CN111796093A - 一种新型冠状病毒、mers与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒 - Google Patents

一种新型冠状病毒、mers与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN111796093A
CN111796093A CN202010694821.5A CN202010694821A CN111796093A CN 111796093 A CN111796093 A CN 111796093A CN 202010694821 A CN202010694821 A CN 202010694821A CN 111796093 A CN111796093 A CN 111796093A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
detection
influenza
mers
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010694821.5A
Other languages
English (en)
Inventor
范春雷
朱晓进
孙刚
臧洋
李铭夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN202010694821.5A priority Critical patent/CN111796093A/zh
Publication of CN111796093A publication Critical patent/CN111796093A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/583—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with non-fluorescent dye label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒，检测条A的释放垫上喷涂有彩色乳胶标记的抗新型冠状病毒S1蛋白多抗和彩色乳胶标记的捕获型抗甲型流感病毒单抗，检测条B的释放垫上喷涂有彩色乳胶标记的抗MERS病毒S1蛋白多抗和彩色乳胶标记的捕获型抗乙型流感病毒单抗，检测条A和检测条B组装于一张双联卡板，即构成所述的试剂盒；其中检测条A用于检测新型冠状病毒与甲型流感病毒，检测条B用于检测MERS与乙型流感病毒。本发明的试剂盒检测方便快速，3‑15分种内可同时判断出4种不易区分的病毒性流行病，可应用于医院检测、居家检测、流行病调查、以及大规模筛查诊断，适用于全球冠状病毒和流感病毒疫情监控。

Description

一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测 试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒。
背景技术
冠状病毒在系统分类上属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具外套膜(envelope)的正链单股RNA病毒，直径约80～120nm，其遗传物质是所有RNA病毒中最大的，感染宿主包括人、鼠、蝙蝠、猪、猫、穿山甲、犬、狼、鸡、牛、蛇类、禽类等脊椎动物。2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。研究表明，其中SARS-CoV-19、SARS-CoV和HCoV-NL63是通过病毒包膜spike glycoprotein(S-protein)介导病毒与宿主细胞膜上的ACE2受体相互作用来感染人的。人感染了新型冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。
流行性感冒病毒(Influenza viruses,Flu)简称流感病毒，是引起流行性感冒的病原体，流行性感冒是由甲、乙、丙三型流感病毒分别引起的急性呼吸道传染病，它传染性强、传播快、潜伏期短、发病率高。甲型流感病毒常以流行形式出现，能引起世界性流感大流行，它在动物中广泛分布，并也能在动物中引起流感流行和造成大量动物死亡。乙型流感病毒常常引起局部爆发，不引起世界性流感大流行。丙型流感病毒主要以散在形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流行。因此对于甲型和乙型流感病毒的检测有相对较大的临床意义。
MERS病毒是一种β属C亚群冠状病毒，全名为中东呼吸综合征冠状病毒，感染后引发中东呼吸综合征(Middle East Respiratory Syndrome，简称MERS)大多数MERS病毒感染病例发生在中东地区。一般人很难从症状上区分出新冠肺炎、MERS和流感，甚至一些检测试剂盒存在严重的交叉反应。因而研发一种可快速区分出新冠肺炎、MERS和流感的居家检测检试剂盒对全球冠状病毒和流感病毒流行和疫情监控具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的上述技术问题，我们根据配体与受体特异性结合的原理，发明了一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒。新型冠状病毒的棘突蛋白有2个亚基，S1和S2，其中S1亚基作为配体与人细胞膜上的ACE2受体相互作用形成高亲和力的特异性结合。依据夹心法免疫层析原理，我们用重组的人ACE2蛋白替代其中一个抗新冠病毒S-蛋白单抗来标记彩色乳胶并喷涂于试纸条的释放垫上，检测时如果检测样本中有新冠病毒，则可通过ACE2与样本中的新冠病毒结合使病毒颗粒带上彩色乳胶，并在层析中被包被于新冠检测线的抗新冠病毒棘突蛋白S1的兔多抗结合而显色；如果检测样本中没有新冠病毒，则新冠检测线不显色。
MERS病毒是通过其表面的S1蛋白与人细胞膜上的DPP4受体相互作用形成特异性结合而感染人的。我们同样用DPP4受体蛋白替代其中一个抗MERS病毒S-蛋白单抗来标记彩色乳胶并喷涂于试纸条的释放垫上，检测时如果检测样本中有MERS病毒，则可通过DPP4与样本中的MERS病毒结合使病毒颗粒带上彩色乳胶，并在层析中被包被于MERS检测线的抗MERS病毒棘突蛋白S1的兔多抗结合而显色；如果检测样本中没有MERS病毒，则MERS检测线不显色。
同时，分别将抗甲型和抗乙型流感病毒的单抗(捕获型)标记彩色乳胶并喷涂于试纸条的释放垫上，检测时如果检测样本中有甲型或乙型流感病毒，则可通过单抗与样本中的病毒结合使其带上彩色乳胶，并在层析中被包被于甲流检测线的抗甲型流感病毒单抗(检测型)或乙流检测线的抗乙型流感病毒单抗(检测型)结合而显色；如果检测样本中没有流感病毒，则甲流和乙流检测线不显色。
本发明的优势在于除具有快速、简便、廉价、稳定好、可实现居家检测等优点外，采用配体与受体相互作用的原理，避免了单抗研发周期长、以及抗体交叉反的问题，既提高了检测特异性又可快速提供一种有效的试剂盒；同时采用兔多抗来夹心检测可进一步提高检测灵敏度。以ACE2受体检测新冠病毒，DPP4受体检测MERS病毒的另一个优势就是可以检测其所有突变株，同时不同冠状病毒间又不会产生交叉反应。对于普通民众来说是很难区分流感与新冠或MERS的，因而我们在一张试纸条上可以同时检测新冠、MERS、甲流和乙流，民众可平时作为居家检测，对于疫情防控具有重要意义。
所述的一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含彩色乳胶标记的抗新型冠状病毒S1蛋白多抗、彩色乳胶标记的抗MERS病毒S1蛋白多抗、彩色乳胶标记的捕获型抗甲型流感病毒单抗和彩色乳胶标记的捕获型抗乙型流感病毒单抗，并分别命名为L-nCoV、L-MERS、L-IFVA和L-IFVB。
所述的一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括两条独立的检测条，分别为检测条A和检测条B；
所述检测条A和检测条B均包括免疫层析试纸条，所述免疫层析试纸条包括底衬、硝酸纤维素膜、样品垫、释放垫和吸水纸；所述样品垫、释放垫、硝酸纤维素膜和吸水纸搭接组装在底衬上，释放垫和吸水纸分别叠压在硝酸纤维素膜的两端，并在硝酸纤维素膜的表面形成检测区；
检测条A中，其检测区的硝酸纤维素膜上设置靠近释放垫的二条检测线区T1和T2线、靠近吸水纸的一条控制线区C1线；将L-nCoV和L-IFVA混合喷涂于检测条A的释放垫上，并在检测条A的T1线、T2线和C1线分别包被检测型抗甲型流感病毒单抗、重组ACE2蛋白和质控抗体，获得所述检测条A；
检测条B中，其检测区的硝酸纤维素膜上设置靠近释放垫的二条检测线区T3和T4线、靠近吸水纸的一条控制线区C2线；将L-MERS和L-IFVB混合喷涂于检测条B的释放垫上，并在检测条B的T3线、T4线和C2线分别包被抗乙型流感病毒单抗、重组DPP4蛋白和质控抗体，获得所述检测条B；
将检测条A和检测条B组装于一张双联卡板，即构成所述的新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒；其中检测条A用于检测新型冠状病毒与甲型流感病毒，检测条B用于检测MERS与乙型流感病毒。
所述的一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒，其特征在于所L-nCoV和L-IFVA按照1:0.7～1.5的质量比混合喷涂于检测条A的释放垫上；所述L-MERS和L-IFVB按照1:0.7～1.5的质量比混合喷涂于检测条B的释放垫上。
所述的一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒，其特征在于所述C1线及C2线上的质控抗体均为羊抗兔IgG多抗。
所述的一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒，其特征在于所述抗新型冠状病毒S1蛋白多抗是兔抗新型冠状病毒S1蛋白多抗，且该多抗是由新型冠状病毒的重组S1蛋白免疫家兔，由抗原S1蛋白柱纯化，获得特异性的兔抗新型冠状病毒S1蛋白多抗，进一步用新型冠状病毒的重组S1蛋白RBD结构域柱去除RBD结合的抗体。
所述的一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒，其特征在于所述抗MERS病毒S1蛋白多抗是兔抗MERS病毒S1蛋白多抗，且该多抗由MERS病毒的重组S1蛋白免疫家兔，由抗原S1蛋白柱纯化，获得特异性的兔抗MERS病毒S1蛋白多抗，进一步用MERS病毒的重组S1蛋白RBD结构域柱去除RBD结合的抗体。
进一步地，一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒适用于粪便、尿液、呼吸道分泌物、眼泪及环境样本等的检测，能应用于新型冠状病毒、MERS、甲型流感病毒和乙型流感病毒的快速同时检测。
本发明取得的有益效果是：
1、本发明公开的试剂盒检测方便快速，3-15分种内可同时判断出4种不易区分的病毒性流行病。检测时，只要在试剂板的两个加样孔分别加样，在3-15分种内肉眼观察，在C1、C2质控线出现的情况下，测试甲型流感病毒的T1线、测试新型冠状病毒的T2线、测试乙型流感病毒的T3线和测试MERS病毒的T4线，哪条线出现即为相应病毒阳性；如果没有出现则为阴性。
2、本发明公开的试剂盒可以区分岀新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒，可应用于医院检测、居家检测、流行病调查、以及大规模筛查诊断，适用于全球冠状病毒和流感病毒疫情监控。
附图说明
图1为实施例3制备的检测条A的结构示意图；
图2为实施例3制备的检测条B的结构示意图；
图3为将检测条A和检测条B并联组装于一张双联卡板形成的试剂盒的结构示意图；
图4为使用实施例3制备的试剂盒对检测样本进行检测时，可能会出现的几种检测结果示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
以下实施例中重组ACE2蛋白、MERS蛋白均由杭州迈尔德生物科技有限公司提供。抗IFVA单抗(检测型)、抗IFVA单抗(捕获型)、抗IFVB单抗(检测型)和抗IFVB单抗(捕获型)均购自于杭州隆基生物技术有限公司。
实施例1 兔抗新冠病毒S1蛋白多抗和兔抗MERS病毒S1蛋白多抗的制备
1)免疫
(1)取体重2.5kg左右，健康的雄性新西兰大白兔；
(2)将纯化的重组新冠病毒S1蛋白用PBS(pH＝7.0)溶液配成200μg/850μl，加150μl 501免疫佐剂，混匀后立即肌注兔后大腿，左右各500μl，为初次免疫；
(3)初次免疫后第12天用同样的方法加强免疫一次；
(4)以后每隔10天用同样的方法加强免疫1次，共加强免疫3次；
(5)每次免疫一周后耳缘静脉取血100μl左右，用于测效价；
(6)最后一次免疫一周后ELISA测定血清效价，要求抗体滴度在1:100000以上。取全血，制备抗新冠病毒S1蛋白免疫血清。
用同样的方法，用纯化的重组MERS病毒S1蛋白免疫兔子，制备抗MERS病毒S1蛋白免疫血清。
2)抗体纯化
(1)用EDC/NHS法将纯化的重组新冠病毒S1蛋白偶联于羧基琼脂糖凝胶，制备成新冠病毒S1蛋白-琼脂糖；
(2)将制备好的抗新冠病毒S1蛋白免疫血清，过新冠病毒S1蛋白-琼脂糖柱，使抗新冠病毒S1蛋白抗体吸附在柱上；
(3)新冠病毒S1蛋白-琼脂糖柱用5-10倍体积的PBS(pH＝7.0)溶液清洗后，用pH＝2.5的甘氨酸-Hcl缓冲液洗脱下来，然后立即用pH＝9.0的Tis-HCl缓冲液中和；
(4)将洗脱后的抗体溶液，置换成含抗体5mg/ml的PBS(pH＝7.0)溶液；
(5)用EDC/NHS法将重组新冠病毒S1蛋白的RBD偶联于羧基琼脂糖凝胶，制备成新冠病毒RBD-琼脂糖；
(6)将步骤4得到的抗体溶液过新冠病毒RBD-琼脂糖柱，使抗RBD抗体结合在柱上，收集川流液，即为去除抗RBD抗体部分的兔抗新冠病毒S1蛋白多克隆抗体，命名为Rabbitanti-nCov S1 PAb，用于后续的乳胶标记；
用同样的方法制备去除抗RBD抗体部分的兔抗MERS病毒S1蛋白多克隆抗体，命名为Rabbit anti-MERS S1 PAb，用于后续的乳胶标记。
实施例2 L-nCov、L-MERS、L-IFVA、L-IFVB和L-RIgG的制备
将ACE2偶联于羧基彩色乳胶。具体步骤如下：
1)按羧基彩色乳胶产品说明书所述的EDC/NHS方法将实施例1制备的Rabbitanti-nCov S1 PAb偶联于羧基彩色乳胶，获得L-nCov；
2)同样将实施例1制备的Rabbit anti-MERS S1 PAb偶联于羧基彩色乳胶，获得L-MERS；
3)同样将抗IFVA单抗(捕获型)偶联于羧基彩色乳胶，获得L-IFVA；
4)同样将抗IFVB单抗(捕获型)偶联于羧基彩色乳胶，获得L-IFVB；
同样将兔IgG也偶联于羧基绿色乳胶，获得L-RIgG，用于试纸条质控系统。
实施例3 一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒的制备
1)将上述实施例2制备的L-nCov、L-IFVA和L-RIgG按1：1：1的质量比混合后用PBS(pH＝7.0)溶液稀释至总质量浓度0.6％，并喷涂在试纸条的释放垫上，37℃烘干12h即为释放垫A，备用；同样，将L-MERS、L-IFVB和L-RIgG混合后喷涂在试纸条的释放垫上，37℃烘干12h，即为释放垫B，备用。
2)用包被稀释液(150mM PB，pH 7.4)将抗IFVA单抗(检测型)、重组人源ACE2蛋白和羊抗兔IgG多克隆抗体(GAR)均稀释成0.5mg/mL，以膜液量30μL/30cm分别均匀喷涂划线于硝酸纤维素膜T1、T2检测线区和C1控制线区上，37℃烘干处理12h，封袋备用，为硝酸纤维素膜片材A。用包被稀释液(150mM PB，pH 7.4)将抗IFVB单抗(检测型)、重组人源DPP4蛋白和羊抗兔IgG多克隆抗体均稀释成0.5mg/mL，以膜液量30μL/30cm分别均匀喷涂划线于硝酸纤维素膜T3、T4检测线区和C2控制线区上，37℃烘干处理12h，封袋备用，为硝酸纤维素膜片材B。
将样品垫、释放垫、硝酸纤维素膜和吸水纸搭接组装在底衬上，释放垫和吸水纸分别叠压在硝酸纤维素膜的两端，样品垫叠压在释放垫上，组装后形成试纸板，切割成宽度3.78mm条状，制备检测条，共2种检测条；释放垫A与硝酸纤维素膜片材A搭配，为检测条A，可检测新冠病毒与甲型流感病毒；释放垫B与硝酸纤维素膜片材B搭配，为检测条B，可检测MERS与乙型流感病毒。将检测条A和检测条B并联组装于一张双联卡板，即得到所述的一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒。
本实施例3制备的检测条A的结构示意图如图1所示，检测条B的结构示意图如图2所示。将检测条A和检测条B并联组装于一张双联卡板形成的试剂盒的结构示意图如图3所示，从图3可以看出：试剂盒上有两个加样孔，左孔用于检测样品中是否表现出对新冠病毒与甲型流感病毒的阳性，右孔用于检测样品中是否表现出对MERS与乙型流感病毒的阳性。
使用实施例3制备的试剂盒对检测样本进行检测时，会出现的检测结果如图4所示。
实施例4 一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒的测试
基于本发明技术方案研发的一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒可应用于所有以ACE2为受体的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、以DPP4为受体的MERS病毒(MERS-CoV)、甲流和乙流的快速检测及其感染疾病的诊断；适合包括粪便、尿液、眼泪、口腔黏膜液、呼吸道分泌物、全血、血浆、血清等多种生物样本及环境样本的检测。
1)新型冠状病毒检测灵敏度实验：
以重组表达的SARS-CoV-2棘突蛋白S1为标准品，用pH＝7.4的PBS溶液分别配制成1、5、10、15、20nM的浓度，空白对照为pH＝7.4的PBS溶液。分别点样本发明的试纸条，每孔100μl，层析10-15分钟后肉眼观察T2线；每个浓度设5个重复，结果显示：空白对照、1nM浓度的S1蛋白新冠病毒、1nM浓度的S1蛋白新冠病毒进行测试时，检测区T2线均无显色，为阴性；5、10、15、20nM浓度的S1蛋白新冠病毒在T2线由弱到强呈现彩色线条，均为阳性，说明本发明的试纸条A对SARS-CoV-2棘突蛋白S1的检测灵敏度达到5nM浓度，结果见表1。
2)新型冠状病毒检测交叉反应实验：
使用本发明产品，对其他常见的传染病病原体进行了交叉反应测试。分别对人类流行的冠状病毒(HKU1、OC43、NL63和229E)、流感、普通病毒和肺炎支原体的样品进行三组平行对照实验，经过数据分析，本产品与人类流行的冠状病毒(HKU1、OC43、NL63和229E)、流感、普通病毒和肺炎支原体不发生交叉反应。
因为我们用ACE2受体蛋白去检测新冠病毒，除了对以ACE2受体为侵染机制的病毒有可能出现交叉反应外，对其它病毒应该没有交叉反应。但迄今为止，冠状病毒中新冠病毒的S1是已知与ACE2受体蛋白结合最强的配体蛋白，Kd≈15nM；其次是SARS-CoV的S1，Kd≈156nM，故有可能出现弱的交叉反应。使用实施例3制作的试剂盒，对一些冠状病毒和呼吸道病毒重组蛋白进行了交叉反应测试，包括SARS-CoV-2、SARS-CoV、NL63、MERS、HKU1、OC43和229E的S1蛋白，RSV(B1)的G蛋白，甲流H1N1的HA蛋白和乙流的HA蛋白；检测条A的T2检测线区对不同病毒重组蛋白的响应结果见表1。
表1试剂盒的T2检测线区对不同病毒重组蛋白的交叉反应测试的响应结果
病毒重组蛋白浓度(nM) 0.00 1 5 10 15 20
SARS-CoV-2的S1蛋白 - - + + ++ +++
SARS-CoV的S1蛋白 - - - - - +
HCoV-NL63的S1蛋白 - - - - - -
MERS-CoV的S1蛋白 - - - - - -
HCoV-229E的S1蛋白 - - - - - -
HCoV-HKU1的S1蛋白 - - - - - -
人RSV(B1)G蛋白 - - - - - -
甲流H1N1的HA蛋白 - - - - - -
乙型流感的HA蛋白 - - - - - -
注：表1中，-表示检测区T2线均无显色，为阴性；+、++、+++表示T2线由弱到强的相应信号，均为阳性。
从表1中可以看出，本申请试剂盒的检测区T2线对NL63、MERS、HKU1、OC43和229E的S1蛋白，RSV(B1)的G蛋白，甲流H1N1的HA蛋白和乙流的HA蛋白均没有应激响应。在对含多种病毒的样品进行测试时，不会出现交叉反应的情况。
3)MERS病毒检测灵敏度实验：
以重组表达的MERS棘突蛋白S1为标准品，用pH＝7.4的PBS溶液分别配制成5、10、15、20、25、30nM的浓度，空白对照为pH＝7.4的PBS溶液。分别点样本发明的试纸条，每孔100μl，层析10-15分钟后肉眼观察T4线；每个浓度设5个重复，结果显示：空白对照、5nM浓度的S1蛋白MERS病毒进行测试时，检测区T4线均无显色，为阴性；10nM、15nM、20nM、25nM和30nM浓度的S1蛋白MERS病毒进行测试时，检测区T4线由弱到强呈现彩色线条，均为阳性，说明本发明的试纸条对MERS棘突蛋白S1的检测灵敏度达到10nM浓度，。
4)MERS病毒检测交叉反应实验：
使用实施例3制作的试剂盒，对一些冠状病毒和呼吸道病毒重组蛋白进行了交叉反应测试，包括SARS-CoV-2、SARS-CoV、NL63、MERS、HKU1、OC43和229E的S1蛋白，RSV(B1)的G蛋白，甲流H1N1和乙流的HA蛋白；结果见表2。
表2试剂盒的T4检测线区对不同病毒重组蛋白的交叉反应测试的响应结果
Figure BDA0002590638690000121
Figure BDA0002590638690000131
注：表2中，-表示检测区T4线均无显色，为阴性；+、++、+++表示T2线由弱到强的相应信号，均为阳性。
从表2可以看出，本申请试剂盒的检测区T4线对SARS-CoV-2、SARS-CoV、NL63、HKU1、OC43和229E的S1蛋白，RSV(B1)的G蛋白，甲流H1N1和乙流的HA蛋白均没有应激响应。在对含多种病毒的样品进行测试时，不会出现交叉反应的情况。
5)甲/乙型流感病毒抗原检测试剂的质量评价和控制：
用甲/乙型流感病毒抗原检测试剂国家参考品(National Standard forInfluenza A/B Viral Antigens Detection Kit)(见表3)对实施例3制作的试剂盒的甲/乙型流感病毒抗原检测进行质量评价和控制。
(1)阳性参考品符合率：PC01-PC04乙型流感病毒均为阳性，甲型流感病毒为阴性；PC05-PC10甲型流感病毒均为阳性，乙型流感病毒为阴性；
(2)阴性参考品符合率：NC01-NC06甲型流感病毒和乙型流感病毒均为阴性；
(3)重复性：使用重复性参考品CV1和CV2各重复测定10次，CV1均为甲型流感病毒阳性、乙型流感病毒阴性，CV2均为乙型流感病毒阳性、甲型流感病毒阴性；且反应结果一致，显色度均一无差别。
Figure BDA0002590638690000141
(4)最低检出限：
S1：滴度不高于1.22×104TCID50/L(1:80稀释)，检测结果为甲型流感病毒阳性、乙型流感病毒阴性；
S2：滴度不高于3.25×104TCID50/L(1:40稀释)，检测结果为甲型流感病毒阳性、乙型流感病毒阴性；
S3：滴度不高于5.25×105TCID50/L(1:40稀释)，检测结果为乙型流感病毒阳性、甲型流感病毒阴性；
S4：滴度不高于1.00×104TCID50/L(1:10稀释)，检测结果为乙型流感病毒阳性、甲型流感病毒阴性；
S5：滴度不高于1.25×103TCID50/L(1:80稀释)，检测结果为甲型流感病毒阳性、乙型流感病毒阴性。
本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。

Claims (8)

1.一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含彩色乳胶标记的抗新型冠状病毒S1蛋白多抗、彩色乳胶标记的抗MERS病毒S1蛋白多抗、彩色乳胶标记的捕获型抗甲型流感病毒单抗和彩色乳胶标记的捕获型抗乙型流感病毒单抗，并分别命名为L-nCoV、L-MERS、L-IFVA和L-IFVB。
2.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括两条独立的检测条，分别为检测条A和检测条B；
所述检测条A和检测条B均包括免疫层析试纸条，所述免疫层析试纸条包括底衬、硝酸纤维素膜、样品垫、释放垫和吸水纸；所述样品垫、释放垫、硝酸纤维素膜和吸水纸搭接组装在底衬上，释放垫和吸水纸分别叠压在硝酸纤维素膜的两端，并在硝酸纤维素膜的表面形成检测区；
检测条A中，其检测区的硝酸纤维素膜上设置靠近释放垫的二条检测线区T1和T2线、靠近吸水纸的一条控制线区C1线；将L-nCoV和L-IFVA混合喷涂于检测条A的释放垫上，并在检测条A的T1线、T2线和C1线分别包被检测型抗甲型流感病毒单抗、重组ACE2蛋白和质控抗体，获得所述检测条A；
检测条B中，其检测区的硝酸纤维素膜上设置靠近释放垫的二条检测线区T3和T4线、靠近吸水纸的一条控制线区C2线；将L-MERS和L-IFVB混合喷涂于检测条B的释放垫上，并在检测条B的T3线、T4线和C2线分别包被抗乙型流感病毒单抗、重组DPP4蛋白和质控抗体，获得所述检测条B；
将检测条A和检测条B组装于一张双联卡板，即构成所述的新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒；其中检测条A用于检测新型冠状病毒与甲型流感病毒，检测条B用于检测MERS与乙型流感病毒。
3.如权利要求2所述的一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒，其特征在于所L-nCoV和L-IFVA按照1:0.7~1.5的质量比混合喷涂于检测条A的释放垫上；所述L-MERS和L-IFVB按照1:0.7~1.5的质量比混合喷涂于检测条B的释放垫上。
4.如权利要求2所述的一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒，其特征在于所述C1线及C2线上的质控抗体均为羊抗兔IgG多抗。
5.如权利要求2所述的一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒，其特征在于所述抗新型冠状病毒S1蛋白多抗是兔抗新型冠状病毒S1蛋白多抗，且该多抗是由新型冠状病毒的重组S1蛋白免疫家兔，由抗原S1蛋白柱纯化，获得特异性的兔抗新型冠状病毒S1蛋白多抗，进一步用新型冠状病毒的重组S1蛋白RBD结构域柱去除RBD结合的抗体。
6.如权利要求2所述的一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒，其特征在于所述抗MERS病毒S1蛋白多抗是兔抗MERS病毒S1蛋白多抗，且该多抗由MERS病毒的重组S1蛋白免疫家兔，由抗原S1蛋白柱纯化，获得特异性的兔抗MERS病毒S1蛋白多抗，进一步用MERS病毒的重组S1蛋白RBD结构域柱去除RBD结合的抗体。
7.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒用于粪便、尿液、呼吸道分泌物或眼泪待测样本的检测，能应用于新型冠状病毒、MERS、甲型流感病毒和乙型流感病毒的快速同时检测。
8.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒、MERS与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒能同时快速检测并区分出新型冠状病毒、MERS、甲型流感病毒和乙型流感病毒4种病毒；所述试剂盒可应用于医院检测、居家检测、流行病调查或大规模筛查诊断，且适用于全球冠状病毒和流感病毒的疫情监控。
CN202010694821.5A 2020-07-18 2020-07-18 一种新型冠状病毒、mers与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒 Pending CN111796093A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010694821.5A CN111796093A (zh) 2020-07-18 2020-07-18 一种新型冠状病毒、mers与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010694821.5A CN111796093A (zh) 2020-07-18 2020-07-18 一种新型冠状病毒、mers与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111796093A true CN111796093A (zh) 2020-10-20

Family

ID=72807791

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010694821.5A Pending CN111796093A (zh) 2020-07-18 2020-07-18 一种新型冠状病毒、mers与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111796093A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2746815C1 (ru) * 2020-12-24 2021-04-21 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) Способ выявления антител - иммуноглобулинов класса g в сыворотке крови к возбудителям тяжелых острых респираторных вирусных инфекций, включая sars-cov-2, с одновременным прогнозом тяжести протекания коронавирусной инфекции covid-19, на гидрогелевом биочипе
CN113588941A (zh) * 2021-07-18 2021-11-02 杭州迈尔德生物科技有限公司 一种基于间接胶体金法的新型冠状病毒中和抗体的检测方法及试剂盒
WO2022207863A1 (en) * 2021-03-31 2022-10-06 Randox Laboratories Ltd Coronavirus assay

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2746815C1 (ru) * 2020-12-24 2021-04-21 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) Способ выявления антител - иммуноглобулинов класса g в сыворотке крови к возбудителям тяжелых острых респираторных вирусных инфекций, включая sars-cov-2, с одновременным прогнозом тяжести протекания коронавирусной инфекции covid-19, на гидрогелевом биочипе
WO2022207863A1 (en) * 2021-03-31 2022-10-06 Randox Laboratories Ltd Coronavirus assay
CN113588941A (zh) * 2021-07-18 2021-11-02 杭州迈尔德生物科技有限公司 一种基于间接胶体金法的新型冠状病毒中和抗体的检测方法及试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11598775B2 (en) Method and devices for rapid diagnosis of foot-and-mouth disease
CN111796093A (zh) 一种新型冠状病毒、mers与甲/乙型流感病毒四合一快速检测试剂盒
EP2063270B1 (en) Rapid diagnosis method specific to avian influenza virus
JP5432453B2 (ja) Ａ型インフルエンザウイルス強毒株の検出法
Liu et al. Comparative research on nucleocapsid and spike glycoprotein as the rapid immunodetection targets of COVID-19 and establishment of immunoassay strips
CN103308684A (zh) 一种猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒
JP5827701B2 (ja) インフルエンザウイルスｈ５亜型の免疫検出法
JP5435844B2 (ja) インフルエンザウイルスｈ５亜型の免疫検出法
WO2020196296A1 (ja) イムノクロマト分析方法及び該方法に使用するテストストリップ
CN111896747A (zh) 检测新型冠状病毒IgM和IgG的免疫层析试纸
CN112305218A (zh) 一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫侧向层析检测方法及其应用
US11105804B1 (en) COVID-19 spike-ACE2 binding assay for drug and antibody screening
CN109799351A (zh) 猪圆环病毒2型双抗体夹心elisa试剂盒及其应用
WO2021224493A1 (en) Method for detecting corona virus
CN112745387B (zh) 抗猪塞尼卡谷病毒单克隆抗体及其应用
CN110320364A (zh) 一种双抗夹心胶体金检测试剂盒、及其制备方法与应用
Malbec et al. Agrodiag PorCoV: A multiplex immunoassay for the differential diagnosis of porcine enteric coronaviruses
JP2006067979A (ja) インフルエンザａ型ウイルスの免疫検出法
JP2023026069A (ja) 等電点９．５以上のタンパク質の免疫測定方法及びそれに用いる検体希釈液、並びにイムノクロマトグラフィーキット
US20230003724A1 (en) Immunoassay method and immunoassay apparatus
Shen et al. A flexible, pan-species, multi-antigen platform for the detection and monitoring of SARS-CoV-2-specific antibody responses
Hawthorne et al. Sensitive plaque neutralization assay for parainfluenza virus types 1, 2, and 3 and respiratory syncytial virus
KR102131844B1 (ko) 인플루엔자와 중동호흡기증후군을 동시에 검출하는 방법 및 키트
CN107389929A (zh) 一种h7亚型禽流感病毒荧光微球检测卡及其应用
JP5490669B2 (ja) 免疫検査試薬、それを用いる検査装置及び検査方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination