KR102021539B1 - 모기 매개 바이러스 진단용 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 모기 매개 바이러스 진단시 모기 매개 바이러스 간 교차반응이 나타나지 않는 것을 특징으로 하는, 모기 매개 바이러스 특이적인 진단을 위한 단리된 펩타이드 및 상기 단리된 펩타이드를 포함하는, 모기 매개 바이러스 특이적인 진단을 위한 신속진단키트에 관한 것이다.

Description

모기 매개 바이러스 진단용 펩타이드 및 이의 용도 {Peptides for diagnosis of mosquito-borne viruses and uses thereof}
본 발명은 모기 매개 바이러스 진단시 모기 매개 바이러스 간 교차반응이 나타나지 않는 것을 특징으로 하는, 모기 매개 바이러스 특이적인 진단을 위한 단리된 펩타이드 및 상기 단리된 펩타이드를 포함하는, 모기 매개 바이러스 특이적인 진단을 위한 신속진단키트에 관한 것이다.
뎅기 바이러스는 연간 5천만명에서 1억명이 고통을 받고 있는 세계적인 주요 질환으로서, 년간 25,000명이 사망한다고 알려져 있다. 뎅기(열)은 모기 매개성 질환이며, 감기증상을 보이다가 뎅기출혈열(DHF) 또는 뎅기쇼크증후군(DSS)으로 진행된다. 따라서, 뎅기 바이러스 감염을 차단하기 위해서는 백신의 개발이 무척 중요하나 이 질환의 경우 중복감염(다른 타입의 뎅기 바이러스에 의한 두 번째 감염)이 되면 훨씬 심각한 DHF/DSS 증세를 보이기 때문에 백신 개발에 어려움이 있어, 아직까지는 빠르고 정확한 진단을 통한 환자 증세 완화가 최선의 치료법으로 알려져 있다.
또한, 지카 바이러스는 황열(Yellow fever), 뎅기(Dengue) 바이러스와 같이 플라비바이러스과(Flaviviridae)에 속하는 것으로서, 지카 바이러스에 감염되면 발열과 피부발진, 결막염, 근육과 관절통증, 두통 등의 가벼운 감기증상이 2~7일 정도 나타난다. 증상이 가벼워 감염 사실을 모르고 지나가는 경우도 있으며 치사율도 낮은 편이다. 하지만 신생아의 소두증이나 신경학적 합병증을 일으킬 가능성이 제기되었고, 브라질에서는 2015년 5월에는 지카 바이러스의 첫 사례가 보고된 이후 2016년 1월까지 200명 이상의 소두증이 확인된 상태이다. 그러나, 현재 적절한 치료제나 백신이 없어 예방할 수 없는 상황이다.
또한, 치쿤쿠니아 바이러스에 감염되는 경우 일 내지 12일의 잠복기를 거친 후 약 40도 가까운 고열이 나면서 심한 근육통과 두통, 관절통이 나타납니다. 그러면서 팔, 다리, 목 주변에 땀띠와 유사한 발진이 일어나고 피로, 오심, 구토 등의 증상을 보인다. 뎅기와 임상증상이 유사하여 감별이 어렵다. 현재 적절한 치료제나 백신이 없어 예방할 수 없는 상황이다.
일본특허공개 제2012-504955호에는 뎅기 바이러스의 표면항원에 결합할 수 있는 재조합 항체를 포함하는 뎅기 바이러스 진단용 키트가 개시되어 있으며, 한국등록특허 제10-169236호에는 지카바이러스 진단을 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 지카바이러스 진단용 키트, 및 이를 이용한 지카바이러스 진단방법이 개시되어 있다.
그러나, 상기 뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아 바이러스는 동종의 모기에 의해 같은 지역에서 유행하며, 감염증상이 유사하기 때문에 정확하게 구별하기 어렵다. 또한, 서열의 유사성으로 인하여 이들 바이러스들의 감염을 정확하게 구별하여 진단하는 것은 쉽지 않다. 현재 대부분의 항체진단키트는 재조합단백질을 사용하여 감염 후 생성된 항체를 진단하지만 이 경우 유사한 바이러스간의 교차반응이 나타나는 문제점이 있다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 모기 매개 바이러스 진단시 교차반응이 나타나지 않는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 서열분석을 통하여 뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아 각각의 바이러스에서 에피토프의 친수성 부분에 결합하는 특이적인 서열에 대한 펩타이드 선정하여 항체진단용 키트에 적용시 높은 민감도로 교차반응 없이 상기 바이러스를 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 모기 매개 바이러스 진단시 모기 매개 바이러스 간 교차반응이 나타나지 않는 것을 특징으로 하는, 모기 매개 바이러스 특이적인 진단을 위한 단리된 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 단리된 펩타이드가 포함된, 모기 매개 바이러스 특이적인 진단을 위한 신속진단키트를 제공하는 것이다.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한, 본 발명의 하나의 양태는 모기 매개 바이러스 진단시 모기 매개 바이러스 간 교차반응이 나타나지 않는 것을 특징으로 하는, 모기 매개 바이러스 특이적인 진단을 위한 단리된 펩타이드를 제공한다.
본 발명자들은 보다 높은 민감도를 갖고 모기 매개 바이러스의 항체를 진단하는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아 바이러스는 서열의 유사성으로 인하여 이들 바이러스들의 감염을 정확하게 구별하여 진단하는 것은 쉽지 않음을 확인하였고, 진단시 교차반응이 일어나는 문제점을 해결하는 것이 중요함을 인식하였다.
본 발명의 용어 "모기 매개 바이러스(Mosquito-borne viruses)"는 모기를 매개로 하여 전파되어 사람에게 병증을 일으키는 바이러스를 의미한다. 그 종류에는 플라비바이러스과(Flaviviridae)의 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus), 뎅기바이러스(Dengue virus), 웨스트나일바이러스(West Nile virus), 황열바이러스(Yellow fever virus)와 토가바이러스과(Togaviridae)의 치쿤구니아바이러스(Chikungunya virus) 등이 있다. 구체적으로 뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아 바이러스는 모기 매개 바이러스로서, 서열의 유사성으로 진단시 구별에 어려움이 있다. 따라서, 본 발명의 목적상 모기 매개 바이러스 진단시 교차반응이 나타나지 않는 펩타이드를 선정하고자 노력하였다.
상기 모기 매개 바이러스에 속하는 바이러스의 일 예로서, 상기 "플라비바이러스과(Flaviviridae)"는 바이러스의 한 과로서, 인간을 비롯한 포유류 등을 자연숙주로 삼으며, 진드기와 모기 등의 곤충을 매개로 하여 전파되는 특징을 갖는다. 플라비바이러스과에 속하는 바이러스가 일으키는 질병으로는 간염, 출혈 증후군, 유산, 점막병, 출혈열, 뇌염 등이 있으며, 플라비바이러스과에 속하는 바이러스 종은 현재 100종 이상인 것으로 알려져 있으며, 구체적으로는 뎅기바이러스, 지카바이러스 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "교차반응"은 항체가 다른 항원물질에서 동일한 항원결정기(eptope)가 있으면 그것에 대응할 수 있는 것을 의미하며, 상기 용어는 교차면역 또는 교차방어면역과 혼용되어 사용될 수 있다. 하나의 항원물질에서도 복수인 다수의 항원결정기(epitope)가 존재하는 경우가 대부분이며, 이는 다중 면역반응을 자극한다.
진단 테스트를 포함한 의료 테스트에서 교차 반응은 혼동을 유발하거나 도움이 되는 경우가 있다. 예를 들어, 관심 항원이 아닌 다른 항원과 반응이 일어날 때 양성 반응의 오류를 산출하는 교란을 일으키기도 하며, 다른 항원을 위한 항체를 사용하여 다른 바이러스를 탐지하는데 도움을 주기도 한다.
본 발명의 목적상 모기 매개 바이러스의 진단시 교차반응은 관심 항원이 아닌 다른 항원과의 반응에 의해 뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아 바이러스 중 어떠한 바이러스에 감염되었는지 확인할 수 없게 되는 것을 의미한다. 즉, 뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아 바이러스는 모기 매개 바이러스에 속하는 것으로 그 서열이 유사하여 진단시 교차반응이 일어날 수 있으며, 양성반응의 오류를 일으킬 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 진단시 교차반응을 일으키지 않고 뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아 바이러스에 특이적인 펩타이드를 최초로 규명하였다.
또한, 본 발명의 목적상 뎅기 바이러스 진단시에는 지카 또는 치쿤쿠니아 바아러스와 교차반응이 나타나지 않고, 지카 바이러스 진단시에는 뎅기 또는 치쿤쿠니아 바아러스와 교차반응이 나타나지 않고, 치쿤쿠니아 바이러스 진단시에는 지카 또는 뎅기 바아러스와 교차반응이 나타나지 않는 것을 의미할 수 있다.
상기 단리된 펩타이드는 에피토프(epitope)의 친수성 부분 중 모기 매개 바이러스에만 특이적인 서열을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 용어 "에피토프(epitope)"란 항원 분자에 존재하는 항원 특이성을 결정하는 부위를 의미하며, 항원결정기 또는 항원결정부위와 혼용되어 사용될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 에피토프는 수용성의 항체와 직접 결합하기 때문에 친수성 잔기가 차지하는 비율이 높은 부분에 존재할 가능성이 높으므로, 모기 매개 바이러스에서 항원결정부위의 친수성(hydrophilicity)을 분석하여 뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아 바이러스에만 특이적인 항원결정부위를 예측하였다. 구체적으로, 상기 바이러스의 에피토프 중에서 각각의 바이러스에만 특이적인 서열부분을 서열분석을 통하여 펩타이드로 선정하였으며, 뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아 바이러스들의 진단시 교차반응이 일어나지 않는 한, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 다중서열분석을 통하여 뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아에 특이적인 서열을 확인하고, 에피토프의 친수성 부분을 분석하여 각 바이러스에만 특이적인 항원결정부위를 예측하였다(도 1).
본 발명의 목적상 상기 단리된 펩타이드는 뎅기 바이러스에 특이적인 경우 서열번호 1 또는 서열번호 2를 포함하는 펩타이드일 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 2의 펩타이드 일 수 있으나, 지카 또는 치쿤쿠니아 바이러스와 같은 모기 매개 바이러스에서 진단시 교차반응을 일으키지 않는 뎅기 바이러스 특이적인 펩타이드라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 지카 바이러스에 특이적인 경우 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5를 포함하는 펩타이드 일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 3, 서열번호 4 및/또는 서열번호 5로 구성되는 펩타이드, 서열번호 4 또는 서열번호 5로 구성되는 펩타이드 일 수 있다. 더욱 구체적으로, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 구성되는 펩타이드 일 수 있으나, 뎅기 또는 치쿤쿠니아 바이러스와 같은 모기 매개 바이러스에서 진단시 교차반응을 일으키지 않는 지카 바이러스 특이적인 펩타이드라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 치쿤쿠니아 바이러스에 특이적인 경우 서열번호 6 내지 서열번호 11 중 하나를 포함하는 펩타이드일 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 9의 펩타이드일 수 있으나, 지카 또는 뎅기 바이러스와 같은 모기 매개 바이러스에서 진단시 교차반응을 일으키지 않는 지카 바이러스 특이적인 펩타이드라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 실시예 1-1에서 선정된 뎅기 특이서열 2개 (DenV-P1, DenV-P2), 지카 특이서열 3개 (ZIKA-P1, ZIKA-P2, IKA-P3) 치쿤구니아 특이서열 6개(CKIK-P1, CKIK-P2, CKIK-P3, CKIK-P4, CKIK-P5, CKIK-P6) 펩타이드를 정상 검체 10개와 감염 검체 10개의 혈청을 이용하여 ELISA로 분석하였다. 그 결과, 뎅기는 2번 (DenV-P2) 펩타이드를 사용하였을 때, 지카는 1번(ZIKA-P1), 2번(ZIKA-P2)과 3번(ZIKA-P3) 펩타이드를 함께 사용하였을 때, 치쿤구니아는 4번(CKIK-P4) 펩타이드를 사용하였을 때 효과적으로 감염진단이 가능한 것을 확인할 수 있었다(도 2).
상기 결과로부터 다중서열분석을 통해 선정된 뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아 바이러스에 특이적인 펩타이드라도 하더라도, 감염진단에 모두 효과적으로 사용할 수 있는 것은 아니며, 일부 특이적인 서열만 감염진단에 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 상기 단리된 펩타이드를 포함하는, 모기 매개 바이러스 특이적인 진단을 위한 신속진단키트를 제공한다.
구체적인 실시 양태로서, 상기 신속진단키트는 완충용액을 포함하는 버퍼패드; 축합패드; 검체 패드; 검사선 및 대조선이 고정화된 멤브레인; 및 흡수패드를 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 신속진단키트는 (ⅰ) 항-사람 IgG-단클론 항체 또는 항-사람 IgM-단클론 항체가 고정화된 멤브레인; (ⅱ) 단리된 펩타이드가 결합된 금 축합체를 포함하는 축합 패드; (ⅲ) 검체 패드; (ⅳ) 완충용액을 포함하는 버퍼 패드; 및 (ⅴ) 흡수 패드를 포함할 수 있다. 상기와 같은 신속진단키트는 뎅기바이러스를 진단하기 위한 것일 수 있다.
다음으로, 상기 멤브레인은 항-사람 IgG 또는 항-사람 IgM 단클론 항체가 고정화되어 있는 것일 수 있다. 상기 항-사람 IgG 단클론 항체 및 항-사람 IgM 단클론 항체는 키트를 이용한 진단 시에, 검체 내에 포함되어 있을 수 있는 항-바이러스 항체를 항원으로 하여 결합하는 역할을 할 수 있으며, 바이러스의 종류에 따라 항-사람 IgG 단클론 항체(검사선 1) 또는 항-사람 IgM 단클론 항체(검사선 2) 중 하나가 포함될 수 있고, 또는 항-사람 IgG 단클론 항체 및 항-사람 IgM 단클론 항체 둘 모두가 포함될 수도 있다.
구체적으로, 지카 또는 치쿤쿠니아 바이러스의 경우에는 상기 멤브레인에 하나의 항체가 고정화되어 있는 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로 항-사람 IgM 단클론 항체가 고정화되어 있는 것일 수 있다. 또한, 뎅기 바이러스의 경우에는 상기 멤브레인에 두 개의 항체가 고정화되어 있는 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로, 항-사람 IgG 단클론 항체 및 항-사람 IgM 단클론 항체 둘 모두 고정화 되어 있는 것일 수 있으나, 지카, 치쿤쿠니아 또는 뎅기 바이러스를 더욱더 민감하게 진단할 수 있는 것이라면 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 각 단클론 항체는 환자의 시료에 뎅기 바이러스에 대한 항체가 존재하는 경우 상기 항체가 IgM 형태인지 아니면 IgG 형태인지를 확인할 수 있어, 뎅기 바이러스에 대한 IgM 형태의 항체인지 아니면 IgG 형태의 항체인지를 확인하는데 사용할 수 있고, 상기 각 단클론 항체를 멤브레인에 고정시킴으로써, 환자의 시료에 뎅기 바이러스에 대한 항체가 존재하는지의 여부를 보다 효과적으로 확인할 수 있다. 상기 진단키트에 포함되는 항-사람 IgG-단클론 항체(검사선 1) 또는 항-사람 IgM-단클론 항체(검사선 2)의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 0.1 내지 5.0 mg/ml의 농도로 상기 멤브레인에 분주하여 고정화시킬 수 있다.
아울러, 상기 멤브레인은 상기 각 단클론 항체를 결합시키기 위하여 사용되는데, 상기 멤브레인은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 항체가 결합될 수 있는 니트로셀룰로오스 멤브레인, PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인 등이 될 수 있다.
다음으로, 상기 키트에 포함된 축합 패드는 뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아 바이러스에 특이적인 단리된 펩타이드가 금입자와 결합된 형태의 금 축합체를 포함하도록 구성될 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 단리된 펩타이드는, 본 발명의 신속진단키트의 구성 중에서, 축합 패드에 포함될 수 있다. 즉, 상기 축합 패드는 본 발명의 단리된 펩타이드가 고정화되어 있는 것일 수 있다. 또한, 상기 단리된 펩타이드는 금 축합체와 축합된 형태로 축합 패드에 포함되어 있는 것일 수 있다.
상기 뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아 바이러스에 특이적인 단리된 펩타이드에 결합된 금입자는 상기 뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아 바이러스에 특이적인 단리된 펩타이드의 위치를 표시하는 표지물질로서 사용되며, 본 발명의 키트에서는 최종적으로 시료에 포함된 항체의 존재여부를 확인하기 위한 수단으로서 사용된다. 본 발명에 따른 단리된 펩타이드는 뎅기 바이러스에 특이적인 펩타이드라면 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 서열번호 2의 펩타이드 일 수 있다. 또한, 상기 단리된 펩타이드는 지카 또는 치쿤쿠니아 바이러스에 특이적인 펩타이드라면 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 지카 바이러스 특이적인 펩타이드는 서열번호 4, 5일 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 3, 4, 5가 동시에 결합하여 반응하는 것 일 수 있다. 또한, 치쿤쿠니아 바이러스 특이적인 펩타이드는 서열번호 9일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다음으로, 본 발명에 따른 검체 패드는 다공성 재질로 구성되고, 상기 멤브레인과 항원패드의 사이에 위치하도록 구성될 수 있다. 상기 검체 패드는 뎅기 바이러스의 감염이 의심되는 개체로부터 얻어진 시료(혈액, 전혈, 혈장, 혈청 등)가 본 발명의 키트에 직접적으로 투입되는 투입구의 역할을 수행할 뿐만 아니라 다공성 재질로 인하여, 상기 시료에 포함된 혈구들은 상기 검체패드를 통해 여과되고, 상기 시료에 포함된 액상성분만을 상기 멤브레인으로 전달하는 역할을 수행할 수 있다. 이때, 상기 다공성 재질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 혈구를 통과시키지 않을 정도의 공극을 포함하는 다공성 알루미나, 다공성 실리케이트, 다공성 합성수지 등이 될 수 있다. 또한, 상기 검체 패드는 혈구를 분리하는 역할을 수행하기 때문에 다공성 재질 이외에도 혈구를 흡착시킬 수 있는 재질로 구성될 수도 있는데, 이러한 혈구를 흡착시킬 수 있는 재질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 니트로셀룰로오스 멤브레인, PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인 등이 될 수 있다.
다음으로, 본 발명에 따른 버퍼 패드는 본 발명의 키트를 사용할 때, 상기 키트내에서 시료의 전달을 보조하고, 항원-항체 반응을 보조하기 위한 완충용액이 포함된 검체전개액을 포함할 수 있는 다공성 재질로 구성되며, 상기 축합패드와 연결되어 키트의 말단에 위치하도록 구성될 수 있다. 상기 다공성 재질은 상기 검체패드에서 정의한 바와 동일하다.
상기 검체전개액은 상기 버퍼 패드에 포함된 상태로 존재할 수도 있고, 본 발명의 키트에 시료를 가한 후에 검체전개액을 버퍼 패드에 가할 수도 있는데, 바람직하게는 본 발명의 키트에 시료를 가한 후에 검체전개액을 버퍼 패드에 가할 수 있다. 상기 검체전개액에 포함된 완충용액은 시료전달 및 항원-항체반응을 보조하는 효과를 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 붕산염 완충용액, 트리스 완충용액, 인산염 완충용액 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 검체전개액은 비특이반응(non-specific reaction)을 억제할 수 있는 Triton X-100, Tween 20, 카제인 등을 포함할 수 있고, 보존제로서 아지드화나트륨 등을 포함할 수 있다.
끝으로, 본 발명에 따른 흡수 패드는 과량의 검체 또는 완충액을 흡수할 수 있는 재질로 구성되고, 상기 검체 패드의 반대편 방향에서 멤브레인과 연결되며, 버퍼 패드의 반대편 방향의 키트 말단에 위치하도록 구성된다. 상기 흡수패드는 과량의 검체 또는 검체전개액을 흡수하여 제거함으로써, 본 발명에서 제공하는 키트의 검사결과를 교란시키지 않도록 하는 역할을 수행하는데, 상기 흡수 패드의 재질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 면, 액체 흡수성 겔 등을 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 진단 키트에 사용하기 위한 검정 시스템은 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱디바이스, 면역크로마토그래피법 및 방사 분할 면역검정 디바이스 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 포함한다. 바람직하게는 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 형태 또는 디바이스 형태의 진단 키트를 이용할 수 있다. 면역크로마토그래피법(immunochromatographic assay: ICA)을 이용한 진단은 그 신속함과 간편함 때문에 래피드 테스트(rapid test)라고도 불리는데, 이는 뎅기 바이러스의 표피단백질 도메인1에 대한 단클론항체가 콜로이드성 금 입자에 축합되어 있고, 이 축합체가 이동하면서 항원 패드에 있는 뎅기 바이러스와 결합을 하게 된다. 이 복합체가 검체(혈액)에 존재하는 뎅기 항체와 반응을 하면서 모세관 현상에 의해 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 멤브레인의 미세구멍(micropore)을 통하여 이동한다. 그 도중에 멤브레인의 미세구멍의 내부 표면에 고정되어 있는 항 사람 IgG 또는 항-사람 IgM-단클론 항체와 결합하여 발색 띠(band)를 형성하게 된다. 이 띠(band)의 발색 정도를 확인함으로서 항체의 존재 여부, 항체의 종류 및 항체의 양을 육안으로 판별할 수 있다.
본 발명의 상기 진단 키트에서, 항원-항체 복합체는 색채입자결합법으로 검출하며, 색채입자로는 예를 들어 콜로이드성 금 입자 또는 칼라 유리 또는 플라스틱(예: 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드(bead)를 포함한다. 본 발명에서는 바람직하게 금 콜로이드를 이용한다.
본 발명의 키트에 포함된 검체 패드에 뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아 바이러스 감염이 의심되는 개체로부터 유래된 혈장, 혈청, 전혈 등의 혈액시료를 가하고, 검체전개액을 버퍼 패드에 가하면, 검체 패드에서 혈구가 분리된 액상성분으로부터 검체내 항 모기 매개 바이러스(뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아) 항체가 결합하고 상기 검체전개액에 의해 축합 패드로부터 분리된 금 축합체가 추가로 결합하여, 금-단리된 펩타이드(축합 패드)-검체내 항 모기 매개 바이러스(뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아) 항체 복합체를 형성한 다음, 상기 복합체에 포함된 시료로부터 유래된 항체가 검사선 1 또는 2와 결합하고, 결합된 부위에서 금 입자로 인하여 발색반응이 나타난다.
만일, 상기 시료에 뎅기 바이러스에 대한 항체가 존재하지 않으면, 검사선 1 및 2의 어디에서도 금입자로 인한 발색반응이 나타나지 않고; 상기 시료에 뎅기 바이러스에 대한 IgG 유형의 항체가 존재하면, 검사선 1에서 금입자로 인한 발색반응이 나타나며; 상기 시료에 뎅기 바이러스에 대한 IgM 유형의 항체가 존재하면, 검사선 2에서 금입자로 인한 발색반응이 나타나게 된다.
또한, 상기 시료에 지카 또는 치쿤쿠니아에 대한 항체가 존재하지 않으면, 검사선 어디에도 금입자로 인한 발색반응이 나타나지 않고; 상기 시료에 지카 또는 치쿤쿠니아 바이러스에 대한 IgM 유형의 항체가 존재하면, 검사선에서 금입자로 인한 발색반응이 나타나게 된다.
본 발명의 뎅기 바이러스 신속진단키트를 사용하면, 상기 시료에 뎅기 바이러스에 대한 항체가 존재하는지를 확인할 수 있음은 물론, 상기 시료에 뎅기 바이러스에 대한 항체가 존재하면, 상기 항체의 형태가 IgM인지 아니면 IgG인지를 확인할 수 있다. 뎅기의 진단에서는 감염시기를 결정하는 것이 중요하다. 즉, 어떤 종류의 항체(IgG 또는 IgM)가 존재하는지 여부와 함께 양성/음성을 판단하는 것이다. 초기에 채혈한 혈액에서 뎅기에 대한 IgM과 IgG 항체가 양성인 것은, 최근 수주 내에 뎅기 바이러스에 감염이 되었음을 의미한다. IgG는 양성이지만 IgM은 매우 낮거나 음성인 경우, 과거 감염으로 보여준다. 초기에 채혈한 검체와 2-4주 후에 채혈한 검체에서 IgG 항체의 역가가 4배 또는 그 이상 상승한 경우 최근 감염일 가능성이 있다. IgM과 IgG 항체가 음성인 것은 뎅기 감염이 아니며 다른 원인으로 인한 증상일 가능성이 있거나, 또는 항체가 측정하기에는 너무 낮은 경우이다. 따라서 뎅기 감염의 가능성은 아직 남아있으며 이는 바이러스 노출 초기에 측정하여 측정 가능한 수준의 항체를 생성하지 못했기 때문이다.
또한, 본 발명의 지카 또는 치쿤쿠니아 바이러스 신속진단키트를 사용하면, 상기 시료에 지카 또는 치쿤쿠니아 바이러스에 대한 항체가 존재하는지를 확인할 수 있다. 지카, 치쿤구니아의 진단은 현증을 진단하는 것이 중요하다. 따라서 지카와 치쿤구니아는 각 바이러스에 대한 IgM 항체 존재 여부를 확인할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 제공된 혈액을 이용하여 본 발명의 키트를 이용한 시험을 수행한 결과, 민감도가 뎅기 IgG 양성 검체에 대해서는 96.7%, 뎅기 IgM 양성 검체에 대해서는 96.5%, 특이도는 뎅기 IgG 양성 검체에 대해서는 100%, 뎅기 IgM 양성 검체에 대해서는 100%임을 확인하였다. 또한, 지카 IgM 양성 검체에 대해서는 민감도가 96.7%, 특이도가 98.7%이며, 치쿤구니아 IgM 양성 검체에 대해서는 민감도가 97.1%, 특이도가 98%인 매우 뛰어난 결과를 확보하였다(표 1).
또한, 타사 제품과의 비교 실험을 수행한 결과, 월등한 민감도를 나타냄을 확인하였다(도 6).
상기 결과는 본 발명의 단리된 펩타이드가 뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아 바이러스에 특이적인 펩타이드로서 진단시 교차반응없이, 즉, 다른 모기 매개 바이러스를 검출하지 않고 원하는 바이러스만을 특이적으로 높은 민감도로 검출할 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 상기 신속진단키트를 이용하여 모기 매개 바이러스를 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 모기 매개 바이러스의 일부 펩타이드 자체를 검체 내의 항체와 결합시켜서 혈액내의 항체를 측정하는 기술로서 기존의 재조합단백질이나 바이러스-유사 입자(VLP, virus-like particle)을 이용하는 것보다 훨씬 더 예민하게 측정할 수 있도록 한다. 또한, 상기 단리된 펩타이드를 사용할 경우, 뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아 바이러스의 감염 진단시 교차반응이 일어나지 않아, 항체 진단키트의 민감도와 정확도를 획기적으로 높이는 데에 특징이 있다.
도 1은 뎅기 바이러스와 지카 바이러스의 다중서열분석을 통한 특이 서열 선정을 나타내는 것이다
도 2는 뎅기, 지카, 치쿤쿠니아 바이러스 단백질의 서열의 친수성 분석을 통한 펩타이드 서열의 선정을 나타내는 것이다.
도 3은 펩타이드 서열을 이용한 혈청진단 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 모기 매개 바이러스 진단용 키트를 도식화한 것이다.
도 5는 뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아의 양성 검체를 이용한 교차반응을 확인한 도이다.
도 6은 타사 제품과의 민감도를 확인한 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 뎅기, 지카, 치쿤구니아 바이러스의 서열분석 및 감염 진단용 펩타이드 선정
실시예 1-1. 뎅기, 지카, 치쿤구니아 바이러스의 서열분석
미국 국립생물정보센터(www.ncbi.nlm.nih.gov) 로부터 뎅기, 지카 및 치쿤구니아 단백질 서열을 얻었다. 다중서열분석을 통하여 뎅기와 지카에 특이적인 서열을 확인하였다. 구체적으로 항체가 인지하는 항원의 일부분을 항원결정부위(epitope)라 하는데 하나의 항원에는 수많은 항원결정부위가 존재한다. 항원결정부위는 수용성의 항체와 직접 결합하기 때문에 친수성 잔기가 차지하는 비율이 높은 부분에 존재할 가능성이 있으므로, 본 발명자들은 친수성(hydrophilicity) 부분을 분석하여 각 바이러스에만 특이적인 항원결정부위를 예측하였다.
단백질 아미노산의 친수성 부분 중에서 각 바이러스에만 특이적인 서열부분을 펩타이드 항원으로 사용하였으며, 구체적으로, 뎅기 특이서열 2개 (DenV-P1: KGIMQAGKRSLRPQPTELKY (서열번호 1), DenV-P2: LIDGPETAECPNTNRAWNSLEVEDY (서열번호 2))와 지카 특이서열 3개 (ZIKA-P1: SVKNPMWRGPQRLPVPVNELPHGW (서열번호 3), ZIKA-P2: AKTNNSFVVDGDTLKECPLEHR (서열번호 4), ZIKA-P3: YSLECDPAVIGTAVKGREAAHSDLGYWIESEKNDTWR (서열번호 5)) 였다. 치쿤구니아는 단백질 아미노산의 친수성 분석을 통한 항원결정부위 예측결과를 통하여 6개(CKIK-P1: PMFEVEPRQVTSNDHANAR (서열번호 6), CKIK-P2: QEIDPDSTILDIGSAPARRMMS (서열번호 7), CKIK-P3: MRSAEDPERLAN (서열번호 8), CKIK-P4: RKLASAAGKVLDRNISGKIGDL (서열번호 9), CKIK-P5: EVMAVPDTETPTFC (서열번호 10), CKIK-P6: MAGAYPSYSTNWADEQVLK (서열번호 11))의 특이서열을 선정하여, 이하의 실험에서 사용하였다.
실시예 1-2. Peptide 항원을 이용한 혈청 진단 (ELISA)
실시예 1-1에서 준비된 뎅기 특이서열 2개 (DenV-P1, DenV-P2), 지카 특이서열 3개 (ZIKA-P1, ZIKA-P2, IKA-P3) 치쿤구니아 특이서열 6개(CKIK-P1, CKIK-P2, CKIK-P3, CKIK-P4, CKIK-P5, CKIK-P6) 펩타이드(펩트론, 대한민국)를 ELISA로 분석하였다. 구체적으로, 상기 펩타이드 항원은 PBS를 이용하여 5㎍/ml이 되도록 희석하였고, 96 well plate (Nunc, Denmark)의 각 well에 각 종류의 펩타이드를 100μl/well의 농도로 코팅하였다.
상기 well plate는 4℃에서 하루 동안 보관하였고, PBS-T (1X PBS + 0.1% Tween-20) 300μl로 3번 세척한 후, 5% BSA가 첨가된 PBS로 한 시간 동안 상온에서 차단하였고, PBS-T로 다시 3번 세척하였다.
진단을 위한 뎅기 시료는 정상 검체 10개와 감염 검체 10개의 혈청을 이용하였다. 이의 혈청을 PBS로 1:50으로 희석하여 100μl/well의 농도로 상온에서 1시간 동안 반응시켰고, PBS-T로 3번 세척하였다. 1:1000으로 희석된 HRP-접합된 염소 항-사람 IgG (Sigma, USA)를 2차 항체로 사용하여 반응시켰다. 2차 항체도 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, PBS-T로 3회 세척하였다. 결합된 2차 항체의 검출은 TMB substrate (BioFX, SurModics, USA)로 10분간 상온에서 반응시킨 후, 1N HCl를 50μl/well로 투여하여 반응을 종료 후에 450nm로 측정하여 반응성을 관찰하였다.
그 결과, 뎅기는 2번 (DenV-P2) 펩타이드를 사용하였을 때, 지카는 1번(ZIKA-P1), 2번(ZIKA-P2)과 3번(ZIKA-P3) 펩타이드를 함께 사용하였을 때, 치쿤구니아는 4번(CKIK-P4) 펩타이드를 사용하였을 때 효과적으로 감염진단이 가능한 것을 확인할 수 있다(도 3).
실시예 2: 뎅기, 지카 및 치쿤구니아 바이러스 항체 진단용 신속 면역크로마토그래피 진단 키트의 제조
실시예 2-1. 스트립 제조 및 진단키트의 구성
도 4와 같이 스트립의 아래쪽으로부터 완충용액이 처리된 버퍼패드; 뎅기, 지카 또는 치쿤구니아 재조합 항원과 금축합체가 축합된 축합패드; 검체를 주입하는 검체패드; 및 검사선과 대조선이 순서대로 부착/분주되어 있는 멤브레인을 순차적으로 부착시키고 상단에는 흡수패드를 부착시켰다.
상기에서 준비된 스트립을 플라스틱 카세트에 장착하고 조립을 하여 진단키트를 완성하였다.
실시예 2-2: 모기 매개 바이러스 진단용 검사선 및 대조선에 항체 분주
항-사람 IgG-단클론 항체와 항-사람 IgM-단클론 항체를 준비하여, 니트로셀룰로오스 멤브레인에 0.5 ~ 4.0 mg/㎖의 농도로 검사선 1(항 사람 IgG)과 검사선 2(항 사람 IgM) 부위에 분주를 하였다. 또한, 멤브레인의 대조선 위치에는 산양 항 생쥐 IgG 다클론 항체를 Arista Biologicals Inc.(미국)로부터 구입하여 1.0 mg/㎖의 농도로 PBS로 희석하여 분주하였다.
실시예 2-3: 모기 매개 바이러스 진단용 금 축합체 및 축합 패드 제조
0.02% HAuCl4 용액을 교반 가열하면서 끓기 시작하면 0.2% Sodium citrate 용액을 첨가하여 용액을 환원시켜 금 입자(gold particle)을 제작하였다. 이렇게 제작된 금 입자에 실시예 1에서 선정된 뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아 특이적인 단리된 펩타이드를 금 입자용액 100 ml당 1 mg을 첨가하여 각각 축합시켰다. 축합된 펩타이드-금 축합체를 10,000 g에서 원심분리하여 침전시키고 0.1% BSA를 함유하는 생리식염수(PBS)로 용해하여 OD450 값이 10이 되도록 제조하였다. 이렇게 제조된 용액을 곧바로 0.05% Tween 20이 전처리된 폴리에스테르나 유리패드에 처리하고 건조시켜서 축합 패드를 완성하였다.
실시예 2-4: 버퍼 패드 및 흡수 패드
유리 섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 패드에 0.1 M Tris (pH 8.0)을 처리한 후, 건조하여 버퍼 패드로 사용하였다. 흡수 패드는 코튼 재질의 패드를 별도의 처리 없이 잘라서 사용하였다.
실시예 3: 모기 매개 바이러스 신속 면역크로마토그래피 진단키트의 검사 방법
바이러스 항체가 존재하는 사람의 혈청/혈장 5μl 또는 전형 10μl를 검체주입구에 넣고, 버퍼패드에 반응용액을 3방울(약 100μl) 떨어뜨린다. 그러면, 검액이 혈구분리가 되고, 멤브레인으로 이동하여 반응을 하게 된다.
진단용 키트는 반응용액이 축합패드로 이동하여 펩타이드-금 축합체를 용해시킨 후, 멤브레인으로 이동하여 "펩타이드-금 축합체-검체내 모기 매개 바이러스(뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아) 항체-항 사람 IgG (또는 항 사람 IgM)"와 같은 형태로 반응을 하게 되어 색 띠를 형성하게 된다. 한편, 반응하지 않은 펩타이드-금 축합체는 대조선 부위에 부착되어 있는 항 생쥐 면역글로블린 G와 반응을 하여 색 띠를 나타나게 된다.
실시예 4: 진단적 효능 시험
본 발명품의 진단적 효능 시험(민감도 및 특이도)을 위해서 General Hospital Kuala Lumpur (GHKL, 말레이시아)로부터 혈액 660건(뎅기 IgG 양성 320건, 뎅기 IgM 양성 190건 및 뎅기 음성 150건), Hospital Gaffree e Guinle (리오 데 자네이로, 브라질)로부터 혈액 250건(지카 IgM 양성 150건, 치쿤구니아 IgM 양성 100건), 음성 검체 300건은 단국대학교 병원(천안, 한국)으로부터 제공받았다. 이들 검체들은 모두 ELISA 법으로 양성과 음성으로 확인된 것이다.
이렇게 제공된 혈액을 이용하여 본 발명의 키트를 이용한 시험을 수행하여 표 1에서와 같이 민감도가 뎅기 IgG 양성 검체에 대해서는 96.7%, 뎅기 IgM 양성 검체에 대해서는 96.5%, 특이도는 뎅기 IgG 양성 검체에 대해서는 100%, 뎅기 IgM 양성 검체에 대해서는 100%임을 확인하였다. 또한, 지카 IgM 양성 검체에 대해서는 민감도가 96.7%, 특이도가 98.7%이며, 치쿤구니아 IgM 양성 검체에 대해서는 민감도가 97.1%, 특이도가 98% 인 매우 뛰어난 결과를 확보하였다(표 1).
Dengue IgG/IgM Zika IgM Chikungunya IgM
민감도 IgG : 96.7% IgM : 96.5% 민감도 96.7% 민감도 97.1%
특이도 IgG : 100% IgM : 100% 특이도 98.7% 특이도 98.0%
검출한계 IgG : 1.1s/CO IgM : 1.2s/CO 검출한계 3.41s/CO 검출한계 1.25s/CO
이들 결과는 바이러스 감염간의 교차반응을 보이지 않았으며, 국제적으로 현재까지 보고된 지카 신속진단키트들 중에서 가장 우수한 결과이다.
실시예 5: 타사 제품과의 민감도 확인
본 연구를 통하여 개발한 키트의 민감도를 확인하고자 타사 제품과 비교실험을 수행하였다. 구체적으로 뎅기 IgG/IgM 키트와 타사 제품(SD)을 비교시 동등 이상의 민감도를 나타내었다. 특히 IgM 항체 검출에서 월등한 분석능을 확인할 수 있었다. 치쿤구니아 IgM 키트에서도 타사 제품(CTK, J.Mitra)과 비교 시 동등 이상의 민감도를 나타내었다(도 6).
상기 결과는 본 발명의 단리된 펩타이드가 뎅기, 지카 또는 치쿤쿠니아 바이러스에 특이적인 펩타이드로서 진단시 교차반응없이, 즉, 다른 모기 매개 바이러스를 검출하지 않고 원하는 바이러스만을 특이적으로 높은 민감도로 검출할 수 있음을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> GenBody Inc. <120> Peptides for diagnosis of mosquito-borne viruses and uses thereof <130> KPA170715-KR-D1 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DenV-P1 <400> 1 Lys Gly Ile Met Gln Ala Gly Lys Arg Ser Leu Arg Pro Gln Pro Thr 1 5 10 15 Glu Leu Lys Tyr 20 <210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DenV-P2 <400> 2 Leu Ile Asp Gly Pro Glu Thr Ala Glu Cys Pro Asn Thr Asn Arg Ala 1 5 10 15 Trp Asn Ser Leu Glu Val Glu Asp Tyr 20 25 <210> 3 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZIKA-P1 <400> 3 Ser Val Lys Asn Pro Met Trp Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro 1 5 10 15 Val Asn Glu Leu Pro His Gly Trp 20 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZIKA-P2 <400> 4 Ala Lys Thr Asn Asn Ser Phe Val Val Asp Gly Asp Thr Leu Lys Glu 1 5 10 15 Cys Pro Leu Glu His Arg 20 <210> 5 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZIKA-P3 <400> 5 Tyr Ser Leu Glu Cys Asp Pro Ala Val Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly 1 5 10 15 Arg Glu Ala Ala His Ser Asp Leu Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys 20 25 30 Asn Asp Thr Trp Arg 35 <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CKIK-P1 <400> 6 Pro Met Phe Glu Val Glu Pro Arg Gln Val Thr Ser Asn Asp His Ala 1 5 10 15 Asn Ala Arg <210> 7 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CKIK-P2 <400> 7 Gln Glu Ile Asp Pro Asp Ser Thr Ile Leu Asp Ile Gly Ser Ala Pro 1 5 10 15 Ala Arg Arg Met Met Ser 20 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CKIK-P3 <400> 8 Met Arg Ser Ala Glu Asp Pro Glu Arg Leu Ala Asn 1 5 10 <210> 9 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CKIK-P4 <400> 9 Arg Lys Leu Ala Ser Ala Ala Gly Lys Val Leu Asp Arg Asn Ile Ser 1 5 10 15 Gly Lys Ile Gly Asp Leu 20 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CKIK-P5 <400> 10 Glu Val Met Ala Val Pro Asp Thr Glu Thr Pro Thr Phe Cys 1 5 10 <210> 11 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CKIK-P6 <400> 11 Met Ala Gly Ala Tyr Pro Ser Tyr Ser Thr Asn Trp Ala Asp Glu Gln 1 5 10 15 Val Leu Lys

Claims (9)

  1. 서열번호 4 또는 서열번호 5로 구성된, 지카 바이러스 특이적인 단리된 펩타이드.
  2. 서열번호 3으로 구성된 펩타이드, 서열번호 4로 구성된 펩타이드 및 서열번호 5로 구성된 펩타이드 중에서 선택된 2 이상의 펩타이드를 포함하는 지카 바이러스 감염 여부 진단용 조성물.
  3. 제1항의 펩타이드 또는 제2항의 조성물을 포함하는, 지카 바이러스 감염 여부 진단을 위한 신속진단키트.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 신속진단키트는 완충용액을 포함하는 버퍼패드; 축합패드; 검체 패드; 검사선 및 대조선이 고정화된 멤브레인; 및 흡수패드를 포함하는, 신속진단키트.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 신속진단키트의 축합 패드는 단리된 펩타이드가 포함되어 있는 것인, 신속진단키트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 단리된 펩타이드는 금 축합체와 축합되어 있는 것인, 신속진단키트.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 멤브레인은 검사선에 항-사람 IgG 또는 항-사람 IgM 단클론 항체가 고정화되어 있는 것인, 신속진단키트.
  8. 제3항에 있어서,
    상기 신속진단키트는 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 형태인 것인, 신속진단키트.
  9. 제3항의 신속진단키트를 이용하여 지카 바이러스 감염 여부 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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미래창조과학부 보도자료 '혈액으로 확인하는 지카바이러스 진단키트 개발' (2016.06.03.)*
솔젠트, 미래창조과학부 과제 최종보고서 (2017-05) '지카, 뎅기열, 치쿤구니아 바이러스 감별진단 키트 개발'
최재원 등, 한국콘텐츠학회 종합학술대회 논문집, p109-110 (2017.05.)*

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