KR102467073B1 - 코로나바이러스에 대한 혈액 중의 항체 검출용 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 코로나바이러스에 대한 항체를 검출할 수 있는 키트에 관한 것이다. 구체적으로, COVID-19의 원인 바이러스인 SARS-CoV-2에 대한 항-인간 IgG 및 항-인간 IgM를 혈액으로부터 신속하게 검출할 수 있는 키트에 관한 것이다.

Description

코로나바이러스에 대한 혈액 중의 항체 검출용 키트{Kit for detecting of antibodies in blood to Coronavirus}

본 발명은 코로나바이러스에 대한 항체를 검출할 수 있는 키트에 관한 것이다. 구체적으로, COVID-19의 원인 바이러스인 SARS-CoV-2에 대한 항-인간 IgG 및 항-인간 IgM을 혈액으로부터 신속하게 검출할 수 있는 키트에 관한 것이다.

코로나 바이러스는 직경 약 80-120nm의 외피를 갖고 단일 가닥 전도 기능(positive-sense) RNA 바이러스로, 가축, 반려 동물, 인간에게 질병을 일으키는 병원균으로 급성 및 만성 질병을 일으킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 코로나바이러스과 (Coronaviridae)는 알파, 베타, 감마 및 델타의 네 가지 속으로 나뉜다. 이 중 알파 코로나 바이러스에 해당하는 인간 코로나 바이러스 229E, NL63, 베타 코로나 바이러스에 해당하는 인간 코로나 바이러스 HKU1, OC43, 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS) 관련 바이러스 등의 5 가지 유형이 인간에게 질병을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다. 코로나 바이러스에 감염된 사람들은 일반적으로 호흡기 증상, 발열, 기침 및 호흡 곤란의 증상을 보이고, 더 심한 경우에는 폐렴, 중증 급성 호흡기 증후군, 신부전 및 사망으로 이어질 수 있다.

한편, 2019 년 신종 코로나 바이러스 (SARS-CoV-2)는 2019 년 중국 우한의 바이러스 성 폐렴 사례로 알려져, 세계 보건기구 (WHO)에서 COVID-19 (Coronavirus infectious disease)로 명명되었다. COVID-19는 호흡기, 코 점막 또는 감염된 사람의 물방울 입을 통해 전염된다. 감염되면 약 2 주 (예상) 잠복기 후 발열, 기침, 호흡기 증상, 폐렴이 주요 증상으로 나타나는 것으로 알려져 있다. COVID-19를 유발하는 SARS-CoV-2 바이러스는 전염성이 매우 강하므로, 조기에 진단하여 격리 등의 조치를 취하는 것이 중요하다. 최근 Real-Time PCT를 이용하여 COVID-19만을 대상으로 감염 여부를 확인하는 검사 방법이 개발되었으나 결과를 얻기까지 약 6 시간이 소요되는 단점이 있다.

본 발명의 목적은 항-인간 IgG-단클론 항체 및 항-인간 IgM-단클론 항체를 동시에 검출 가능하면서도 시인성과 정확성이 개선된 코로나바이러스 항체 검출용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 개체로부터 분리된 혈액, 혈장 또는 혈청을 이용하여 개체에 존재하는 코로나바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 키트를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사람 IgG 또는 사람 IgM; 항-인간 IgG-단클론 항체; 및 항-인간 IgM-단클론 항체가 고정화된 멤브레인을 포함하는 제1 패드; 및 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드(Nucleocapsid) 단백질이 결합된 금 축합체를 포함하는 제2 패드를 포함하는 코로나바이러스 항체 검출용 키트를 제공한다.

또한 개체로부터 분리된 혈액, 혈장 또는 혈청을 상기 키트에 접촉하는 단계를 포함하는, 개체에 존재하는 코로나바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법을 제공한다.

또한, 제1 패드의 멤브레인(membrane)에 사람 IgG 또는 사람 IgM; 항-인간 IgG-단클론 항체; 및 항-인간 IgM-단클론 항체를 고정화하여 제1 패드를 제조하는 단계; 금 입자에 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 및 닭 IgY를 축합하는 단계; 상기 금 축합체를 완충액, 계면활성제, 안정화제, 보존제, 및 방부제를 포함하는 용액에 투석하는 단계; 제2 패드의 멤브레인에 완충액, 계면활성제, 안정화제, 보존제, 및 방부제를 포함하는 용액으로 처리하고, 상기 투석된 금 축합체를 처리한 후 건조하여 제2 패드를 제조하는 단계; 및 상기 제1 패드에 상기 제2 패드를 배치하는 단계를 포함하는 키트의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 키트를 이용하여 SARS-CoV-2에 대한 특정 항체를 15 분 내로 신속하게 검출할 수 있다. 본 발명의 키트는 시료로서 인간의 전혈, 혈장, 또는 혈청 모두 이용 가능하므로, 경제적이고 효율이 높다. 또한 적은 양의 시약과 시료로 특이성과 신뢰도 높게 SARS-CoV-2에 대한 특정 항체를 검출할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 시인성이 뛰어나면서도 면역 크로마토그래피 분석법의 고질적 단점인 후크 현상(Hook effect)을 보완하여 향상된 정확성을 갖는다.

또한, 본 발명의 키트는 장기 보관 안정성이 뛰어나고 반응 편차가 적은 장점을 갖는다.

도 1은 본 발명의 키트의 점수(scope)를 매기는 기준이 되는 컬러 스케일을 나타낸 이미지이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

면역 크로마토그래피 분석법은 나노 입자를 이용한 진단 방법으로서 조작이 간편하고, 판정까지 필요로 하는 시간이 5~30분 정도로 비교적 단시간이며, 고가의 장치를 필요로 하지 않는 것으로부터 우수한 간이 진단 수법으로서 임상의 현장에서 많이 사용되고 있다.

그러나, 상기 분석법은 시료 내에 검출하고자 하는 물질(예를 들어, 본원에서는 사람 IgG 및 사람 IgM)의 농도가 과량인 경우 검사선에서의 신호 세기가 오히려 감소하는 후크 현상(Hook effect, 또는 Prozone effect)을 보인다. 따라서 검출하고자 하는 물질이 존재하여 양성임에도, 진단 결과 위음성의 결과가 나타날 수 있는 문제점이 있다.

이에, 본 발명에서는 사람 IgG 또는 사람 IgM; 항-인간 IgG-단클론 항체; 및 항-인간 IgM-단클론 항체가 고정화된 멤브레인을 포함하는 제1 패드; 및 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드(Nucleocapsid) 단백질이 결합된 금 축합체를 포함하는 제2 패드를 포함하는 코로나바이러스 항체 검출용 키트를 제공함으로써 기존 면역 크로마토그래피 분석법의 장점을 가지면서도 상기 문제점을 해결하여 정확성을 개선한 키트를 제공할 수 있다.

본 발명의 일 구체예로 설명하면, 상기 키트는 제1 패드로서 C라인, G라인, M라인 및 가변 대조선 구역을 포함하는 니트로셀룰로오스 막(Nitrocellulose membrane); 제2 패드로서 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 단백질(Nucleocapsid protein, 이하 NP)이 결합된 금 축합체(Conjugated complex) 및 단일 클론 닭 IgY가 결합된 금 축합체를 포함하는 축합 패드(conjugated pad); 시료를 적용하기 위한 시료 패드 (Sample pad); 반응 결과물이 포획되는 흡수 패드(Absorbent pad); 및 상기 패드를 고정하기 위한 판넬로서 PVC 카드로 구성될 수 있다. 여기서 각 패드는 필요에 따라 1 개 이상 배치될 수 있다. 상기 제1 패드에서 C라인, G라인, M라인 및 가변 대조선에는 각각 단일 클론 항-닭 IgY, 단일 클론 항-인간 IgG, 단일 클론 항-인간 IgM, 및 인간 IgG 또는 인간 IgM이 코팅되어 있으므로, 축합 패드로부터 로딩되는 인간 IgG, 인간 IgM 및 닭 IgY와 면역 복합체를 형성하여 각 라인이 시각화 될 수 있다.

축합 패드에는 SARS-CoV-2의 NP가 존재하므로, 시료 내 SARS-CoV-2에 대한 IgG 또는 IgM가 특이적으로 복합체를 형성하여 제1 패드를 따라 로딩되고, 닭 IgY는 크로마토그래피가 정상적으로 작동한 지표로서 제1 패드를 따라 로딩되어 시료 내 SARS-CoV-2에 대한 항체 유무와 관계없이 C 라인으로 시각화 된다. 한편, 시료를 로딩하였으나 C 라인이 시각화되지 않는 경우, 이 반응은 거짓 반응(false)으로 분류하여 재시도하여야 한다. 본 발명에서는 C 라인 및 가변 대조선이 존재하기 때문에, 일 구체예에 따른 키트의 반응 결과에 대한 신뢰도를 높일 수 있다.

상기 가변 대조선 구역에는 사람 IgG 또는 사람 IgM이 코팅되어 있어, 시료 내 IgG 및/또는 IgM의 농도가 과량인 경우 면역 복합체를 형성하지 못하고 발생하는 금 축합체와 반응하여 시각화 될 수 있다.

보다 구체적으로 설명하면, 코로나바이러스에 감염되지 않은 경우 키트 내 항-인간 IgG-단클론 항체 및 항-인간 IgM-단클론 항체와 어떠한 반응을 일으키지 않으므로 G 라인 및 M 라인은 시각화 되지 않으며, 로딩된 금 축합체가 가변 대조선의 IgG 또는 IgM과 반응하여 가변 대조선이 시각화된다(음성). 코로나바이러스에 감염되어 인체 내 IgG 및 Ig이 존재하는 경우 면역 복합체가 생성되므로 G 라인 및 M 라인이 모두 시각화되며, 이와 반응하지 못한 일부 금 축합체가 가변 대조선에도 시각화된다(양성). 이는 상호 경쟁적인 반응이므로 G 라인 및 M 라인은 가변 대조선과 진하기가 반대로 나타난다. 만약 체내 IgG 농도 및 IgM 농도가 높은 경우, 후크 현상으로 인해 G 라인 및 M 라인이 음성인 경우에 가까워진다(위음성). 그러나 이 경우 가변 대조선에 시각화 될 금 축합체의 양이 아주 적어지기 때문에 가변 대조선 또한 거의 시각화 되지 않는다. 따라서 가변 대조선을 보고 음성이 아닌 양성(위음성)임을 판단할 수 있다.

(위 모든 경우 키트가 정상 작동하였기 때문에 C 라인 또한 시각화 된다.)

일 구체예에 따른 키트의 반응 결과는 시료 패드에 몇 방울, 예를 들어 10 ul 내지 30 ul, 또는 15 ul 내지 25 ul를 적용하고, 로딩 용액 50 ul 내지 150 ul, 60 ul 내지 120 ul, 또는 80 ul 내지 100 ul를 시료 패드에 추가로 적용한 후 10 내지 15 분 예치한 결과일 수 있다.

상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2일 수 있다. SARS-Cov-2는 코로나바이러스감염증-19 (COVID-19)의 원인이 되는 바이러스로서, 2020년 1월에 최초로 확인된 것으로 GenBank MN908947.3로 정의되는 우한-발생 최초 COVID-19 바이러스 전체 유전자염기서열 정보에 기반한 것일 수 있다.

상기 제1 패드에서 멤브레인(membrane)은 다공성 재질로서, 다공성 알루미나, 다공성 실리케이트, 다공성 합성수지, 니트로셀룰로오스, 폴리비닐리덴 플루이드(PVDF) 또는 이들의 조합이 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 제1 패드의 멤브레인에는 항-닭 IgY 단클론 항체가 추가로 고정화될 수 있다. 이 경우 제2 패드는 닭 IgY가 결합된 금 축합체를 더 포함한다. 단일 클론 항-닭 IgY 항체는 제2 패드로부터 로딩되는 닭 IgY의 금 축합체와 결합하여 C 라인을 가시화하고, 이는 양성 대조군으로서 일 구체예에 따른 키트가 정상적으로 작동함을 의미한다.

상기 제2 패드는 금 축합체 등을 배치시킬 수 있는 멤브레인을 포함하고, 제2 패드의 멤브레인은 예를 들어 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르 또는 이들의 조합일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 SARS-CoV-2의 NP는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시된다. 본 발명자들은 키트의 신뢰도를 향상시키기 위해 보다 높은 특이성과 민감도를 보이는 NP를 스크리닝 하였고, 서열번호 1의 아미노산 서열이 가장 일관된 반응성을 보이는 것으로 평가되었다. 그러나 본 발명의 키트에는 다양한 서열의 NP를 적용할 수 있고, 키트의 반응 효율을 위해서 상기 NP 단백질 또는 이의 절편은 500 개 이하, 구체적으로 450 개 이하, 보다 구체적으로 400개 내지 450개의 아미노산으로 이루어진 것이 바람직할 수 있다.

상기 키트는 별도의 용기, 시료를 채취하기 위한 모세관 튜브 등을 더 포함할 수 있고, 로딩 용액이나 검체를 흡수할 수 있는 흡수 패드, 시료를 적용하기 위한 시료 패드, 로딩 용액이나 검체의 유출을 막기 위한 하부 패드, 하우징 등을 더 포함할 수 있다. 상기 흡수 패드 및 시료 패드는 상기 제1 패드 및 제2 패드와 밀접하게 접촉하거나 연결된 것일 수 있다. 구체적으로 제1 패드의 한 쪽 면에 제2 패드가 접촉하거나 연결되고, 반대 쪽 면에 흡수 패드가 위치하고, 제2 패드의 한 쪽 면에 시료 패드가 접촉하거나 연결되어 시료를 시료 패드에 적용하면 순차적으로 제2 패드, 제1 패드, 및 흡수 패드를 따라 로딩 용액 및 검체 시료가 이동할 수 있다.

상기 흡착 패드는 과량의 시료 또는 로딩 용액을 흡수할 수 있는 재질로서 면, 액체 흡수성 겔, Cytocep 1662 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 시료 패드는 시료와 이어서 적용하는 로딩 용액을 빠르게 흡수하여 다음 패드에 전달할 수 있는 재질로서, 예를 들어 유리 섬유, 면, 셀룰로오스, 또는 이들의 조합을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 금 축합체는 금 입자에 상기 SARS-CoV-2의 NP 또는 닭 IgY를 각각 축합시킨 것으로서, 로딩 용액과 동일한 조성의 용액으로 투석한 것으로 제2 패드에 적용된 것일 수 있다. 금 축합체를 제조 직후의 상태로 제2 패드에 적용하는 경우 장기 보관 안정성과 반응성이 저하될 수 있다.

상기 키트는 로딩 용액을 더 포함할 수 있다. 상기 로딩(loading) 용액은 시료 패드로부터 시료를 축합 패드인 제2 패드로 이송하고, 상기 제2 패드에서 생성된 면역 복합체가 제1 패드의 막을 따라 흡수 패드까지 이송되도록 한다. 로딩 용액은 완충액, 계면활성제, 안정화제, 보존제, 및 방부제를 포함하는 것일 수 있다. 상기 완충액은 붕산염, Tris, 인산염 완충 용액, 또는 이들의 조합을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 계면활성제는 챕스 (Chaps), 설포베타인 타입 계면활성제, 트리톤 (triton), 트윈 (Tween) 또는 이들의 조합일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 안정화제는 카제인염, 수크로오스, 트레할로오스, 아르기닌 또는 이들의 조합일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 보존제는 당류, 당알코올류, 소르브산, 벤조산, 프로피온산 칼슘, 소듐아지드(sodium azide), 아황산염, EDTA 또는 이들의 조합이 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 방부제는 proclin 또는 티모라졸일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

일 구체예에서, 상기 로딩 용액은 0.2 내지 0.5 M 완충액, 0.05w/w% 내지 0.5w/w%의 계면활성제, 0.5w/w% 내지 1.5w/w%의 안정화제, 0.01w/w% 내지 0.5w/w% 보존제, 및 0.01w/w% 내지 0.1w/w% 방부제를 포함하는 수용액일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 로딩 용액은 Tris 0.2 내지 0.5 M, Tween-20 0.05w/w% 내지 0.5w/w%, 카제인나트륨 0.5w/w% 내지 1.5w/w%, 소듐아지드 0.01w/w% 내지 0.5w/w%, Proclin 300 0.01w/w% 내지 0.1w/w% (pH 6.0 내지 7.0)을 포함하는 수용액일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 로딩 용액은 0.4 M의 Tris (pH 6.5), 0.2%의 Tween-20, 1%의 카제인나트륨, 0.1%의 소듐아지드(sodium azide), 및 0.01%의 Thimerosal을 포함하는 수용액일 수 있다.

상기 금 축합체, 및 제2패드는 로딩 용액과 동일한 조성의 용액으로 처리된 것이 바람직할 수 있다. 로딩 용액과 동일한 조성으로 처리된 경우 혈액과 같은 검출이 까다로운 시료에 대해서도 로딩 효율이 더욱 증가하는 효과를 얻을 수 있고, 장기 보관 안정성 및 반응 안정성 효과를 달성할 수 있다.

상기 키트는 2±2℃, 22±2℃, 또는 30±2℃의 온도 조건에서 3개월 이상, 바람직하게는 26 개월 내 반응 안정성을 갖는 것일 수 있다. 상기 반응 안정성은 시료를 실온에서 시료 패드에 적용하여 로딩한 후 15 분 내 C라인에 반응 결과가 나타나는 것을 의미할 수 있다. 또한, 상기 키트는 55±1 ℃, 75±15 RH%의 밀봉 조건에서 5 주 이상, 10 주 이상, 15 주 이상, 또는 19 주 이상 반응 안정성을 갖는 것일 수 있다.

상기 키트의 제1 패드에 코팅된 항체는 C라인, M라인, G라인 및 가변 대조선 각각 0.8 ± 0.16 ㎍이고, SARS-CoV-2에 대한 IgG의 경우 약 3.75 ㎍/ml 이상, IgM의 경우 약 9.37 ㎍/ml 이상의 항체를 검출할 수 있다.

상기 범위 미만으로 코팅될 경우 반응 결과선이 명확하게 보이지 않아 시인성 및 정확성이 떨어지며, 상기 범위를 초과할 경우 키트의 안정성이 떨어지는 단점이 있다.

일 구체예에 따른 키트는, 증상 발병 7일 이후의 개체에 대해 항체를 검출하기에 적합할 수 있다. 상기 키트는 증상 발병 7일 이후의 개체에 대해 검사하였을 때, 80% 이상의 민감도 및 90 % 이상, 95 % 이상, 또는 97 % 이상의 특이도를 갖는다. 상기 민감도는 real time PCR로 검사하였을 때 양성으로 도출되는 결과 값과 일치하는 수준을 의미하고, 상기 특이도는 real time PCR로 검사하였을 때 음성으로 도출되는 결과 값과 일치하는 수준을 의미한다.

상기 키트의 시료 패드에 적용하는 시료는 혈액, 혈장, 또는 혈청일 수 있다. 시료는 반응 결과에 대한 신뢰도를 높이기 위하여 전처리한 것일 수 있다.

상기 전처리는 예를 들어 혈청(serum)을 사용하는 경우, 개체로부터 채취된 혈액을 전혈 (whole blood)을 항응고 시약 없이 30분 간 방치하고, 원심 분리하여 상등액을 수득함으로써 얻을 수 있다. 혈청은 2-8 ℃에 7일 간 냉장보관한 것이 시료로서 바람직할 수 있다.

또한 시료로서 혈장(plasma)을 사용하는 경우, 항응고 시약을 혼합하고 원심 분리하여 상등액을 수득함으로써 혈장을 얻을 수 있다. 혈장은 2-8 ℃에 7일 간 냉장보관 한 것이 시료로서 바람직할 수 있다.

또한 시료로서 전혈 (whole blood)로서 사용하는 경우, 채취하자 마자 곧바로 시험에 적용할 수 있다. 상기 전혈은 정맥 혈액을 이용할 수 있고, 손가락 끝에서 채취한 소량의 혈액을 이용할 수 있다. 정맥 혈액은 채취 후 항응고 시약을 혼합하고, 2-8 ℃에 1-2일간 보관한 것으로서, 용혈되지 않은 것이 시료로서 바람직할 수 있다.

상기 항-응고제는 헤파린, EDTA, 구연산나트륨, 와파린, 쿠마딘, 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다

본 발명의 다른 양상은 상기 키트에 개체로부터 분리된 혈액, 혈장 또는 혈청을 접촉하는 단계를 포함하는, 개체에 존재하는 코로나바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 검출 방법은 개체의 코로나바이러스 질환의 치료 수준을 결정하는데 정보를 제공할 수 있다. 상기 개체는 포유동물 또는 인간일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은, 제1 패드의 멤브레인(membrane)에 사람 IgG 또는 사람 IgM; 항-인간 IgG-단클론 항체; 및 항-인간 IgM-단클론 항체를 고정화하여 제1 패드를 제조하는 단계; 금 입자에 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 및 닭 IgY를 축합하는 단계; 상기 금 축합체를 완충액, 계면활성제, 안정화제, 보존제, 및 방부제를 포함하는 용액에 투석하는 단계; 제2 패드의 멤브레인에 완충액, 계면활성제, 안정화제, 보존제, 및 방부제를 포함하는 용액으로 처리하고, 상기 투석된 금 축합체를 처리한 후 건조하여 제2 패드를 제조하는 단계; 및 상기 제1 패드에 상기 제2 패드를 배치하는 단계를 포함하는 키트의 제조방법을 제공한다.

상기 제1 패드의 멤브레인에 각 항체를 코팅할 때는, 수평균분자량 30,000 내지 50,000의 폴리락트산 20 내지 40 중량부, 75 내지 85w/w% 에탄올 수용액 55 내지 75 중량부, 및 1%의 안정화제 수용액 2 내지 7 중량부를 혼합한 것을 항체를 코팅할 위치에 적용하여 인쇄하고, 건조한 후, 각 항체 수용액을 적용하고 축합 시약, 예를 들어, EDC(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide)를 적용함으로써 멤브레인에 항체를 고정시킬 수 있다. 이러한 방법을 취하는 경우, 항체가 일정한 방향으로 멤브레인에 고정되면서 키트 간의 반응 편차를 줄이고, 적은 양의 항체를 사용하여 고효율의 반응성을 얻을 수 있다. 상기 폴리락트산의 수평균분자량은 30,000 내지 50,000인 것이 바람직하고, 상기 분자량이 30,000 이하인 경우 항체가 불특정한 방향으로 고정될 수 있고, 50,000 이상인 경우 항체의 고정력이 감소할 수 있다.

금 축합체는 사용할 로딩 용액과 동일한 조성의 용액으로 투석하여 준비한다. 투석 단계가 없는 경우 로딩 용액의 성분에 따라 반응 편차가 발생할 수 있고, 금 축합체에 축합된 물질은 단백질이므로 건조하는 단계에서 안정성을 상실하거나, 용액 성분이 급격하게 변함에 따라 변성이 발생할 수 있다. 이를 차단하기 위해 투석 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 금 축합체를 투석하는 이유와 동일한 이유로, 제2 패드의 멤브레인도 로딩 용액과 동일한 성분으로 처리한 후 투석된 금 축합체 용액을 처리하여 건조하는 것이 바람직하다.

이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 본 발명에 따른 코로나바이러스 항체 검출용 키트의 제조

제1패드인 니트로셀룰로오스 막에 항-인간 IgG (clone No.: 8A#15-3, SD Biosensor, Korea), 항-인간 IgM(clone No.: #78-7, SD Biosensor, Korea), 항-닭 IgY (clone No.: #3G7-1B2, SD Biosensor, Korea) 및 인간 IgG(Human IgG1 Anti SARS-CoV-2 Spike (S1) Antibody, Clone: CR3022, Biovendor, Czech Republic)를 코팅하였다. 구체적으로 니트로셀룰로오스 막에 수평균분자량 30,000 내지 50,000의 폴리락트산 30 중량부, 80w/w% 에탄올을 65 중량부, 및 1%의 카제인나트륨 5중량부를 혼합한 것을 이용하여 각 라인 위치에 적용하고 40℃에서 약 10 분 간 건조하고, 각 1 ㎍/㎕의 항체 수용액을 같은 라인 위치에 1㎕을 적용한 후 항체 수용액이 막에 흡수되면 EDC(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide)를 적용하여 각 밴드 위치에 항체를 고정시켰다. 그런 다음, 니트로셀룰로오스 막을 증류수에 2-3회 세척하여 잔여물을 제거하고 건조하였다.

금 축합체는 콜로이드 입자로서 하기와 같이 제조하였다. 0.1% HAuCl4용액을 교반 가열하면서 끓기 시작하면 0.5% 소듐시트르산 용액을 첨가하여 용액을 환원시켜 금 입자를 만들고, 여기에 SARS-CoV-2의 NP(서열번호 1) 및 닭 IgY(AC146, Sigma-aldrich)를 금 입자용액 100㎖당 각각 1mg을 첨가하여 축합시켰다. 축합된 단클론항체-금 축합체를 10,000g에서 원심분리하여 침전시키고 0.1% BSA를 함유하는 생리식염수(PBS)로 용해하여 OD450값이 10이 되도록 만들어 보관하였다.

축합 패드(Conjugated pad)인 제2패드는 하기와 같이 제조하였다. 구체적으로, 폴리에스테르 막을 준비하여 제1패드와 유사한 폭으로 절단하고, 0.4 M의 Tris (pH 6.5), 0.2%의 Tween-20, 1%의 카제인나트륨, 0.1%의 소듐아지드(sodium azide), 및 0.05%의 Proclin 300으로 제조된 용액에 담궈 적셔 두었다. 상기 제조된 금 축합체는 상기 용액과 동일한 조성의 용액에 투석하여 준비하였다. 그런 다음, 상기 폴리에스테르에 상기 투석한 금 축합체를 처리하고 건조하여 제2패드를 완성하였다. 그런 다음, 흡착 패드로 Cytocep 1662, 시료 패드로 유리 섬유로 이루어진 막을 준비한 후 각 패드를 배치하여 키트를 완성하였다.

시험예 1: 코로나바이러스 항체 검출용 키트의 결과 분석

상기 제조예 1에서 제조한 키트를 5개 준비하고, 0.1% BSA를 함유하는 생리식염수(PBS)에 사람 IgG의 농도가 각각 0㎍/ml, 1.87㎍/ml, 3.75㎍/ml, 7.5㎍/ml 및 50㎍/ml가 되도록 제조한 용액을 각각 로딩을 개시한 후 C 라인, 가변 대조선 및 G 라인의 결과를 도 2의 pantone 2425C의 컬러 스케일에 기준하여 결정하였다. 점수를 분류하는 기준은 아래 표 1과 같으며, 각 키트의 실험 결과는 하기 표 2로 나타내었다. (본 시험예에서는 편의상 IgG만을 포함하여 로딩을 개시하였으므로 M 라인의 경우 모든 키트에서 시각화되지 않았다. 따라서 M 라인의 결과는 하기 표에서 배제하였다.)

분류	Scope
강한 양성	3+
중간 양성	2+
약한 양성	1+
음성	-

사람 IgG의 농도(㎍/ml)	Color Scope			감염 여부
	C 라인	가변 대조선	G 라인
0	3+	3+	-	음성
1.87	3+	3+	1+	약한 양성
3.75	3+	1+	3+	양성
7.5	3+	2+	3+	양성
50	3+	-	1+	양성(위음성)

표 2에 나타난 바와 같이, 사람 IgG의 농도가 아주 높을 경우(50㎍/ml), 후크 현상이 나타나 G 라인의 컬러 스케일이 사람 IgG의 농도가 0이거나 낮은 경우와 비슷하게 나타났다(위음성). 그러나 상기 표의 가변 대조선의 결과에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 키트는 사람 IgG의 농도가 높은 경우 가변 대조선이 연하게 나타나므로 이를 통해 음성 혹은 약한 양성인 경우와 구별이 가능하다.

시험예 2: 제1 패드의 항체 코팅량 결정

상기 제조예 1에서, 제1 패드에 각 0.5㎍/㎕의 항체 수용액을 같은 라인 위치에 1㎕을 적용한 것을 제외하고는 제조예 1 과 동일하게 비교예 1을 제조하였고, 같은 방법으로 각 2㎍/㎕의 항체 수용액을 같은 라인 위치에 1㎕을 적용하여 비교예 2를 제조하였다.

비교예 1 및 2에 대하여, 위 시험예 1에서와 같이 0.1% BSA를 함유하는 생리식염수(PBS)에 사람 IgG의 농도가 3.75㎍/ml되도록 제조한 용액을 각각 로딩을 개시하였다. 비교예 1의 경우 로딩된 사람 IgG의 농도가 실시예 1과 같음에도, C 라인 및 G 라인의 컬러 스케일이 2+로 낮게 나타났다. 비교예 2의 경우 실시예 1과 동일하게 나타났으나, 이 경우 장기 보관 안정성이 떨어지는 단점이 있다.

시험예 3: 코로나바이러스 항체 검출용 키트의 효능 검증

임상 시료를 이용하여 실시예 1의 키트의 코로나바이러스 항체 검증 효능을 확인하였다.

임상 시험은 분당 서울대학교 병원의 의학과에서 진행하였다. Real time PCR (PowercheckTM 2019-nCoV Real time PCR kit, Emergency Use Approved)로 확인된 양성의 환자 30 명의 혈청과 음성(무감염자)의 혈청 75 개를 확보하였다. 대조군 라인 (C line)은 스코어 2+ 초과에 BG 값은 Perfect clear이고, 15 분 내 크로마토그래피를 완료할 수 있는 경우 정상 값으로 평가하였고, 그 외 스코어를 매기는 기준은 표 1과 동일하게 설정하였다.

그 결과를 하기의 표 3 내지 표 5에 나타내었다. 표 3은 양성 환자의 발병 7일 후 혈청을 대상으로 시험한 것이고, 표 4는 양성 환자의 발병 14일 후 혈청을 대상으로 시험한 것이고, 표 5는 무감염자 일반인의 혈청 75 개를 대상으로 시험한 것이다. 증상 발병 후 2 일 내에는 IgM 양성을 볼 수 있는 것으로 평가되고, 7일 이후에는 민감도는 80.95%, 14일 이후에는 민감도가 81.82%에 달하는 것으로 평가되었다. 한편, 무감염자를 대상으로 한 시험에서는 거의 반응이 나타나지 않아 97 %이상의 신뢰도를 보였다.

증상 발병 7일 후 테스트 결과	PCR
	양성	음성	합계
양성	17	0	17
음성	4	0	4
합계	21	0	21
민감도	80.95% (17/21, 95% CI, 58.09% - 94.55%)

증상 발병 14일 이후 테스트 결과	PCR
	양성	음성	합계
양성	9	9
음성	2	0	2
합계	11	0	11
민감도	81.82% (9/11, 95% CI 48.22% - 97.72%)

특이도 평가	PCR
	양성	음성	합계
양성	0	2	0
음성	0	73	0
합계	0	75	0
민감도	97.33% (73/75, 95% CI 90.70% - 99.68%)

*CI(confidence interval): 신뢰도

시험예 4: 코로나바이러스 항체 검출용 키트의 선택성 확인

본 발명의 키트가 다른 약물이나 화학 성분에 따른 교차 반응성은 없는지 확인하였다. 구체적으로, 환자의 혈액에 존재할 가능성이 높은 약물로 NSAID인 아세트아미노펜, 항생제인 에리스로마이신, 카페인, 에탄올, 콜레스테롤, 및 빌리루빈을 준비하고, 이를 상기 시험예 1에서 얻은 환자 혈청 중 7개를 선정하여 양성 대조군로 아무 처리를 하지 않은 시료 하나만을 제외하고 각 약 1%로 혼합하여 시험군을 제조한 후 시험예 1과 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과를 모든 시료에서 scope +2 수준의 양성 결과가 관찰되었고, 콜레스테롤 및 빌리루빈이 포함된 시료는 아무 처리를 하지 않은 양성 대조군에 비해 발현 속도가 늦은 편이었으나, 모두 10분이 지난 시점에서 양성 대조군과 구별이 불가한 정도로 진한 밴드가 관찰되어 15 분 내에 모두 안정적으로 항체를 검출할 수 있음을 확인하였다.

이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

SEQUENCE LISTING <110> DONGEUI UNIVERSITY <120> Kit for detecting of antibodies in blood to Coronavirus <130> WP213030 <160> 1 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 418 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SARS CoV-2 Nucleocapsid protein <400> 1 Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr Phe 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg Ser 20 25 30 Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr 35 40 45 Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu Lys 50 55 60 Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro Asp 65 70 75 80 Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly Gly 85 90 95 Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu 100 105 110 Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly 115 120 125 Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His 130 135 140 Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu 145 150 155 160 Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg 165 170 175 Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser 180 185 190 Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala Arg 195 200 205 Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp 210 215 220 Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln 225 230 235 240 Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys 245 250 255 Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala 260 265 270 Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln 275 280 285 Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala 290 295 300 Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly 305 310 315 320 Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Ala Ala Ile 325 330 335 Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu 340 345 350 Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys 355 360 365 Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg 370 375 380 Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp 385 390 395 400 Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr 405 410 415 Gln Ala

Claims (8)

1. 사람 IgG 또는 사람 IgM; 항-인간 IgG-단클론 항체; 및 항-인간 IgM-단클론 항체가 고정화된 멤브레인을 포함하는 제1 패드; 및
   코로나바이러스의 뉴클레오캡시드(Nucleocapsid) 단백질이 결합된 금 축합체를 포함하는 제2 패드를 포함하고,
   상기 사람 IgG 또는 사람 IgM은 상기 멤브레인의 가변 대조선에 고정화되는 것인, 코로나바이러스 항체 검출용 키트.
2. 제1항에 있어서, 상기 제1 패드의 멤브레인에는 항-닭 IgY 단클론 항체가 추가로 고정화되고, 상기 제2 패드는 닭 IgY 항체가 결합된 금 축합체를 더 포함하는 것인 키트.
3. 제1항에 있어서, 상기 사람 IgG 또는 사람 IgM; 항-인간 IgG-단클론 항체; 및 항-인간 IgM-단클론 항체는 각 0.64㎍ 이상 0.96㎍ 이하로 고정화된 키트.
4. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오캡시드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것인 키트.
5. 제1항에 있어서, 상기 키트는 15 분 내에 항체를 검출할 수 있는 것인 키트.
6. 제1항에 있어서, 상기 키트는 증상 발병 7일 이후의 개체에 대해 항체를 검출하기 위한 것인 키트.
7. 제1 패드의 멤브레인(membrane)에 사람 IgG 또는 사람 IgM; 항-인간 IgG-단클론 항체; 및 항-인간 IgM-단클론 항체를 고정화하여 제1 패드를 제조하는 단계;
   금 입자에 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 및 닭 IgY를 축합하는 단계;
   상기 금 축합체를 완충액, 계면활성제, 안정화제, 보존제, 및 방부제를 포함하는 용액에 투석하는 단계;
   제2 패드의 멤브레인에 완충액, 계면활성제, 안정화제, 보존제, 및 방부제를 포함하는 용액으로 처리하고, 상기 투석된 금 축합체를 처리한 후 건조하여 제2 패드를 제조하는 단계; 및
   상기 제1 패드에 상기 제2 패드를 배치하는 단계를 포함하고,
   상기 사람 IgG 또는 사람 IgM은 상기 제1 패드의 멤브레인의 가변 대조선에 고정화되는 것인, 키트의 제조방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 사람 IgG 또는 사람 IgM; 항-인간 IgG-단클론 항체; 및 항-인간 IgM-단클론 항체는 각 0.64㎍ 이상 0.96㎍ 이하로 고정화된, 키트의 제조방법.

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