってもよい。
【００７５】 特に好ましい態様において、受容体混合物は、ポリクローナル抗血清である。 別の特に好ましい態様において、受容体の混合物は、受容体の１つの混合物が
抗原の捕捉因子として働き、そして受容体の１つの混合物が抗原の検出因子とし
て働き、そして好ましくは、少なくとも１つの混合物がポリクローナル血清であ
る検出に用いられる。
【００７６】 別の特に好ましい態様において、受容体の混合物は、抗原の捕捉因子および検
出因子両方として働き、混合物は、好ましくはポリクローナル抗血清である。 さらに特に好ましい態様において、ポリクローナル抗血清は、微生物、好まし
くはＨ．ピロリの溶解物に対して得られた。
【００７７】 別の特に好ましい態様において、溶解物は、富化された抗原を含む溶解物であ
る。 別の好ましい態様において、溶解物は、免疫ドミナント抗原が枯渇した溶解物
である。
【００７８】 ２つの上述の態様はまた、溶解物が富化された抗原、好ましくは富化されたカ
タラーゼを含む溶解物、および免疫ドミナント抗原、好ましくは主に抗原性ウレ
アーゼが枯渇した溶解物であるという事実も含む。特に、前記の組み合わせは、
高免疫感作収量を得る可能性を提供し、これは本発明の方法に特に適切である。
対応する富化されたおよび枯渇法を行う方法は、実施例により詳細に記載される
。
【００７９】 別の特に好ましい態様において、好ましくはＨ．ピロリ由来の、好ましくはカ
タラーゼ、メタロプロテアーゼまたはウレアーゼ酵素である、精製または（半）
合成産生抗原に対するポリクローナル抗血清が得られた。
【００８０】 本発明にしたがい、受容体、好ましくはモノクローナル抗体、その断片または
誘導体あるいはアプタマーは、直鎖またはコンホメーション・エピトープを認識
し、そして特異的に結合することが可能である。別の好ましい態様において、少
なくとも１つの受容体は、コンホメーション・エピトープに結合する。
【００８１】 特に好ましい態様において、すべての受容体は、コンホメーション・エピトー
プに結合する。 特に好ましい態様において、カタラーゼ・エピトープに結合する抗体［ＨＰ２
５．２ｍ／２Ｈ１０］の重鎖は、少なくとも１つの以下のＣＤＲ、好ましくはＣ
ＤＲ３そしてさらにより好ましくは以下のＣＤＲの３つのすべて： ＣＤＲ１： ＮＹＷＩＨ ＣＤＲ２： ＹＩＮＰＡＴＧＳＴＳＹＮＱＤＦＱＤ ＣＤＲ３： ＥＧＹＤＧＦＤＳ を有する。
【００８２】 別の特に好ましい態様において、カタラーゼ・エピトープに結合する抗体［Ｈ
Ｐ２５．２ｍ／２Ｈ１０］の重鎖をコードするＤＮＡ配列は、少なくとも１つの
以下のＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ３そしてさらにより好ましくは以下のＣＤＲの
すべて： ＣＤＲ１： ＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡ ＴＴＣＡＣ ＣＤＲ２： ＴＡＣＡＴＴＡＡＴＣ ＣＴＧＣＣＡＣＴＧＧ ＴＴＣＣＡＣＴＴ
ＣＴ ＴＡＣＡＡＴＣＡＧＧ ＡＣＴＴＴＣＡＧＧＡ Ｃ ＣＤＲ３： ＧＡＧＧＧＧＴＡＣＧ ＡＣＧＧＧＴＴＴＧＡ ＣＴＣＣ を有する。
【００８３】 別の特に好ましい態様において、カタラーゼ・エピトープに結合する抗体［Ｈ
Ｐ２５．２ｍ／２Ｈ１０］の軽鎖は、少なくとも１つの以下のＣＤＲ、好ましく
はＣＤＲ３そしてさらにより好ましくは以下のＣＤＲのすべて： ＣＤＲ１： ＳＡＳＳＳＶＮＹＭＹ ＣＤＲ２： ＤＴＳＫＬＡＳ ＣＤＲ３： ＱＱＷＳＳＮＰＹＴ を有する。
【００８４】 さらに、別の特に好ましい態様において、抗体［ＨＰ２５．２ｍ／２Ｈ１０］
の軽鎖をコードするＤＮＡ配列は、少なくとも１つの以下のＣＤＲ、好ましくは
ＣＤＲ３そしてさらにより好ましくは以下のＣＤＲの３つのすべて： ＣＤＲ１： ＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴ ＣＡＡＧＴＧＴＡＡＡ ＴＴＡＣＡＴＧＴ
ＡＣ ＣＤＲ２： ＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡ ＡＡＴＴＧＧＣＴＴＣ Ｔ ＣＤＲ３： ＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡ ＧＴＡＧＴＡＡＴＣＣ ＧＴＡＣＡＣＧ を有する。
【００８５】 特に好ましい態様において、カタラーゼ・エピトープに結合する抗体［ＨＰ２
５．６ｍ／１Ｂ５］の重鎖は、少なくとも１つの以下のＣＤＲ、好ましくはＣＤ
Ｒ３そしてさらにより好ましくは以下のＣＤＲのすべて： ＣＤＲ１： ＤＴＹＶＨ ＣＤＲ２： ＫＩＤＰＡＮＧＫＴＫＹＤＰＩＦＱＡ ＣＤＲ３： ＰＩＹＹＡＳＳＷＦＡＹ を有する。
【００８６】 別の特に好ましい態様において、カタラーゼ・エピトープに結合する抗体［Ｈ
Ｐ２５．６ｍ／１Ｂ５］の重鎖をコードするＤＮＡ配列は、少なくとも１つの以
下のＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ３そしてさらにより好ましくは以下のＣＤＲのす
べて： ＣＤＲ１： ＧＡＣＡＣＣＴＡＴＧＴＧＣＡＣ ＣＤＲ２： ＡＡＧＡＴＴＧＡＴＣＣＴＧＣＧＡＡＴＧＧＴＡＡＡＡＣＴＡＡＡ
ＴＡＴＧＡＣＣＣＧＡＴＡＴＴＣ ＣＡＧＧＣＣ ＣＤＲ３： ＣＣＣＡＴＴＴＡＴＴＡＣＧＣＴＡＧＴＴＣＣＴＧＧＴＴＴＧＣＴ
ＴＡＣ を有する。
【００８７】 別の特に好ましい態様において、カタラーゼ・エピトープに結合する抗体［Ｈ
Ｐ２５．６ｍ／１Ｂ５］の軽鎖は、少なくとも１つの以下のＣＤＲ、好ましくは
ＣＤＲ３そしてさらにより好ましくは以下のＣＤＲのすべて： ＣＤＲ１： ＫＡＳＱＤＶＧＴＳＶＡ ＣＤＲ２： ＷＴＳＴＲＨＴ ＣＤＲ３： ＱＱＹＳＳＳＰＴ を有する。
【００８８】 さらに、特に好ましい態様において、カタラーゼ・エピトープに結合する抗体
［ＨＰ２５．６ｍ／１Ｂ５］の軽鎖をコードするＤＮＡ配列は、少なくとも１つ
の以下のＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ３そしてさらにより好ましくは以下のＣＤＲ
のすべて： ＣＤＲ１： ＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＧＧＴＡＣＴＴＣＴＧＴＴ
ＧＣＣ ＣＤＲ２： ＴＧＧＡＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＧＣＡＣＡＣＴ ＣＤＲ３： ＣＡＧＣＡＡＴＡＴＡＧＣＡＧＣＴＣＴＣＣＣＡＣＧ を有する。
【００８９】 別の好ましい態様において、β−ウレアーゼに特異的な抗体は、ブダペスト条
約制定法にしたがって、１９９８年６月２３日に、ドイツ微生物および細胞培養
コレクション（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒ
ｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＤＳＭＺ）に、寄託番
号ＤＳＭ ＡＣＣ２３６０またはＤＳＭ ＡＣＣ２３６２下で寄託された、ハイ
ブリドーマＨＰ８ｍ／４Ｈ５−Ｄ４−Ｃ９またはＨＰ９．１ｍ／３Ｃ２−Ｆ８−
Ｅ２によって生成された抗体である。図に記載される、βウレアーゼに特異的な
抗体［ＨＰ８ｍ／１Ｈ５−Ｇ２−Ｂ４］は、寄託ハイブリドーマＨＰ８ｍ／４Ｈ
５−Ｄ４−Ｃ９の娘クローンによって産生される。親および娘クローンによって
産生される抗体はどちらも、同一のＤＮＡ配列にコードされ、そして同一の特性
を有する。
【００９０】 本発明の方法の別の特に好ましい態様において、β−ウレアーゼのエピトープ
に結合する抗体の重鎖は、少なくとも１つの以下のＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ３
そしてさらにより好ましくは以下のＣＤＲのすべて： ＣＤＲ１： ＧＦＴＦＳＳＨＦＭＳ ＣＤＲ２： ＳＩＳＳＧＧＤＳＦＹＰＤＳＬＫＧ ＣＤＲ３： ＤＹＳＷＹＡＬＤＹ または： ＣＤＲ１： ＧＹＡＦＳＴＳＷＭＮ ＣＤＲ２： ＲＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ ＣＤＲ３： ＥＤＡＹＹＳＮＰＹＳＬＤＹ を有する。
【００９１】 別の特に好ましい態様において、β−ウレアーゼのエピトープに結合する抗体
の重鎖をコードするＤＮＡ配列は、少なくとも１つの以下のＣＤＲ、好ましくは
ＣＤＲ３そしてさらにより好ましくは以下のＣＤＲのすべて： ＣＤＲ１： ＧＧ ＣＴＡＣＧＣＡＴＴＣ ＡＧＴＡＣＣＴＣＣＴ ＧＧＡＴＧ
ＡＡＣ ＣＤＲ２： ＣＧＧＡＴＴＴＡＴＣ ＣＴＧＧＡＧＡＴＧＧ ＡＧＡＴＡＣＴＡ
ＡＣ ＴＡＣＡＡＴＧＧＧＡ ＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧ Ｃ ＣＤＲ３： ＧＡＧ ＧＡＴＧＣＣＴＡＴＴ ＡＴＡＧＴＡＡＣＣＣ ＣＴＡＴ
ＡＧＴＴＴＧ ＧＡＣＴＡＣ または： ＣＤＲ１： ＧＧ ＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣ ＡＧＴＡＧＣＣＡＴＴ ＴＣＡＴＧ
ＴＣＴ ＣＤＲ２： ＴＣＣＡＴＴＡＧＴＡ ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡ ＣＡＧＴＴＴＣＴ
ＡＴ ＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣ ＴＧＡＡＧＧＧＣ ＣＤＲ３： ＧＡＣＴＡＣ ＴＣＴＴＧＧＴＡＴＧ ＣＴＴＴＧＧＡＣＴＡ Ｃ
を有する。
【００９２】 本発明の方法の別の特に好ましい態様において、β−ウレアーゼのエピトープ
に結合する抗体の軽鎖は、少なくとも１つの以下のＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ３
そしてさらにより好ましくは以下のＣＤＲのすべて： ＣＤＲ１： ＲＡＳＱＳＩＧＴＲＩＨ ＣＤＲ２： ＹＧＳＥＳＩＳ ＣＤＲ３： ＱＱＳＮＴＷＰＬＴ または： ＣＤＲ１： ＨＡＳＱＮＩＮＶＷＬＳ ＣＤＲ２： ＫＡＳＮＬＨＴ ＣＤＲ３： ＱＱＧＲＳＹＰＬＴ を有する。
【００９３】 さらに、前記抗体の軽鎖をコードするＤＮＡ配列は、好ましくは以下のＣＤＲ
： ＣＤＲ１： Ａ ＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡ ＧＡＧＣＡＴＴＧＧＣ ＡＣＡＡＧＡ
ＡＴＡＣ ＡＣ ＣＤＲ２： ＴＡＴ ＧＧＴＴＣＴＧＡＧＴ ＣＴＡＴＣＴＣＴ ＣＤＲ３： ＣＡＡＣＡＡ ＡＧＴＡＡＴＡＣＣＴ ＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣ Ｇ
または： ＣＤＲ１： Ｃ ＡＴＧＣＣＡＧＴＣＡ ＧＡＡＣＡＴＴＡＡＴ ＧＴＴＴＧＧ
ＴＴＡＡ ＧＣ ＣＤＲ２： ＡＡＧ ＧＣＴＴＣＣＡＡＣＴ ＴＧＣＡＣＡＣＡ ＣＤＲ３： ＣＡＡＣＡＧ ＧＧＴＣＧＡＡＧＴＴ ＡＴＣＣＴＣＴＣＡＣ Ｇ
を有する。
【００９４】 さらに、前記ＣＤＲを有する重鎖および軽鎖が、好ましくはＨ．ピロリ由来の
、カタラーゼまたはβ−ウレアーゼあるいはその断片に特異的に結合する、１つ
の抗体、その断片または誘導体と共に発生することが好ましい。さらに、本発明
はまた、これらの重鎖または軽鎖が、他の軽鎖または重鎖と組み合わされ、これ
らの結合特性が、本質的に維持されていてもまたは改善されていてもよい態様も
含む。対応する方法は、先行技術に知られる。特に好ましい抗体は、軽鎖および
重鎖の可変領域に、図１および２、３および４、５および６または７および８に
示されるアミノ酸配列を有するか、または該領域は、そこに示されるＤＮＡ配列
にコードされる。当該技術分野に知られる方法にしたがい、ＣＤＲを多様なＦＲ
（フレームワーク領域）に組み込んでもよい。
【００９５】 特に好ましい態様において、抗体とのインキュベーション前に、便試料を用い
て、以下の工程を行う：便試料を１：３ないし１：２５、好ましくは１：１５の
比で、試料緩衝液に再懸濁する。こうした試料緩衝液は、当該技術分野に知られ
る。試料緩衝液の例は： １５０ｍＭ ＰＢＳ、０．１％ ＳＤＳである。
【００９６】 好ましい態様において、試料緩衝液は、１５０ｍＭ ＰＢＳ、０．５％ 血清
および２％ 界面活性剤からなる。血清は、ウシ、マウス、ラット、ブタまたは
ヒトから得てもよいし、そして界面活性剤は、イオン性（好ましくはＴｗｅｅｎ
２０）および非イオン性界面活性剤（好ましくはＳＤＳ）の群より選択しても
よい。
【００９７】 別の態様において、本発明にしたがった検出はまた、胃ガス、呼気濃縮物、唾
液、歯垢、粘膜スメア、生検、全血または血清中のＨ．ピロリの検出のために用
いてもよい。呼吸ガスは、患者に冷たいＣＯ2含有飲料を与え、「げっぷ」の形
での胃ガスの放出を引き起こすことによって得てもよい。前記ガスは、適切な容
器に収集してもよいし、または呼気濃縮物を、当業者に知られる方式で、例えば
ＤＥ １９７１８９２５にしたがった装置またはＤＥ １９５０５５０４にした
がった装置によって、回収してもよい。こうした方式で得られた濃縮物は、その
後、ここに記載される試料を便試料の代わりに用いることを除き、先に記載され
たような本発明の方法のすべての工程を用いて、本発明の試験に、液体型で導入
してもよい。歯垢および粘膜スメアは、当該技術分野に知られる方法にしたがっ
て得てもよく、そして唾液同様、全血および血清を、適切な濃度で、それと共に
再懸濁緩衝液の修飾を伴い、本発明にしたがった検出に用いてもよい。
【００９８】 別の好ましい態様において、工程（ｂ）における、少なくとも１つの抗原−受
容体複合体／抗原−受容体−受容体混合物複合体の形成は、イムノクロマトグラ
フィー法によって検出される。
【００９９】 本発明の方法の特に好ましい態様において、免疫学的方法で、固相への結合お
よびエピトープの検出両方に、同一の受容体を用いる。非修飾型の捕捉因子受容
体を、固相、例えばニトロセルロースに結合させてもよい一方、検出に用いた受
容体を、所望により標識してもよい。
【０１００】 別の好ましい態様において、捕捉因子受容体は、ビオチン化型で存在し、そし
て固相に固定されたストレプトアビジンによって、固相に結合してもよい。 一方、捕捉因子受容体は、ビオチンで標識されていなくてもよく、そして微生
物のエピトープ、好ましくは細菌エピトープは、第三のビオチン標識受容体を介
して検出してもよく、この受容体は、好ましくは抗体、その断片もしくは誘導体
、またはアプタマー、あるいは種特異的もしくはＩｇクラス特異的抗体または対
応するアプタマーである。前記の第三のビオチン標識受容体は、捕捉因子受容体
に特異的に結合し、そして解析物−受容体複合体は、第三のビオチン標識受容体
を介して、本態様において、固定化ストレプトアビジンからなる試験ラインに結
合される。
【０１０１】 コロイド状金、セレン、有色ポリスチレンまたはラテックス粒子、炭素粒子と
共に分散色（当業者は当該技術分野から知る）を、検出に用いる受容体の標識と
して用いてもよい。
【０１０２】 一方、前に言及されたように、検出に用いる受容体はまた、標識されていなく
てもよく、そしてしたがって、微生物のエピトープは、前記非標識受容体に対し
て向けられる第三の標識受容体を介して検出してもよく、前記受容体は、好まし
くは、種特異的またはＩｇクラス特異的抗体あるいは対応するアプタマーであっ
てもよい抗体、その断片または誘導体あるいはアプタマーである。
【０１０３】 特に好ましい態様において、標識はコロイド状金である。 こうした標識は、当該技術分野に知られる；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上
記引用文中を参照されたい。同じことがアプタマーにもあてはまる。先に記載さ
れる態様は、場合により腸通過後もなお四量体として存在するカタラーゼの検出
に関して特に好適である。もちろん、この態様においても、抗体、断片、誘導体
およびアプタマーの組み合わせ、例えば同一抗原の異なるエピトープに結合する
抗体の組み合わせを用いてもよい。
【０１０４】 本発明の方法の別の好ましい態様において、モノクローナル抗体はネズミ抗体
である。 さらに、別の好ましい態様において、受容体は、支持体に固定されている。
【０１０５】 日常的なチェックを行う場合、受容体、好ましくは抗体、その断片または誘導
体あるいはアプタマーを支持体に固定することが特に好適である。さらに、抗体
−支持体／アプタマー−支持体の組み合わせは、ツールセットまたはキットの形
でパッケージングしてもよい。
【０１０６】 別の特に好ましい態様において、支持体材料は、有孔支持材料である。 別の特に好ましい態様において、支持体材料は、試験ストリップである。 さらに、好ましい態様において、支持体材料は、セルロースまたはセルロース
誘導体からなる。
【０１０７】 便、胃ガス、呼気濃縮物、唾液、歯垢、粘膜スメア、生検、全血または血清を
、本発明の方法によって解析してもよい哺乳動物は、動物、例えば飼われている
動物、例えばネコまたはイヌ、有用動物、例えばブタ、あるいは別の種類の動物
、例えばマウス、トラ（ｔｉｇｅｒ）、アレチネズミ（ｇｅｒｂｉｌ）、または
フェレット（ｆｅｒｒｅｔ）であってもよい。
【０１０８】 別の好ましい態様において、哺乳動物はヒトである。 別の好ましい態様において、本発明の方法は自動化法である。自動化法は、例
えば、ロボットによって行ってもよく、ロボットが方法のいくつかまたはすべて
の工程を行う。相当するロボットは、当該技術分野に知られる。
【０１０９】 さらに、本発明は、前述のＣＤＲの組み合わせを有するＶ領域を有する、また
は前述のハイブリドーマの１つによって産生されるモノクローナル抗体、その断
片または誘導体に関する。
【０１１０】 この場合、図１および２、３および４、５および６または７および８に示され
るＶ領域の少なくとも１つを有する、モノクローナル抗体群、その断片群または
誘導体群が好ましい。好ましくは、この抗体は、図１および２、３および４、５
および６または７および８に示されるＶ領域の２つを有する。さらに、これらの
Ｖ領域が、図１および２に示されるＤＮＡ配列にコードされることが好ましい。
【０１１１】 本発明の特に好ましい態様において、モノクローナル抗体、その断片または誘
導体は、ネズミ抗体またはその断片または誘導体、あるいはキメラ、好ましくは
ヒト化抗体またはその断片または誘導体である。誘導体はまた、融合タンパク質
であってもよい。さらに、抗体は、例えばコロイド、金、セレン、ラテックス、
有色ポリスチレン、当業者に知られる分散色の炭素粒子からなる標識で、放射能
、蛍光、燐光または化学発光標識で、標識されていることが好ましい。
【０１１２】 キメラヒト化およびヒト抗体の、並びに他の誘導体の産生は、当該技術分野に
公知である（例えばＶａｕｇｈａｎら、１９９８； Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８
９、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記）。
【０１１３】 本発明はまた、モノクローナル抗体、その断片または誘導体と同一のエピトー
プに特異的に結合するアプタマーにも関する。こうしたアプタマーは、当該技術
分野に知られる方法にしたがって、産生してもよい。
【０１１４】 さらに、本発明は、上述の抗体、その断片または誘導体、あるいはアプタマー
の１つによって特異的に結合されるエピトープに関する。 さらに、本発明は、本発明のエピトープに特異的に結合する、さらなる抗体群
、その誘導体群または断片群に関する。これらの抗体は、例えば、ハプテン／抗
原の成分としてエピトープを用いる標準法にしたがって産生してもよい、モノク
ローナル抗体であってもよい。
【０１１５】 さらに、本発明は、支持体材料に固定された、少なくとも１つの受容体、好ま
しくは、上に定義されるような、少なくとも１つのモノクローナル抗体、その断
片または誘導体、あるいはアプタマーを含む、診断組成物に関する。
【０１１６】 さらに、本発明は、（ａ）支持体材料に固定された、上に定義されるような、
少なくとも１つのモノクローナル抗体、その断片または誘導体、あるいはアプタ
マーであることが好ましい、少なくとも１つの受容体；（ｂ）便試料を調整し、
そして解析するための装置、および所望により上に定義されるような受容体の混
合物を含む、少なくとも１つの上述のエピトープを検出するための試験装置に関
する。
【０１１７】 先に言及されたように、本発明はさらに、ＷＯ ９８／５８５８７に記載され
るような、便試料を調製し、そして解析するための装置に関する。前記装置は、
試料の吸収および調製のためのユニットおよび試験ユニット（試験ストリップ）
を１つの装置に含む。
【０１１８】 本発明のさらなる主題は、（ａ）少なくとも１つの受容体、好ましくは、上に
定義されるような、モノクローナル抗体、その断片または誘導体、あるいはアプ
タマーであって、サイズが典型的には５ｎｍないし１００ｎｍ、好ましくは４０
ｎｍないし６０ｎｍの範囲である（金に関しては４０ｎｍないし６０ｎｍの粒子
サイズ、そしてラテックスに関しては２００ｎｍないし５００ｎｍが特に好まし
い）、コロイド状金、ポリスチレン（ラテックス）または他の有色粒子とコンジ
ュゲート化されている、前記受容体；（ｂ）ＷＯ ９８／５８５８７に記載され
るような、便試料を調製し、そして解析するための装置；および所望により（ｃ
）上に定義されるような受容体の混合物を含む試験装置である。
【０１１９】 便試料を調製し、そして解析するための装置の代わりに、組成物およびキット
はまた、胃ガス、呼気濃縮物、唾液、歯垢、粘膜スメア、生検、全血または血清
を調製し（必要な場合）そして解析するための装置も有する可能性がある。
【０１２０】 さらに、本発明は、（ａ）好ましくは、上に定義され、そして支持体材料に固
定されているような、少なくとも１つのモノクローナル抗体、その断片または誘
導体、あるいはアプタマーであり、そして支持体材料に固定されている、少なく
とも１つの受容体；所望によりまた、（ｂ）例えばＷＯ ９８／５８５８７に記
載されるような、便試料を調製し、そして解析するための装置；および所望によ
り（ｃ）上に定義されるような受容体の混合物を含むキットに関する。
【０１２１】 実施例は本発明を例示する。
【０１２２】
【実施例】
実施例１：Ｈ．ピロリ抗原の単離 Ｈ．ピロリの培養 Ｈ．ピロリ（株ＮＣＴＣ １１６３７）は、ペトリ皿中、１０％ ウマ血液お
よびアンホテリシンＢ、バンコマイシンおよびセフソルジン（Ｃｅｆｓｏｌｕｄ
ｉｎ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を添加したＷｉｌｋｉｎｓ ｃｈａ
ｌｋｅｒｓ寒天上にプレーティングし、そして微好気性大気中で（Ａｎａｅｒｏ
ｃｕｌｔ ＧａｓＰＡｋ、Ｍｅｒｃｋ）、３７℃で３または４日間インキュベー
ションした。２つのペトリ皿の内容物を、１ｌビン（Ｓｃｈｏｔｔ）中の、上述
のように抗生物質を添加した３５０ ｍｌのＢＨＩＢ培地に懸濁し、培地を１０
％ ＣＯ2、５％ Ｏ2、８５％ Ｎ2のガス混合物で、１０分間、燻蒸し、そし
てビンを密封した。培養を、回転震蘯装置上で、３７℃で２日間、震蘯した。そ
の後、ビンの内容物を、無菌的に１０ｌビンに入れ、そして４．７ｌのＢＨＩＢ
培地で満たした。これを回転震蘯装置上で、３７℃でさらに２日間、インキュベ
ーションした。続いて、全体積を、５，０００ｇで１５分間、遠心分離し、上清
をデカントし、そして細菌ペレットの重量を測定した。ペレットを保存するため
、２：１（ｗ／ｖ）の比で１５％グリセリンを添加した生理食塩水に再懸濁し、
そして−８０℃で凍結した。培養した細菌の同一性をチェックするため、細菌の
顕微鏡検査と共に、ウレアーゼ、酸化酵素およびカタラーゼに関する試験を行っ
た。
【０１２３】 実施例２：Ｈ．ピロリ抗原の調製 Ｈ．ピロリ溶解物の調製 ＰＢＳ、ｐＨ ７．５を１：１０の比でＨ．ピロリ細菌ペレット（実施例１）
に添加し、そして氷上で再懸濁した。細菌細胞を、氷上で、各６０秒の中断をは
さみ、２５−３０％の強度で、１０ｘ６０秒、小さい超音波検出装置（Ｓｏｎｉ
ｆｅｒ 、Ｂｒａｎｓｏｎ）を用いて、超音波処理した。破壊された細菌細胞を
、４℃で２ｘ２０分間、そして１０，０００ ｒｐｍ（Ｓｏｒｖａｌｌ、ＳＳ３
４）で遠心分離した。上清を、ポリクローナル抗血清の産生のための抗原調製と
して用いた。
【０１２４】 Ｈ．ピロリ・カタラーゼの調製 破壊緩衝液（２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ ７．０、１ ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１ ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、０．０５
％ アジ化ナトリウムおよび１０％（ｖ／ｖ）イソブタノール）を、１：２（ｗ
／ｖ）の比で凍結細菌ペレットに添加し、そして完全に融解するまで、室温（Ｒ
Ｔ）で、オーバーヘッド震蘯装置中で震蘯し、そしてさらにおよそ１５分間、続
いて震蘯した。２０，０００ ｒｐｍ（Ｓｏｒｖａｌｌ、ＳＳ−３４）、４℃で
２０分間の遠心分離後、上清をデカントし、そして０．４５μｍフィルターを通
じてろ過した。
【０１２５】 清澄な上清を、１：３の比で、緩衝液Ａ（２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐ
Ｈ ７．０、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、１ ｍＭ ＰＭＳＦ、０．０５％ アジ化ナ
トリウム）で希釈し、そして緩衝液Ａで平衡化したＳｏｕｒｃｅＱカラム（１６
／１０）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に移した。ＳｏｕｒｃｅＱカラムを通じる流
れは、酵素カタラーゼを含み、そしてウレアーゼ、Ｈｓｐ６０およびアルキルヒ
ドロペルオキシドレダクターゼなどのＨ．ピロリ主要抗原を含まなかった。
【０１２６】 カタラーゼを単離するため、ＳｏｕｒｃｅＱカラムを通じる流れを、分子ふる
いクロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）（１６／６０）に供した。
カタラーゼは、およそ１５０ ｋＤａの大きさの別のタンパク質（好中球活性化
タンパク質、ＮＡＰ）と共に、ほぼ同程度の割で、単離された。
【０１２７】 より高い純度のカタラーゼは、ＳｏｕｒｃｅＱカラムを通じる流れを、４０
ｍＭ 酢酸ナトリウム上の２ Ｍ 酢酸ナトリウム溶液、ｐＨ ４．９に入れ、
そしてＳｏｕｒｃｅＳカラム（８／２８）に移した際に得られた。緩衝液Ａで洗
浄し、結合していないタンパク質を除いた後、直線ＮａＣｌ勾配（緩衝液Ａに加
えた０％から１００％の緩衝液Ｂ）を用い、緩衝液Ｂ（４０ ｍＭ 酢酸ナトリ
ウム、１ Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ４．９）でカタラーゼを溶出した。カタラーゼ
は、およそ３７０ ｍＭ ＮａＣｌで溶出する。
【０１２８】 実施例３：カタラーゼの性質決定 ＳＤＳ ＰＡＧＥ中の還元条件下では、精製タンパク質は、およそ５８ ｋＤ
ａの分子量および９０％以上の純度を有した。
【０１２９】 単離タンパク質を同定するため、微量配列決定を行った。タンパク質を、ＳＤ
Ｓ ＰＡＧＥゲル中で、ＬｙｓＣプロテアーゼで切断した。抽出タンパク質混合
物は、ＲＰ−ＨＰＬＣを介して分離した。ＬｙｓＣペプチドの配列解析は、以下
のアミノ酸配列を生じた： ＥＲＬＨＤＴＩＧＥＳＬＡＨＶＴＨＫ この配列は、Ｈ．ピロリ・カタラーゼ由来の対応するＬｙｓＣペプチド（Ｍａ
ｎｏｓ Ｊ．ら（１９９８）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ３（１）， ２８−３
８； Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＡＣ１６０６８．１）に同一である。
【０１３０】 実施例４：ポリクローナルおよびモノクローナル抗体（ｐＡｋ；ｍＡｋ）の産 生 ポリクローナル抗血清の産生 Ｈ．ピロリ溶解物、ウレアーゼ、Ｈｓｐ６０およびアルキルヒドロペルオキシ
ドレダクターゼなどの主要抗原が枯渇したＨ．ピロリ溶解物（実施例２：単離お
よび精製を参照されたい）、富化されたカタラーゼを含むＨ．ピロリ溶解物（例
えば溶解物にカタラーゼを添加することによるもの）に対するポリクローナル抗
血清と共に、精製カタラーゼに対するポリクローナル抗血清は、選択された哺乳
動物（例えばマウス、ウサギ、ヤギなど）を、カタラーゼ・エピトープを含む、
対応する免疫原性調製で免疫感作することによって、得ることが可能である。
【０１３１】 抗体は、血清のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製
してもよく、そして患者の便における抗原検出にモノクローナル抗体が適してい
るかどうか評価するため、サンドイッチＥＬＩＳＡ（実施例９を参照されたい）
における捕捉抗体として用いてもよい。
【０１３２】 ポリクローナルウサギ抗血清は、Ｈ．ピロリ溶解物からのｐａｂ産生（Ｈｅｒ
ｂｅｒｔｓｈａｕｓｅｎ）によって精製した。プロテインＡアフィニティークロ
マトグラフィーによって、これらの抗血清から、ポリクローナル抗体を精製し、
そして患者の便における抗原検出にモノクローナル抗体が適しているかどうか評
価するため、サンドイッチＥＬＩＳＡ（実施例９を参照されたい）における捕捉
抗体として用いた。
【０１３３】 モノクローナル抗体の産生 モノクローナル抗体は、当業者に知られる方法にしたがい（Ｈａｒｌｏｗ ＆
Ｌａｎｅ、１９８９； Ｐｅｔｅｒｓ ＆ Ｂａｕｍｇａｒｔｅｎ、１９９０
）、生成した。
【０１３４】 免疫感作 Ｈ．ピロリ溶解物から産生された抗原調製（実施例２を参照されたい）を、ネ
ズミ（ＢＡＬＢ／ｃ ｘ Ｃ５７／Ｂｌａｃｋ、Ｆ１世代、８−１２週齢）を免
疫感作するのに用いた。基本的免疫感作では、５０μｇの抗原を、フロイントの
完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）で乳化し、そして腹腔内注射した（２００μｌ
／マウス）。４ヶ月ごとの追加免疫注射では、マウスに、フロイント不完全アジ
ュバントと共に、各々２５μｇの抗原を投与した。ＥＬＩＳＡ（例えば融合スク
リーニング）の陽性対照としての抗血清は、マウス後眼窩から採取した血液から
得た。
【０１３５】 融合 最後の免疫感作の２日後、マウス脾臓を除去し、そしてポリエチレングリコー
ル４０００を用いて、５：１の比で、脾臓細胞を骨髄腫細胞Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．
６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０； Ｋｅａｒｎｅｙら、１９７９）と融合
させた。融合細胞を、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン
補足剤（Ｓｉｇｍａ）を含むクローニング培地（＝ＲＰＭＩ １６４０培地、２
０％ ＦＣＳ、２００ Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ−６））に懸濁し、そして２−６ｘ
１０4細胞／プレートの細胞密度で、９６ウェルマイクロタイタープレートに蒔
いた。ハイブリドーマは、３７℃、５％ ＣＯ2および９５％相対湿度で培養し
た。
【０１３６】 直接ＥＬＩＳＡによる融合スクリーニング コロニー化プレート（融合およそ１０日後）由来の抗体含有培養上清のスクリ
ーニングは、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｂ、Ｎｕｎ
ｃ）上の直接ＥＬＩＳＡで行った。
【０１３７】 ＥＬＩＳＡプレートを炭酸緩衝液、ｐＨ ９．６中の２μｇ／ｍｌの免疫感作
抗原で被覆した（１００μｌ／プレート、一晩、５℃）。被覆溶液を吸い取り、
そしてなお未結合である結合部位を、ＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳でブロ
ッキングした（２００μｌ／プレート、１時間、室温）。プレートを、０．０２
５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）を含むＰＢＳ、ｐＨ ７．３で２回洗浄した後
、一次クローンの培養上清を、プレート中で希釈せずにピペッティングし（１０
０μｌ／プレート）、そしてプレートを室温で１−２時間インキュベーションし
た。抗血清を陽性対照として用い、培地を陰性対照として用いた。再び洗浄した
後、結合抗体の検出は、ペルオキシダーゼ標識二次抗体を用いて行った（０．１
％ ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中のウサギ−抗マウスＩｇ−ＰＯＤ（ＤＡ
ＫＯ）、２０分間、室温）。プレートを４回洗浄し、そしてたたいた後、基質溶
液（ＴＭＢ＋Ｈ2Ｏ2を含むＫ−Ｂｌｕｅ、Ｎｅｏｇｅｎまたはクエン酸緩衝液、
ｐＨ ４．５）を添加した。ペルオキシダーゼは、無色基質テトラメチルベンジ
ジン（ＴＭＢ、Ｓｉｇｍａ）を、有色複合体に変える。１０分後、１ Ｎ 硫酸
を添加することによって、反応を停止した。抗原特異的抗体を産生するクローン
の培養上清は、無色陰性培養上清に比較して、かなり色がついていた。
【０１３８】 ハイブリドーマの樹立および培養 陽性クローンは、モノクローンを得るため、限界希釈解析の原理にしたがい、
２回再クローニングした（Ｃｏｌｌｅｒ ＆ Ｃｏｌｌｅｒ、１９８３）。第一
の再クローニングは、ヒポキサンチン・チミジン補足剤（Ｓｉｇｍａ）を含むク
ローニング培地中で行い、第二の再クローニングは、クローニング培地中で行っ
た。再クローンは、直接ＥＬＩＳＡによって、抗原特異性に関して調べた。最終
的に、最終クローンを、平底ビン中の産生培地（５％ ＩｇＧ減少ＦＣＳを含む
ＲＰＭＩ １６４０培地）に適応させた。該細胞を凍結保存し、そして抗体精製
のため、培養上清を産生した。
【０１３９】 実施例５：培養上清由来の抗体の性質決定 １０のクローンを、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける、Ｈ．ピロリに感染した
患者の便試料の優れた反応性によって、３０の特異的（免疫感作抗原に対する抗
体を産生する）クローンのレパートリーから選択した。
【０１４０】 アイソタイプ決定 培養上清において、モノクローナル抗体のアイソタイプ決定は、アイソタイプ
決定キットＩｓｏＳｔｒｉｐ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて
、樹立クローンで行った。結果は：８種類のＩｇＧ１クローンおよび１種類のＩ
ｇＧ２ａクローンであった（表２を参照されたい）。
【０１４１】 ウェスタンブロット ウェスタンブロットにおいて、免疫感作抗原を特異的に認識する能力に関して
、培養上清を調べた。ゲル当たり１５μｇの精製抗原を、還元試料緩衝液（Ｌａ
ｅｍｍｌｉ、１９７０）中で煮沸し、そして１２％ ＳＤＳポリアクリルアミド
ミニゲル（８．６ ｃｍ ｘ ７．７ ｃｍ ｘ ０．１ ｃｍ、Ｂｉｏｍｅｔ
ｒａ）に適用した。２５−３０ ｍＡでの電気泳動分離後、タンパク質（抗原）
を、半乾燥ブロット技術によって、ニトロセルロース上に固定した。
【０１４２】 膜を、ＰＢＳ中の２％脱脂粉乳でブロッキングし（３０分間、室温）、そして
ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０（０．２％）で５分間、３回洗浄した。以下のインキ
ュベーション工程では、３４のクロスチャンネルを備えたグリッドプレートを用
いて、膜をＡｃｃｕｔｒａｎクロスブロットスクリーニングユニット（Ｓｃｈｌ
ｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｌ）内にクランプで締めた。形成されるトレ
ース各々において、２５０μｌのＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０および試験しようと
する２５０μｌのハイブリドーマ培養上清を添加する。震蘯しながら、室温で２
時間、インキュベーションを行った。
【０１４３】 ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄した後、ＰＯＤ−コンジュゲート化二次
抗体（ウサギ−抗マウスＩｇ−ＰＯＤ、ＤＡＫＯ）で、膜を１時間インキュベー
ションした。膜を３回洗浄し、そして３，３−ジアミノベンジジン基質溶液（Ｄ
ＡＢ、Ｓｉｇｍａ）を添加することによって、免疫複合体を視覚化した。続いて
、不溶性ペルオキシダーゼ基質によって、抗体に結合しているタンパク質バンド
を視覚化した。
【０１４４】 ６つのハイブリドーマ培養上清が、カタラーゼに対応するバンド（５８ ｋＤ
ａ）を示し、３つがウェスタンブロットで陰性であったが、ＥＬＩＳＡにおいて
、天然抗原と陽性反応を示した。これらは、コンホメーション・エピトープを認
識する可能性がある。表２は、結果の要約を示す。
【０１４５】 実施例６：患者試料中のｍＡｋ培養上清のスクリーニング（混合ポリクローナ ル／モノクローナル系） 直接ＥＬＩＳＡを介した融合スクリーニングにおいて、陽性抗原認識を示すモ
ノクローナル抗体を、患者認識および抗原検出限界に関して、サンドイッチＥＬ
ＩＳＡで培養上清として解析した。
【０１４６】 感染状態（群０および４）が組織学的解析および／または13Ｃ−尿素呼吸試験
によって決定されている便試料を、内部発生試料として用いた。群０の患者では
、Ｈ．ピロリの感染は、確実に排除することが可能であり、群４の患者では、感
染は、確実に検出することが可能であった。
【０１４７】 ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｂ； Ｎｕｎｃ）の被覆は、１００μｌ
のポリクローナルウサギ抗カタラーゼ抗体またはポリクローナルウサギ抗Ｈ．ピ
ロリ抗体溶液（ｐＡｋ；およそ２０μｇ ＩｇＧ／ｍｌ ０．１Ｍ 炭酸緩衝液
、ｐＨ ９．５）を用いて、５℃で一晩、行った。なお未結合である結合部位の
飽和のため、プレート当たり、０．２％の魚ゼラチン（ｗ／ｖ）を含む２００μ
ｌの１５０ ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ ７．２を添加し、そして室温で３０分間イン
キュベーションした。その後、０．０２５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（洗浄緩衝液１
）を添加しながら、２５０μｌ ＰＢＳでＥＬＩＳＡプレートを２回洗浄した。
ヒト便は、２％脱脂粉乳および１ ｍＭ ＥＤＴＡを添加しながら、１５０ ｍ
Ｍ ＰＢＳで、１：１０（ｗ／ｖ）の比に懸濁した。
【０１４８】 抗原検出限界の決定のため、５０ｎｇ／ｍｌのカタラーゼ（実施例２を参照さ
れたい）を、Ｈ．ピロリ陰性便懸濁物に添加し、そしてＨ．ピロリ陰性便懸濁物
で、１：２段階で希釈した。プレート当たり各々１００μｌの便懸濁物を、１時
間インキュベーションした（患者試料で二重測定）。プレートを洗浄緩衝液２（
０．２％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で４回洗浄した。その後、ハイブリ
ドーマ由来の１００μｌ培養上清（ＰＢＳ中１：５希釈）を添加し、そして室温
で６０分間インキュベーションした。結合抗体の検出は、コンジュゲート化二次
抗体（ウサギ抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ、ＤＡＫＰ、デンマーク・コペンハーゲン
）を添加することによって、行った。ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）は、無色基質
テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｓｉｇｍａ）を青い産物に変えた。５ないし
１０分後、または陰性対照もまたわずかに青い発色を見せたら直ちに、１Ｎ 硫
酸の添加によって、反応を停止した。発色反応の強度は、ＥＬＩＳＡ読取装置（
ＭＷＧ Ｓｐｅｋｔｒａｌ）で測定した。測定は、参照波長６２０ ｎｍに対し
て４５０ ｎｍで行った。ＥＬＩＳＡプレートは、検出抗体または基質溶液を添
加する前に、各々、洗浄緩衝液で、３−４回、洗浄した。
【０１４９】 対照（抗原を添加しない、Ｈ．ピロリ陰性便懸濁物）の２倍より大きいかまた
はそれに等しい消光が検出された最低濃度を、検出限界とした。
【０１５０】 表１：ＨＰ２５．２ｍ／２Ｈ１０：患者試料を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ における感度および特異性
【０１５１】
【表１】
【０１５２】
【０１５３】 サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、患者試料を用いると、モノクローナル抗体
ＨＰ２５．２ｍ／２Ｈａｌｌｉｎ（Ｋ１０）は、６８％の感度（２５のうち１７
の陽性試料が正しく認識された）および８２％の特異性（１７のうち１４の試料
が正しく認識された）を示した。
【０１５４】 表２：カタラーゼに対するモノクローナル抗体の性質決定
【０１５５】
【表２】
【０１５６】 結果 表２は、アイソタイプ決定、ウェスタンブロット解析、検出限界の決定および
カタラーゼに対する培養上清中のモノクローナル抗体に関する患者認識を要約す
る。混合ポリクローナル−モノクローナルサンドイッチＥＬＩＳＡ系において、
ｍａｂ ＨＰ２５．２ｍ／２Ｈａｌｌｉｎ（Ｋ１０）は、６８％の感度および８
２％の特異性を示した。感度および特異性の改善は、純粋なモノクローナルＥＬ
ＩＳＡ系において、（培養上清の代わりに）精製ｍａｂを用いた際に示された。
【０１５７】 この目的のため、同一のエピトープに対して向けられるモノクローナル抗体ま
たは同一抗原の異なるエピトープに対して向けられる２つの異なるモノクローナ
ル抗体（実施例８を参照されたい）を、捕捉および検出抗体として用いてもよい
。
【０１５８】 実施例７：ハイブリドーマ培養上清からのモノクローナル抗体の精製 血清不含ハイブリドーマ培養上清からのｍａｂの精製は、修飾プロテインＧア
フィニティークロマトグラフィーによって行った（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ、１９９４）。
【０１５９】 ろ過した（０．４５μｍ）培養上清を、プロテインＧマトリックス上に直接導
いた。フロースルー中または溶出物中のタンパク質の検出は、２８０ｎｍの光学
密度を測定することを介して行った。１５０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．２で洗浄し
た後、検出装置のバックグラウンド値になるまで、０．１Ｍ グリシン／ＨＣｌ
、ｐＨ３．３で溶出を行った。タンパク質マトリックスは、０．１Ｍ グリシン
／ＨＣｌ、ｐＨ２．７で再生した。
【０１６０】 実施例８：精製モノクローナル抗体の性質決定および試験のための抗体の選択 培養上清からの測定中の便試料認識のための最適検出特性を示す抗体を、精製
状態でさらに性質決定した。まず、表面プラズモン共鳴によって、親和性定数を
決定した。さらに、抗体の結合領域をマッピングした（エピトープマッピング）
。最後に、サンドイッチ便ＥＬＩＳＡおよび迅速試験において、便試料によって
、抗体の適切な対形成を選択した。
【０１６１】 表面プラズモン共鳴分光（ＳＰＲ分光）による、抗体−抗原相互作用の性質 決定 ＳＰＲ分光によって、モノクローナル抗体の親和性定数を決定することが可能
である。したがって、ＥＬＩＳＡおよび迅速試験の発展に適した抗体を見出すこ
とが可能である。
【０１６２】 Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢＩＡｃｏｒｅでの表面プラズモン共鳴分光の伝導 すべての工程は、製造者の指示（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕ
ａｌ）にしたがい、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉａｃｏｒｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎ
ｇ Ｕｎｉｔ ＣＡ １８６で行った。
【０１６３】 カタラーゼは、ＢＩＡｃｏｒｅ ＣＭ５センサーチップのデキストランマトリ
ックス上へのアミンカップリングを通じて固定した。デキストランマトリックス
の活性化のため、０．０５ Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およ
び０．２ Ｍ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド（ＥＤＣ）溶液の１：１混合物４５μｌを、流速５μｌ／分で、センサーチッ
プ上に導いた。その後、カタラーゼ（３５μｌ； １０ ｍＭ 酢酸ナトリウム
、ｐＨ ５．０中の５０μｇ／ｍｌ）を、デキストランマトリックスに結合させ
た。残ったＮＨＳエステルを、１ Ｍ エタノールアミン（３５μｌ）で不活性
化した。デキストランマトリックスに共有結合していないカタラーゼは、ＨＣｌ
（１０ｍＭ； １５μｌ）でセンサーチップを再生することによって、除去した
。
【０１６４】 カタラーゼ特異的モノクローナル抗体を添加することによって、これらを固定
化カタラーゼと反応させ、そして検出因子への質量付着を測定した。２０ないし
６７０ｎＭの範囲の異なる濃度の抗体溶液を用いた。これらは、各々、流速２５
μｌ／分で、センサーチップ上に固定されたカタラーゼを介して注入された。
【０１６５】 抗体の吸着（Ｋon）および脱離（Ｋoff）の速度定数値を計算することが可能
であった（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア３．０）。試験した６つの
うち４つのモノクローナル抗体が、非常に優れた親和性ＫD＞５Ｅ−１０を示し
た（表３）。
【０１６６】 表３：カタラーゼに対するモノクローナル抗体の親和性測定の結果
【０１６７】
【表３】
【０１６８】 カタラーゼに対するモノクローナル抗体のエピトープマッピング Ｐｅｐｓｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（オランダ）によって、エピトープマッピン
グを行った。カタラーゼのペプチドバンク（２７アミノ酸の重複を持つ３０量体
）をプラスチックマップ上に産生し、そして抗体と共にインキュベーションした
。決定されたエピトープ（抗体が結合したペプチド）を表４に列挙する。ＨＰ２
５．２ｍ／２Ｈ１０（Ｋ１０）は、非特異的ペプチド認識を示し、すなわちこの
抗体は、中断された構造エピトープに結合する可能性が非常に高い。主要認識領
域（表４を参照されたい）以外に、ＨＰ２５．６ｍ／１Ｂ５はまた、さらなる非
特異的ペプチド結合も示し、これは、構造成分が関与しているという予想に理由
を与える。検出されたエピトープを、大腸菌カタラーゼ（Ｂｒａｖｏら、１９９
９）の構造に移すと、抗体ＨＰ２５．６ｍ／１Ｂ５、１Ａ５ ４Ｅ３、１Ｇ４お
よび１Ｈ４が、触媒ドメインの近くの領域である、酵素中心（アミノ酸１９０−
３６０）に結合することが明らかになる。
【０１６９】 表４：カタラーゼ−ｍａｂのエピトープマッピングの結果
【０１７０】
【表４】
【０１７１】 抗体の重複認識領域を下線で示す。 患者便による、適切な抗体対形成の決定 第一に、カタラーゼに対する抗体を、互いに対して力価測定（ｔｉｔｔｅｒ）
した。その後、前記方式で最適化されたＥＬＩＳＡ系によって、患者便試料を試
験し、そしてヒトゼロ便において、カタラーゼの検出限界を決定した（表５）。
【０１７２】 サンドイッチＥＬＩＳＡの設定 ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｂ； Ｎｕｎｃ）の被覆は、炭酸緩衝液
、０．１ Ｍ、ｐＨ ９．５中のｍａｂ溶液１００μｌで、３７℃で１時間行っ
た。なお未結合である結合部位のブロッキングのため、プレート当たり２００μ
ｌの１５０ ｍＭ ＰＢＳを、０．２％ 魚ゼラチン（ｗ／ｖ）と共に、ピペッ
ティングし、そして室温で３０分間インキュベーションした。続いて、２５０μ
ｌの洗浄緩衝液１（０．０２５％ Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ）で２回洗浄した。
ヒト便は、２％脱脂粉乳および１ ｍＭ ＥＤＴＡを添加した１５０ ｍＭ Ｐ
ＢＳに１：１０（ｗ／ｖ）の比で懸濁した。抗原検出限界の決定のため、精製Ｈ
．ピロリ・カタラーゼを、既知の濃度で、Ｈ．ピロリ陰性患者の便懸濁物（ゼロ
便）に添加した。便試料懸濁物を７０００ｇで５分間遠心分離した。プレート当
たり、各々１００μｌの上清を、１時間インキュベーションした。試料は、二重
値として適用した。続いて、洗浄緩衝液２（０．２％ Ｔｗｅｅｎを添加した２
５０μｌ ＰＢＳ）で、プレートを４回洗浄した。その後、ＰＢＳ、０．１％
ＢＳＡ中のビオチン−カップリング抗体の溶液１００μｌを添加し、そして室温
で６０分間インキュベーションした。結合抗原／抗体複合体の検出は、ＰＯＤ（
Ｄｉａｎｏｖａ）とストレプトアビジンのコンジュゲートを添加することによっ
て、行った。その後、ＰＯＤは、続く工程で、無色基質ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）を
青い産物に変えた。５ないし１０分後、または陰性対照がわずかに青い発色をし
めしたら直ちに、１ Ｎ 硫酸（１００μｌ／プレート）を添加することによっ
て、反応を停止した。発色反応の強度は、ＥＬＩＳＡ読取装置（ＭＷＧ Ｓｐｅ
ｋｔｒａｌ）で測定した。測定は、６２０ ｎｍの参照波長に対して、４５５
ｎｍで行った。
【０１７３】 ＨＰ２５．２ｍ／２Ｈ１０（表５）は、試験したすべての他の抗体との組み合
わせに適した検出因子抗体であることが証明された。親和性データにより、ＨＰ
２５．６ｍ／１Ｂ５、１Ｇ４および１Ｈ４は、迅速試験における捕捉抗体として
試験した。ＨＰ２５．２ｍ／１Ｂ５が最も優れた捕捉抗体であることが証明され
た。
【０１７４】 表５：カタラーゼに対するモノクローナル抗体対形成の発見の結果
【０１７５】
【表５】
【０１７６】 実施例９：イムノクロマトグラフィー迅速試験で用いるためのコンジュゲート の産生 ビオチンとｍａｂのカップリング 精製後、モノクローナル抗体群をビオチンとカップリングする。カップリング
は既知の方法（Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ、１９８８）にしたがって行った。
【０１７７】 モノクローナル抗体群は、およそ１−２ ｍｇ／ｍｌの濃度でコンジュゲート
化した。カップリング前に、抗体は、０．１ Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
８．３、および０．１ Ｍ 炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ ８．３中での
透析によって、再緩衝した。抗体各１ ｍｇに、５０μｇのＮ−ヒドロキシスク
シンイミドビオチン（ＮＨＳ−ｄ−ビオチン； Ｓｉｇｍａ）を添加し、そして
ＤＭＳＯ中で混合した。混合物を室温で１時間インキュベーションした。その後
、ビオチン化抗体を、０．１５ Ｍ ＰＢＳ、０．０５％ ＮａＮ3、ｐＨ ７
．５に対する徹底的な透析によって、未カップリングＮＨＳ−ｄ−ビオチンから
遊離させた。
【０１７８】 コロイド状金へのｍａｂのカップリング モノクローナル抗体（ｍａｂ）を標準法（Ｆｒｅｎｓ、１９７３； Ｇｅｏｇ
ｈｅｇａｎおよびＡｃｋｅｒｍａｎ、１９７７； Ｓｌｏｔら、１９８５）にし
たがい、コロイド状金にカップリングした。粒子サイズ４０ ｎｍ、反対除法（
Ｏｐｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）（５２０）ｎｍ＝１の金コロイド（
Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌ、英国カーディフ）を、０．１ Ｍ Ｋ2ＣＯ3 でｐＨ ９に調整した。精製ｍａｂは２ ｍＭ ホウ酸緩衝液、ｐＨ ９．２に
対して透析し、そして０．１ ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。カップリングのた
め、ｍａｂ溶液２ ｍｌを、一滴ずつ、迅速に攪拌しながら金溶液２０ ｍｌに
添加し、そして室温で３０分間インキュベーションした。カップリングのための
最適ＩｇＧ濃度および適切なｐＨ値は、個々に各ｍａｂに関して決定した。金Ｉ
ｇＧコンジュゲートの安定化のため、２ ｍｌ ウシ血清アルブミンを、１０％
の濃度で添加し、そしてさらに５分間インキュベーションした。続いて、ＩｇＧ
にカップリングしていない金コロイドおよび未結合ＩｇＧを、遠心分離によって
分離した。この目的のため、カップリング調製を、１５０００ ｒｐｍ（Ｓｏｒ
ｖａｌｌ、ＳＳ−３４）で３０分間遠心分離し、そして清澄な上清を、真空によ
って吸い取った。遠心管の底に、濃い赤に染まったゆるい沈降物として堆積した
金ＩｇＧコンジュゲートを、１％ ウシ血清アルブミンおよび０．０５％ Ｎａ
Ｎ3を添加した２ ｍｌの２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．２に吸収させた。
【０１７９】 実施例１０：イムノクロマトグラフィー迅速試験 サンドイッチ原理にしたがったイムノクロマトグラフィー試験は、抗体対、Ｈ
Ｐ２５．２ｍ／２Ｈ１０およびＨＰ２５．６ｍ／１Ｂ５を用いて設定した。図９
および１０に図式的に例示されるように、この試験は、試料適用領域（１）、フ
ィルター（２）、試験または解析領域（３）および吸収領域（４）からなる。
【０１８０】 精製ｍａｂ ＨＰ２５．２ｍ／２Ｈ１０は、シグナル形成免疫試薬として金（
Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌ、英国カーディフ）にカップリングさせた。ｍ
ａｂ金コンジュゲートは、３からのＯＤ（５２０ｎｍ）に５％ スクロース（Ｓ
ｉｇｍａ、ダイゼンホッフェン）を添加することによって、脱イオン水で希釈し
、そしてガラス繊維（Ｐａｌｌ、ドライアイヒ）で出来たコンジュゲート・フリ
ースに適用した。続いて、コンジュゲート・フリースを真空乾燥させた。
【０１８１】 試験領域（図１０、３）として、流速９５−１７５秒／４ ｃｍのニトロセル
ロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）を、試
験および対照ラインを形成する免疫試薬で被覆した。この目的のため、試験スト
リップのための特定の適用器具（Ｉｍａｇｅｎｅ、米国ニューハンプシャー州ハ
ノーバー）を用いた。試験ライン（図１０、６）として、精製ｍａｂ、ＨＰ２５
．６ｍ／１Ｂ５を、リン酸緩衝液、ｐＨ７．４中、１−２μｇ／ｃｍの濃度で適
用した。対照ライン（図１０、７）として、ポリクローナル抗マウス抗体（Ｄｉ
ａｎｏｖａ、ハンブルグ）を、０．１−０．３μｇ／ｃｍの濃度で適用した。
【０１８２】 続いて、被覆ニトロセルロースおよび被覆コンジュゲート・フリースを、試験
ストリップの他の成分を含むポリエステルキャリアー（Ｇ ＆ Ｌ、米国カリフ
ォルニア州サンタクララ）に固着させ、そして５ｍｍの幅の単一の片に切断した
。フィルター（図１０、２）として、１−２ｃｍの幅で、ガラス繊維材料（Ａｈ
ｌｓｔｒｏｍ、米国ペンシルバニア州マウントホーリースプリングス； Ｐａｌ
ｌ、ドライアイヒ； Ｗｈａｔｍａｎ、英国メードストン）を用いた。吸収領域
（図１０、４）には、幅２−３ｃｍで、吸収性セルロースまたはセルロースガラ
ス繊維材料を用いた（Ｐａｌｌ、ドライアイヒ； Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆
Ｓｃｈｕｅｌｌ、ダッセル； Ｗｈａｔｍａｎ、英国メードストン）。
【０１８３】 実施例１１：試験ラインとしてストレプトアビジンを用いた、イムノクロマト グラフィー迅速試験 実施例１０に記載された迅速試験と異なり、試験ラインとして用いられるｍａ
ｂ ＨＰ２５．６ｍ／１Ｂ５を、ビオチンにカップリングさせ、そして試料適用
領域の第二のコンジュゲート・フリース上に乾燥させた。試験ラインとして、組
換えストレプトアビジン（Ｒｏｃｈｅ、マンハイム）は、リン酸緩衝液、ｐＨ
７．４中、１０−２０ ｍｇ／ｍｌの濃度で被覆した。
【０１８４】 このサンドイッチ設定で、両抗体コンジュゲートは、試験中、可動性であり、
そして試験中、試験ストリップを横切って移動する。抗原の存在下で、ストレプ
トアビジンへのビオチンの結合のため、試験ラインで停止する、完全サンドイッ
チ複合体は、移動中に形成される。
【０１８５】 実施例１２：イムノクロマトグラフィー迅速試験による、ヒト便中のＨ．ピロ リの検出 患者試料 イムノクロマトグラフィー迅速試験の評価のため、１０の異なる病院または胃
腸手術室の患者由来の２００の便試料が自由に使用可能であった。試料は、胃腸
管のいかなる問題または疾患も持たない患者および胃腸管の問題または疾患のた
めの治療を受けている患者、両方に由来した。陰性患者の感染状態は、13Ｃ−尿
素呼吸試験および／または胃生検の組織学的解析によって決定した。金標準（ｇ
ｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ）として認められたこれらの２つの方法で、矛盾する
結果を示した患者は、評価に含まなかった。試験しようとする便試料は、実験室
スタッフが感染状態に関して知ることがないように、分類した。
【０１８６】 試験実行 迅速試験のため、便試料を、試料緩衝液中で１：１５の比に溶解し、そして５
００μｌの試料溶液を、試験ストリップの適用領域（試料適用領域）に適用した
。１５分後、視覚的に試験を解析した。試験ラインでの試験シグナルは、存在（
試験結果陽性）または非存在（試験結果陰性）と評価した。試験結果の読み取り
は、実験室人員として資格をもたない３人によって、各々独立に行った。さらに
、試験は、実験室人員によって、０（陰性）、１（わずかに陽性）および２（強
く陽性）として、半定量的に評価した。
【０１８７】 表６は、総数２００の患者試料を評価した後の、便迅速試験によって達成した
結果を、２つの参照法と比較して示す。該試験において、総計１００のうち９５
のＨ．ピロリ陽性試料が真の陽性であることが見出され、５試料は偽陰性結果を
示した。総計１００のうち９４試料のＨ．ピロリ陰性試料が真の陰性であること
が見出され、６試料は偽陽性結果を示した。比較すると、迅速試験の感度および
特異性は、９５％および９４％であった。
【０１８８】 表６：総計２００の便試料の評価の金標準法および迅速試験（半定量的）の試 験結果
【０１８９】
【表６】
【０１９０】
【０１９１】
【０１９２】
【０１９３】
【０１９４】
【０１９５】 実施例１３：ハイブリドーマ細胞株由来の免疫グロブリンの機能する可変領域 のクローニングおよび配列決定 総ＲＮＡは、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、１９８７）
にしたがい、抗体産生ハイブリドーマ細胞株から単離した。
【０１９６】 その後、対応するｃＤＮＡを、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）にし
たがって合成した。 それぞれの抗体のカッパ軽鎖と共に重鎖Ｆｄ部分（ＶＨまたはＣＨ１）をコー
ドするＤＮＡ領域は、ＰＣＲによって増幅した。表７に示されるオリゴヌクレオ
チドプライマーセットを用い、単一ハイブリドーマ細胞株から単離したｃＤＮＡ
がテンプレートとして働いた。
【０１９７】 用いたプライマーセットは、重鎖Ｆｄ断片中の５’−ＸｈｏＩおよび３’−Ｓ
ｐｅＩ切断部位と共に、カッパ軽鎖中の５’−ＳａｃＩおよび３’−ＸｂａＩ切
断部位を導いた。重鎖Ｆｄ１１をコードするＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のため、異
なる５’−ＶＨプライマー（ＭＶＨ １−８およびＭＵＬＨ １−３）を各々、
３’−ＶＨプライマーＭＩｇＧ２ａ（ＨＰ２５．２ｍ／２Ｈ１０）または３’−
ＶＨプライマーＭＩｇＧ１（ＨＰ２５．６ｍ／１Ｂ５）と組み合わせた。カッパ
軽鎖をコードするＤＮＡ断片の増幅のため、１１の異なる５’−ＶＫプライマー
（ＭＵＶＫ １−７およびＭＵＬＫ １−４）を、各々、３’−ＶＫプライマー
３’ＭＵＣＫと組み合わせた。
【０１９８】 以下の温度プログラムをすべてのＰＣＲ増幅で用いた：９４℃３０秒の変性、
５２℃６０秒のプライマー付着、７２℃９０秒の重合。このプログラムを４０周
期の間、維持し、その後、７２℃１０分間で断片を最終的に完了させた。
【０１９９】 ＰＣＲ増幅の結果は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして期待さ
れる分子量のＤＮＡバンドを単離した。抗体２５．２ｍ／２Ｈ１０に関しては、
その後、酵素ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ（重鎖）またはＳａｃＩおよびＸｂａＩ（
軽鎖）を用いて、単離されたバンドを制限消化に供した。ベクターをまず、制限
酵素ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩまたはＳａｃＩおよびＸｂａＩで切断した後、得ら
れた断片を、プラスミドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）にクローニングした。
【０２００】 続いて、クローニングされた重鎖および軽鎖断片のプラスミド調製を配列決定
した。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の機能する可変領域（ＶＨまたはＶＬ）
をコードする配列を選択した。この方式で、各ハイブリドーマ細胞株に関して、
１つの機能するＶＨおよび１つの機能するＶＬ領域を正確に同定することが可能
であった。図１および図２は、機能するＶＨおよびＶＬ配列を示す。ＶＨ領域の
最初の４アミノ酸は、再クローニングすることによって、完了させた。クローニ
ングおよび配列決定は、標準法にしたがって行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９
８９）。
【０２０１】 抗体２５．６ｍ／１Ｂ５に関しては、単離されたバンドをその後、直接配列決
定し、そして機能する軽鎖および機能する重鎖を同定した。その後、重鎖Ｆｄ断
片および軽鎖を、酵素ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ（重鎖）並びにＳａｃＩおよびＸ
ｂａＩ（軽鎖）を用いた制限消化に供した。酵素ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩおよび
／またはＳａｃＩおよびＸｂａＩによって、プラスミドベクターｐＢＳＩＩＩＨ
ｉｓＥｘ（Ｃｏｎｎｅｘ）を分割した後、得られた断片をこのベクターにクロー
ニングし、そして再び配列決定した。
【０２０２】 この方式で、このハイブリドーマ細胞株に関し、正確に１つの機能するＶＨお
よび１つの機能するＶＬ領域を同定することが可能であった。機能するＶＨおよ
びＶＬ配列は、図３／図４に提供される。ＶＨおよびＶＬ配列において、成熟Ｎ
末端は、リーダープライマーによる配列決定によって決定されたように示される
。クローニングおよび配列決定は、標準法にしたがって行った（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、１９８９）。
【０２０３】 表７：重鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖の機能する可変領域のＰＣＲ増幅に用 いられるプライマーのリスト（５’−３’方向）
【０２０４】
【表７】
【０２０５】 参考文献
【０２０６】
【表８】
【図面の簡単な説明】
【図１】 カタラーゼに特異的なモノクローナル抗体［ＨＰ２５．２ｍ／２
Ｈ１０］の重鎖のＶ領域をコードするクローニングされたＤＮＡ配列。コードさ
れるアミノ酸配列は、一文字暗号で示される。Ｋａｂａｔらにしたがって決定さ
れたＣＤＲ領域１−３は下線で示す。
【図２】 カタラーゼに特異的なモノクローナル抗体［ＨＰ２５．２ｍ／２
Ｈ１０］の軽鎖のＶ領域をコードするクローニングされたＤＮＡ配列。コードさ
れるアミノ酸配列は、一文字暗号で示される。Ｋａｂａｔらにしたがって決定さ
れたＣＤＲ領域１−３は下線で示す。
【図３】 カタラーゼに特異的なモノクローナル抗体［ＨＰ２５．６ｍ／１
Ｂ５］の重鎖のＶ領域をコードするクローニングされたＤＮＡ配列。コードされ
るアミノ酸配列は、一文字暗号で示される。Ｋａｂａｔらにしたがって決定され
たＣＤＲ領域１−３は下線で示す。
【図４】 カタラーゼに特異的なモノクローナル抗体［ＨＰ２５．６ｍ／１
Ｂ５］の軽鎖のＶ領域をコードするクローニングされたＤＮＡ配列。コードされ
るアミノ酸配列は、一文字暗号で示される。Ｋａｂａｔらにしたがって決定され
たＣＤＲ領域１−３は下線で示す。
【図５】 ウレアーゼに特異的な第一のモノクローナル抗体（ＤＳＭ ＡＣ
Ｃ２３６０）の軽鎖をコードするＤＮＡ配列。コードされるアミノ酸配列は、一
文字暗号で示される。Ｋａｂａｔらにしたがって決定されたＣＤＲ領域１−３は
下線で示す。
【図６】 ウレアーゼに特異的な第一のモノクローナル抗体（ＤＳＭ ＡＣ
Ｃ２３６０）の重鎖をコードするＤＮＡ配列。コードされるアミノ酸配列は、一
文字暗号で示される。Ｋａｂａｔらにしたがって決定されたＣＤＲ領域１−３は
下線で示す。
【図７】 ウレアーゼに特異的な第二のモノクローナル抗体（ＤＳＭ ＡＣ
Ｃ２３６２）の軽鎖をコードするＤＮＡ配列。コードされるアミノ酸配列は、一
文字暗号で示される。Ｋａｂａｔらにしたがって決定されたＣＤＲ領域１−３は
下線で示す。
【図８】 ウレアーゼに特異的な第二のモノクローナル抗体（ＤＳＭ ＡＣ
Ｃ２３６２）の重鎖をコードするＤＮＡ配列。コードされるアミノ酸配列は、一
文字暗号で示される。Ｋａｂａｔらにしたがって決定されたＣＤＲ領域１−３は
下線で示す。
【図９】 迅速試験ストリップの一般的な設定：試料適用領域（１）；試験
または解析領域（３）、吸収領域（４）。試料適用領域は、例えばコロイド状金
またはポリスチレン（ラテックス）または他の結合パートナーで標識されている
、検出に必要な受容体（乾燥状態）、例えば解析物または抗原の特異的抗体があ
る。ほとんどの場合、試験キャリアーは、特別の試験膜、例えばニトロセルロー
スからなる。前記試験膜上で、解析物または抗原に対して向けられる、さらなる
特異的受容体が、試験ラインとして固定される。試料適用領域および試験領域の
間にフィルター（２）がある。
【図１０】 対照ラインを有する、迅速試験ストリップの設定：試料適用領
域（１）；試験または解析領域（３）、および吸収領域（４）。試料適用領域に
は、可視有色粒子、例えばコロイド状金またはポリスチレンで標識されている、
抗原に必要な受容体（乾燥状態）がある。好ましい態様において、試料適用領域
は、一方の領域に、例えば金標識受容体を、他方の領域に、ビオチン標識受容体
を含む、２つの重複するコンジュゲート領域からなってもよい。試験キャリアー
は、ほとんどの場合、特別の試験膜、例えばニトロセルロースからなる。この試
験膜上で、解析物（抗原）に対して向けられる、さらなる特異的受容体が、試験
ライン（６）として固定される。好ましい態様において、ストレプトアビジンが
試験ラインとして固定されてもよい。機能対照として、別の対照または捕捉ライ
ン（７）、例えば標識受容体に対して向けられる受容体を、試験膜上に固定して
もよい。試料適用領域および試験キャリアーの間にフィルター（２）がある。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年９月１２日（２００２．９．１２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ Ｚ 33/53 33/53 Ｕ 33/543 ５２１ 33/543 ５２１ 33/573 33/573 Ａ 33/577 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (31)優先権主張番号 ００１０７０２８．３ (32)優先日 平成12年３月31日(2000．3．31) (33)優先権主張国 欧州特許庁（ＥＰ） (31)優先権主張番号 ００１１０１１０．４ (32)優先日 平成12年５月10日(2000．5．10) (33)優先権主張国 欧州特許庁（ＥＰ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 カルマン，ゲーアハルト ドイツ連邦共和国 81371 ミュンヘン， アルラムシュトラーセ 28 (72)発明者 ラクナー，メレット ドイツ連邦共和国 80689 ミュンヘン， ヴィリバルトシュトラーセ 34 (72)発明者 トリューエ，アンドレアス ドイツ連邦共和国 81241 パズィング， ランツベルガー・シュトラーセ 497 (72)発明者 デーネルト，ゾンヤ ドイツ連邦共和国 81373 ミュンヘン， バート・ガシュタイナー・シュトラーセ 10 (72)発明者 シュヴァルツ，ゲオルク ドイツ連邦共和国 80809 ミュンヘン， グラフ−コンラート‐シュトラーセ 25 Ｆターム(参考） 2G045 AA28 AA34 AA35 BB10 BB20 BB46 BB51 CA25 CB04 CB07 CB21 FA11 FA16 FB01 FB03 FB15 FB17 4B064 AG27 CA20 CC24 CE12 DA01 DA13 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA11 DA76 DA86 EA29 EA52 FA74 GA26

Claims (45)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 酸耐性微生物での哺乳動物の感染を検出するための方法で
    あって、以下の工程： （ａ）抗原を含む哺乳動物の便試料を適用するための試料適用領域を持つイム
    ノクロマトグラフィー迅速試験の提供および便試料の適用、 （ｂ）（ｉ）酸耐性微生物由来の抗原と受容体との複合体形成を可能にする条
    件下で、第一の受容体を用いた；または（ｉｉ）酸耐性微生物由来の抗原と２つ
    の第一の受容体群との複合体形成を可能にする条件下で、少なくとも２つの異な
    る第一の受容体群を用いた、便試料のインキュベーション、ここで（ｉ）記載の
    第一の受容体または（ｉｉ）記載の第一の受容体群が、少なくともいくつかの哺
    乳動物で、天然構造、あるいは該酸耐性微生物に感染したまたは該微生物で免疫
    感作された後、それに対して哺乳動物が抗体を産生する構造、あるいは該酸耐性
    微生物の抽出物もしくは溶解物、またはそれに由来するタンパク質もしくはその
    断片、または合成ペプチドが抗体を産生するような構造に相当する構造を、腸通
    過後に示す抗原に、特異的に結合する、；および （ｃ）解析領域に固定された第二の受容体の提供、ここで第二の受容体は、（
    ｂ）記載の抗原受容体複合体に結合する、および （ｄ）解析領域の第二の受容体に抗原受容体複合体を集積させることによる、
    （ｂ）記載の少なくとも１つの抗原受容体複合体の輸送および形成の検出 を含む、前記方法。
  2. 【請求項２】 酸耐性微生物での哺乳動物の感染の検出のためのイムノク
    ロマトグラフィー試験であって、請求項１記載の方法を実行するのに特に適して
    いるかまたはそのために設計されており： （ａ）抗原を含む哺乳動物由来の便試料の適用のための試料適用領域（１、２
    ）、 （ｂ）（ｉ）酸耐性微生物由来の抗原と受容体の複合体形成を可能にする条件
    下での第一の受容体（５）を用いた；または（ｉｉ）酸耐性微生物由来の抗原と
    ２つの第一の受容体群との複合体形成を可能にする条件下での、少なくとも２つ
    の異なる第一の受容体群を用いた、便のインキュベーションのための装置、ここ
    で（ｉ）記載の第一の受容体または（ｉｉ）記載の第一の受容体群が、少なくと
    もいくつかの哺乳動物で、天然構造、あるいは該酸耐性微生物に感染したまたは
    該微生物で免疫感作された後、それに対して哺乳動物が抗体を産生する構造、あ
    るいは該酸耐性微生物の抽出物もしくは溶解物、またはそれに由来するタンパク
    質もしくはその断片、または合成ペプチドが抗体を産生するような構造に相当す
    る構造を、腸通過後に示す抗原に、特異的に結合する、 （ｃ）解析領域に固定された第二の受容体（６）、ここで第二の受容体（６）
    は、（ｂ）記載の抗原受容体複合体に結合する、および （ｄ）解析物受容体複合体の集積のため、固定された第二の受容体（６）を含
    む解析領域に、（ｂ）記載の抗原受容体複合体を輸送する、輸送装置（３） を有する、前記試験。
  3. 【請求項３】 便試料が適用前に懸濁されている、請求項１または２記載
    の方法または試験。
  4. 【請求項４】 試験ストリップがセルロースまたはセルロース誘導体で出
    来た解析領域を備え、そしてキャリアー材料が、キャリアー材料中の毛管力を介
    して行われる輸送に適している、上述の請求項のいずれか１つに記載の方法また
    は試験。
  5. 【請求項５】 試料適用領域が、コンジュゲート・フリース（１）および
    輸送方向にそれに続く、便または便懸濁物の固体物質部分を本質的にろ過するの
    に適しているフィルター（２）を有する、上述の請求項のいずれか１つに記載の
    方法または試験。
  6. 【請求項６】 フィルター（２）が１ないし２μｍの排除サイズを示す、
    請求項５記載の方法または試験。
  7. 【請求項７】 フィルターが、ガラス繊維および／またはポリエステルガ
    ラス繊維混合物で製造されている、請求項５または６記載の方法または試験。
  8. 【請求項８】 試験ストリップがポリエステルキャリアー上に固定されて
    いる、請求項４ないし６のいずれか１つに記載の方法または試験。
  9. 【請求項９】 抗体または抗体コンジュゲートが、第一および／または第
    二の受容体（群）として提供されている、上述の請求項のいずれか１つに記載の
    方法または試験。
  10. 【請求項１０】 単数または複数の第一の受容体（群）（５）が、懸濁に
    可溶性であり、試験ストリップ上に固定されており、そして／または試験ストリ
    ップ上に乾燥されており、そして／または単数または複数の第二の受容体（群）
    （６）が、懸濁に不溶性であり、試験ストリップ上に固定されており、そして／
    または試験ストリップ上に乾燥されている、請求項４ないし９のいずれか１つに
    記載の方法または試験。
  11. 【請求項１１】 （ｉ）の場合、第一の受容体（５）が、または（ｉｉ）
    の場合、第一の受容体群の１つが、可視または有色粒子、特定の直接標識、例え
    ば金の使用に関しては、典型的にはその大きさが５ｎｍないし１００ｎｍ、好ま
    しくは４０ｎｍないし６０ｎｍ、特に好ましくは４０ｎｍないし６０ｎｍ、また
    はラテックスの使用に関しては、２００ｎｍないし５００ｎｍの範囲のコロイド
    状金またはポリスチレン（ラテックス）で標識されている、あるいは、（ｉ）の
    場合、第一の受容体に特異的に結合する、または（ｉｉ）の場合、第一の受容体
    群の１つに特異的に結合する、さらなる受容体によって標識されており、さらな
    る受容体が、可視または有色粒子、特定の直接標識、例えば金の使用に関しては
    、典型的にはその大きさが５ｎｍないし１００ｎｍ、好ましくは４０ｎｍないし
    ６０ｎｍ、特に好ましくは４０ｎｍないし６０ｎｍ、またはラテックスの使用に
    関しては、２００ｎｍないし５００ｎｍの範囲のコロイド状金またはポリスチレ
    ン（ラテックス）で標識されている、上述の請求項のいずれか１つに記載の方法
    または試験。
  12. 【請求項１２】 （ｉｉ）の場合、可視または有色粒子で標識されていな
    い、第一の受容体の少なくとも１つが、ビオチンとコンジュゲート化され、そし
    て単数または複数の第一のビオチン化受容体（群）が、ストレプトアビジンによ
    って、試験ラインで固定されるように、第二の受容体（６）がストレプトアビジ
    ンであり、そして好ましくはポリストレプトアビジンである、請求項１１記載の
    方法または試験。
  13. 【請求項１３】 好ましくは対照ラインとしての、対照部分が、試験部分
    の後の輸送方向で形成される、上述の請求項のいずれか１つに記載の方法または
    試験。
  14. 【請求項１４】 試験ストリップが、本質的に、輸送方向の末端に、吸収
    領域（４）を示す、請求項４ないし１３のいずれか１つに記載の方法または試験
    。
  15. 【請求項１５】 試験ストリップが、３ないし１０ｍｍ、好ましくはおよ
    そ５ｍｍの幅、および５０ないし１００ｍｍ、好ましくは７５ｍｍの長さを有す
    る、請求項４ないし１４のいずれか１つに記載の方法または試験。
  16. 【請求項１６】 コンジュゲート・フリース（１）の長さが、５ないし３
    ０ｍｍ、好ましくはおよそ２５ｍｍであり、流方向のコンジュゲート・フリース
    （１）およびフィルターの重複が、５ないし１５ｍｍ、好ましくはおよそ１０ｍ
    ｍであり；２つのコンジュゲート・フリースを用いた場合、第一のコンジュゲー
    ト・フリースの長さが、好ましくは２５ｍｍであり、流方向の第一および第二の
    コンジュゲート・フリースの重複が、好ましくは１２．５ｍｍであり、第二のコ
    ンジュゲート・フリースの長さが、好ましくはおよそ１２．５ｍｍであり、流方
    向の第二のコンジュゲート・フリースおよびフィルター（２）の重複が、好まし
    くは１０ｍｍであり、試験または解析領域の長さが、１０ないし３０ｍｍ、好ま
    しくはおよそ２０ｍｍであり、幅がおよそ５ｍｍであり、そして流方向の試験ま
    たは解析領域および吸収領域の重複が、好ましくはおよそ１ｍｍである、請求項
    ４ないし１５のいずれか１つに記載の方法または試験。
  17. 【請求項１７】 微生物が酸耐性細菌、好ましくは、ヘリコバクター（Ｈ
    ｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）
    またはミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌、そして特に
    好ましくは、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒ
    ｉ）、ヘリコバクター・ヘパティクス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｈｅｐａｔ
    ｉｃｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅ
    ｊｕｎｉ）またはヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕ
    ｌｏｓｉｓ）種の細菌であり、抗原が好ましくは、カタラーゼ、ウレアーゼまた
    はメタロプロテイナーゼであって、好ましくはＨ．ピロリのものである、上述の
    請求項のいずれか１つに記載の方法または試験。
  18. 【請求項１８】 単数または複数の受容体／受容体群が、抗体（群）、そ
    の断片（群）もしくは誘導体（群）またはアプタマー（群）であるか、あるいは
    さらに好ましくはマウス抗体またはその断片もしくは誘導体、あるいはキメラ、
    好ましくはヒト化抗体、またはその断片もしくは誘導体、あるいは結合パートナ
    ー、好ましくはアビジン、ストレプトアビジン、ポリストレプトアビジンおよび
    ビオチンである、先の請求項のいずれか１つに記載の方法または試験。
  19. 【請求項１９】 受容体の混合物が検出に用いられ、受容体が抗原の検出
    因子として用いられる場合、受容体の混合物が抗原の捕捉因子の機能を有し、そ
    して／または受容体が抗原の捕捉因子として用いられる場合、混合物が抗原の検
    出因子の機能を有し、そして受容体の混合物が、好ましくはポリクローナル抗血
    清である、請求項１７または１８記載の方法または試験。
  20. 【請求項２０】 受容体の混合物が、検出のために用いられ、受容体の１
    つの混合物が抗原の捕捉因子の機能を有し、そして別の混合物が抗原の検出因子
    の機能を有し、そして好ましくは、少なくとも１つの混合物がポリクローナル血
    清である、請求項１７ないし１９のいずれか１つに記載の方法または試験。
  21. 【請求項２１】 受容体の混合物が、抗原の捕捉因子および検出因子両方
    の機能を有し、そして好ましくは、該混合物がポリクローナル血清である、請求
    項１７ないし１９のいずれか１つに記載の方法または試験。
  22. 【請求項２２】 ポリクローナル抗血清が、微生物の溶解物に対して産生
    され、そして好ましくは、溶解物が富化された抗原を含む溶解物であり、そして
    さらに好ましくは、溶解物が、免疫ドミナント抗原が枯渇した溶解物であるか、
    またはポリクローナル抗血清が、精製または（半）合成産生抗原に対して産生さ
    れ、そして好ましくは、抗原がカタラーゼ、ウレアーゼまたはメタロプロテイナ
    ーゼの抗原である、請求項１９記載の方法または試験。
  23. 【請求項２３】 抗原の捕捉因子として作用する、単数または複数の受容
    体（群）（ａ）および／または抗原の検出因子として作用する、単数またはまた
    は複数の受容体（群）（ｂ）の代わりに、各々 （ａ）の場合、抗原に特異的に結合する少なくとも１つの非標識抗体、および
    少なくとも１つの非標識抗体に特異的に結合する１つの標識抗体からなる、 （ｂ）の場合、抗原に特異的に結合する少なくとも１つの非固定抗体、および
    この少なくとも１つの非固定抗体に特異的に結合する、試験ラインに固定された
    １つの抗体からなる 免疫複合体を用いる、請求項１７ないし２２のいずれか１つに記載の方法または
    試験。
  24. 【請求項２４】 受容体および／または受容体群の混合物が、コンホメー
    ション・エピトープに結合する、請求項１９または２３記載の方法または試験。
  25. 【請求項２５】 カタラーゼ・エピトープに結合する抗体の重鎖が、少な
    くとも１つの以下のＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ３そしてより好ましくは以下のＣ
    ＤＲの３つのすべて： ＣＤＲ１： ＮＹＷＩＨ ＣＤＲ２： ＹＩＮＰＡＴＧＳＴＳＹＮＱＤＦＱＤ ＣＤＲ３： ＥＧＹＤＧＦＤＳ を示し、そして抗体の重鎖をコードするＤＮＡ配列が、少なくとも１つの以下の
    ＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ３そしてより好ましくは以下のＣＤＲの３つのすべて
    ： ＣＤＲ１： ＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡ ＴＴＣＡＣ ＣＤＲ２： ＴＡＣＡＴＴＡＡＴＣ ＣＴＧＣＣＡＣＴＧＧ ＴＴＣＣＡＣＴＴ
    ＣＴ ＴＡＣＡＡＴＣＡＧＧ ＡＣＴＴＴＣＡＧＧＡ Ｃ ＣＤＲ３： ＧＡＧＧＧＧＴＡＣＧ ＡＣＧＧＧＴＴＴＧＡ ＣＴＣＣ を示し、そしてより好ましくは、カタラーゼ・エピトープに結合する抗体の軽鎖
    が、少なくとも１つの以下のＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ３そしてより好ましくは
    以下のＣＤＲの３つのすべて： ＣＤＲ１： ＳＡＳＳＳＶＮＹＭＹ ＣＤＲ２： ＤＴＳＫＬＡＳ ＣＤＲ３： ＱＱＷＳＳＮＰＹＴ を示し、そしてより好ましくは、抗体の軽鎖をコードするＤＮＡ配列が、少なく
    とも１つの以下のＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ３そしてより好ましくは以下のＣＤ
    Ｒの３つのすべて： ＣＤＲ１： ＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴ ＣＡＡＧＴＧＴＡＡＡ ＴＴＡＣＡＴＧＴ
    ＡＣ ＣＤＲ２： ＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡ ＡＡＴＴＧＧＣＴＴＣ Ｔ ＣＤＲ３： ＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡ ＧＴＡＧＴＡＡＴＣＣ ＧＴＡＣＡＣＧ を示す、請求項１８ないし２４のいずれか１つに記載の方法または試験。
  26. 【請求項２６】 カタラーゼ・エピトープに結合する抗体の重鎖が、少な
    くとも１つの以下のＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ３そしてより好ましくは以下のＣ
    ＤＲの３つのすべて： ＣＤＲ１： ＤＴＹＶＨ ＣＤＲ２： ＫＩＤＰＡＮＧＫＴＫＹＤＰＩＦＱＡ ＣＤＲ３： ＰＩＹＹＡＳＳＷＦＡＹ を示し、そして抗体の重鎖をコードするＤＮＡ配列が、少なくとも１つの以下の
    ＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ３そしてより好ましくは以下のＣＤＲの３つのすべて
    ： ＣＤＲ１： ＧＡＣＡＣＣＴＡＴＧＴＧＣＡＣ ＣＤＲ２： ＡＡＧＡＴＴＧＡＴＣＣＴＧＣＧＡＡＴＧＧＴＡＡＡＡＣＴＡＡＡ
    ＴＡＴＧＡＣＣＣ ＧＡＴＡＴＴＣＣＡＧＧＣＣ ＣＤＲ３： ＣＣＣＡＴＴＴＡＴＴＡＣＧＣＴＡＧＴＴＣＣＴＧＧＴＴＴＧＣＴ
    ＴＡＣ を示し、そしてより好ましくは、カタラーゼ・エピトープに結合する抗体の軽鎖
    が、少なくとも１つの以下のＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ３そしてより好ましくは
    以下のＣＤＲの３つのすべて： ＣＤＲ１： ＫＡＳＱＤＶＧＴＳＶＡ ＣＤＲ２： ＷＴＳＴＲＨＴ ＣＤＲ３： ＱＱＹＳＳＳＰＴ を示し、そしてより好ましくは、抗体の軽鎖をコードするＤＮＡ配列が、少なく
    とも１つの以下のＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ３そしてより好ましくは以下のＣＤ
    Ｒの３つのすべて： ＣＤＲ１： ＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＧＧＴＡＣＴＴＣＴＧＴＴ
    ＧＣＣ ＣＤＲ２： ＴＧＧＡＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＧＣＡＣＡＣＴ ＣＤＲ３： ＣＡＧＣＡＡＴＡＴＡＧＣＡＧＣＴＣＴＣＣＣＡＣＧ を示す、請求項１８ないし２４のいずれか１つに記載の方法または試験。
  27. 【請求項２７】 β−ウレアーゼのエピトープに結合する抗体の重鎖が、
    少なくとも１つの以下のＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ３： ＣＤＲ１： ＧＦＴＦＳＳＨＦＭＳ ＣＤＲ２： ＳＩＳＳＧＧＤＳＦＹＰＤＳＬＫＧ ＣＤＲ３： ＤＹＳＷＹＡＬＤＹ または： ＣＤＲ１： ＧＹＡＦＳＴＳＷＭＮ ＣＤＲ２： ＲＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ ＣＤＲ３： ＥＤＡＹＹＳＮＰＹＳＬＤＹ を示す、請求項１８ないし２４のいずれか１つに記載の方法。
  28. 【請求項２８】 重鎖をコードする抗体のＤＮＡ配列が、少なくとも１つ
    の以下のＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ３そしてより好ましくは以下のＣＤＲの３つ
    のすべて： ＣＤＲ１： ＧＧ ＣＴＡＣＧＣＡＴＴＣ ＡＧＴＡＣＣＴＣＣＴ ＧＧＡＴＧ
    ＡＡＣ ＣＤＲ２： ＣＧＧＡＴＴＴＡＴＣ ＣＴＧＧＡＧＡＴＧＧ ＡＧＡＴＡＣＴＡ
    ＡＣ ＴＡＣＡＡＴＧＧＧＡ ＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧ Ｃ ＣＤＲ３： ＧＡＧ ＧＡＴＧＣＣＴＡＴＴ ＡＴＡＧＴＡＡＣＣＣ ＣＴＡＴ
    ＡＧＴＴＴＧ ＧＡＣＴＡＣ または： ＣＤＲ１： ＧＧ ＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣ ＡＧＴＡＧＣＣＡＴＴ ＴＣＡＴＧ
    ＴＣＴ ＣＤＲ２： ＴＣＣＡＴＴＡＧＴＡ ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡ ＣＡＧＴＴＴＣＴ
    ＡＴ ＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣ ＴＧＡＡＧＧＧＣ ＣＤＲ３： ＧＡＣＴＡＣ ＴＣＴＴＧＧＴＡＴＧ ＣＴＴＴＧＧＡＣＴＡ Ｃ
    を示す、請求項２７記載の方法。
  29. 【請求項２９】 β−ウレアーゼのエピトープに結合する抗体の軽鎖が、
    少なくとも１つの以下のＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ３そしてより好ましくは以下
    のＣＤＲの３つのすべて： ＣＤＲ１： ＲＡＳＱＳＩＧＴＲＩＨ ＣＤＲ２： ＹＧＳＥＳＩＳ ＣＤＲ３： ＱＱＳＮＴＷＰＬＴ または： ＣＤＲ１： ＨＡＳＱＮＩＮＶＷＬＳ ＣＤＲ２： ＫＡＳＮＬＨＴ ＣＤＲ３： ＱＱＧＲＳＹＰＬＴ を示す、請求項１８ないし２４のいずれか１つに記載の方法。
  30. 【請求項３０】 軽鎖をコードする抗体のＤＮＡ配列が、少なくとも１つ
    の以下のＣＤＲ、好ましくはＣＤＲ３そしてより好ましくは以下のＣＤＲの３つ
    のすべて： ＣＤＲ１： Ａ ＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡ ＧＡＧＣＡＴＴＧＧＣ ＡＣＡＡＧＡ
    ＡＴＡＣ ＡＣ ＣＤＲ２： ＴＡＴ ＧＧＴＴＣＴＧＡＧＴ ＣＴＡＴＣＴＣＴ ＣＤＲ３： ＣＡＡＣＡＡ ＡＧＴＡＡＴＡＣＣＴ ＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣ Ｇ
    または： ＣＤＲ１： Ｃ ＡＴＧＣＣＡＧＴＣＡ ＧＡＡＣＡＴＴＡＡＴ ＧＴＴＴＧＧ
    ＴＴＡＡ ＧＣ ＣＤＲ２： ＡＡＧ ＧＣＴＴＣＣＡＡＣＴ ＴＧＣＡＣＡＣＡ ＣＤＲ３： ＣＡＡＣＡＧ ＧＧＴＣＧＡＡＧＴＴ ＡＴＣＣＴＣＴＣＡＣ Ｇ
    を示す、請求項２９記載の方法。
  31. 【請求項３１】 軽鎖および重鎖の可変領域の抗体が、図１および２また
    は３および４および／または５および６または７および８に例示されるアミノ酸
    配列を示す、請求項１８ないし３０のいずれか１つに記載の方法または試験。
  32. 【請求項３２】 軽鎖および重鎖の可変領域のコード領域が、図１および
    ２または３および４および／または５および６または７および８に例示されるＤ
    ＮＡ配列を示す、請求項１８ないし３１のいずれか１つに記載の方法または試験
    。
  33. 【請求項３３】 抗体とのインキュベーション前に、便試料を用いて、以
    下の工程：試料緩衝液中の、便試料の１：３ないし１：２５、好ましくは１：５
    、特に好ましくはおよそ１：１５の再懸濁が行われる、上述の請求項のいずれか
    １つに記載の方法または試験。
  34. 【請求項３４】 エピトープの検出に用いられるのと同一の受容体が、固
    相への結合に用いられる、上述の請求項のいずれか１つに記載の方法または試験
    。
  35. 【請求項３５】 受容体がモノクローナルマウス抗体である、上述の請求
    項のいずれか１つに記載の方法または試験。
  36. 【請求項３６】 哺乳動物がヒトである、上述の請求項のいずれか１つに
    記載の方法または試験。
  37. 【請求項３７】 便試料の代わりに、検出のために、呼気濃縮物、胃ガス
    、歯垢、唾液、粘膜スメア、生検、全血または血清を用いる、上述の請求項のい
    ずれか１つに記載の方法。
  38. 【請求項３８】 自動化法である、上述の請求項のいずれか１つに記載の
    方法。
  39. 【請求項３９】 請求項２５ないし３２に定義されるＣＤＲの少なくとも
    １つの適切な組み合わせを含む、Ｖ領域を示す、モノクローナル抗体、その断片
    または誘導体。
  40. 【請求項４０】 図１および２または３および４および／または５および
    ６または７および８に例示されるＶ領域の少なくとも１つを示す、請求項３９記
    載のモノクローナル抗体、その断片または誘導体。
  41. 【請求項４１】 マウス抗体またはその断片もしくは誘導体、あるいはキ
    メラ、好ましくはヒト化抗体またはその断片もしくは誘導体である、請求項３９
    または４０記載のモノクローナル抗体、その断片または誘導体。
  42. 【請求項４２】 請求項３９ないし４１のいずれか１つに記載のモノクロ
    ーナル抗体、その断片または誘導体と同一のエピトープに特異的に結合する、ア
    プタマー。
  43. 【請求項４３】 請求項３９ないし４１のいずれか１つに記載のモノクロ
    ーナル抗体、その断片または誘導体あるいは請求項４２記載のアプタマーに特異
    的に結合される、エピトープ。
  44. 【請求項４４】 請求項４３記載のエピトープに特異的に結合する、抗体
    、その断片または誘導体。
  45. 【請求項４５】 請求項２ないし４４のいずれか１つに記載の、少なくと
    も１つの試験を含む、キット。
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