WO2020196296A1 - イムノクロマト分析方法及び該方法に使用するテストストリップ - Google Patents

イムノクロマト分析方法及び該方法に使用するテストストリップ Download PDF

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WO2020196296A1
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detected
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cationic
test strip
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加奈子 東
翔平 家治
元喜 森田
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積水メディカル株式会社
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    • G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus

Definitions

  • the present invention relates to an immunochromatographic analysis method for detecting a substance to be detected such as influenza virus and a test strip used for the method.
  • the present invention also relates to a non-specific reaction suppression method in an immunochromatographic analysis method for detecting a substance to be detected such as influenza virus.
  • POCT Point of Care Testing
  • an immunological method for detecting a substance to be detected that causes a disease by using a binding partner that specifically reacts with the substance to be detected is widely used.
  • the immunochromatography method is widely used because it is easy to operate.
  • immunization methods tend to involve non-specific reactions when contaminants such as cross-antigenic bacteria, viruses, and proteins are contained in the sample. Accurate determination may be hindered by such false positive reactions, which is a problem.
  • Patent Document 1 discloses a reagent composition for immunochromatography containing a nonionic surfactant, an N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine buffer, and casein.
  • a nonionic surfactant an N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine buffer
  • casein an N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine buffer
  • An object of the present invention is to provide an immunochromatographic analysis method in which non-specific reactions are suppressed and a test strip used for the method.
  • the present inventors have found that the non-specific reaction can be effectively suppressed by providing the following constitution in the immunochromatographic analysis method of the substance to be detected, and have completed the present invention.
  • the present invention is as follows. ⁇ 1> Immunochromatographic analysis method of a substance to be detected using a test strip containing the following (1) to (3) (1) A sample supply unit that supplies a biological sample that may contain the substance to be detected. Insoluble membrane carrier (3) with at least one detection part containing a cationic substance and a binding partner that immunologically reacts with the substance to be detected. A conjugate in which an immunologically responsive binding partner is immobilized on a labeled substance.
  • the immunochromatographic analysis method according to ⁇ 1> wherein the substance to be detected is a respiratory tract infection virus.
  • the conjugate is contained in the conjugate portion provided between the sample supply unit and the detection unit of (1) or (2), ⁇ 1> to ⁇ 3.
  • the cationic substance is contained in a solid phase antibody coating solution for application to the detection unit when the test strip is prepared at a concentration of 0.05 to 10% by mass, ⁇ 1> to ⁇ 4.
  • the immunochromatographic analysis method according to any one of. ⁇ 6> The immunochromatographic analysis method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the biological sample is respiratory secretions.
  • Test strip for immunochromatography containing the following (1) to (3) (1) A sample pad (2) having a sample supply unit for supplying a biological sample that may contain a substance to be detected.
  • a binding partner that immunologically reacts with a substance to be detected Is a conjugate fixed to the marker body.
  • test strip for immunochromatography according to any one of. ⁇ 12> ⁇ 8> to ⁇ 11, wherein the cationic substance is contained in a solid phase antibody coating solution for coating on a detection unit when the test strip is prepared at a concentration of 0.05 to 10% by mass.
  • the test strip for immunochromatography according to any one of. ⁇ 13> The immunochromatographic test strip according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 12>, wherein the biological sample is a respiratory secretion.
  • the test strip for immunochromatography according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 13>, wherein the substance to be detected is influenza B virus.
  • Non-specific reaction suppression method in the immunochromatographic analysis method of a substance to be detected using a test strip containing the following (1) to (3) (1) A biological sample that may contain the substance to be detected.
  • Sample pad (2) An insoluble membrane carrier (3) having at least one detection unit containing a cationic substance and having a fixed binding partner that immunologically reacts with the substance to be detected.
  • a conjugate in which a binding partner that immunologically responds to the substance to be detected is immobilized on a label.
  • the cationic substance is contained in a solid phase antibody coating solution for coating on the detection unit when the test strip is prepared in an amount of 0.05 to 10% by mass.
  • ⁇ 18> The method for suppressing a nonspecific reaction according to any one of ⁇ 15> to ⁇ 17>, wherein the biological sample is a respiratory secretion.
  • ⁇ 19> The method for suppressing a non-specific reaction according to any one of ⁇ 15> to ⁇ 18>, wherein the substance to be detected is influenza B virus.
  • the cationic substance is L-lysine hydrochloride, hydroxypropyltrimonium hydrolyzed soy protein (trade name: Promois WS-HQ; manufactured by Seiwa Kasei Co., Ltd.), and cocodimonium hydroxypropyl hydrolyzed keratin (trade name: Promois).
  • WK-HCAQ manufactured by Seiwa Kasei Co., Ltd.
  • the immunochromatographic analysis method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, which is selected from the group consisting of combinations thereof.
  • the cationic substance is L-lysine hydrochloride, hydroxypropyltrimonium hydrolyzed soy protein (trade name: Promois WS-HQ; manufactured by Seiwa Kasei Co., Ltd.), and cocodimonium hydroxypropyl hydrolyzed keratin (trade name: Promois).
  • WK-HCAQ manufactured by Seiwa Kasei Co., Ltd.
  • the test strip for immunochromatography according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 14> selected from the group consisting of combinations thereof.
  • the cationic substance is L-lysine hydrochloride, hydroxypropyltrimonium hydrolyzed soy protein (trade name: Promois WS-HQ; manufactured by Seiwa Kasei Co., Ltd.), and cocodimonium hydroxypropyl hydrolyzed keratin (trade name: Promois).
  • WK-HCAQ manufactured by Seiwa Kasei Co., Ltd.
  • the non-specific reaction suppression method according to any one of ⁇ 16> to ⁇ 20>, which is selected from the group consisting of combinations thereof.
  • non-specific reactions in immunochromatographic analysis of the substance to be detected can be effectively suppressed.
  • examples of the substance to be detected include viruses and physiologically active substances such as proteins that can be generally measured by utilizing an antigen-antibody reaction.
  • examples of the virus include influenza viruses such as influenza A virus and influenza B virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, human immunodeficiency virus, and the like.
  • influenza viruses such as influenza A virus and influenza B virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, human immunodeficiency virus, and the like.
  • examples of the protein include human hemoglobin. Examples thereof include hepatitis B virus antibody, hepatitis C virus antibody, and human immunodeficiency virus antibody.
  • a respiratory tract infection virus is preferable as the substance to be detected in the present invention.
  • a respiratory tract infection virus is a virus that causes respiratory diseases.
  • the respiratory infection virus in the present invention is not particularly limited as long as it is a virus that can be detected by utilizing an antigen-antibody reaction, and is a coronavirus such as coronavirus 229E, coronavirus OC43, and coronavirus NL63; A.
  • Influenza virus such as type influenza virus, type B influenza virus, type C influenza virus, parainfluenza virus 1, parainfluenza virus 2, and parainfluenza virus 3; RS virus such as respiratory syncytial virus type A and respiratory syncytial virus type B; adenovirus Reinnovirus; Metapneumovirus; Cytomegalovirus; and Bocavirus.
  • RS virus such as respiratory syncytial virus type A and respiratory syncytial virus type B
  • adenovirus Reinnovirus such as respiratory syncytial virus type A and respiratory syncytial virus type B
  • adenovirus Reinnovirus such as respiratory syncytial virus type A and respiratory syncytial virus type B
  • adenovirus Reinnovirus such as respiratory syncytial virus type A and respiratory syncytial virus type B
  • adenovirus Reinnovirus such as respiratory syncytial virus type A and respiratory syncytial virus type B
  • respiratory organ is a general term for organs related to respiration, and includes organs from the nasal vestibule to the alveoli (lungs) via the nasal cavity, pharynx, larynx, trachea, bronchioles, and bronchioles.
  • biological sample examples of the biological sample used in the present invention that may contain a substance to be detected include substances mainly derived from living organisms (organisms) such as body fluids and extracts obtained by extracting the substances to be detected from them. Be done. Specific examples of the substance derived from a living body (living body) include blood, urine, stool, and respiratory secretions. When the substance to be detected is a respiratory infectious virus, the biological sample includes respiratory secretions, specifically, nasal juice, sputum, saliva, etc. derived from the nostrils, nasal cavities, pharynx, nasopharynx, etc. Is preferable.
  • the above-mentioned biological substance and its extract may be used as a sample as it is, or may be appropriately diluted with a sample diluent to prepare a sample. In addition, a sample that has been appropriately filtered may be used.
  • a cationic substance means a substance that exhibits cationic properties when dissolved or dispersed in water.
  • a cationic surfactant a cationic lipid, a cationic peptide, a cationic amino acid and the like can be used, but it is preferable to use a cationic peptide or a cationic amino acid.
  • a cationic peptide means a peptide that is positively charged as a whole molecule under neutral conditions, for example, conditions that are dissolved or dispersed in water.
  • the cationic peptide can contain a large amount of basic amino acid residues (arginine (Arg), lysine (Lys), or histidine (His)) in the amino acid residues constituting the peptide.
  • the content of the basic amino acid residue is 40% or more, preferably 50% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more with respect to all the amino acid residues constituting the cationic peptide. , Especially preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more.
  • the content of basic amino acid residues is 100%.
  • the content of acidic amino acid residues is added to all the amino acid residues constituting the peptide.
  • the content of acidic amino acid residues is 0%.
  • the cationic peptide is not particularly limited as long as it is a peptide that has a positive charge as a whole under neutral conditions, and for example, a cationized derivative of a proteolytic product derived from a living body, the basic amino acid residue.
  • a cationized derivative of a proteolytic product derived from a living body the basic amino acid residue.
  • Polyarginine, polylysine, polyhistidine, etc. which are the base polymers, can be used.
  • the cationized derivatives of bio-derived proteolytic products derivatives in which a quaternary ammonium group is bonded to the N-terminal of the peptide of bio-derived proteolytic products are particularly preferable, and hydroxypropyltrimonium hydrolyzed soybean protein (trade name: Promois).
  • WS-HQ manufactured by Seiwa Kasei Co., Ltd.
  • cocodimonium hydroxypropyl hydrolyzed keratin trade name: Proteins WK-HCAQ; manufactured by Seiwa Kasei Co., Ltd.
  • salts of cationic peptides can also be used.
  • Promois is a registered trademark.
  • Cationic amino acids mean arginine (Arg), lysine (Lys), and histidine (His). It is preferable to use L-form as the cationic amino acid.
  • salts of cationic amino acids such as hydrochloride can also be used.
  • L-lysine hydrochloride these cationic substances can be used alone or in combination of two or more kinds.
  • L-lysine hydrochloride hydroxypropyltrimonium hydrolyzed soy protein (trade name: Promois WS-HQ; manufactured by Seiwa Kasei Co., Ltd.), cocodimonium hydroxypropyl hydrolyzed keratin (trade name: Promois WK-HCAQ; It is most preferable to use a cationic substance selected from the group consisting of (manufactured by Seiwa Kasei Co., Ltd.) and a combination thereof.
  • the concentration of the cationic substance can be appropriately adjusted according to the type of the cationic substance and the substance to be detected.
  • a solid phase antibody coating solution for coating on the detection part when preparing a test strip For example, a solid phase antibody coating solution for coating on the detection part when preparing a test strip.
  • the concentration of 0.001 to 10% by mass preferably 0.01 to 10% by mass, more preferably 0.02 to 10% by mass, still more preferably 0.05 to 10 It is by mass, most preferably 0.1 to 10% by mass.
  • the upper limit may be 8% by mass, 5% by mass, 3% by mass, or 2% by mass.
  • a conjugate is a label in which a binding partner that immunologically responds to the substance to be detected is immobilized on the label.
  • the conjugate pad may exist in a state of being impregnated with a pad other than the sample pad, the third pad, and the insoluble membrane (type A), or a part of the sample pad or insoluble. It may be present as a conjugate on a portion of the membrane (type B) or as a separate conjugate reagent to be mixed with a biological sample (type C).
  • a known labeled body can be used as the labeled body used in the present invention.
  • the conjugate preferably has an anti-influenza virus monoclonal antibody immobilized on gold colloidal particles.
  • test strip in which the existence mode of the conjugate is the above type A will be described.
  • the sample pad, the conjugate pad, the third pad, and the insoluble membrane are arranged in this order from the upstream to the downstream in the sample flow direction.
  • Each layer is arranged so as to at least partially overlap the upper and lower layers.
  • a test strip of such an arrangement example is shown in FIG.
  • the first complex is then passed through a porous third pad located in contact with the underside of the conjugate pad and developed into an insoluble membrane.
  • a binding partner that immunologically reacts to the substance to be detected is immobilized on a part of the insoluble membrane.
  • the first complex and the binding partner that immunologically reacts with the substance to be detected are bound by an immune reaction and fixed as the second complex.
  • the immobilized second complex is detected by means for detecting signals such as absorbance, reflected light, fluorescence, and magnetism derived from the conjugate.
  • FIG. 2 shows a test strip of an arrangement example in which a sample supply portion and a conjugate portion are configured as a part of the sample pad.
  • the sample supply section is a site for supplying a sample containing a substance to be detected
  • the conjugate section is a site containing a conjugate
  • the sample supply section is on the upstream side of the conjugate section.
  • the conjugate portion is formed on the sample pad or the insoluble membrane carrier on the downstream side of the sample supply portion.
  • the conjugate portion is arranged in a line in a direction orthogonal to the sample development direction, that is, the line connecting the center of the sample supply portion of the sample pad and the center of the downstream end portion of the insoluble membrane carrier described later. Is preferable.
  • the line-shaped conjugate portions are preferably arranged in a line shape in a direction perpendicular to the longitudinal direction of the sample pad and the insoluble membrane carrier.
  • the conjugate portion may be located upstream of the detection portion of the insoluble membrane carrier, but is preferably formed on the sample pad. In this case, it is not necessary that all of the sample pad downstream from the conjugate portion is the conjugate portion, and a porous material portion that does not contain the conjugate may be present on the further downstream side of the conjugate portion.
  • the position of the conjugate portion can be adjusted to an appropriate length by those skilled in the art, but the center line of the line of the conjugate portion is at least 3 mm upstream from the downstream end of the sample pad. It is preferably arranged in.
  • the "center line" of the conjugate portion or the detection portion means a center line drawn in a direction perpendicular to the longitudinal direction of the sample pad, and is a direction parallel to the longitudinal direction of the sample pad. It does not mean the center line drawn by.
  • the first complex forms a second complex with a binding partner that is immunologically responsive to the substance to be detected, which is immobilized on the detection part.
  • the second complex fixed to the detection unit is detected by means for detecting signals such as absorbance, reflected light, fluorescence, and magnetism derived from the conjugate.
  • a test strip having a type C conjugate will be described.
  • the difference from the Type A test strip is that there is no conjugate pad and the conjugate exists as a separate conjugate reagent.
  • a filter chip having a conjugate built in the filter can be mentioned.
  • the conjugate and the substance to be detected are combined to form a first complex (aggregate).
  • the binding partner that immunologically reacts to the substance to be detected is fixed.
  • a complex is formed.
  • the fixed second complex is detected by means for detecting signals such as absorbance, reflected light, fluorescence, and magnetism derived from the conjugate.
  • binding partner that immunologically responds to the substance to be detected is preferably an antibody capable of binding to the substance to be detected. Binding partners that immunologically respond to the substance to be detected are immobilized on the label and the detection site.
  • the binding partner is an antibody
  • the label and the antibody immobilized on the detection unit may be the same, but it is preferable that the label and the detection unit are different.
  • the reactivity of the substance to be detected bound to the conjugate and the antibody of the detection part can be increased.
  • the sensitivity of the immunochromatographic test strip is improved.
  • another thing means that it is a different kind, and it means that it is an antibody that recognizes a different epitope.
  • the antibody immobilized on the label and the detection part is preferably a monoclonal antibody. By using a monoclonal antibody, the specificity of the reaction can be increased.
  • functional fragments of antibodies having antigen-antibody reaction activity are also treated as antibodies in the present invention.
  • Examples of the functional fragment of the antibody include those obtained through an immunization process on animals, those obtained by using gene recombination technology, and chimeric antibodies.
  • Examples of the functional fragment of the antibody include F (ab') 2 , Fab'and the like. These functional fragments can be produced by treating the antibody with a proteolytic enzyme (eg, pepsin, papain, etc.).
  • sample pad The sample pad is laminated with the conjugate pad or the insoluble membrane carrier so that the lower surface of the downstream end thereof contacts the upper surface of the conjugate pad or the insoluble membrane carrier described later.
  • porous material constituting the sample pad include pads made of non-woven fibers such as paper, cellulose mixture, nitrocellulose, polyester, acrylonitrile copolymer, glass, rayon and the like. Of these, a pad made of glass fiber (a pad made of glass fiber) is preferable.
  • the third pad is placed between the conjugate pad and the insoluble membrane in the Type A test strip for the purpose of removing non-specific reactants in the biological sample. It is desirable that the third pad is arranged as needed depending on the properties of the sample and the like, and any third pad may be used as long as it can permeate the complex of the substance to be detected and the conjugate in the sample.
  • the insoluble membrane carrier that can be used in the present invention has at least one detector on which a binding partner that immunologically reacts with the substance to be detected is immobilized. Immobilization of a binding partner that immunologically reacts with the substance to be detected on an insoluble membrane carrier can be carried out by a known method. For example, a liquid containing the above-mentioned binding partner at a predetermined concentration is prepared. Then, the antibody is obtained by applying the liquid to the insoluble membrane carrier in a line shape and drying it using a device or the like having a mechanism capable of moving the liquid horizontally while discharging the liquid from the nozzle at a constant speed. It can be immobilized on an insoluble membrane carrier.
  • a liquid containing the above-mentioned binding partner at a predetermined concentration can be prepared by adding the binding partner to the buffer solution.
  • the type of the buffer solution include commonly used buffer solutions such as phosphate buffer solution, Tris buffer solution, and Good's buffer solution.
  • the pH of the buffer is preferably in the range of 6.0 to 9.5, more preferably 6.5 to 8.5, and even more preferably 7.0 to 8.0.
  • the buffer solution may further contain salts such as sodium chloride, stabilizers such as sugars, preservatives, preservatives such as proclin, and the like.
  • Salts include those added for the purpose of adjusting the ionic strength, such as sodium chloride, and those added for the purpose of adjusting the pH of the buffer solution, such as sodium hydroxide.
  • blocking can be performed by further coating a commonly used blocking agent with a solution or vapor to cover a portion other than the site where the antibody is immobilized.
  • the detection unit provided on the insoluble membrane carrier contains a cationic substance.
  • a coating solution containing the cationic substance and containing the binding partner at a predetermined concentration is prepared, and the coating solution is applied, dried, and fixed on the insoluble membrane carrier. Is preferable.
  • the membrane constituting the insoluble membrane carrier that can be used in the present invention
  • a known membrane that has been conventionally used as an insoluble membrane carrier for immunochromatographic test strips can be used.
  • membranes composed of fibers made of polyethylene, polyethylene terephthalate, nylons, glass, polysaccharides such as cellulose and cellulose derivatives, and ceramics Specific examples thereof include glass fiber filter paper and nitrocellulose membrane commercially available from Sartorius, Millipore, Toyo Filter Paper, Whatman and the like.
  • an absorbent pad is installed at the downstream end of the insoluble membrane carrier.
  • Absorbent pads are liquid-absorbent sites that control the development of samples by absorbing the samples that have moved and passed through the insoluble membrane carrier.
  • known absorption pads conventionally used for immunochromatographic test strips can be used, and for example, filter paper can be used.
  • a non-specific reaction means that a signal derived from a conjugate is detected and determined to be positive even though the substance to be detected is absent or substantially absent in the biological sample. Means.
  • immunochromatography means an immunoassay method applying the property (capillary phenomenon) in which a subject slowly flows on a porous material such as a cellulose membrane while dissolving a reagent.
  • using a test strip means detecting a substance to be detected contained in a biological sample by bringing the test strip into contact with the biological sample.
  • the immunochromatographic test strip is preferably placed on a solid support such as a plastic pressure-sensitive adhesive sheet.
  • the solid phase support is composed of a substance that does not interfere with the capillary flow of the sample and the conjugate.
  • the test strip for immunochromatography may be fixed on the solid phase support with an adhesive or the like.
  • the components of the adhesive are composed of a substance that does not interfere with the capillary flow of the sample and the conjugate. It is also possible to laminate a polyester film or the like for the purpose of increasing the mechanical strength of the insoluble membrane carrier and preventing evaporation (drying) of water during the assay.
  • the immunochromatographic test strip is placed in an appropriate container (housing) in consideration of the size of the immunochromatographic test strip, the sample addition method and addition position, the formation position of the detection part of the insoluble membrane carrier, the signal detection method, and the like. It can be stored and mounted for use. The state of being stored and mounted in this way is called a "device".
  • the immunochromatographic analysis method of the present invention can include the following steps (A) to (D).
  • (B) Contacting the biological sample with the conjugate to form a first complex
  • ( C) In a detection unit containing a cationic substance, the first complex is brought into contact with a binding partner that immunologically reacts with the biological sample to form a second complex, and (D). )
  • the immunochromatographic analysis method means an analysis method using immunochromatography.
  • test strip for immunochromatography can be prepared by appropriately modifying or modifying the method described in Examples.
  • the present invention is not limited by the following description.
  • the present inventors have stated that in a test strip for immunochromatography, when the detection part contains an anionic substance, the non-specific reaction increases, while when the detection part contains a cationic substance, the non-specific reaction is suppressed. I found it. Therefore, the non-specific causative substance is positively charged, and it is considered that the non-specific reaction can be suppressed by repelling the non-specific causative substance with the cationic substance (Fig. 3).
  • anti-influenza virus monoclonal antibody Preparation of anti-influenza virus monoclonal antibody.
  • the anti-influenza virus monoclonal antibody and anti-influenza B virus monoclonal antibody used in the following tests use recombinant influenza nuclear protein as an antigen, immunize mice, and are usually performed by those skilled in the art to produce a monoclonal antibody. Was obtained using.
  • test strip preparation Preparation of test strip for immunochromatography 1) Preparation of gold colloidal particle-labeled anti-influenza virus monoclonal antibody (conjugate) 100 ⁇ g / mL of anti-influenza virus monoclonal antibody and anti-influenza virus monoclonal antibody Each PBS contained at the concentration of was prepared. 1 mL of each antibody solution was added to 20 mL of 1 OD / mL gold colloidal particle solution, and the mixture was stirred at room temperature for 10 minutes.
  • insoluble membrane carrier (antibody-fixed membrane) on which anti-influenza virus monoclonal antibody is immobilized 0 with a phosphate buffer solution containing various cationic substances at a predetermined concentration on one end of a short side of a nitrocellulose membrane (pore size 8 ⁇ m).
  • Anti-influenza virus monoclonal antibody adjusted to .75 mg / mL, anti-influenza virus monoclonal antibody adjusted to 1.0 mg / mL, and anti-mouse IgG antibody adjusted to 0.75 mg / mL were added to the length of the insoluble membrane carrier. It was applied in a line as a solid phase antibody coating solution in a direction perpendicular to the direction.
  • the line was applied in the order of influenza A virus monoclonal antibody (c1), anti-influenza B virus monoclonal antibody (c2), and control antibody (c3) from the upstream side when the test strip was assembled.
  • test strip for immunochromatography The sample pad prepared in 2) was laminated on the insoluble membrane carrier obtained in 3) to prepare a test strip for immunochromatography.
  • Example 1 Using the test strip for immunochromatography prepared in the above test strip preparation example 1, a detection test for influenza A and B viruses was performed.
  • Test method (1) Sample The nasal mucus of a healthy subject without influenza was mixed with a sample diluent to dilute and used as a sample. (2) Procedure Dispense 135 ⁇ L of the sample prepared in (1) above into a test tube, insert a strip for immunochromatography, and after 5, 15, 30, and 45 minutes, a test line on the antibody-fixed membrane of the detection portion. The presence or absence of color development of A and B was visually determined. 2. 2. Test Results Tables 1 and 2 show the results of determining the presence or absence of color development on the test line B, which indicates the detection of influenza B virus.
  • the "additive concentration” in the table indicates the concentration based on the solid phase antibody coating solution.
  • "-" indicates that the test line B indicating the detection of influenza B virus did not develop color and false positives did not occur, and "+” indicates that the line developed color and false positives occurred. Represents what you have done. Non-specific reactions occurred 30 minutes and / or 45 minutes after the reaction for all controls with and without non-cationic peptides added. On the other hand, all the samples to which the cationic peptide or the cationic amino acid was added did not cause a non-specific reaction. Test line A, which shows the detection of influenza A virus, did not produce a non-specific reaction in all the samples tested. Therefore, it was shown that the non-specific reaction that occurs in the detection of influenza B virus can be prevented by adding a cationic substance to the detection unit.
  • Example 2 [Example 2] 1.
  • Test Method A detection test for influenza A and B viruses was carried out in the same manner as in Example 1 except that the type and concentration of the cationic peptide or cationic amino acid were changed.
  • Test Results Tables 3 and 4 show the results of determining the presence or absence of color development on the test line B, which indicates the detection of influenza B virus. In Tables 3 and 4, "-" indicates that the test line B indicating the detection of influenza B virus did not develop color and no false positives occurred, and "+” indicates that the line developed color and false positives. Represents what has occurred.

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Abstract

被検出物質のイムノクロマト分析方法における非特異反応を効果的に抑制することを課題とする。　以下の（１）～（３）を含むテストストリップを利用する、被検出物質のイムノクロマト分析方法により、前記課題を解決することができる。（１）被検出物質を含有する可能性のある生物学的サンプルを供給するサンプル供給部を有する、サンプルパッド、（２）被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーが固定され且つカチオン性物質を含む検出部を少なくとも１つ有する不溶性メンブレン担体、及び（３）被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーが標識体に固定されたコンジュゲート。

Description

イムノクロマト分析方法及び該方法に使用するテストストリップ
　本発明は、インフルエンザウイルス等の被検出物質を検出するためのイムノクロマト分析方法及び該方法に使用するテストストリップに関する。本発明は、インフルエンザウイルス等の被検出物質を検出するためのイムノクロマト分析方法における非特異反応抑制方法にも関する。
　疾患の早期診断を目的として、患者の傍らでリアルタイムに実施して、診断及び治療に役立つ有益な情報を迅速に得るＰＯＣＴ（ポイントオブケアテスティング）が実施されている。ＰＯＣＴにおいて、被検出物質に特異的に反応する結合パートナーを用いて疾患の原因となる被検出物質を検出する免疫法が広く行われている。このような免疫法の中でも、とりわけ、イムノクロマトグラフィー法は操作が簡便であるため、広く用いられている。しかしながら、このような免疫法では、交差抗原性の細菌、ウイルス、タンパク質などの夾雑物が検体中に含まれているときに、非特異的な反応を伴いやすい。そのような偽陽性反応により正確な判定が妨げられる場合もあり、問題となっている。
　サンプル中の夾雑物による非特異反応を抑制するために、様々な試みがなされている。例えば、特許文献１は、非イオン界面活性剤、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン緩衝剤およびカゼインを含むイムノクロマトグラフィー用試薬組成物を開示する。しかしながら、非特異反応を抑制することが実証されているのはこれらの物質を組み合わせた場合のみである。したがって、単一の物質を添加した場合においても、サンプル中の夾雑物による非特異反応を効果的に抑制できる技術が求められていた。
特開２０１２－３７２５３号公報
　本発明の目的は、非特異反応を抑制した、イムノクロマト分析方法及び該方法に使用するテストストリップを提供することである。
　本発明者らは、被検出物質のイムノクロマト分析方法において、下記の構成を具備することにより、非特異反応を効果的に抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は具体的には、以下の通りである。
＜１＞以下の（１）～（３）を含むテストストリップを利用する、被検出物質のイムノクロマト分析方法
（１）被検出物質を含有する可能性のある生物学的サンプルを供給するサンプル供給部を有する、サンプルパッド
（２）被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーが固定され且つカチオン性物質を含む検出部を少なくとも１つ有する不溶性メンブレン担体
（３）被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーが標識体に固定されたコンジュゲート。
＜２＞前記被検出物質が、呼吸器感染ウイルスである、＜１＞に記載のイムノクロマト分析方法。
＜３＞前記カチオン性物質が、カチオン性ペプチド又はカチオン性アミノ酸である、＜１＞又は＜２＞に記載のイムノクロマト分析方法。
＜４＞前記コンジュゲートが、前記（１）または（２）のサンプル供給部と検出部との間に設けられたコンジュゲート部に含有されていることを特徴とする、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載のイムノクロマト分析方法。
＜５＞前記カチオン性物質が、前記テストストリップを作製する際に検出部に塗布するための固相抗体塗布液に、０．０５～１０質量％の濃度で含まれる、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載のイムノクロマト分析方法。
＜６＞前記生物学的サンプルが、呼吸器分泌液である、＜１＞～＜５＞のいずれかに記載のイムノクロマト分析方法。
＜７＞前記被検出物質が、Ｂ型インフルエンザウイルスである、＜１＞～＜６＞のいずれかに記載のイムノクロマト分析方法。
＜８＞以下の（１）～（３）を含むイムノクロマトグラフィー用テストストリップ
（１）被検出物質を含有する可能性のある生物学的サンプルを供給するサンプル供給部を有する、サンプルパッド
（２）被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーが固定され且つカチオン性物質を含む検出部を少なくとも１つ有する不溶性メンブレン担体
（３）被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーが標識体に固定されたコンジュゲート。
＜９＞前記被検出物質が、呼吸器感染ウイルスである、＜８＞に記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
＜１０＞前記カチオン性物質が、カチオン性ペプチド又はカチオン性アミノ酸である、＜８＞又は＜９＞に記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
＜１１＞前記コンジュゲートが、前記（１）または（２）のサンプル供給部と検出部との間に設けられたコンジュゲート部に含有されていることを特徴とする、＜８＞～＜１０＞のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
＜１２＞前記カチオン性物質が、前記テストストリップを作製する際に検出部に塗布するための固相抗体塗布液に、０．０５～１０質量％の濃度で含まれる、＜８＞～＜１１＞のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
＜１３＞前記生物学的サンプルが、呼吸器分泌液である、＜８＞～＜１２＞のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
＜１４＞前記被検出物質が、Ｂ型インフルエンザウイルスである、＜８＞～＜１３＞のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
＜１５＞以下の（１）～（３）を含むテストストリップを利用する、被検出物質のイムノクロマト分析方法における非特異反応抑制方法
（１）被検出物質を含有する可能性のある生物学的サンプルを供給するサンプル供給部を有する、サンプルパッド
（２）被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーが固定され且つカチオン性物質を含む検出部を少なくとも１つ有する不溶性メンブレン担体
（３）被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーが標識体に固定されたコンジュゲート。
＜１６＞前記カチオン性物質が、カチオン性ペプチド又はカチオン性アミノ酸である、＜１５＞に記載の非特異反応抑制方法。
＜１７＞前記カチオン性物質が、前記テストストリップを作製する際に検出部に塗布するための固相抗体塗布液に、０．０５～１０質量％で含まれる、＜１５＞又は＜１６＞に記載の非特異反応抑制方法。
＜１８＞前記生物学的サンプルが、呼吸器分泌液である、＜１５＞～＜１７＞のいずれかに記載の非特異反応抑制方法。
＜１９＞前記被検出物質が、Ｂ型インフルエンザウイルスである、＜１５＞～＜１８＞のいずれかに記載の非特異反応抑制方法。
＜２０＞前記カチオン性物質が、Ｌ－リシン塩酸塩、ヒドロキシプロピルトリモニウム加水分解ダイズタンパク（商品名Ｐｒｏｍｏｉｓ　ＷＳ－ＨＱ；成和化成社製）、ココジモニウムヒドロキシプロピル加水分解ケラチン（商品名Ｐｒｏｍｏｉｓ　ＷＫ－ＨＣＡＱ；成和化成社製）、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、＜１＞～＜７＞のいずれかに記載のイムノクロマト分析方法。
＜２１＞前記カチオン性物質が、Ｌ－リシン塩酸塩、ヒドロキシプロピルトリモニウム加水分解ダイズタンパク（商品名Ｐｒｏｍｏｉｓ　ＷＳ－ＨＱ；成和化成社製）、ココジモニウムヒドロキシプロピル加水分解ケラチン（商品名Ｐｒｏｍｏｉｓ　ＷＫ－ＨＣＡＱ；成和化成社製）、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、＜８＞～＜１４＞のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
＜２２＞前記カチオン性物質が、Ｌ－リシン塩酸塩、ヒドロキシプロピルトリモニウム加水分解ダイズタンパク（商品名Ｐｒｏｍｏｉｓ　ＷＳ－ＨＱ；成和化成社製）、ココジモニウムヒドロキシプロピル加水分解ケラチン（商品名Ｐｒｏｍｏｉｓ　ＷＫ－ＨＣＡＱ；成和化成社製）、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、＜１６＞～＜２０＞のいずれかに記載の非特異反応抑制方法。
　本発明により、被検出物質のイムノクロマト分析における非特異反応を効果的に抑制することができる。
本発明の一実施形態において使用するテストストリップの模式構成図である。 本発明の一実施形態において使用するテストストリップの模式構成図である。 本発明において効果が得られる理由を示す仮説の模式図である。
（被検出物質）
　本発明において、被検出物質としては、ウイルス、及び一般に抗原抗体反応を利用して測定し得るタンパク質などの生理活性物質等が挙げられる。上記ウイルスとしては、例えば、Ａ型インフルエンザウイルスやＢ型インフルエンザウイルスなどのインフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス等が挙げられ、上記タンパク質としては、例えば、ヒトヘモグロビン、Ｂ型肝炎ウイルス抗体、Ｃ型肝炎ウイルス抗体、ヒト免疫不全ウイルス抗体等が挙げられる。
　本発明における被検出物質としては呼吸器感染ウイルスが好ましい。本明細書において呼吸器感染ウイルスとは、呼吸器系疾患の原因となるウイルスである。本発明における呼吸器感染ウイルスとしては、抗原抗体反応を利用して検出され得るウイルスであれば特に限定されることはなく、コロナウイルス２２９Ｅ、コロナウイルスＯＣ４３、及びコロナウイルスＮＬ６３等のコロナウイルス；Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、C型インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス１、パラインフルエンザウイルス２、及びパラインフルエンザウイルス３等のインフルエンザウイルス；ＲＳウイルスＡ型及びＲＳウイルスＢ型等のＲＳウイルス；アデノウイルス；ライノウイルス；メタニューモウイルス；サイトメガロウイルス；並びにボカウイルス等を挙げることができる。中でも、インフルエンザウイルスを被検出物質とするのが好ましく、Ｂ型インフルエンザウイルスを被検出物質とするのがより好ましく、後述する検出部を複数個所（例えば２箇所）形成して、Ａ型インフルエンザウイルスおよびＢ型インフルエンザウイルスを検出することが最も好ましい。
　なお、本明細書において「呼吸器」とは、呼吸に関係する器官の総称であり、鼻前庭から、鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支、細気管支を経た肺胞（肺）までの器官をいう。
（生物学的サンプル）
　本発明において使用される、被検出物質を含有する可能性のある生物学的サンプルとしては、体液などの主に生体（生物）由来の物質やそれらから被検出物質を抽出した抽出液等が挙げられる。生体（生物）由来の物質としては、具体的には、血液、尿、便、及び呼吸器分泌液が挙げられる。被検出物質が呼吸器感染ウイルスである場合、生物学的サンプルとしては、呼吸器分泌液、具体的には、鼻孔・鼻腔・咽頭・鼻咽頭などを由来とする鼻汁液、喀痰、又は唾液等が好ましい。上記の生体（生物）由来物質やその抽出液は、そのままサンプルとして用いてもよく、適宜サンプル希釈液によって希釈してサンプルとしてもよい。また、適宜濾過したものをサンプルとして用いてもよい。
（カチオン性物質）
　本明細書において、カチオン性物質（陽イオン性物質）とは、水に溶解又は分散させた時にカチオン性を示す物質を意味する。カチオン性物質は、カチオン界面活性剤、カチオン性脂質、カチオン性ペプチド、及びカチオン性アミノ酸等を使用することができるが、カチオン性ペプチド又はカチオン性アミノ酸を使用することが好ましい。
　カチオン性ペプチドは、中性条件下、例えば水に溶解又は分散させた条件下で、分子全体として正電荷に帯電しているぺプチドを意味する。カチオン性ペプチドは、ペプチドを構成するアミノ酸残基に塩基性アミノ酸残基（アルギニン（Ａｒｇ）、リシン（Ｌｙｓ）、又はヒスチジン（Ｈｉｓ））を多く含むものであることができる。具体的には、カチオン性ペプチドを構成する全アミノ酸残基に対して塩基性アミノ酸残基の含有率が４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上、もっと好ましくは９０％以上、一層好ましくは９５％以上、より一層好ましくは９８％以上、であることが好適である。最も好ましくは、塩基性アミノ酸残基の含有率が１００％であることが望ましい。また、当該カチオン性ペプチドにおいては、酸性アミノ酸残基（アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、システイン（Ｃｙｓ）、又はチロシン（Ｔｙｒ））の含有率が、ペプチドを構成する全アミノ酸残基に対して一定値以下であることが望ましい。具体的には、全アミノ酸残基に対して２０％以下、好ましくは１５％以下、より好ましくは１２％以下、さらに好ましくは１０％以下、特に好ましくは８％以下、もっと好ましくは６％以下、一層好ましくは４％以下、より一層好ましくは２％以下、さらに一層好ましくは１％以下、であることが好適である。最も好ましくは、酸性アミノ酸残基の含有率が０％であることが望ましい。
　カチオン性ペプチドは、中性条件下において、ペプチド全体として正電荷を帯びているペプチドである限り特に限定されることはなく、例えば、生体由来のタンパク質分解物のカチオン化誘導体、前記塩基性アミノ酸残基のポリマーであるポリアルギニン、ポリリシン、またはポリヒスチジン等を使用することができる。生体由来のタンパク質分解物のカチオン化誘導体の中でも、生体由来のタンパク質分解物のペプチドのＮ末端に４級アンモニウム基を結合させた誘導体が特に好ましく、ヒドロキシプロピルトリモニウム加水分解ダイズタンパク（商品名Ｐｒｏｍｏｉｓ　ＷＳ－ＨＱ；成和化成社製）又はココジモニウムヒドロキシプロピル加水分解ケラチン（商品名Ｐｒｏｍｏｉｓ　ＷＫ－ＨＣＡＱ；成和化成社製）を使用することがさらに好ましい。本発明の効果が得られる限りにおいて、カチオン性ペプチドの塩を使用することもできる。なお、Ｐｒｏｍｏｉｓは登録商標である。
　カチオン性アミノ酸は、アルギニン（Ａｒｇ）、リシン（Ｌｙｓ）、及びヒスチジン（Ｈｉｓ）を意味する。カチオン性アミノ酸としてはＬ体を使用することが好ましい。本発明の効果が得られる限りにおいて、塩酸塩等のカチオン性アミノ酸の塩を使用することもできる。中でも、Ｌ－リシン塩酸塩を使用することが特に好ましい。
　これらのカチオン性物質は単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。カチオン性物質として、Ｌ－リシン塩酸塩、ヒドロキシプロピルトリモニウム加水分解ダイズタンパク（商品名Ｐｒｏｍｏｉｓ　ＷＳ－ＨＱ；成和化成社製）、ココジモニウムヒドロキシプロピル加水分解ケラチン（商品名Ｐｒｏｍｏｉｓ　ＷＫ－ＨＣＡＱ；成和化成社製）、及びこれらの組み合わせから成る群から選択されるカチオン性物質を使用することが最も好ましい。
　カチオン性物質の濃度は、カチオン性物質の種類や被検出物質に応じて適宜調整することが可能であるが、例えば、テストストリップを作製する際に検出部に塗布するための固相抗体塗布液の濃度として、非特異反応抑制効果の観点から、０．００１～１０質量％、好ましくは０．０１～１０質量％、より好ましくは０．０２～１０質量％、さらに好ましくは０．０５～１０質量％、最も好ましくは０．１～１０質量％である。上限は、８質量％、５質量％、３質量％、又は２質量％であってもよい。
（コンジュゲート）
　コンジュゲートは、被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーが標識体に固定されたものである。コンジュゲートの存在様式としては、コンジュゲートパッドとして、サンプルパッド、サードパッド、不溶性メンブレン以外の別のパッドに含浸された状態で存在してもよいし（タイプＡ）、サンプルパッドの一部もしくは不溶性メンブレンの一部にコンジュゲート部として存在してもよいし（タイプＢ）、さらには、生物学的サンプルと混合されるように個別のコンジュゲート試薬として存在してもよい（タイプＣ）。
　本発明で用いられる標識体は、公知の標識体を用いることができる。例えば、金コロイド粒子や白金コロイド粒子などのコロイド状金属粒子、カラーラテックス粒子、磁性粒子などが好ましく、特に金コロイド粒子が好ましい。
　インフルエンザウイルスを検出する場合、コンジュゲートは、金コロイド粒子に抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体が固定されたものが好ましい。
　以下、コンジュゲートの存在様式が上記タイプＡのテストストリップについて説明する。
　サンプルの流れ方向の上流より下流に向かって、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、サードパッド、不溶性メンブレンの順で配置される。それぞれの層は、上下の層と少なくとも一部が重複するように配置される。このような配置例のテストストリップを図１に示す。
　テストストリップのサンプルパッドに、被検出物質を含有するサンプルが供給されると、被検出物質はサンプルパッドを通過して下流側のコンジュゲートパッドへと流れる。コンジュゲートパッドでは、被検出物質とコンジュゲートが接触して第一複合体（凝集体）を形成しながら当該パッドを通過する。その後、第一複合体はコンジュゲートパッドの下面に接触して配置された多孔質サードパッドを通過し、不溶性メンブレンへと展開される。
　不溶性メンブレンには、その一部に被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーが固定されている。ここで、第一複合体と被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーとが免疫反応により結合して、第二複合体として固定されることになる。固定された第二複合体は、コンジュゲートに由来する吸光度、反射光、蛍光、磁気等のシグナルを検出する手段により検出される。
　次に、コンジュゲートの存在様式がタイプＢのテストストリップについて説明する。
　上記タイプＡのテストストリップとの違いは、サンプルパッドもしくは不溶性メンブレンとコンジュゲートパッドが一体になった点である。サンプルパッドの一部にサンプル供給部およびコンジュゲート部が構成されている配置例のテストストリップを図２に示す。
　上記サンプル供給部は、被検出物質を含有するサンプルを供給する部位であり、上記コンジュゲート部は、コンジュゲートを含有する部位であり、サンプル供給部がコンジュゲート部の上流側となる。
　コンジュゲート部は、上記サンプル供給部よりも下流側のサンプルパッド上又は不溶性メンブレン担体上に形成される。コンジュゲート部は、サンプル展開方向、即ち、サンプルパッドのサンプル供給部の中心と後述する不溶性メンブレン担体の下流側端部の中心を結ぶ線、に対して直行する方向にライン状に配置されているのが好ましい。換言すれば、ライン状のコンジュゲート部は、サンプルパッド及び不溶性メンブレン担体の長手方向に対して垂直の方向にライン状に配置されているのが好ましい。コンジュゲート部は、不溶性メンブレン担体の検出部より上流に存在することもできるが、サンプルパッドに形成されていることが好ましい。この場合、サンプルパッドのコンジュゲート部よりも下流側の全てがコンジュゲート部である必要はなく、コンジュゲート部のさらに下流側にはコンジュゲートを含まない多孔質材料部分が存在していてもよい。
　コンジュゲート部の位置は、当業者であれば適切な長さに調節することができるが、ライン状のコンジュゲート部のラインの中心線が、サンプルパッドの下流側端部から少なくとも３ｍｍ以上上流側に配置されているのが好ましい。なお、本明細書において、コンジュゲート部又は検出部の「中心線」とは、サンプルパッドの長手方向に対して垂直方向に引かれる中心線を意味し、サンプルパッドの長手方向に対して平行方向に引かれる中心線を意味するものではない。
　サンプル供給部に供給された被検出物質を含有するサンプルは、上流から下流へ移動する。コンジュゲート部において、被検出物質とコンジュゲートとが、第一複合体を形成する。第一複合体はさらに下流へ移動する。そして、第一複合体は、検出部に固定された、被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーと第二複合体を形成する。検出部に固定された第二複合体は、コンジュゲートに由来する吸光度、反射光、蛍光、磁気等のシグナルを検出する手段により検出される。
　次に、コンジュゲートの存在様式がタイプＣのテストストリップについて説明する。
　上記タイプＡのテストストリップとの違いは、コンジュゲートパッドが存在せず、コンジュゲートは個別のコンジュゲート試薬として存在する点である。例えば、フィルター中にコンジュゲートが内蔵されたフィルターチップが挙げられる。このようなフィルターチップを使って、被検出物質を通過させることでコンジュゲートと被検出物質が結合し、第一複合体（凝集体）を形成する。これをコンジュゲートパッドを有さないこと以外はタイプＡと同一の前記テストストリップに供給することで、被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーが固定されている検出部において第二複合体が形成される。そして固定された第二複合体は、コンジュゲートに由来する吸光度、反射光、蛍光、磁気等のシグナルを検出する手段により検出される。
（被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナー）
　本発明で用いられる、被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーは、被検出物質に結合可能な抗体であることが好ましい。被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーは、標識体および検出部に固定される。
　結合パートナーが抗体である場合、標識体および検出部に固定される抗体は同一であってもよいが、標識体と検出部とで別のものであることが好ましい。標識体に固定される抗体と、検出部に固定される抗体とで別のものを用いることにより、コンジュゲートと結合した被検出物質と検出部の抗体との反応と、コンジュゲートと結合した被検出物質と未反応のコンジュゲートとの反応とが競合するのを抑制することができる。さらに、コンジュゲートと結合した被検出物質と検出部の抗体との反応性を上げることができる。そして、結果としてイムノクロマトグラフィー用テストストリップの感度が良好になる。なお、別のものとは、種類が異なることをいい、異なるエピトープを認識する抗体であることをいう。さらに、標識体および検出部に固定される抗体はモノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体を用いることで、反応の特異性を上げることができる。
　また、これらの抗体の分子全体のほかに、抗原抗体反応活性を有する抗体の機能性断片も本発明では同じく抗体として取り扱う。抗体の機能性断片としては、動物への免疫工程を経て得られたもののほか、遺伝子組み換え技術を使用して得られたものや、キメラ抗体が挙げられる。抗体の機能性断片としては、例えば、F(ab')2、Fab’などが挙げられる。これらの機能性断片は前記抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理することにより製造できる。
（サンプルパッド）
　サンプルパッドは、その下流側の端部の下面がコンジュゲートパッド又は後述する不溶性メンブレン担体の上面に接触するようにコンジュゲートパッド又は不溶性メンブレン担体と積層される。サンプルパッドを構成する多孔質材料としては、紙、セルロース混合物、ニトロセルロース、ポリエステル、アクリロニトリルコポリマー、ガラス、レーヨン等のような不織繊維からなるパッドが挙げられる。中でもガラス繊維からなるパッド（グラスファイバー製パッド）が好ましい。
（サードパッド）
　サードパッドは、生物学的サンプル中の非特異反応物質の除去の目的で、前記タイプＡのテストストリップにおいて、コンジュゲートパッドと不溶性メンブレンとの間に配置される。サードパッドは、試料の性状等により必要に応じて配置されることが望ましく、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートの複合体を透過させることができるものであればいずれでもよい。
（不溶性メンブレン担体）
　本発明で使用することができる不溶性メンブレン担体は、被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーが固定された少なくとも１つの検出部を有する。被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーの不溶性メンブレン担体への固定は、公知の方法で実施することができる。例えば、上記の結合パートナーを所定の濃度で含有する液を調製する。そして、ノズルから液を一定の速度で吐出しながら水平方向に移動させることのできる機構を有する装置などを用いて、上記液をライン状に不溶性メンブレン担体に塗布し、乾燥させることにより上記抗体を不溶性メンブレン担体に固定させることができる。
　また、上記の結合パートナーを所定の濃度で含有する液は、緩衝液に結合パートナーを添加することにより調製することができる。該緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。緩衝液のｐＨは６．０～９．５の範囲が好ましく、６．５～８．５がより好ましく、７．０～８．０がさらに好ましい。緩衝液には、さらに塩化ナトリウムなどの塩類、糖類などの安定剤や保存剤、プロクリンなどの防腐剤等を含んでもよい。塩類は塩化ナトリウムなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する目的で添加するものも含まれる。
　不溶性メンブレンに結合パートナーを固定した後、さらに、通常使用されるブロッキング剤を溶液あるいは蒸気状にして抗体を固定した部位以外を被覆し、ブロッキングを行うこともできる。
　不溶性メンブレン担体上に設けられた検出部は、カチオン性物質を含有する。検出部にカチオン性物質を含有させる手段としては、カチオン性物質を含む、結合パートナーを所定の濃度で含有する塗布液を作製し、この塗布液を不溶性メンブレン担体に塗布、乾燥、及び固定させることが好ましい。
　本発明で使用することができる不溶性メンブレン担体を構成するメンブレンとしては、従来からイムノクロマトグラフィー用テストストリップの不溶性メンブレン担体として用いられている公知のメンブレンが使用できる。例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体などの多糖類、セラミックス等からなる繊維から構成されるメンブレンがあげられる。具体的には、ザルトリウス社、ミリポア社、東洋濾紙社、ワットマン社などから市販されているガラス繊維ろ紙やニトロセルロース膜などが挙げられる。
　本発明で使用することができるイムノクロマトグラフィー用テストストリップにおいては、上記不溶性メンブレン担体の下流側端部に吸収パッドを設置するのが好ましい。吸収パッドとは、不溶性メンブレン担体を移動・通過したサンプルを吸収することにより、サンプルの展開を制御する液体吸収性を有する部位である。吸収パッドとしては、従来からイムノクロマトグラフィー用テストストリップに用いられている公知の吸収パッドを用いることができ、例えば、ろ紙を用いることができる。
　本明細書において非特異反応とは、被検出物質が生物学的サンプル中に存在しない、あるいは実質的に存在しないにも拘わらず、コンジュゲートに由来するシグナルが検出され、陽性と判断されることを意味する。
（イムノクロマトグラフィー用テストストリップ）
　本明細書において、「イムノクロマトグラフィー」とは、セルロース膜等の多孔質材料上を被検体が試薬を溶解しながらゆっくりと流れる性質（毛細管現象）を応用した免疫測定法を意味する。本明細書において、「テストストリップを利用する」とは、テストストリップと生物学的サンプルとを接触させることにより、生物学的サンプルに含まれる被検出物質を検出することを意味する。イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、プラスチック製粘着シートのような固相支持体上に配置させることが好ましい。該固相支持体は、サンプル及びコンジュゲートの毛管流を妨げない物質で構成する。また、イムノクロマトグラフィー用テストストリップを固相支持体上に接着剤等で固定してもよい。この場合、接着剤の成分等においてもサンプル及びコンジュゲートの毛管流を妨げない物質で構成する。なお、不溶性メンブレン担体の機械的強度を上げ且つアッセイ中の水分の蒸発（乾燥）を防ぐ目的でポリエステルフィルムなどをラミネートすることも可能である。該イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、イムノクロマトグラフィー用テストストリップの大きさ、サンプルの添加方法や添加位置、不溶性メンブレン担体の検出部の形成位置、シグナルの検出方法などを考慮した適当な容器（ハウジング）に格納・搭載して使用することができる。このように格納・搭載された状態を「デバイス」という。
　本発明のイムノクロマト分析方法は、以下の（Ａ）～（Ｄ）の工程を含むことができる。
（Ａ）被検出物質を含有する可能性のある生物学的サンプルをサンプル供給部に接触させること
（Ｂ）前記生物学的サンプルとコンジュゲートとを接触させ、第一複合体を形成させること
（Ｃ）カチオン性物質を含む検出部において、前記第一複合体と前記生物学的サンプルに対して免疫学的に反応する結合パートナーとを接触させ、第二複合体を形成させること、及び
（Ｄ）コンジュゲートに由来するシグナルを測定すること。
　なお、本明細書においてイムノクロマト分析方法とは、イムノクロマトグラフィーを利用する分析方法を意味する。
　イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製は実施例に記載の方法を適宜、修飾・改変して行うことができる。
　本発明において非特異反応抑制効果が得られる理由は、完全に解明されているわけではないが、以下のように推論することができる。しかしながら、本発明は以下の説明によって限定されるものではない。
　本発明者らは、イムノクロマトグラフィー用テストストリップにおいて、検出部がアニオン性物質を含むと非特異反応が増加し、一方で検出部がカチオン性物質を含むと、非特異反応が抑制されることを見出した。したがって、非特異原因物質は正電荷を帯びており、カチオン性物質により非特異原因物質反発させることで非特異反応を抑制することができると考えられる（図３）。
　次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、本明細書において、特に説明のない限り、％は質量％を示す。
〔抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体の調製〕
　以下の試験に用いた抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体及び抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体は、抗原としてリコンビナントインフルエンザ核タンパクを用い、マウスに免疫し、当業者がモノクローナル抗体を製造するために通常行う方法を用いて得られた。
〔テストストリップ作製例１〕イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
１）金コロイド粒子標識抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体（コンジュゲート）の作製
　抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体および抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を１００μｇ／ｍLの濃度で含むPBSをそれぞれ調製した。１　ＯＤ／ｍＬの金コロイド粒子溶液２０ｍＬに対し各抗体溶液を１ｍＬ添加し、室温で１０分間撹拌した。該金コロイド粒子－抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体混合液および該金コロイド－抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体混合液に対し、１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を２ｍＬ添加し、さらに５分間撹拌後、１０℃にて、１０，０００ｒｐｍで４５分間遠心し、沈渣（コンジュゲート）を得た。得られたコンジュゲートに対し、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｄｉｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｃｒｉｐｐｓ社製）を添加しコンジュゲートを懸濁させた。
２）サンプルパッドの作製
　上記１）で調製したコンジュゲートを、８～２０ＯＤ／ｍＬとなるように、１．３３％カゼイン、４％スクロース溶液（ｐＨ７．５）と混合してコンジュゲート液を作製し、全長２８ｍｍのグラスファイバー製パッドに、ライン幅４ｍｍのラインを形成するように滲みこませた。７０℃、３０分間加温することにより乾燥させ、コンジュゲート部を含むサンプルパッドとした。
３）抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体が固定された不溶性メンブレン担体（抗体固定メンブレン）の作製
　ニトロセルロースメンブレン（孔径８μｍ）の短辺の一端に、各種カチオン性物質を所定濃度で含むリン酸緩衝液で０．７５ｍｇ／ｍＬに調整した抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体、１．０ｍｇ／ｍＬに調整した抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体及び０．７５ｍｇ／ｍＬに調整した抗マウスＩｇＧ抗体を、不溶性メンブレン担体の長手方向に対して垂直の方向に固相抗体塗布液としてライン状に塗布した。その後、７０℃、４５分乾燥し、抗体固定メンブレンとした。ラインは、テストストリップを組み立てた際に上流側から、Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体（ｃ１）、抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体（ｃ２）、コントロール抗体（ｃ３）の順になるように塗布した。
４）イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
　２）で作製したサンプルパッドを、３）で得られた不溶性メンブレン担体に積層し、イムノクロマトグラフィー用テストストリップを作製した。
〔実施例１〕
　上記テストストリップ作製例１で作製したイムノクロマトグラフィー用テストストリップを用いて、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスの検出試験を行った。
１．試験方法
（１）試料　
　インフルエンザに罹患していない健康な対象の鼻腔粘液を、サンプル希釈液と混合して希釈し、試料として用いた。
（２）手順
　上記（１）で調製した試料１３５μＬをテストチューブに分注し、イムノクロマトグラフィー用ストリップを挿入し、５、１５、３０、及び４５分後に、検出部分の抗体固定メンブレン上のテストラインＡ及びＢの発色の有無を目視にて判定した。
２．試験結果
　Ｂ型インフルエンザウイルスの検出を示すテストラインＢの発色有無の判定結果を表１、２に示す。なお、表中の「添加物濃度」は、固相抗体塗布液を基準とした濃度を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　表１及び表２中、「－」はＢ型インフルエンザウイルスの検出を示すテストラインＢが発色せず、偽陽性が発生しなかったものを表し、「＋」はラインが発色し偽陽性が発生したものを表す。カチオン性ではないペプチドを添加したもの及び何も添加しなかったコントロールに関しては、全て反応３０分後及び／又は４５分後に非特異反応を生じた。一方で、カチオン性ペプチド又はカチオン性アミノ酸を添加したサンプルは、全て非特異反応を生じなかった。Ａ型インフルエンザウイルスの検出を示すテストラインＡは、試験したサンプル全てにおいて非特異反応を生じなかった。したがって、カチオン性物質を検出部に添加することにより、Ｂ型インフルエンザウイルスの検出において生じる非特異反応を防止できることが示された。
〔実施例２〕
１．試験方法
　カチオン性ペプチド又はカチオン性アミノ酸の種類及び濃度を変更した以外は実施例１と同様にして、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスの検出試験を行った。
２．試験結果
　Ｂ型インフルエンザウイルスの検出を示すテストラインＢの発色有無の判定結果を表３、４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　表３及び表４中、「－」はＢ型インフルエンザウイルスの検出を示すテストラインＢが発色せず、偽陽性が発生しなかったものを表し、「＋」はラインが発色し、偽陽性が発生したものを表す。カチオン性ペプチドを添加した測定系では、カチオン性ペプチドの濃度を０．１０％まで減少させた場合でも、Ｂ型インフルエンザウイルスの検出において十分な非特異反応抑制効果を確認することができた。カチオン性アミノ酸を添加した測定系では、カチオン性ペプチドの濃度を１％まで増加させた場合でも十分な非特異反応抑制効果を確認することができた。また、Ａ型インフルエンザウイルスの検出においては、試験したサンプル全てにおいて非特異反応を生じなかった。
　本発明によれば、被検出物質のイムノクロマト分析における非特異反応を効果的に抑制することが可能である。
（ａ）プラスチック製粘着シート
（ｂ）不溶性メンブレン
（ｃ１）テストラインＡ
（ｃ２）テストラインＢ
（ｃ３）コントロールライン
（ｄ）コンジュゲートパッド
（ｅ）サンプルパッド
（ｆ）吸収パッド
（ｇ）サードパッド
（ｈ）コンジュゲート部
（ｉ）フィルム 

Claims (16)

  1. 　以下の（１）～（３）を含むテストストリップを利用する、被検出物質のイムノクロマト分析方法
    （１）被検出物質を含有する可能性のある生物学的サンプルを供給するサンプル供給部を有する、サンプルパッド
    （２）被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーが固定され且つカチオン性物質を含む検出部を少なくとも１つ有する不溶性メンブレン担体
    （３）被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーが標識体に固定されたコンジュゲート。
  2. 　前記被検出物質が、呼吸器感染ウイルスである、請求項１に記載のイムノクロマト分析方法。
  3. 　前記カチオン性物質が、カチオン性ペプチド又はカチオン性アミノ酸である、請求項１又は２に記載のイムノクロマト分析方法。
  4. 　前記コンジュゲートが、前記（１）または（２）のサンプル供給部と検出部との間に設けられたコンジュゲート部に含有されていることを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載のイムノクロマト分析方法。
  5. 　前記カチオン性物質が、前記テストストリップを作製する際に検出部に塗布するための固相抗体塗布液に、０．０５～１０質量％の濃度で含まれる、請求項１～４のいずれかに記載のイムノクロマト分析方法。
  6. 　前記生物学的サンプルが、呼吸器分泌液である、請求項１～５のいずれかに記載のイムノクロマト分析方法。
  7. 　前記被検出物質が、Ｂ型インフルエンザウイルスである、請求項１～６のいずれかに記載のイムノクロマト分析方法。
  8. 　以下の（１）～（３）を含むイムノクロマトグラフィー用テストストリップ
    （１）被検出物質を含有する可能性のある生物学的サンプルを供給するサンプル供給部を有する、サンプルパッド
    （２）被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーが固定され且つカチオン性物質を含む検出部を少なくとも１つ有する不溶性メンブレン担体
    （３）被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーが標識体に固定されたコンジュゲート。
  9. 　前記被検出物質が、呼吸器感染ウイルスである、請求項８に記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
  10. 　前記カチオン性物質が、カチオン性ペプチド又はカチオン性アミノ酸である、請求項８又は９に記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
  11. 　前記コンジュゲートが、前記（１）または（２）のサンプル供給部と検出部との間に設けられたコンジュゲート部に含有されていることを特徴とする、請求項８～１０のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
  12. 　前記カチオン性物質が、前記テストストリップを作製する際に検出部に塗布するための固相抗体塗布液に、０．０５～１０質量％の濃度で含まれる、請求項８～１１のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
  13. 　前記生物学的サンプルが、呼吸器分泌液である、請求項８～１２のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
  14. 　前記被検出物質が、Ｂ型インフルエンザウイルスである、請求項８～１３のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
  15. 　以下の（１）～（３）を含むテストストリップを利用する、被検出物質のイムノクロマト分析方法における非特異反応抑制方法
    （１）被検出物質を含有する可能性のある生物学的サンプルを供給するサンプル供給部を有する、サンプルパッド
    （２）被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーが固定され且つカチオン性物質を含む検出部を少なくとも１つ有する不溶性メンブレン担体
    （３）被検出物質に対して免疫学的に反応する結合パートナーが標識体に固定されたコンジュゲート。
  16. 　前記カチオン性物質が、カチオン性ペプチド又はカチオン性アミノ酸である、請求項１５に記載の非特異反応抑制方法。 
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