RU2808765C2 - Набор для выявления антител классов M и G к нуклеокапсиду (Nc) и рецепторсвязывающему домену спайк белка коронавируса SARS-CoV-2 - Google Patents
Набор для выявления антител классов M и G к нуклеокапсиду (Nc) и рецепторсвязывающему домену спайк белка коронавируса SARS-CoV-2 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2808765C2 RU2808765C2 RU2023101039A RU2023101039A RU2808765C2 RU 2808765 C2 RU2808765 C2 RU 2808765C2 RU 2023101039 A RU2023101039 A RU 2023101039A RU 2023101039 A RU2023101039 A RU 2023101039A RU 2808765 C2 RU2808765 C2 RU 2808765C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- membrane
- sample
- conjugate
- antibodies
- cov
- Prior art date
Links
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 title claims abstract description 30
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 title claims abstract description 5
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 title claims abstract description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 86
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 24
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 18
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims abstract description 11
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 4
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims abstract description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims abstract description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- DEQXHPXOGUSHDX-UHFFFAOYSA-N methylaminomethanetriol;hydrochloride Chemical compound Cl.CNC(O)(O)O DEQXHPXOGUSHDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims abstract description 3
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims abstract description 3
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 58
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 13
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 5
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 5
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 claims description 5
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 claims description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 5
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 2
- 229940071162 caseinate Drugs 0.000 claims description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 abstract 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 abstract 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 abstract 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 abstract 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 abstract 1
- 229940080237 sodium caseinate Drugs 0.000 abstract 1
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 54
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 37
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 22
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 13
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 13
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 11
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 9
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 7
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 6
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 6
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 6
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 6
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 5
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000011241 protective layer Substances 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 3
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 3
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910003803 Gold(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000309467 Human Coronavirus Species 0.000 description 2
- 241000342334 Human metapneumovirus Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 2
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- RJHLTVSLYWWTEF-UHFFFAOYSA-K gold trichloride Chemical compound Cl[Au](Cl)Cl RJHLTVSLYWWTEF-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 description 1
- 241001647372 Chlamydia pneumoniae Species 0.000 description 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 241001529459 Enterovirus A71 Species 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000711467 Human coronavirus 229E Species 0.000 description 1
- 241000482741 Human coronavirus NL63 Species 0.000 description 1
- 241001428935 Human coronavirus OC43 Species 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101001024637 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 201000005010 Streptococcus pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 239000001988 antibody-antigen conjugate Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 108700010904 coronavirus proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- FDWREHZXQUYJFJ-UHFFFAOYSA-M gold monochloride Chemical compound [Cl-].[Au+] FDWREHZXQUYJFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229940127554 medical product Drugs 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 230000009800 post vaccination immunity Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 230000007485 viral shedding Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Описан набор для выявления антител классов М и G к нуклеокапсиду (Nc) и рецепторсвязывающему домену спайк белка коронавируса SARS-CoV-2, в образце биологической жидкости человека. Набор содержит впитывающую мембрану для нанесения образца и мембрану для нанесения конъюгата с нанесенными и высушенными конъюгатами рекомбинантного антигена коронавируса SARS-CoV-2, где мембрану для образца пропитывают буферным раствором, представляющим собой водный раствор, приготовленный из компонентов в следующем их соотношении, мас. %: трис-оксиметил аминометана 1%, трис-оксиметил аминометан гидрохлорида 0,1%, казеинат натриевая соль 1%, поливинилпирролидон 0,1%, азид натрия 2%, твин-20 1%, мышиные антитела к эритроцитам человека 0,02%, мембрану для конъюгата пропитывают водным раствором, приготовленным из компонентов в следующем их соотношении, мас. %: натрий гидрофосфат безводный 1,5%, поливиниловый спирт 0,5%, альбумин бычий сывороточный 1%, тритон-Х-100 0,1%, азид натрия 2%. Техническим результатом изобретения является получение точного диагностического результата в процессе использования изобретения. 3 ил., 11 табл., 3 пр.
Description
Область техники.
Изобретение относится к иммунологии и медицинской диагностике и может быть использовано для одновременного дифференцированного определения специфических антител классов М и G к вирусу SARS-CoV-2 методом иммунохроматографии с использованием конъюгатов наиболее иммунодоминантных белков SARS-CoV-2 нуклеопротеина и spike-белка с наночастицами коллоидного золота для массового скрининга с целью выявления лиц, зараженных SARS-CoV-2 и реконвалесцентов.
Уровень техники
Для борьбы с любой эпидемией колоссальное значение имеет своевременная диагностика, и пандемия COVID-19 не является исключением. Поскольку ранние клинические проявления у инфицированных неспецифичны, необходимо в короткие сроки подтвердить диагноз и принять все необходимые меры для обеспечения безопасности больных и их окружения [1, 2, 3]. В то же время некоторые исследования показали, что у значительного числа инфицированных людей (около 44%) симптомы болезни могут отсутствовать, это создает дополнительные трудности в контроле за распространением COVID-19 в мире [2, 3, 4, 5, 6, 7].
Несмотря на то, что этот молекулярный метод широко применяется во всем мире, ограничения этой технологии очевидны. Ложноотрицательные результаты ОТ-ПЦР в диагностике подозрительных случаев COVID-19 представляют большую угрозу для общества и усложняет эпидемиологическую обстановку в целом. При развивающейся клинической симптоматики пациента и отрицательном результате ОТ-ПЦР незаменимым инструментом диагностики становятся серологические методы исследования, направленные на обнаружение специфических антител в плазме, сыворотке или цельной крови человека.
Серологические тесты обычно выявляют антитела к белку спайк (S) и/или нуклеопротеину (N), поскольку они являются наиболее иммуногенными белками SARS-CoV-2. Белок S, состоящий из субъединицы S2 и S1 с рецептор-связывающим доменом (RBD), образует шип оболочки и используется вирусом для соединения с рецептором клетки человека АСЕ-2. Поскольку антитела против S белка обладают нейтрализующим действием in vitro, было высказано предположение они могут быть маркером эффективного иммунного ответа [8, 9].
С другой стороны, использование нуклеопротеина в диагностике коронавирусов человека, включая SARS-CoV-1, ранее было рекомендовано для уменьшения периода «серологического окна» [10]. Кроме этого предполагается, что анализы с использованием полноразмерного белка N могут выявлять больше ложноположительных результатов, поскольку нуклеокапсидный белок имеет несколько консервативных областей с высокой (90,5%) гомологией последовательностей с другими коронавирусами человека: HCoV-229E, -NL63, -ОС43 и -HKU1 24 [10]. Несмотря на это высокая иммуногенность и стабильность нуклеопротеина позволяет использовать его при разработке вакцин в качестве мишени для нейтрализующих антител и дает основание применять его при разработке серологических тестов [11].
Известен патент CN 111398603 В (Китай) Тест-полоска для обнаружения нового антитела к коронавирусу, способ ее приготовления и применения, где в качестве антитела захвата выступают антитела мышиные моноклональные к IgG человека. Недостатком этой методики является отсутствие тестирования для выявления специфических IgM, которые начинают вырабатываться у некоторых лиц с первых дней болезни и может служить для скрининга остро заболевших лиц в дебюте заболевания, когда наиболее важна терапия и мониторинг состояния. Кроме того, использование антигена SARS-CoV-2 в конъюгате и на тестовой линии ведет к перерасходу сырья и удорожанию набора реагента.
Известен патент CN 111024954A (Китай) на устройство для иммунохроматографии с коллоидным золотом для комбинированного обнаружения антигена и антитела к COVID-19 и способ их использования, который представляет собой двойную тест-кассету с двумя тест-полосками, где одна тест-полоска предназначена для выявления нуклеопротеина коронавируса, а другая - для выявления IgM и IgG к нему. Недостатком данного метода является неоправданный перерасход сырья, т.к. хорошо известна динамика антителообразования при COVID-19, таким образом, целесообразно разделить аналиты (антиген и антитела) и использовать тесты на разных стадиях заболевания, когда обнаружение антител или антигена наиболее вероятна. Для конъюгирования используются частицы НКЗ с размером 55-65. Использование больших частиц может приводить к быстрой потере стабильности конъюгата. Апробация на клиническом материале представляла собой тестирование 10 образцов от лиц с подтвержденным диагнозом, что является недостаточным для полноценной апробации теста.
Известен патент WO 2022041055 A1 (Китай) на набор для выявления антител SARS-CoV-2 и метод обнаружения. В качестве конъюгата используется конъюгат S белка, что может привести к ложноположительным результатам, поскольку не будут выявляться антитела к нуклеопротеину, которые вырабатываются в большом количестве в результате инфекции и длительно сохраняются в кровяном русле после выздоровления в то время как к S-белку антитела вырабатываются в меньшей степени. Такой набор реагентов можно использовать для оценки поствакцинального иммунитета при использовании вакцин, индуцирующих именно S-специфичный иммунный ответ. Однако в качестве метки используются квантовые точки, что лишает набор главного преимущества ИХА - бесприборности и невозможности использования для самотестирования в домашних условиях.
Значительная часть подобных тестов, зарегистрированных в РФ, имеют зарубежное место производства:
- Экспресс-тест COVID-19 IgG/IgM., номера партий: BNCP40200088, BNCP40200089, BNCP40200090, BNCP40200093 ООО «Биотек» производитель "Инзек Интернешнел Трейдинг Б.В.", Нидерланды;
- Экспресс-тест иммунохроматографический для обнаружения антител IgG и IgM к коронавирусу 2019-nCoV (STANDARD Q COVID-19 IgM/IgG Duo), серия KS2002. OOO «Уайт Продакт» производитель "СД Биосенсор Инк.", Республика Корея;
- Набор для обнаружения антител иммуноглобулинов класса IgG/IgM к SARS-CoV-2 (на основе коллоидного золота), партия 6603000 «ОМК»,производитель "Нанкин Вазим Медикал Текнолоджи Ко., Лтд", Китай;
- Набор реагентов "Экспресс тест Sinocare SARS-CoV-2 Antibody Test Strip" для качественного обнаружения общих антител IgG и IgM к коронавирусу методом иммунохроматографического анализа, с коллоидным золотом, серии 02G0513 01, 02G0513 02 ООО "Хирургические Инновации и Ко",производитель "Чанша Синокер Инк.", Китай;
- Кассетная тест-система "Covid-19 IgG/IgM", номер партии 20200328 варианты исполнения: I. №1, И. №2, ООО "Медтехника МОСКВА", производитель Hangzhou Testsea Biotechnology Co. Ltd., Китай;
- Экспресс-тест для определения антител IgG/IgM к коронавирусу (SARS-CoV-2) вызывающему тяжелый острый респираторный синдром с использованием метода коллоидного золота, лот 0320081 ООО "РУССКАЯ КОММЕРЧЕСКАЯ ГРУППА", производитель "Маккура Биотекнолоджи Ко. Лтд.", Китай;
- Тест-кассеты для быстрого определения COVID-19 IgG/IgM, номер модели ERCSS05310, партия №501 Общество с ограниченной ответственностью "Женел Трейд", производитель "Спринг Хелскеа Сервисез АГ", Швейцария и проч., что так же ведет к затратам на их перевозку, рискам, касающимся условий транспортировки, что может непосредственно влиять на качество медизделий.
Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является изобретение «Набор для обнаружения антител IgM/IgG к новому коронавирусу (SARS-CoV-2)» (Патент CN 111187354 B).
Предлагается набор для обнаружения антител к SARS-CoV-2 (IgM/IgG) с применением метода захвата коллоидным золотом, непрямого метода коллоидного золота и сэндвич-метода с двойным антигеном коллоидного золота. Антиген представляет собой высокоактивный рекомбинантный антиген, экспрессируемый путем слияния фрагментов N-белка и доминирующих эпитопов S-белка, и используется непрямая маркировка коллоидным золотом. Подушка для образца предварительно обработана. Набор позволяет напрямую и вручную интерпретировать результат с высокой точностью.
Технической задачей разработки заявляемого изобретения является создание тест-системы иммунохроматографической для быстрого, бесприборного, дифференцированного выявления антител классов М и G к SARS-CoV-2 с использованием наиболее иммунодоминантных белков коронавируса с целью высокоэффективной скрининговой диагностики новой коронавирусной инфекции.
Для решения этой задачи мы предлагаем набор для выявления антител классов М и G к нуклеокапсиду (Nc) и рецептор-связывающему домену спайк белка коронавируса SARS - CoV -2, в образце биологической жидкости человека, характеризующийся тем, что он содержит картридж с отверстием для внесения буферного раствора, отверстием для внесения образца, аналитическим окном для детекции результата, внутри которого размещена тест-полоска, состоящая из подложки, на поверхности которой последовательно расположены мембраны в следующем порядке: впитывающая мембрана для нанесения образца, мембрана для нанесения конъюгата с нанесенными и высушенными конъюгатами рекомбинантного антигена коронавируса SARS-CoV-2, нитроцеллюлозная мембрана-иммуносорбент с нанесенными тестовыми линиями мышиных моноклональных антител к IgM и IgG человека и контрольной линией с нанесенными козьими антителами к IgG мыши, адсорбирующая мембрана, причем мембрану для образца пропитывают буферным раствором, представляющим собой водный раствор, приготовленный из компонентов в следующем их соотношении, мас %:
трис-оксиметил аминометана 1%,
трис оксиметил аминометан гидрохлорида 0,1%,
казеинат натриевая соль 1%,
поливинилпирролидон 0,1%,
азид натрия 2%,
твин-20 1%,
мышиные антитела к эритроцитам человека 0,02%,
мембрану для конъюгата пропитывают водным раствором приготовленный из компонентов в следующем их соотношении, мас %:
натрий гидрофосфат безводный 1,5%,
поливиниловый спирт 0,5%,
альбумин бычий сывороточный 1%,
тритон-Х-100 0,1%,
азид натрия 2%.
Техническим результатом изобретения является получение точного диагностического результата в процессе использования изобретения, что достигается за счет:
- Выбора наиболее иммунодоминантных белков SARS-CoV-2 и отработки технологии их конъюгирования с наночастицами коллоидного золота.
- Подбора состава буферных растворов для обработки мембран, разведения конъюгатов, образца.
- Подбора условий сорбции козьих антител к IgM и IgG человека и конъюгатов.
Набор применяет метод захвата коллоидного золота, непрямой метод коллоидного золота и метод сэндвича с двойным антигеном коллоидного золота.
Для набора не требуется прибор для обнаружения, результат интерпретируется напрямую, набор прост и удобен в эксплуатации, имеет короткое время обнаружения, около 10 минут. Заявленный набор не уступает в точности известным наборам того же назначения и способствует расширению арсенала диагностических средств, предназначенных выявления антител классов М и G к SARS-CoV-2 (Фиг. 1).
Краткое описание поясняющих материалов
Фиг. 1 - внешний вид заявляемого набора.
Фиг. 2 - внешний вид тест-полоски и схема нанесения образца и буфера.
Фиг. 3 - интерпретация результатов, полученных с помощью заявляемого набора.
Осуществление изобретения. Тест-полоска состоит из:
I. подложки из поливинилхлорида, размером 60×4 мм, толщиной 0,2-0,6 мм (фирма Современные технологии, Россия);
II. иммуносорбента, представляющего собой полоску нитроцеллюлозной мембраны с большой пропускной способностью, размером 30x4 мм, толщиной 185 мкм ± 20%, (фирма «Millipore», США, кат. № SHF1800425), с нанесенными на тестовые линии мышиными моноклональным антителами к IgM (III) (фирма «Имтек», Россия, кат № MGHIgm) и мышиными моноклональным антителами к IgG человека (IV) (фирма «Имтек», Россия, кат № MGHIgg) в концентрации ≥0,5 мг/мл в фосфатном буфере (рН 7,4) (ЗАО «ЭКОлаб», Россия) и козьими антителами к IgG мыши (контрольная линия) в концентрации ≥1 мг/мл в трисовом буфере (V) (рН 7,4) (ООО Биосан», Новосибирск, кат №1-2012);
VI. мембраны для нанесения конъюгата (фирма «Millipore», США, кат № GFDX 203000), размером 6×4 мм, с нанесенными и высушенными конъюгатами рекомбинантного антигена коронавируса SARS-CoV-2 в концентрации ≥1 мг/мл, в фосфатном буфере (рН 7,4) (ЗАО «ЭКОлаб», Россия) и мышиных иммуноглобулинов класса G в концентрации ≥0,5 мг/мл в фосфатном буфере (рН 7,4) (ООО Биосан», Новосибирск, кат №1-2037) с коллоидными частицами золота (размер частиц 30 - 40 нм);
VII. впитывающей мембраны для нанесения образца (VIII) и буферного раствора (IX) размером 20×4 мм, толщиной 0,6-0,8 мм, плотностью 270±20 г/м2 (фирма LF1, Whatman, Великобритания, кат №8121-1750);
X. мембраны для адсорбции, размером 16x4 мм, толщиной 0,3-0,5 мм, плотностью 179±5 г/м2 («Millipore», США, кат № CFSP2 230 00).
Тест-полоска помещается в пластиковый картридж с тремя отверстиями: круглым отверстием с маркировкой «В» для внесения буферного раствора, расположенным в области впитывающей мембраны для нанесения образца, квадратным отверстием с маркировкой «S» для внесения образца крови, сыворотки или плазмы крови, расположенным в области впитывающей мембраны для нанесения образца, аналитического окна с маркировкой «С», «IgG», «IgM» расположенным в области нитроцеллюлозной мембраны (Фиг. 2)
Для одновременного дифференцированного определения специфических антител классов М и G к вирусу SARS-CoV-2 методом иммунохроматографии используется антиген Спайк RBD (рецептор-связывающий домен), который представляет собой фрагмент Arg319-Phe541 SARS-CoV-2 Спайк поверхностного гликопротеина [Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, тяжелый острый респираторный синдром коронавируса 2] GenBank: QHD43416.1. Содержит на С-терминальном конце His6-MeTKy. Теоретическая молекулярная масса 25921 Da, включая His6-tag. Теоретическая pi: 8,91. Также используемый нуклеопротеин представляет собой полноразмерный нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2 [коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома] GenBank: QHD43423.2. Содержит С-концевой линкер GS и His10-тег. Теоретический MW 47141 Da, включая линкер GS и His10-тег. Теоретическая pI: 10.07/. В основе работы теста лежит метод качественного иммунохроматографического анализа. При наличии в исследуемом образце антител к коронавирусу они связываются в области внесения пробы со специфичным конъюгатом, представляющим собой рекомбинантный антиген SARS-CoV-2, конъюгированный с коллоидным золотом. При этом формируется комплекс «антитело-антиген конъюгата», который мигрирует с током жидкости. В тестовых зонах происходит его взаимодействие с антителами против IgM и IgG человека с образованием окрашенных комплексов. Наличие цветной линии указывает на положительный результат, а ее отсутствие - на отрицательный. Непрореагировавший конъюгат взаимодействует с антивидовыми антителами в области контрольной зоны (зона С) с образованием окрашенного иммунного комплекса. Цветная контрольная линия формируется всегда, независимо от наличия антител к коронавирусу в образце.
Приготовление иммунохроматографического набора реагентов обнаружения антител к COVID-19 включает следующие этапы:
1.1. Приготовление наночастиц коллоидного золота (НКЗ).
1.2. Приготовление конъюгата антигенов с НКЗ.
2. Подготовка мембраны для образца.
2.1. Приготовление раствора для обработки мембраны для образца
2.2. Обработка мембраны для образца
2.3. Сушка мембраны для образца
2.4. Нарезка мембраны для образца
3. Подготовка мембраны для конъюгата.
3.1. Обработка мембраны для конъюгата
3.2. Сушка мембраны для конъюгата
3.3. Нарезка мембраны для конъюгата
4. Подготовка мембраны для адсорбции
5. Приготовления рабочих разведений антител
5.1. Приготовление буферного раствора для нанесения тестовой и контрольной линий
5.2. Приготовление рабочего раствора антител для сорбции тестовой линии
5.3. Приготовление рабочего раствора антител для сорбции контрольной линии
6. Сорбция антител
6.1. Сушка подложек с нанесенными антителами.
7. Приготовление рабочего разведения конъюгата
7.1. Приготовление рабочего раствора конъюгата
7.2. Сорбция конъюгата
7.3. Сушка и нарезка нанесенного конъюгата
8. Сборка и нарезка иммуносорбента (мастершита)
1.1. Приготовление наночастиц коллоидного золота (НКЗ).
Проводят по следующей методике:
Приготовление раствора цитрата натрия: 0,2300 г цитрата натрия развести в 10 мл деионизованной воды.
Приготовление раствора хлорида золота: 0,1 г хлорида золота (III) развести в 10 мл деионизованной воды.
Приготовление наночастиц коллоидного золота: 500 мл деионизованной воды поместить в круглодонную колбу вместимостью 1000 мл, поставить на магнитную мешалку со скоростью 700 об/мин и нагреть до температуры 96-98°С. Контроль температуры вести по ртутному термометру. Внести 10 мл раствора хлорида золота (III). Довести температуру до 96-98°С. Контроль температуры вести по ртутному термометру. Внести 10 мл раствора цитрата натрия (одной порцией), перемешивать 8 минут. Снять колбу с коллоидным золотом с мешалки, дать остыть до комнатной температуры. На спектрофотометре снять спектр поглощения в диапазоне от 450 нм до 620 нм с шагом в 1 нм относительно воздуха, определить максимум поглощения. Для снятия спектра коллоидное золото развести детонизованной водой 1:10. Хранить коллоидное золото при температуре 2-8°С в защищенном от света месте не более 6 месяцев от даты изготовления.
1.2. Приготовление конъюгата антигенов с НКЗ.
Проводят по следующей методике:
Приготовление 0,1 М раствора карбоната натрия: 1,059 г карбоната натрия развести в 100 мл деионизованной воды.
Определение рН изоэлектрической точки антигенов: В эппендорфах приготовить ряд растворов коллоидного золота с добавлением различного количества 0,1М карбоната натрия:
В каждый из этих растворов добавить по 12-18 мкг антигенов, перемешать, через 20 мин сравнить цвет. Первая пробирка, в которой не наблюдается изменения окраски относительно исходного цвета коллоидного золота, указывает на количество карбоната натрия, которое следует добавлять при конъюгации для достижения рН изоэлектрической точки.
Приготовление конъюгата антигенов с коллоидным золотом.
К требуемому количеству коллоидного золота добавить 0,1М раствор карбоната натрия, необходимый для достижения рН изоэлектрической точки для данного вида антигенов.
Перемешивать на магнитной мешалке в течение 3 минут. Добавить антигены из расчета 12-18 мкг на 1 мл коллоидного золота. Перемешивать на магнитной мешалке в течении 15 минут. Добавить 10% раствор БСА из расчета 0,02 мл на 1 мл коллоидного золота. Перемешивать на магнитной мешалке в течении 10 минут. Центрифугировать при 12000g, 4°С в течение 30 минут. Осторожно пипеткой удалить надосадочную жидкость. Добавить деионизованную воду в количестве, равном изначальному количеству коллоидного золота, перемешать при помощи вортекса. Центрифугировать при 12000g, 40С в течение 30 минут. Осторожно пипеткой удалить надосадочную жидкость. Добавить деионизованную воду в количестве, в 20 раз меньшем изначального количества коллоидного золота. Полученный конъюгат перенести во флакон из темного стекла. На спектрофотометре измерить оптическую плотность конъюгата при разведении его деионизованной водой 1:100 относительно воды при длине волны, равной максимуму поглощения данной серии коллоидного золота. В качестве консерванта добавить азид натрия до 0,1% к объему конъюгата. Хранить конъюгаты с коллоидным золотом при температуре 2-8°С в защищенном от света месте не более 12 месяцев от даты изготовления.
Антиген представляет собой высокоактивный рекомбинантный антиген, экспрессируемый путем слияния фрагментов N-белка и доминирующих эпитопов S-белка, и используется непрямая маркировка коллоидным золотом.
2. Подготовка мембраны для образца.
2.1. Приготовление буферного раствора для обработки мембраны для образца.
В необходимом количестве чистой деионизированной воды растворить компоненты, перечисленные в Таблице 2, до достижения следующих концентраций в мас %:
Поместить стакан на магнитную мешалку и перемешивать в течение 15 минут. Измерить рН полученного раствора. Значение рН должно соответствовать 8,0±0,1.
2.2. Обработка мембраны для образца
Работа с мембранами проводится в перчатках. Необходимо выложить лист мембраны размером 20,4*25,4 см в чистый и сухой пластиковый лоток с размером по дну не более 25*30 см. Мерным цилиндром отмерить 50 мл буферного раствора для пропитки мембраны для образца и влить в лоток. Небольшим покачиванием распределить буферный раствор по всей поверхности мембраны в лотке. Качать на шейкере 15 минут с каждой стороны (режим 13 оборотов в минуту). Переворачивать, используя металлические или пластиковые пинцеты. Повторить операцию для необходимого количества мембран.
2.3. Сушка мембраны для образца
Сушка мембран для образца осуществляется при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30% в течение 24 часов. Высушенные мембраны хранятся при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30%.
2.4. Нарезка мембраны для образца
Необходимое количество пропитанных мембран для образца сложить в стопку и поместить в автоматический резак. Выбрать нужную программу для нарезки мембран для образца по 1,9 см. Произвести нарезку мембран. Нарезанные мембраны хранятся при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30%.
3. Подготовка мембраны для конъюгата.
Приготовление буферного раствора для пропитки мембраны для конъюгата, представляющего собой водный раствор, содержащий компоненты, приведенные в Таблице 3 при их соотношении в мас %.
В необходимом количестве чистой деионизированной воды растворить натрий гидрофосфат безводный и поливиниловый спирт. Для этого поместить стакан на магнитную мешалку с нагревом и перемешивать в течение 1-2 ч. Охладить полученный раствор до комнатной температуры. Взвесить и добавить в полученный раствор альбумин бычий сывороточный, тритон-Х-100, азид натрия в колическвах, соответствующих приведенным в Табл. 3. Измерить рН полученного раствора. Значение рН должно соответствовать 7,4±0,1. При необходимости провести корректировку рН. Хранить раствор для пропитки мембран пгш температуре 2-8°С в течение 14 суток.
3.1. Обработка мембраны для конъюгата
Работа с мембранами проводится в перчатках. Необходимо выложить мембрану в чистый и сухой лоток. Мерным цилиндром отмерить 20 мл буферного раствора для пропитки мембран и влить в лоток. Небольшим покачиванием распределить буферный раствор по всей поверхности мембраны в лотке. Качать на шейкере 15 минут с каждой стороны (режим 13 оборотов в минуту).
Повторить операцию для необходимого количества мембран.
3.2. Сушка мембраны для конъюгата
Сушка мембран для образца осуществляют при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30% в течение 24 часов. Высушенные мембраны хранятся при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30%.
3.3. Нарезка мембраны для конъюгата
Необходимое количество мембран сложить в стопку и поместить в резак. Произвести нарезку мембран по 0,9 см.
4. Подготовка мембраны для адсорбции
Нарезка мембраны для адсорбции
Мембраны для адсорбции не требуют обработки. Необходимое количество мембран сложить в стопку и поместить в резак. Выбрать нужную программу для нарезки мембран. Произвести нарезку мембран по 1,5 см. Нарезанные мембраны хранятся при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30%.
5. Приготовления рабочих разведений антител
5.1. Приготовление буферного раствора для нанесения тестовой и контрольной
линий.
Взвесить и добавить в сухой мерный стакан объемом 200 мл следующие компоненты (Таблица 4):
С помощью мерного цилиндра отмерить и внести в стакан 90 мл очищенной воды. Поместить стакан на магнитную мешалку и перемешивать в течение 15 минут. Измерить рН полученного раствора. Значение рН должно соответствовать 7,4±0,1. Хранить раствор для сорбции при температуре 2-8°С в течение 14 суток.
5.2. Приготовление рабочего раствора антител для сорбции тестовой линии
В буфер для сорбции внести моноклональные антитела к IgM, IgG человека в концентрации 0, 5 мг/мл. Тщательно перемешать полученные растворы на вортексе или магнитной мешалке в зависимости от объема серии.
5.3. Приготовление рабочего раствора антител для сорбции контрольной линии
В буфер для сорбции контрольной линии внести козьи антитела к IgG кролика до конечной концентрации 0,5 мг/мл. Объем раствора и антител рассчитать, исходя из концентрации, указанной в спецификации к реагенту. Тщательно перемешать полученный раствор на вортексе или магнитной мешалке в зависимости от объема серии.
6. Сорбция антител
Сорбцию проводят с помощью диспенсера «AUTOKUN», HGS510.
На подложку наклеить нитроцеллюлозную мембрану CN140, отклеив защитный слой с этой зоны (см схему 1). На каждую подложку наносится рабочий раствор антител для тестовой и контрольной линии в объеме 1 мкл на см2.
6.1. Сушка подложек с нанесенными антителами.
Сушка подложки с нанесенными антителами осуществляют при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30% в течение 24 часов. Высушенные подложки хранятся при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30% в бумажном конверте.
7. Приготовление рабочего разведения конъюгата
Приготовление буферного раствора для разведения конъюгата.
Взвесить и добавить в сухой мерный стакан объемом 200 мл следующие компоненты (таблица 5):
С помощью мерного цилиндра отмерить и внести в стакан 90 мл очищенной воды. Поместить стакан на магнитную мешалку и перемешивать в течение 15 минут. Измерить рН полученного раствора. Значение рН должно соответствовать 8±0,1.
Взвесить и добавить Сахарозу 20%, трегалозу 5%. Перемешивать раствор на магнитной мешалке до полного растворения компонентов. Разбавить раствор очищенной водой до конечного объема 100 мл.
7.1. Приготовление рабочего раствора конъюгата
Определить рабочее разведение конъюгата. В качестве рабочего разведения принимается то, при котором достигаются устойчивые результаты со стандартным образцом предприятия СОП-300 «Стандартная панель отрицательных образцов предприятия содержащих и не содержащих антитела к коронавирусу SARS-CoV-2». В соответствии с заданием на приготовление конъюгата и результатами определения рабочего разведения рассчитать количество, необходимое для сорбции.
Расчет произвести по формуле:
, где
OD - рабочее разведение конъюгата;
V - количество рабочего разведения конъюгата необходимое для сорбции;
ОП - оптическая плотность конъюгата, указанная в паспорте.
В буфер для разведения конъюгата внести конъюгаты антигенов (антител) с НКЗ.
7.2. Сорбция конъюгата
Нанесение конъюгата
Обработанные листы мембран выложить в чистый и сухой лоток размером не более 25*30 см по дну так, чтобы лист мембраны строго горизонтально лежал на дне лотка. Нанести на каждый лист необходимый объем конъюгата из расчета 14 мкл на см2. Качать на шейкере 10 минут, не переворачивая (режим 13 оборотов в минуту).
7.3. Сушка и нарезка нанесенного конъюгата
Сушка листов с нанесенным конъюгатом осуществляется при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30% в течение 24 часов. Высушенные мембраны с нанесенным конъюгатом хранятся при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30% в бумажном конверте. Необходимое количество пропитанных мембран для конъюгата (не более 20 шт) сложить в стопку и поместить в резак. Выбрать нужную программу для нарезки мембран для конъюгата по 0,9 см. Произвести нарезку мембран. Нарезанные мембраны хранятся при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30% в бумажном конверте.
8. Сборка и нарезка иммуносорбента (мастершита)
Сборка мастершита осуществляется при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30%. Для сборки мастершита использовать предварительно обработанные (при необходимости) и нарезанные мембраны. С подложки с наклеенной мембраной CN140 снять (отклеить) защитный слой в зоне мембраны для адсорбции (см. схему 1). Наклеить полоску мембраны для адсорбции, выровняв ее по наружному краю с краем подложки. При этом на противоположном крае образуется нахлест на CN140 1-2 мм. Далее освободить от защитного слоя зону конъюгата (см. схему 1), наклеить мембрану с конъюгатом, выровняв ее по нижнему краю со стороны зоны для образца, при этом на противоположном крае образуется нахлест на CN140 1-2 мм. В последнюю очередь освободить подложку от оставшегося защитного слоя в нижней зоне и наклеить мембрану для образца, выровняв ее по нижнему краю с краем подложки.
Схема 1. Сборка мастершита
Произвести нарезку собранного мастершита на тест-полоски по 4 мм на высокоскоростном резаке HGS210, «AUTOKUN». Выбрать нужную программу для нарезки тест-полосок (ширина тест-полоски 4 мм).
9. Приготовление буферного раствора для разведения образца.
Взвесить и добавить в сухой мерный стакан объемом 1 л следующие компоненты:
С помощью мерного цилиндра отмерить и внести в стакан 900 мл очищенной воды. Поместить стакан на магнитную мешалку и перемешивать в течение 15 минут. Измерить рН полученного раствора. Значение рН должно соответствовать 7,2±0,1. Полученный раствор перенести в цилиндр и разбавить очищенной водой до конечного объема 1,0 л. Перенести раствор в колбу объемом 1 л.
Перечень специфического сырья:
Для исследования используются образцы сыворотки, плазмы или цельной крови человека, объемом не менее 10 мкл. Образцы сыворотки и плазмы (полученные с использованием гепарина, цитрата натрия в качестве антикоагулянта) до проведения анализа можно хранить при температуре от 2 до 8°С не более четырех суток. При необходимости хранения образцов сыворотки и плазмы более 7 дней рекомендуется разделить их на аликвоты и хранить при температуре от минус 20 до минус 70°С. Размороженные образцы перед исследованием нужно тщательно перемешать. При работе с размороженными образцами следует учитывать, что каждый цикл оттаивания-замораживания приводит к разрушению выявляемых антител, снижая качество исследуемого материала. С целью получения достоверных результатов исследования рекомендуется использовать только однократное замораживание-оттаивание образцов.
Для забора образцов цельной крови из вены необходимо использовать пробирки с антикоагулянтом (с гепарином, цитратом натрия или ЭДТА). Образцы венозной крови до проведения анализа можно хранить при температуре от 2 до 8°С не более суток. Замораживание проб цельной крови из вены не допускается.
Образцы цельной капиллярной крови из пальца должны исследоваться незамедлительно и хранению не подлежат.
Не допускается использование для исследования образцов с повышенным содержанием ли-пидов и (или) с признаками гемолиза, и (или) с видимым микробным проростом.
Образцы сыворотки и плазмы, содержащие осадок, перед анализом отцентрифугировать в течение 10-15 минут при 2500-3000 об/мин.
Порядок проведения анализа.
1. Извлечь тест-кассету из индивидуальной упаковки, промаркировать, положить устройство на ровную горизонтальную поверхность.
2. заполнить одноразовую пипетку исследуемым образцом до синей риски (10 мкл)
- удерживая пипетку вертикально, нажатием внести пробу в отверстие тест-кассеты, промаркированное знаком « S »(Фиг. 2),
- удерживая флакон-капельницу вертикально, внести 2 капли буферного раствора в отверстие тест-кассеты, промаркированное знаком « В » (Фиг. 2),
- запустить таймер.
3. Оценить результат реакции визуально через 10-15 минут. Не интерпретировать результаты позднее 20 минут после внесения пробы.
Учет и интерпретация результатов (Фиг. 3)
Отрицательный результат: в контрольной зоне (С) про-является красная линия, в тестовых зонах (IgM и IgG) окрашивания не происходит.
Положительный результат: проявляются две или три четкие красные или розовые линии. Одна линия должна находиться в контрольной зоне (С), другая (или другие) - в тестовых зонах (IgM и/или IgG).
Недействительный результат: в контрольной зоне (С) не появляется окрашенной линии независимо от наличия линий в тестовых зонах (IgM и IgG).
Интенсивность окраски линий может меняться в зависимости от концентрации антител к SARS-CoV-2 в исследуемом образце. Линия в тестовой зоне может быть слабо окрашена вследствие низкого уровня антител в пробе.
В случае получения недействительного результата анализ следует повторить с использованием другой тест-кассеты набора.
Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующим примерами.
Пример 1.
Исследование интерференции в заявляемом наборе реагентов
Потенциальные интерферирующие вещества добавляли в пулы сывороток, содержащих и не содержащих антитела к SARS-CoV-2. Образцы были испытаны с помощью заявляемого набора реагентов, обозначаемого далее как «HXA-COVTD-19-IgM/IgG» в трех повторах с последующей визуальной интерпретацией, происходящей через 10-15 минут после внесения образцов. Результаты представлены в таблицах 6,7.
Проведенные исследования показали, что интерферирующие вещества в исследованных концентрациях не оказывают влияния на результат анализа с помощью заявляемого набора реагентов.
Пример 2. Исследование перекрестной реактивности в наборе реагентов «ИХА-COVID-19-IgM/IgG».
Перекрестную реактивность «HXA-COVID-19-IgM/IgG» исследовали с использованием образцов сыворотки которые содержат антитела к патогенам: другие типы коронавируса, HBV, HCV, HIV-1, HIV-2, Adenovirus, Human Metapneumovirus (hMPV), Parainfluenza virus 1-4, Influenza A, Influenza B, Enterovirus 71, Respiratory syncytial virus, Rhinovirus, Chlamydia pneumoniae, Streptococcus pneumonia, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, EB Virus. Полученные результаты представлены в Табл. 8
Проведенные испытания показали отсутствие перекрестной реактивности с другими патогенами при исследовании образцов сыворотки (плазмы) с помощью набора реагентов.
Пример 3. Оценка эквивалентности сыворотки крови человека к плазме крови человека в сравнении с набором-аналогом.
Была проведена оценка эквивалентности получаемых результатов при использовании образцов сыворотки крови человека и плазмы крови человека при использовании заявляемого набора в сравнении с набором-аналогом (Набор реагентов «COVID-19 IGG/IGM» ООО "БИОТЭК", РУ № РЗН 2020/10177 от 24.04.2020 г.). Результаты представлены в Табл. 9.
Представленные результаты исследования образцов плазмы показали, что тип биологического образца не оказывает влияния на результат анализа, а также, что вид антикоагулянта (гепарин или цитрат натрия, ЭДТА) не оказывают влияния на результат анализа. Результаты испытаний заявляемого набора реагентов «HXA-COVID-19-IgM/IgG» сопоставимы и совпадают с результатами исследования тех же образцов, полученными с помощью зарегистрированного в Российской Федерации набора реагентов Экспресс-тест COVID-19 IgG/IgM (Цельная кровь/сыворотка/плазма), номер партии BNCP40200082, ООО "БИОТЭК".
В ходе внутренних клинико-лабораторных испытаний разработанного набора реагентов было проанализировано 332 образца сыворотки крови, характеризующихся следующими параметрами:
Проведенные исследования показали, что тест имеет высокие показатели чувствительности и специфичности при исследовании клинического материала.
Литература
1. Huang C, Wang Y., Li X., Ren L., Zhao J., Hu Y. et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 2020; 395: 497-506.
2. Zhang J., Litvinova M., Wang W., Yan Wang, Deng X., Chen X. et al. Evolving epidemiology and transmission dynamics of coronavirus disease, 2019 outside Hubei province, China: a descriptive and modeling study. Lancet Infect. Dis. 2020; 20: 793-802.
3. Nussbaumer-Streit B., Mayr V., Dobrescu A.I., Chapman A., Persad E., Klerings I. et al. Quarantine alone or in combination with other public health measures to control COVID-19: a rapid review. Cochrane Database Syst Rev. 2020; 4CD013574.
4. Wölfel R., Corman V.M., Guggemos W., Seilmaier M., Zange S., Marcel A. Miilleret al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID- 2019. Nature. 2020; 581: 465-9.
5. He X., Lau E.H.Y., Wu P., Deng X., Wang J., Hao X. et al. Temporal dynamics in viral shedding and transmissibility of COVID-19. Nat. Med. 2020; 26: 672-5.
6. Rothe C, Schunk M., Sothmann P., Bretzel G., Froeschl G., Wallrauch C. et al. Transmission of 2019-nCoV infection from an asymptomatic contact in Germany. N. Engl. J. Med. 2020; 382: 970-1.
7. Ferretti L., Wymant C, Kendall M., Zhao L., Nurtay A., Abeler-Dorneret L. al. Quantifying SARS-CoV-2 transmission suggests epidemic control with digital contact tracing. Science. 2020; 368eabb6936.
8. Perera R.A., Mok C.K., Tsang O.T., Lv H., Ko R.L., Wu N.C. et al. Serological assays for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), March 2020. Euro Surveill. 2020; 25(16):pii=2000421.
9. Amanat F., Stadlbauer D., Strohmeier S., Nguyen T.H.O., Chromikova V., McMahon M. et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nat. Med.; 2020. Doi: 10.1038/s41591-020-0913-5.
10. Meyer B., Drosten C, Müller M.A. Serological assays for emerging coronaviruses: Challenges and pitfalls. Virus Res. 2014; 194: 175-83. Doi: 10.1016/j.virusres.2014.03.018.
11. Dutta N.K., Kaushiki M.;. James G T. The Nucleocapsid Protein of SARS-CoV-2: a Target for Vaccine Development. J. Virol. 2020; 94(13): e00647-20.
Claims (14)
- Набор для выявления антител классов М и G к нуклеокапсиду (Nc) и рецепторсвязывающему домену спайк белка коронавируса SARS-CoV-2, в образце биологической жидкости человека, характеризующийся тем, что он содержит картридж с отверстием для внесения буферного раствора, отверстием для внесения образца, аналитическим окном для детекции результата, внутри которого размещена тест-полоска, состоящая из подложки, на поверхности которой последовательно расположены мембраны в следующем порядке: впитывающая мембрана для нанесения образца, мембрана для нанесения конъюгата с нанесенными и высушенными конъюгатами рекомбинантного антигена коронавируса SARS-CoV-2, нитроцеллюлозная мембрана-иммуносорбент с нанесенными тестовыми линиями мышиных моноклональных антител к IgM и IgG человека и контрольной линией с нанесенными козьими антителами к IgG мыши, адсорбирующая мембрана, причем мембрану для образца пропитывают буферным раствором, представляющим собой водный раствор, приготовленный из компонентов в следующем их соотношении, мас. %:
- трис-оксиметил аминометана 1%,
- трис-оксиметил аминометан гидрохлорида 0,1%,
- казеинат натриевая соль 1%,
- поливинилпирролидон 0,1%,
- азид натрия 2%,
- твин-20 1%,
- мышиные антитела к эритроцитам человека 0,02%,
- мембрану для конъюгата пропитывают водным раствором, приготовленным из компонентов в следующем их соотношении, мас. %:
- натрий гидрофосфат безводный 1,5%,
- поливиниловый спирт 0,5%,
- альбумин бычий сывороточный 1%,
- тритон-Х-100 0,1%,
- азид натрия 2%.
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2023101039A RU2023101039A (ru) | 2023-05-30 |
RU2808765C2 true RU2808765C2 (ru) | 2023-12-04 |
Family
ID=
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2510510C1 (ru) * | 2012-08-09 | 2014-03-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Иммуновед" (ООО "Иммуновед") | Тест-система для полуколичественного иммунохроматографического анализа |
RU2754340C1 (ru) * | 2021-02-11 | 2021-09-01 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное объединение "Диагностические системы" | Тест-система и способ дифференцированного выявления антител к SARS-CoV-2 |
WO2021231498A2 (en) * | 2020-05-11 | 2021-11-18 | Chan Zuckerberg Biohub, Inc. | Detection assay for anti-sars-cov-2 antibodies |
RU2761481C1 (ru) * | 2021-09-07 | 2021-12-08 | Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Тест-система для выявления SARS-CoV-2, Influenza virus A, Influenza virus B методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией |
WO2021254868A1 (en) * | 2020-06-19 | 2021-12-23 | Sciensano | Multiplex sars-cov-2 immunoassay |
WO2022049403A1 (en) * | 2020-09-07 | 2022-03-10 | Imperial College Innovations Limited | Sars-cov-2 antibody detection assay |
RU2769572C1 (ru) * | 2021-05-14 | 2022-04-04 | Общество с ограниченной ответственностью «Система-БиоТех» | Тест-система для выявления специфических нуклеотидных последовательностей, характерных для выявляемых микроорганизмов или вирусов, способ применения тест-системы (варианты) |
RU218447U1 (ru) * | 2022-12-12 | 2023-05-25 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" | Мультипараметрическая тест-система для одновременного определения антигенов вирусов SARS-CoV-2, гриппа типа А и В методом иммунохроматографии |
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2510510C1 (ru) * | 2012-08-09 | 2014-03-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Иммуновед" (ООО "Иммуновед") | Тест-система для полуколичественного иммунохроматографического анализа |
WO2021231498A2 (en) * | 2020-05-11 | 2021-11-18 | Chan Zuckerberg Biohub, Inc. | Detection assay for anti-sars-cov-2 antibodies |
WO2021254868A1 (en) * | 2020-06-19 | 2021-12-23 | Sciensano | Multiplex sars-cov-2 immunoassay |
WO2022049403A1 (en) * | 2020-09-07 | 2022-03-10 | Imperial College Innovations Limited | Sars-cov-2 antibody detection assay |
RU2754340C1 (ru) * | 2021-02-11 | 2021-09-01 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное объединение "Диагностические системы" | Тест-система и способ дифференцированного выявления антител к SARS-CoV-2 |
RU2769572C1 (ru) * | 2021-05-14 | 2022-04-04 | Общество с ограниченной ответственностью «Система-БиоТех» | Тест-система для выявления специфических нуклеотидных последовательностей, характерных для выявляемых микроорганизмов или вирусов, способ применения тест-системы (варианты) |
RU2761481C1 (ru) * | 2021-09-07 | 2021-12-08 | Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Тест-система для выявления SARS-CoV-2, Influenza virus A, Influenza virus B методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией |
RU218447U1 (ru) * | 2022-12-12 | 2023-05-25 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" | Мультипараметрическая тест-система для одновременного определения антигенов вирусов SARS-CoV-2, гриппа типа А и В методом иммунохроматографии |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111233985A (zh) | 一种新型冠状病毒IgA抗体快速检测试纸条的制备方法 | |
CN211148669U (zh) | 一种基于S抗原的新型冠状病毒2019-nCoV抗体快速检测试剂盒 | |
Ernst et al. | Technical considerations to development of serological tests for SARS-CoV-2 | |
CN113215107B (zh) | 一种检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫试剂盒及其制备方法 | |
WO2021159703A1 (zh) | 一种快速检测新型冠状病毒n蛋白的免疫层析试剂盒及其制备方法和应用 | |
CN111007257A (zh) | 一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体检测免疫阻断层析试剂盒及其应用 | |
CN108152506B (zh) | 乙型流感病毒IgA抗体免疫荧光检测试纸条及其制备方法、检测方法和应用 | |
US20100322823A1 (en) | Rapid Detection of Post-Vaccination Antibody Response | |
CN115420895A (zh) | 甲型/乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒抗原检测试纸条和试剂盒 | |
US20210356464A1 (en) | Serological assays for diagnosing or confirming covid-19 virus infections | |
WO2019241188A1 (en) | Antibody pairs for use in a rapid influenza b diagnostic test | |
RU2808765C2 (ru) | Набор для выявления антител классов M и G к нуклеокапсиду (Nc) и рецепторсвязывающему домену спайк белка коронавируса SARS-CoV-2 | |
WO2005062052A1 (ja) | 簡易メンブレンアッセイ法及びキット | |
US20210341475A1 (en) | Antibody pairs for use in a rapid influenza a diagnostic test | |
EP4365195A1 (en) | Antibody against nucleocapsid protein of sars-cov-2 | |
CN111735962A (zh) | 新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条 | |
KR102021540B1 (ko) | 모기 매개 바이러스 진단용 펩타이드 및 이의 용도 | |
KR102021539B1 (ko) | 모기 매개 바이러스 진단용 펩타이드 및 이의 용도 | |
JPH11346768A (ja) | イヌジステンパーウイルスヌクレオカプシド蛋白質の抗原性を有する蛋白質及び抗イヌジステンパーウイルスヌクレオカプシド蛋白質抗体測定試薬 | |
ES2257095T3 (es) | Especificidad mejorada en la deteccion de anticuerpos igm de anti-rubeola. | |
KR102467073B1 (ko) | 코로나바이러스에 대한 혈액 중의 항체 검출용 키트 | |
JP2020026953A (ja) | 重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット及び重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出方法 | |
KR102021538B1 (ko) | 모기 매개 바이러스 진단용 펩타이드 및 이의 용도 | |
Tian et al. | Development and Head-to-Head Comparison of Two Colloidal Gold Based Serologic Lateral Flow Assays for SARS-CoV-2 Antibody Tests | |
JP7226878B1 (ja) | 検査方法、イムノクロマトグラフィーテストストリップ、及びイムノクロマトグラフィーキット |