WO2019187271A1 - 検査キットおよび検査方法 - Google Patents
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Definitions
- FIG. 1 is a diagram showing an embodiment of a test kit of the present invention
- FIG. 1 (a) is a plan view
- FIG. 1 (b) is a longitudinal sectional view
- FIG. 2 is an immunochromatographic test provided in the test kit of the present invention.
- FIG. 2A is a perspective view
- FIG. 2B is an exploded perspective view showing an embodiment of a piece.
- the upper side in FIG. 1A and FIG. 2 is referred to as “upper” and the lower side is referred to as “lower”.
- the immunochromatography method is generally a method for determining the presence or absence of a virus as an object to be measured in a test sample (specimen) through the following steps. That is, 1: First, a test sample (specimen) is brought into contact with a labeled antibody that specifically recognizes a virus as an object to be measured. 2: Then, this test sample is developed in the development layer by capillary action. At the time of development, a specific antibody that specifically recognizes the measurement object immobilized in the middle of the development layer captures the complex of the measurement object and the labeled antibody, and 3: this captured complex This is a method for discriminating the presence or absence of an object to be measured by observing a labeled antibody possessed by.
- the test piece 10 is configured to include the blood cell filtration unit 15, so that a test sample for confirming the presence or absence of dengue virus contains blood cell components such as red blood cells, white blood cells, and platelets, that is, whole blood. Etc. can be used. Therefore, it is possible to reduce labor and time when separating plasma components from whole blood or the like using centrifugation or the like.
- the first specific antibody one that recognizes a part of NS1 that is one kind of external antigen as an antigen determining site is selected, and further, the second specific antibody (second primary antibody) is selected.
- Primary antibody is selected from those that recognize part of the E protein, which is one of the internal antigens, as an antigen-determining site, and thus includes both the first specific antibody and the second specific antibody.
- a specific antibody recognizes an antigen derived from dengue virus by binding to an antigen determination site of an antigen contained in a test sample with a window size (optimum test possible period) of about 10 days from 0 days later. .
- the specific antibody immobilized by the recognition unit 17 preferably has a mixing ratio (molar ratio) between the first specific antibody and the second specific antibody of about 1: 0.1 to 1:20, More preferably, it is about 1: 0.5 to 1:10.
- the first specific antibody and the second specific antibody respectively recognize the first antigen determining site and the second antigen determining site of the dengue virus specifically, and in the recognition unit 17, A complex of the first specific antibody and dengue virus and a complex of the second specific antibody and dengue virus can be reliably formed.
- the specific antibody is immobilized in the recognition unit 17 when the development layer 12 is a porous carrier composed of a nitrocellulose film as described above, and the recognition unit 17 is formed with an aqueous solution containing the specific antibody. After dripping into the power region, it can be performed by drying and washing.
- the spreading layer 12 By constituting the spreading layer 12 with nitrocellulose in this way, a chemical bond is formed between the spreading layer 12 and the specific antibody without prior chemical treatment of the spreading layer 12 or the specific antibody. Is done. Therefore, the recognition part 17 can be formed by reliably immobilizing the specific antibody on the development layer 12 by a simple process of bringing the aqueous solution containing the specific antibody into contact with the development layer 12.
- the temperature at which the aqueous solution is dried is not particularly limited, but is preferably about 40 to 70 ° C., and more preferably about 50 to 65 ° C.
- the specific antibody can be reliably immobilized on the development layer 12 while suppressing or preventing the inactivation of the antigen recognition ability of the specific antibody.
- any antibody capable of recognizing the labeled antibody that is, one having a function capable of capturing the labeled antibody that has developed (permeated) the developing layer 12 upstream of the control unit 18 can be used.
- any of IgG, IgA, IgM, IgE, and IgD may be used, but IgG is preferably used in terms of ease of handling.
- a mouse antibody is generally added to the test sample (blood) in advance, A method for recognizing and adsorbing a mouse antibody to a mouse antibody is known.
- the antibody that recognizes the constant site of the antibody (mouse antibody) provided in the labeled antibody is used as the anti-antibody, the added anti-antibody immobilized on the control unit 18 is unintentionally used.
- the labeled antibody cannot be sufficiently recognized by the immobilized anti-antibody, and the control unit 18 confirms the reaction between the immobilized anti-antibody and the labeled antibody (visual recognition).
- the amount of mouse antibody added is limited.
- the labeled antibody is used as the labeled antibody immobilized on the control unit 18. Captured by the recognizing anti-antibody.
- (D) Second labeled antibody As the second labeled antibody derived from mouse, both the antigen site recognized by the human anti-mouse antibody and the sugar chain binding site of the antibody recognizing the sugar chain are deleted, and A specific antibody that specifically recognizes NS1 produced by Dengue virus outside the virus is labeled with colloidal gold.
- (D) Second labeled antibody As a second labeled antibody derived from a mouse, the antigen site recognized by the human anti-mouse antibody is deleted, and the dengue virus specifically recognizes NS1 produced outside the virus. A specific antibody labeled with colloidal gold was prepared.
- a sample supply unit composed of a support substrate composed of a glass plate, a 1.2 cm ⁇ 1.9 cm glass filter (Millipore) made of a strip, and a glass wool of 0.5 cm ⁇ 1.0 cm composed of a strip
- a blood cell filtration part comprising a porous carrier comprising a porous carrier comprising a filter carrier comprising a porous carrier comprising a strip-shaped glass wool of 0.5 cm ⁇ 3.0 cm; and
- the development layer formed with the recognition part and the control part prepared in the step 1-2-1 and the reagent part prepared in the step 1-2-2 are used respectively. It was.
- the sample supply unit, the reagent unit, the development layer, and the absorption unit are arranged in this order from the upstream side to the downstream side so that the edges of each other come into contact with each other. Then, an immunochromatographic test piece as shown in FIG. 2 was obtained by disposing a blood cell filtration unit on the sample supply unit.
- test kit of Comparative Example 1B has HAMA activity due to the use of a specific antibody and a labeled antibody that are normal without losing the antigen site recognized by the human anti-mouse antibody. As a result, all the subjects who were determined as false positives showed the results determined as false positives.
- (C) 1st labeled antibody As a 1st labeled antibody derived from a mouse
- control part instead of the first specific antibody and the second specific antibody, a phosphate buffer containing an anti-antibody recognizing a labeled antibody described later is prepared, The control part is formed at a position downstream of the recognition part in the middle of the development layer in the same manner as the recognition part except that it is dropped at a position 2.0 cm from the upstream end of the development layer. did.
- a sample supply unit composed of a support substrate composed of a glass plate, a 1.2 cm ⁇ 1.9 cm glass filter (Millipore) made of a strip, and a glass wool of 0.5 cm ⁇ 1.0 cm composed of a strip
- a blood cell filtration part comprising a porous carrier comprising a porous carrier comprising a filter carrier comprising a porous carrier comprising a strip-shaped glass wool of 0.5 cm ⁇ 3.0 cm; and
- the development layer formed with the recognition part and the control part prepared in the step 1-2-1 and the reagent part prepared in the step 1-2-2 are used respectively. It was.
- Comparative Example 1C A test kit for Comparative Example 1C was produced in the same manner as Example 1C except that the specific antibody and labeled antibody shown below were used instead of the specific antibody and labeled antibody prepared in 3-1 above. Then, using this test kit, a test (sugar chain binding sample) that was determined to be false positive by having an antibody having a sugar chain binding site that recognizes a sugar chain was performed.
- the inspection kit of the present invention is used for inspecting the presence or absence of infection by a virus, a development layer for developing a test sample containing the virus, a recognition unit provided in the middle of the development layer, And a reagent part arranged so as to contact an upstream edge of the development layer when the test sample is based on a development direction in which the development layer is developed.
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Abstract
Description
(1) ウイルスによる感染の有無を検査するのに用いられる検査キットであって、
前記ウイルスを含有する検査試料を展開する展開層と、該展開層の途中に設けられた認識部と、前記検査試料が前記展開層を展開する展開方向を基準としたとき、前記展開層の上流側の縁部に接触するように配置された試薬部とを有し、
前記認識部は、前記ウイルスが有する第1の抗原決定部位および第2の抗原決定部位を、それぞれ、特異的に認識する、マウス由来の第1の特異抗体および第2の特異抗体が固定化され、
前記試薬部は、前記ウイルスが有する前記第1の抗原決定部位および前記第2の抗原決定部位を、それぞれ、特異的に認識する機能を有し、かつ標識物質で標識化されている、マウス由来の第1の標識化抗体および第2の標識化抗体を含み、
前記第1の標識化抗体および前記第2の標識化抗体は、それぞれ、ヒト抗マウス抗体が認識する抗原部位と、糖鎖を認識する抗体の糖鎖結合部位との少なくとも一方を欠損または改変していることを特徴とする検査キット。
前記血球ろ過部を介して前記試薬供給部に前記検査試料を供給することにより、前記検査試料に含まれる血球成分が除去されるよう構成されている上記(1)ないし(7)のいずれかに記載の検査キット。
前記検査試料を前記展開層に供給する第1の工程と、
前記検査試料が前記展開層を展開する際に、前記展開層の途中に設けられた前記認識部に、前記ウイルスが捕捉されているか否かを確認する第2の工程とを有することを特徴とする検査方法。
本発明の検査キットは、免疫(イムノ)クロマト方式を用いて、ウイルスの感染の有無を検査するために用いられるものである。
また、本実施形態では、標識化抗体が備える抗体(2次抗体)の定常部位(より詳しくはCH2領域)において、ヒト抗マウス抗体が認識する抗原部位と、ヒト抗体が認識する糖鎖の結合部位とのうち少なくとも一方が、欠損または改変している。これらのうち、ヒト抗マウス抗体が認識する抗原部位が欠損または改変している領域は、標識化抗体が備える抗体(2次抗体)の定常部位(C領域)の他、標識化抗体が備える抗体(2次抗体)の可変部位(V領域)において存在していてもよいが、本実施形態のように、定常部位(C領域)に存在していることが好ましい。これにより、第1の抗体(第1の2次抗体)による、外部抗原の1種であるNS1の一部を抗原決定部位として認識する認識能、さらには、第2の抗体(第2の2次抗体)による、内部抗原の1種であるEタンパクの一部を抗原決定部位として認識する認識能が低下するのを的確に抑制または防止することができる。
さらに、標識化抗体が備える抗体(2次抗体)の定常部位において、ヒト抗マウス抗体が認識する抗原部位と、ヒト抗体が認識する糖鎖の結合部位との双方が、欠損または改変している場合、これらが欠損または改変している領域は、隣接もしくはそれらの一部が重なっていることが好ましい。これにより、第1の抗体(第1の2次抗体)および第2の抗体(第2の2次抗体)を、マウス由来の抗体(マウス抗体)として得る際の工程の簡略化を図ることができる。さらに、第1の抗体(第1の2次抗体)による、外部抗原の1種であるNS1の一部を抗原決定部位として認識する認識能、さらには、第2の抗体(第2の2次抗体)による、内部抗原の1種であるEタンパクの一部を抗原決定部位として認識する認識能が低下するのを的確に抑制または防止することができる。
以上のようにして、デングウイルスによる感染の有無を検査することができる。
また、本実施形態では、認識部17で固定化されている特異抗体(1次抗体)の定常部位(より詳しくはCH2領域)において、ヒト抗マウス抗体が認識する抗原部位と、ヒト抗体が認識する糖鎖の結合部位とのうち少なくとも一方が欠損または改変している。これらのうち、ヒト抗マウス抗体が認識する抗原部位が欠損または改変している領域は、認識部17で固定化されている特異抗体(1次抗体)の定常部位(C領域)の他、認識部17で固定化されている特異抗体(1次抗体)の可変部位(V領域)において存在していてもよいが、本実施形態のように、定常部位(C領域)に存在していることが好ましい。これにより、第1の特異抗体(第1の1次抗体)による、外部抗原の1種であるNS1の一部を抗原決定部位として認識する認識能、さらには、第2の特異抗体(第2の1次抗体)による、内部抗原の1種であるEタンパクの一部を抗原決定部位として認識する認識能が低下するのを的確に抑制または防止することができる。
さらに、認識部17で固定化されている特異抗体(1次抗体)の定常部位において、ヒト抗マウス抗体が認識する抗原部位と、ヒト抗体が認識する糖鎖の結合部位との双方が、欠損または改変している場合、これらが欠損または改変している領域は、隣接もしくはそれらの一部が重なっていることが好ましい。これにより、第1の特異抗体(第1の1次抗体)および第2の特異抗体(第2の1次抗体)を、マウス由来の抗体(マウス抗体)として得る際の工程の簡略化を図ることができる。さらに、第1の特異抗体(第1の1次抗体)による、外部抗原の1種であるNS1の一部を抗原決定部位として認識する認識能、さらには、第2の特異抗体(第2の1次抗体)による、内部抗原の1種であるEタンパクの一部を抗原決定部位として認識する認識能が低下するのを的確に抑制または防止することができる。
このとき、展開層12中を前記複合体も展開し、この複合体中にはデングウイルスが含まれるため、展開層12の途中に形成された、認識部17に固定化された、デングウイルスを特異的に認識する特異抗体により、デングウイルスを含む複合体が捕捉される。
さらに、検査方法では、任意の目的で、1以上の工程を追加することができる。
1.ウインドウサイズ(至適検査可能期間)の検討
1-1.特異抗体および標識化抗体の準備
(a)第1の特異抗体
マウス由来の第1の特異抗体として、ヒト抗マウス抗体が認識する抗原部位と、糖鎖を認識する抗体の糖鎖結合部位との双方を欠損し、かつ、デングウイルスが有するエンベロープが備えるEタンパクを特異的に認識するものを用意した。
マウス由来の第2の特異抗体として、ヒト抗マウス抗体が認識する抗原部位と、糖鎖を認識する抗体の糖鎖結合部位との双方を欠損し、かつ、デングウイルスがウイルスの外部に産出するNS1を特異的に認識するものを用意した。
マウス由来の第1の標識化抗体として、ヒト抗マウス抗体が認識する抗原部位と、糖鎖を認識する抗体の糖鎖結合部位との双方を欠損し、かつ、デングウイルスが有するエンベロープが備えるEタンパクを特異的に認識する特異抗体が、金コロイドで標識化されているものを用意した。
マウス由来の第2の標識化抗体として、ヒト抗マウス抗体が認識する抗原部位と、糖鎖を認識する抗体の糖鎖結合部位との双方を欠損し、かつ、デングウイルスがウイルスの外部に産出するNS1を特異的に認識する特異抗体が、金コロイドで標識化されているものを用意した。
1-2-1.展開層への認識部およびコントロール部の形成
短冊状をなす0.5cm×3.0cmのニトロセルロース(ミリポア社製)を展開層として用意し、この展開層の上流側の端部から1.5cmの位置に、第1の特異抗体および第2の特異抗体をそれぞれ5mg/mLを含有するリン酸緩衝液1.0μLを、展開層の長手方向対して直交する方向に幅約0.1cmのライン状に滴下した。その後、リン酸緩衝液を60℃×4時間の条件で乾燥させることにより、展開層の途中に、第1の特異抗体と第2の特異抗体とが固定化された認識部を形成した。
第1の特異抗体および第2の特異抗体に代えて、後述する標識化抗体を認識する抗抗体を含有するリン酸緩衝液を調製し、このリン酸緩衝液を、展開層の上流側の端部から2.0cmの位置に滴下したこと以外は前記認識部の形成と同様にして、コントロール部を、展開層の途中の前記認識部よりも下流側の位置に形成した。
短冊状をなす0.5cm×1.0cmのガラスウールで構成される多孔質担体を用意し、第1の標識化抗体および第2の標識化抗体を含有するリン酸緩衝液に、多孔質担体を含浸した後、かかる多孔質担体を凍結乾燥することにより、第1の標識化抗体と第2の標識化抗体とが多孔質担体に担持された試薬部を得た。
まず、中空部を備える2.7cm×8.5cmのポリカーボネートで構成されるハウジングケースと、短冊状をなす0.5cm×7.5cmの白色ポリスチレン、白色ビニール、白色ポリエステル、クリアポリエステルで構成される支持基板と、短冊状をなす1.2cm×1.9cmのガラスフィルター(ミリポア社製)で構成される試料供給部と、短冊状をなす0.5cm×1.0cmのガラスウールで構成される多孔質担体からなる血球ろ過部と、短冊状をなす0.5cm×3.0cmのガラスウールで構成される多孔質担体からなる濾紙で構成される多孔質担体からなる吸収部と、前記工程1-2-1で作製した認識部およびコントロール部が形成された展開層と、前記工程1-2-2で作製した試薬部とをそれぞれ用意した。
1-3-1. 対象症例
デングウイルスの感染が疑われた被検者を対象とした。
デングウイルスの感染が疑われた被検者について、検体として血液を採取し、この検体中からRT-PCR法を用いてデングウイルス遺伝子が検出された延べ170例をデングウイルス感染群(陽性群)とした。
デングウイルスの感染が疑われた被検者について、その当日(0日後)に、検体として血液(全血)を採取し、実施例1Aの検査キットのハウジングケースが備える検査試料供給窓から露出する血球ろ過部に検体を滴下した後、検査結果観察窓から露出する展開層に設けられた認識部およびコントロール部における、標識化抗体の捕捉の有無を観察した。
前記1-2-1.(a)における、認識部の形成の際に、リン酸緩衝液に対する第2の特異抗体の添加を省略して、展開層の途中に、第1の特異抗体が固定化された認識部を形成し、さらに、前記1-2-2における、試薬部の作製の際に、リン酸緩衝液に対する第2の標識化抗体の添加を省略して、第1の標識化抗体が多孔質担体に担持された試薬部を作製したこと以外は、前記実施例1Aと同様にして、比較例1Aの検査キットを製造し、その後、この検査キットを用いて、デングウイルスの感染の有無の検査を実施した。
前記1-2-1.(a)における、認識部の形成の際に、リン酸緩衝液に対する第1の特異抗体の添加を省略して、展開層の途中に、第2の特異抗体が固定化された認識部を形成し、さらに、前記1-2-2における、試薬部の作製の際に、リン酸緩衝液に対する第1の標識化抗体の添加を省略して、第2の標識化抗体が多孔質担体に担持された試薬部を作製したこと以外は、前記実施例1Aと同様にして、比較例2Aの検査キットを製造し、その後、この検査キットを用いて、デングウイルスの感染の有無の検査を実施した。
以上の結果を、表1に示す。
(実施例1B)
(a)第1の特異抗体
マウス由来の第1の特異抗体として、ヒト抗マウス抗体が認識する抗原部位を欠損し、かつ、デングウイルスが有するエンベロープが備えるEタンパクを特異的に認識するものを用意した。
マウス由来の第2の特異抗体として、ヒト抗マウス抗体が認識する抗原部位を欠損し、かつ、デングウイルスがウイルスの外部に産出するNS1を特異的に認識するものを用意した。
マウス由来の第1の標識化抗体として、ヒト抗マウス抗体が認識する抗原部位を欠損し、かつ、デングウイルスが有するエンベロープが備えるEタンパクを特異的に認識する特異抗体が、金コロイドで標識化されているものを用意した。
マウス由来の第2の標識化抗体として、ヒト抗マウス抗体が認識する抗原部位を欠損し、かつ、デングウイルスがウイルスの外部に産出するNS1を特異的に認識する特異抗体が、金コロイドで標識化されているものを用意した。
2-2-1.展開層への認識部およびコントロール部の形成
短冊状をなす0.5cm×3.0cmのニトロセルロース(ミリポア社製)を展開層として用意し、この展開層の上流側の端部から1.5cmの位置に、第1の特異抗体および第2の特異抗体をそれぞれ5mg/mLを含有するリン酸緩衝液1.0μLを、展開層の長手方向対して直交する方向に幅約0.1cmのライン状に滴下した。その後、リン酸緩衝液を60℃×4時間の条件で乾燥させることにより、展開層の途中に、第1の特異抗体と第2の特異抗体とが固定化された認識部を形成した。
第1の特異抗体および第2の特異抗体に代えて、後述する標識化抗体を認識する抗抗体を含有するリン酸緩衝液を調製し、このリン酸緩衝液を、展開層の上流側の端部から2.0cmの位置に滴下したこと以外は前記認識部の形成と同様にして、コントロール部を、展開層の途中の前記認識部よりも下流側の位置に形成した。
短冊状をなす0.5cm×1.0cmのガラスウールで構成される多孔質担体を用意し、第1の標識化抗体および第2の標識化抗体を含有するリン酸緩衝液に、多孔質担体を含浸した後、かかる多孔質担体を凍結乾燥することにより、第1の標識化抗体と第2の標識化抗体とが多孔質担体に担持された試薬部を得た。
まず、中空部を備える2.7cm×8.5cmのポリカーボネートで構成されるハウジングケースと、短冊状をなす0.5cm×7.5cmの白色ポリスチレン、白色ビニール、白色ポリエステル、クリアポリエステルで構成される支持基板と、短冊状をなす1.2cm×1.9cmのガラスフィルター(ミリポア社製)で構成される試料供給部と、短冊状をなす0.5cm×1.0cmのガラスウールで構成される多孔質担体からなる血球ろ過部と、短冊状をなす0.5cm×3.0cmのガラスウールで構成される多孔質担体からなる濾紙で構成される多孔質担体からなる吸収部と、前記工程1-2-1で作製した認識部およびコントロール部が形成された展開層と、前記工程1-2-2で作製した試薬部とをそれぞれ用意した。
2-3-1. RT-PCR法
デングウイルスの感染が疑われた被検者について、検体として血液を採取し、この検体中からRT-PCR法を用いてデングウイルス遺伝子が検出されず、野生型のマウスIgGを用いた免疫クロマト法で偽陽性を示した検体から30例から、更にマウスIgG ELISAにて高い陽性を示した20例をHAMA陽性群とした。
HAMA活性を有していることで偽陽性と判定された検体(HAMA陽性群)について、実施例1Bの検査キットのハウジングケースが備える検査試料供給窓から露出する血球ろ過部に検体を滴下した後、検査結果観察窓から露出する展開層に設けられた認識部およびコントロール部における、標識化抗体の捕捉の有無を観察した。
前記2-1において準備した特異抗体および標識化抗体に代えて、以下に示す特異抗体および標識化抗体を用いたこと以外は、前記実施例1Bと同様にして、比較例1Bの検査キットを製造し、その後、この検査キットを用いて、HAMA活性を有していることで偽陽性と判定された検体(HAMA陽性群)について検査を実施した。
マウス由来の第1の特異抗体として、ヒト抗マウス抗体が認識する抗原部位が欠損することなく正常であり、かつ、デングウイルスが有するエンベロープが備えるEタンパクを特異的に認識するものを用意した。
マウス由来の第2の特異抗体として、ヒト抗マウス抗体が認識する抗原部位が欠損することなく正常であり、かつ、デングウイルスがウイルスの外部に産出するNS1を特異的に認識するものを用意した。
マウス由来の第1の標識化抗体として、ヒト抗マウス抗体が認識する抗原部位が欠損することなく正常であり、かつ、デングウイルスが有するエンベロープが備えるEタンパクを特異的に認識する特異抗体が、金コロイドで標識化されているものを用意した。
マウス由来の第2の標識化抗体として、ヒト抗マウス抗体が認識する抗原部位が欠損することなく正常であり、かつ、デングウイルスがウイルスの外部に産出するNS1を特異的に認識する特異抗体が、金コロイドで標識化されているものを用意した。
以上の結果を、表2に示す。
(実施例1C)
(a)第1の特異抗体
マウス由来の第1の特異抗体として、糖鎖を認識する抗体の糖鎖結合部位を欠損し、かつ、デングウイルスが有するエンベロープが備えるEタンパクを特異的に認識するものを用意した。
マウス由来の第2の特異抗体として、糖鎖を認識する抗体の糖鎖結合部位を欠損し、かつ、デングウイルスがウイルスの外部に産出するNS1を特異的に認識するものを用意した。
マウス由来の第1の標識化抗体として、糖鎖を認識する抗体の糖鎖結合部位を欠損し、かつ、デングウイルスが有するエンベロープが備えるEタンパクを特異的に認識する特異抗体が、金コロイドで標識化されているものを用意した。
マウス由来の第2の標識化抗体として、糖鎖を認識する抗体の糖鎖結合部位を欠損し、かつ、デングウイルスがウイルスの外部に産出するNS1を特異的に認識する特異抗体が、金コロイドで標識化されているものを用意した。
3-2-1.展開層への認識部およびコントロール部の形成
短冊状をなす0.5cm×3.0cmのニトロセルロース(ミリポア社製)を展開層として用意し、この展開層の上流側の端部から1.5cmの位置に、第1の特異抗体および第2の特異抗体をそれぞれ5mg/mLを含有するリン酸緩衝液1.0μLを、展開層の長手方向対して直交する方向に幅約0.1cmのライン状に滴下した。その後、リン酸緩衝液を60℃×4時間の条件で乾燥させることにより、展開層の途中に、第1の特異抗体と第2の特異抗体とが固定化された認識部を形成した。
第1の特異抗体および第2の特異抗体に代えて、後述する標識化抗体を認識する抗抗体を含有するリン酸緩衝液を調製し、このリン酸緩衝液を、展開層の上流側の端部から2.0cmの位置に滴下したこと以外は前記認識部の形成と同様にして、コントロール部を、展開層の途中の前記認識部よりも下流側の位置に形成した。
短冊状をなす0.5cm×1.0cmのガラスウールで構成される多孔質担体を用意し、第1の標識化抗体および第2の標識化抗体を含有するリン酸緩衝液に、多孔質担体を含浸した後、かかる多孔質担体を凍結乾燥することにより、第1の標識化抗体と第2の標識化抗体とが多孔質担体に担持された試薬部を得た。
まず、中空部を備える2.7cm×8.5cmのポリカーボネートで構成されるハウジングケースと、短冊状をなす0.5cm×7.5cmの白色ポリスチレン、白色ビニール、白色ポリエステル、クリアポリエステルで構成される支持基板と、短冊状をなす1.2cm×1.9cmのガラスフィルター(ミリポア社製)で構成される試料供給部と、短冊状をなす0.5cm×1.0cmのガラスウールで構成される多孔質担体からなる血球ろ過部と、短冊状をなす0.5cm×3.0cmのガラスウールで構成される多孔質担体からなる濾紙で構成される多孔質担体からなる吸収部と、前記工程1-2-1で作製した認識部およびコントロール部が形成された展開層と、前記工程1-2-2で作製した試薬部とをそれぞれ用意した。
3-3-1. RT-PCR法
デングウイルスの感染が疑われた被検者について、検体として血液を採取し、この検体中からRT-PCR法を用いてデングウイルス遺伝子が検出されなかった30例をデングウイルス陰性群とした。さらに大腸菌により産生された組換えEタンパクに対しELISA陰性を示した20例を糖鎖結合検体とした。
糖鎖を認識する糖鎖結合部位を備える抗体を有していることで偽陽性と判定された検体(糖鎖結合検体)を用いて、実施例1Cの検査キットのハウジングケースが備える検査試料供給窓から露出する血球ろ過部に検体を滴下した後、検査結果観察窓から露出する展開層に設けられた認識部およびコントロール部における、標識化抗体の捕捉の有無を観察した。
前記3-1において準備した特異抗体および標識化抗体に代えて、以下に示す特異抗体および標識化抗体を用いたこと以外は、前記実施例1Cと同様にして、比較例1Cの検査キットを製造し、その後、この検査キットを用いて、糖鎖を認識する糖鎖結合部位を備える抗体を有していることで偽陽性と判定された検体(糖鎖結合検体)について検査を実施した。
マウス由来の第1の特異抗体として、糖鎖を認識する抗体の糖鎖結合部位が欠損することなく正常であり、かつ、デングウイルスが有するエンベロープが備えるEタンパクを特異的に認識するものを用意した。
マウス由来の第2の特異抗体として、糖鎖を認識する抗体の糖鎖結合部位が欠損することなく正常であり、かつ、デングウイルスがウイルスの外部に産出するNS1を特異的に認識するものを用意した。
マウス由来の第1の標識化抗体として、糖鎖を認識する抗体の糖鎖結合部位が欠損することなく正常であり、かつ、デングウイルスが有するエンベロープが備えるEタンパクを特異的に認識する特異抗体が、金コロイドで標識化されているものを用意した。
マウス由来の第2の標識化抗体として、糖鎖を認識する抗体の糖鎖結合部位が欠損することなく正常であり、かつ、デングウイルスがウイルスの外部に産出するNS1を特異的に認識する特異抗体が、金コロイドで標識化されているものを用意した。
以上の結果を、表3に示す。
10 免疫クロマト試験片(試験片)
11 支持基板
12 展開層
13 試薬部
14 試料供給部
15 血球ろ過部
16 吸収部
17 認識部
18 コントロール部
20 ハウジングケース
21 中空部
22 検査試料供給窓
23 検査結果観察窓
Claims (9)
- ウイルスによる感染の有無を検査するのに用いられる検査キットであって、
前記ウイルスを含有する検査試料を展開する展開層と、該展開層の途中に設けられた認識部と、前記検査試料が前記展開層を展開する展開方向を基準としたとき、前記展開層の上流側の縁部に接触するように配置された試薬部とを有し、
前記認識部は、前記ウイルスが有する第1の抗原決定部位および第2の抗原決定部位を、それぞれ、特異的に認識する、マウス由来の第1の特異抗体および第2の特異抗体が固定化され、
前記試薬部は、前記ウイルスが有する前記第1の抗原決定部位および前記第2の抗原決定部位を、それぞれ、特異的に認識する機能を有し、かつ標識物質で標識化されている、マウス由来の第1の標識化抗体および第2の標識化抗体を含み、
前記第1の標識化抗体および前記第2の標識化抗体は、それぞれ、ヒト抗マウス抗体が認識する抗原部位と、糖鎖を認識する抗体の糖鎖結合部位との少なくとも一方を欠損または改変していることを特徴とする検査キット。 - さらに、前記第1の特異抗体および前記第2の特異抗体は、それぞれ、前記ヒト抗マウス抗体が認識する抗原部位と、前記糖鎖を認識する抗体の糖鎖結合部位との少なくとも一方を欠損または改変している請求項1に記載の検査キット。
- 前記ウイルスは、デングウイルスである請求項1または2に記載の検査キット。
- 前記第1の特異抗体および前記第1の標識化抗体は、それぞれ、前記デングウイルスが有する内部抗原の一部を特異的に認識するものである請求項3に記載の検査キット。
- 前記内部抗原は、エンベロープが備えるEタンパクである請求項4に記載の検査キット。
- 前記第2の特異抗体および前記第2の標識化抗体は、それぞれ、前記デングウイルスが有する外部抗原の一部を特異的に認識するものである請求項3ないし5のいずれか1項に記載の検査キット。
- 前記外部抗原は、前記デングウイルスがウイルスの外部に産出するNS1である請求項6に記載の検査キット。
- 前記試薬部の上流側の縁部に接触するように配置された試薬供給部と、該試薬供給部上に積層するように配置された血球ろ過部とを有し、前記検査試料が全血であり、
前記血球ろ過部を介して前記試薬供給部に前記検査試料を供給することにより、前記検査試料に含まれる血球成分が除去されるよう構成されている請求項1ないし7のいずれか1項に記載の検査キット。 - 請求項1ないし8のいずれか1項に記載の検査キットを用いて、ウイルスによる感染の有無を検査する検査方法であって、
前記検査試料を前記展開層に供給する第1の工程と、
前記検査試料が前記展開層を展開する際に、前記展開層の途中に設けられた前記認識部に、前記ウイルスが捕捉されているか否かを確認する第2の工程とを有することを特徴とする検査方法。
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