WO2020196295A1 - 呼吸器感染ウイルスの免疫学的分析方法及び検出キット - Google Patents

呼吸器感染ウイルスの免疫学的分析方法及び検出キット Download PDF

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WO2020196295A1
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respiratory tract
virus
anionic surfactant
tract infection
sample
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加奈子 東
翔平 家治
元喜 森田
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積水メディカル株式会社
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    • G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus

Definitions

  • the present invention relates to an immunological analysis method and a detection kit for detecting a respiratory tract infection virus such as influenza virus.
  • the present invention also relates to a sample diluent in an immunological analysis method for detecting a respiratory tract virus such as influenza virus.
  • Influenza virus is a single-stranded RNA virus belonging to the family Orthomyxoviridae. Influenza viruses are classified into three types, A, B, and C, based on the difference in antigenicity between M1 protein and NP protein. It is the A type and the B type that show a fashionable spread. Symptoms of influenza are systemic symptoms such as fever (usually high fever of 38 ° C. or higher), headache, general malaise, myalgia, and arthralgia. In addition, pneumonia may occur in the elderly and encephalopathy may occur in children, which may be fatal. In addition, it can cause a global pandemic.
  • POCT Point of Care Testing
  • an immunological method for detecting a virus that causes a respiratory tract infection using an antibody that specifically reacts with a respiratory tract infection virus is widely used.
  • immunization methods tend to involve non-specific reactions when contaminants such as cross-antigenic bacteria, viruses, and proteins are contained in the sample. Accurate determination may be hindered by such false positive reactions, which is a problem.
  • Patent Document 1 discloses that the measurement sensitivity of influenza M1 protein by immunoassay is improved by contacting a sample containing influenza virus with a specific nonionic surfactant. However, when we tested some of the nonionic surfactants used in Patent Document 1, we found that non-specific reactions occurred with respect to the detection of influenza virus.
  • Patent Document 2 discloses a medium composition for preparing a sample suspension solution, which contains an ionic surfactant and is used for immunoassay. However, only cationic or amphoteric surfactants are being tested. Furthermore, it is not possible to clearly identify whether the factor causing the effect is due to other factors other than the ionic surfactant, for example, the increase in the amount of arginine added or the addition of an ionic surfactant.
  • An object of the present invention is to provide an immunological analysis method for respiratory infectious viruses that suppresses non-specific reactions.
  • the present invention is as follows. ⁇ 1> (A) Contacting a biological sample that may contain a respiratory tract infection virus with an anionic surfactant and (B) Contacting the respiratory tract infection virus with a conjugate, first Forming a complex and (C) contacting the first complex with an antibody that immunologically reacts with the respiratory tract infection virus to form a second complex and (D) conjugating.
  • a method of immunological analysis of a respiratory tract virus including measuring a signal derived from.
  • a test strip for immunochromatography having the following constitution is used.
  • a test strip (1) breathing that includes the following (1) and (2) and in (1) or (2) where a conjugate containing a conjugate is provided between the sample supply and detection.
  • ⁇ 7> The immunological analysis method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the biological sample is respiratory secretions.
  • ⁇ 8> The immunological analysis method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the respiratory tract infection virus is influenza B virus.
  • the anionic surfactant is selected from the group consisting of a sulfonate-based anionic surfactant, a carboxylate-based anionic surfactant, a polyoxyethylene alkyl ether sodium sulfate-based anionic surfactant, and a combination thereof.
  • the immunological analysis method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8> The immunological analysis method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>.
  • Respiratory tract infection virus detection kit containing the following (1) and (2) (1) Detection reagent using an antibody against respiratory tract infection virus (2) Biological sample diluent containing anionic surfactant .. ⁇ 11> The respiratory tract infection virus detection kit according to ⁇ 10>, wherein the respiratory tract infection virus is an influenza virus. ⁇ 12> The respiratory tract infection virus detection kit according to ⁇ 10> or ⁇ 11>, which comprises a test strip for immunochromatography having the following configuration. A test strip (3) breathing that includes the following (3) and (4) and in (3) or (4) where a conjugate containing a conjugate is provided between the sample supply and detection.
  • Sample pad (4) A detector on which an antibody that immunologically reacts to a respiratory tract virus is immobilized, which has a sample supply unit that supplies the biological sample that may contain the respiratory tract virus.
  • An insoluble membrane carrier having at least one.
  • the respiratory tract infection virus detection kit according to any one of ⁇ 10> to ⁇ 14>, wherein the respiratory tract infection virus is influenza B virus.
  • the anionic surfactant is selected from the group consisting of a sulfonate-based anionic surfactant, a carboxylate-based anionic surfactant, a polyoxyethylene alkyl ether sodium sulfate-based anionic surfactant, and a combination thereof.
  • a biological sample diluent in an immunological detection method using an antibody against a respiratory tract infection virus which is the biological sample diluent containing an anionic surfactant.
  • ⁇ 18> The biological sample diluent according to ⁇ 17>, wherein the respiratory tract infection virus is an influenza virus.
  • ⁇ 20> The biological sample diluent according to any one of ⁇ 17> to ⁇ 19>, wherein the biological sample is a respiratory secretion.
  • ⁇ 21> The biological sample diluent according to any one of ⁇ 17> to ⁇ 20>, wherein the respiratory tract infection virus is influenza B virus.
  • the anionic surfactant is selected from the group consisting of a sulfonate-based anionic surfactant, a carboxylate-based anionic surfactant, a polyoxyethylene alkyl ether sodium sulfate-based anionic surfactant, and a combination thereof.
  • the biological sample diluent according to any one of ⁇ 17> to ⁇ 21>.
  • a biological sample that may contain a respiratory tract infection virus is brought into contact with an anionic surfactant, and then an antigen-antibody reaction is carried out to cause a non-specific reaction with a substance having cross-antigenicity. Can be effectively suppressed.
  • test strip used in one Embodiment of this invention It is a schematic block diagram of the test strip used in one Embodiment of this invention. It is a schematic block diagram of the test strip used in one Embodiment of this invention.
  • the respiratory tract infection virus which is the substance to be detected in the present invention, is a virus that causes respiratory diseases.
  • a virus that can be detected by utilizing an antigen-antibody reaction is preferable.
  • Respiratory syncytial virus is not limited to these, but coronaviruses such as coronavirus 229E, coronavirus OC43, and coronavirus NL63; influenza A virus, influenza B virus, influenza C virus, parainfluenza virus 1, parainfluenza virus 1, para.
  • Influenza viruses such as influenza virus 2 and parainfluenza virus 3; respiratory syncytial virus such as respiratory syncytial virus A and respiratory syncytial virus B; adenovirus; rhinovirus; metapneumovirus; cytomegalovirus; and bocavirus. it can. Among them, it is preferable to use influenza virus as the substance to be detected, and it is more preferable to use influenza B virus as the substance to be detected. Influenza A virus and type A virus and type A virus can be detected by forming a plurality of detection parts (for example, two places) described later. It is most preferable to detect influenza B virus.
  • respiratory organ is a general term for organs related to respiration, and includes organs from the nasal vestibule to the alveoli (lungs) via the nasal cavity, pharynx, larynx, trachea, bronchioles, and bronchioles.
  • Biological samples that may contain respiratory tract infection viruses used in the present invention include substances mainly derived from living organisms (organisms) such as body fluids and extracts obtained by extracting respiratory tract infection viruses from them. Can be mentioned. Specific examples of the substance derived from a living body (living body) include blood, urine, stool, and respiratory secretions. Among them, as the biological sample, respiratory secretions, specifically, nasal discharge, sputum, saliva and the like derived from the nostrils, nasal cavities, pharynx, nasopharynx and the like are preferable.
  • the above-mentioned biological substance and its extract may be used as a sample as it is, or may be appropriately diluted with a sample diluent to prepare a sample.
  • sample diluent may be referred to as a sample diluent, a sample extract, a sample developing solution, a sample suspension, or the like, but all of them are used interchangeably.
  • the anionic surfactant means a surfactant in which the hydrophobic group portion is negatively ionized when dissolved in water.
  • a surfactant that does not become an ion when dissolved in water is referred to as a nonionic surfactant
  • a surfactant in which the hydrophobic group portion is positively ionized is referred to as a cationic surfactant.
  • a surfactant that exhibits the properties of an anionic surfactant in the alkaline region and the properties of a cationic surfactant in the acidic region is referred to as an amphoteric surfactant.
  • anionic surfactant a sulfonate-based anionic surfactant, a carboxylate-based anionic surfactant, a polyoxyethylene alkyl ether sodium sulfate-based anionic surfactant and the like are preferable, and ⁇ -naphthalene sulfonate formalin condensate sodium More preferred are anionic surfactants selected from the group consisting of salts, special polycarboxylic acid type polymer surfactants, sodium polyoxyethylene lauryl ether sulfates, sodium polyoxyethylene alkyl ether sulfates, and combinations thereof.
  • ⁇ -naphthalene sulfonic acid formalin condensate sodium salt (trade name: Demor NL) as a sulfonate-based anionic surfactant; special polycarboxylic acid-type polymer surfactant as a carboxylate-based anionic surfactant.
  • Agent (trade name: Demol EP); Polyoxyethylene alkyl ether sodium sulfate-based anionic surfactant, polyoxyethylene lauryl ether sulfate sodium (trade name: Emar 20C), polyoxyethylene alkyl ether sulfate sodium (trade name: Emar) 20CM) and the like.
  • These anionic surfactants can be used alone or in combination of two or more.
  • sulfonate-type anionic surface active agent refers to a surfactant which is a salt of a substance having a sulfonic group (-SO 3 H), "carboxylate-type anionic surfactant
  • the "agent” refers to an anionic surfactant which is a salt of a substance having a carboxylic acid group (-COOH), and the “polyoxyethylene alkyl ether sodium sulfate-based anionic surfactant” refers to a polyoxyethylene alkyl ether sodium sulfate. It means an anionic surfactant having a chemical structure. It is also possible to use other types of surfactants in addition to the anionic surfactants, as long as the effects of the present invention are not impaired. It is preferable not to use other types of surfactants.
  • the concentration of the anionic surfactant can be adjusted as appropriate depending on the type of the anionic surfactant and the immunological analysis method, for example, for mixing with a biological sample containing the anionic surfactant.
  • the concentration in the sample diluent or the concentration in the impregnating solution for impregnating the insoluble surfactant containing an anionic surfactant is 0.01 to 10% by mass, preferably 0.1 from the viewpoint of the non-specific reaction suppressing effect. It is -10% by mass, more preferably 0.2 to 10% by mass, still more preferably 0.25 to 10% by mass, and most preferably 0.3 to 10% by mass.
  • the upper limit may be 8% by mass, 5% by mass, 3% by mass, or 2% by mass.
  • the means for contacting the biological sample with the anionic surfactant is not particularly limited as long as the effects of the present invention can be obtained.
  • the sample diluent may contain an anionic surfactant or may be present in the measurement system from the beginning. It is preferable that the sample diluent contains an anionic surfactant and the sample diluent and the biological sample are mixed.
  • a conjugate is an antibody immobilized on a label that immunologically reacts to a respiratory tract infection virus.
  • the conjugate pad may exist in a state of being impregnated with a pad other than the sample pad, the third pad, and the insoluble membrane (type A), or a part of the sample pad or insoluble. It may be present as a conjugate on a portion of the membrane (type B) or as a separate conjugate reagent to be mixed with the specimen (type C).
  • the label used in the present invention a known label that has been conventionally used for detecting a respiratory tract virus can be used.
  • the conjugate preferably has an anti-influenza virus monoclonal antibody immobilized on gold colloidal particles.
  • test strip in which the existence mode of the conjugate is the above type A will be described.
  • the sample pad, the conjugate pad, the third pad, and the insoluble membrane are arranged in this order from the upstream to the downstream in the sample flow direction.
  • Each layer is arranged so as to at least partially overlap the upper and lower layers.
  • a test strip of such an arrangement example is shown in FIG.
  • the first complex is then passed through a porous third pad located in contact with the underside of the conjugate pad and developed into an insoluble membrane.
  • An antibody that immunologically reacts to a respiratory tract virus is immobilized on a part of the insoluble membrane.
  • the first complex and the antibody that immunologically reacts with the respiratory tract infection virus are bound by an immune reaction and fixed as the second complex.
  • the immobilized second complex is detected by means for detecting signals such as absorbance, reflected light, fluorescence, and magnetism derived from the conjugate.
  • the anionic surfactant may be contained in the sample diluent, may be present in the measurement system from the beginning, or may be contained in the sample pad, for example.
  • FIG. 2 shows a test strip of an arrangement example in which a sample supply portion and a conjugate portion are configured as a part of the sample pad.
  • the sample supply section is a site for supplying a sample containing a respiratory tract infection virus
  • the conjugate section is a site containing a conjugate
  • the sample supply section is on the upstream side of the conjugate section.
  • the conjugate portion is formed on the sample pad or the insoluble membrane carrier on the downstream side of the sample supply portion.
  • the conjugate portion is arranged in a line in a direction orthogonal to the sample development direction, that is, the line connecting the center of the sample supply portion of the sample pad and the center of the downstream end portion of the insoluble membrane carrier described later. Is preferable.
  • the line-shaped conjugate portions are preferably arranged in a line shape in a direction perpendicular to the longitudinal direction of the sample pad and the insoluble membrane carrier.
  • the conjugate portion may be located upstream of the detection portion of the insoluble membrane carrier, but is preferably formed on the sample pad. In this case, it is not necessary that all of the sample pad downstream from the conjugate portion is the conjugate portion, and a porous material portion that does not contain the conjugate may be present on the further downstream side of the conjugate portion.
  • the position of the conjugate portion can be appropriately adjusted by those skilled in the art, but the center line of the line of the conjugate portion is arranged at least 3 mm or more upstream from the downstream end of the sample pad. It is preferable to have.
  • the "center line" of the conjugate portion or the detection portion means a center line drawn in a direction perpendicular to the longitudinal direction of the sample pad, and is a direction parallel to the longitudinal direction of the sample pad. It does not mean the center line drawn by.
  • the first complex forms a second complex with an antibody that immunologically reacts to the respiratory tract infection virus immobilized on the detection part.
  • the second complex fixed to the detection unit is detected by means for detecting signals such as absorbance, reflected light, fluorescence, and magnetism derived from the conjugate.
  • the anionic surfactant may be contained in the sample diluent, may be present in the measurement system from the beginning, or may be contained in the sample pad, for example.
  • a test strip having a type C conjugate will be described.
  • the difference from the Type A test strip is that there is no conjugate pad and the conjugate exists as a separate conjugate reagent.
  • a filter chip having a conjugate built in the filter can be mentioned.
  • the conjugate and the respiratory tract virus bind to each other to form a first complex (aggregate).
  • an antibody that immunologically reacts to the respiratory tract infection virus is fixed.
  • a second complex is formed at the detection unit. Then, the fixed second complex is detected by means for detecting signals such as absorbance, reflected light, fluorescence, and magnetism derived from the conjugate.
  • the antibody used in the present invention that immunologically reacts with a respiratory tract infection virus is an antibody capable of binding to a respiratory tract infection virus.
  • Antibodies that immunologically respond to respiratory infection viruses are immobilized on the label and detector.
  • the label and the antibody immobilized on the detection unit may be the same, but it is preferable that the label and the detection unit are different.
  • the reactivity of the respiratory tract infection virus bound to the conjugate and the antibody of the detection part can be increased.
  • the sensitivity of the immunochromatographic test strip is improved.
  • another thing means that it is a different kind, and it means that it is an antibody that recognizes a different epitope.
  • the antibody immobilized on the label and the detection part is preferably a monoclonal antibody. By using a monoclonal antibody, the specificity of the reaction can be increased.
  • functional fragments of antibodies having antigen-antibody reaction activity are also treated as antibodies in the present invention.
  • Examples of the functional fragment of the antibody include those obtained through an immunization process on animals, those obtained by using gene recombination technology, and chimeric antibodies.
  • Examples of the functional fragment of the antibody include F (ab') 2 , Fab'and the like. These functional fragments can be produced by treating the antibody with a proteolytic enzyme (eg, pepsin, papain, etc.).
  • sample pad The sample pad is laminated with the conjugate pad or the insoluble membrane carrier so that the lower surface of the downstream end thereof contacts the upper surface of the conjugate pad or the insoluble membrane carrier described later.
  • porous material constituting the sample pad include pads made of non-woven fibers such as paper, cellulose mixture, nitrocellulose, polyester, acrylonitrile copolymer, glass, rayon and the like. Of these, a pad made of glass fiber (a pad made of glass fiber) is preferable.
  • the third pad is placed between the conjugate pad and the insoluble membrane in the Type A test strip for the purpose of removing non-specific reactants in the biological sample. It is desirable that the third pad is arranged as needed depending on the properties of the sample and the like, and any third pad may be used as long as it can permeate the complex of the respiratory tract virus and the conjugate in the sample.
  • the insoluble membrane carrier that can be used in the present invention has at least one detector on which an antibody that immunologically reacts to a respiratory tract infection virus is immobilized. Immobilization of an antibody that immunologically reacts to a respiratory tract infection virus on an insoluble membrane carrier can be performed by a known method. In the case of a lateral flow type immunochromatographic reagent, a solution containing the above antibody at a predetermined concentration is prepared. Then, the antibody is obtained by applying the liquid to the insoluble membrane carrier in a line shape and drying it using a device or the like having a mechanism capable of moving the liquid horizontally while discharging the liquid from the nozzle at a constant speed. It can be immobilized on an insoluble membrane carrier.
  • a solution containing the above antibody at a predetermined concentration can be prepared by adding the antibody to the buffer solution.
  • the type of the buffer solution include commonly used buffer solutions such as phosphate buffer solution, Tris buffer solution, and Good's buffer solution.
  • the pH of the buffer is preferably in the range of 6.0 to 9.5, more preferably 6.5 to 8.5, and even more preferably 7.0 to 8.0.
  • the buffer solution may further contain salts such as sodium chloride, stabilizers such as sugars, preservatives, preservatives such as proclin, and the like. Salts include those added for the purpose of adjusting the ionic strength, such as sodium chloride, and those added for the purpose of adjusting the pH of the buffer solution, such as sodium hydroxide.
  • the membrane constituting the insoluble membrane carrier that can be used in the present invention
  • a known membrane that has been conventionally used as an insoluble membrane carrier for immunochromatographic test strips can be used.
  • membranes composed of fibers made of polyethylene, polyethylene terephthalate, nylons, glass, polysaccharides such as cellulose and cellulose derivatives, and ceramics Specific examples thereof include glass fiber filter paper and nitrocellulose membrane commercially available from Sartorius, Millipore, Toyo Filter Paper, Whatman and the like.
  • an absorbent pad is installed at the downstream end of the insoluble membrane carrier.
  • Absorbent pads are liquid-absorbent sites that control the development of samples by absorbing the samples that have moved and passed through the insoluble membrane carrier.
  • known absorption pads conventionally used for immunochromatographic test strips can be used, and for example, filter paper can be used.
  • the non-specific reaction is derived from a conjugate even though the respiratory tract virus to be detected is not present in the biological sample or is substantially absent such as below the detection limit. It means that the signal to be detected is detected and it is judged as positive.
  • the method for immunological analysis of respiratory tract infection virus including steps (A) to (D) of the present invention is a non-specific reaction in the method for immunological analysis of respiratory tract infection virus including steps (A) to (D). It can be a suppression method, preferably a non-specific reaction suppression method in an immunological analysis method for influenza virus, including steps (A) to (D), and more preferably steps (A) to. It can be a non-specific reaction suppression method in the immunological analysis method of influenza B virus including (D).
  • immunochromatography means an immunoassay method applying the property (capillary phenomenon) in which a subject slowly flows on a porous material such as a cellulose membrane while dissolving a reagent.
  • the immunochromatographic test strip is preferably placed on a solid support such as a plastic pressure-sensitive adhesive sheet.
  • the solid phase support is composed of a substance that does not interfere with the capillary flow of the sample and the conjugate.
  • the test strip for immunochromatography may be fixed on the solid phase support with an adhesive or the like. In this case, even the components of the adhesive are composed of a substance that does not interfere with the capillary flow of the sample and the conjugate.
  • the immunochromatographic test strip is placed in an appropriate container (housing) in consideration of the size of the immunochromatographic test strip, the sample addition method and addition position, the formation position of the detection part of the insoluble membrane carrier, the signal detection method, and the like. It can be stored and mounted for use. The state of being stored and mounted in this way is called a "device".
  • test strip for immunochromatography can be prepared by appropriately modifying or modifying the method described in Examples.
  • anti-influenza virus monoclonal antibody Preparation of anti-influenza virus monoclonal antibody.
  • the anti-influenza virus monoclonal antibody and anti-influenza B virus monoclonal antibody used in the following tests use recombinant influenza nuclear protein as an antigen, immunize mice, and are usually performed by those skilled in the art to produce a monoclonal antibody. Was obtained using.
  • test strip preparation Preparation of test strip for immunochromatography 1) Preparation of gold colloidal particle-labeled anti-influenza virus monoclonal antibody (conjugate) 100 ⁇ g / mL of anti-influenza virus monoclonal antibody and anti-influenza virus monoclonal antibody Each PBS contained at the concentration of was prepared. 1 mL of each antibody solution was added to 20 mL of 1 OD / mL gold colloidal particle solution, and the mixture was stirred at room temperature for 10 minutes.
  • insoluble membrane carrier (antibody-fixed membrane) on which anti-influenza virus monoclonal antibody is immobilized
  • Anti-A adjusted to 0.75 mg / mL with phosphate buffer at one end of a short side of a nitrocellulose membrane (pore size 8 ⁇ m).
  • Influenza virus monoclonal antibody, anti-influenza virus monoclonal antibody adjusted to 1.0 mg / mL, and anti-mouse IgG antibody adjusted to 0.75 mg / mL are lined in a direction perpendicular to the longitudinal direction of the insoluble membrane carrier. It was applied in the form. Then, it was dried at 70 ° C. for 45 minutes to prepare an antibody-fixed membrane. The line was applied in the order of influenza A virus monoclonal antibody (c1), anti-influenza B virus monoclonal antibody (c2), and control antibody (c3) from the upstream side when the test strip was assembled.
  • test strip for immunochromatography The sample pad prepared in 2) was laminated on the insoluble membrane carrier obtained in 3) to prepare a test strip for immunochromatography.
  • Example 1 Using the test strip for immunochromatography prepared in the above test strip preparation example 1, a detection test for influenza A and B viruses was performed.
  • Test method (1) Sample The nasal mucus of a healthy subject not suffering from influenza was diluted by mixing with a sample diluent containing each surfactant at a concentration of 1%, and used as a sample. (2) Procedure Dispense 135 ⁇ L of the sample prepared in (1) above into a test tube, insert a strip for immunochromatography, and after 5, 15, 30, and 45 minutes, a test line on the antibody-fixed membrane of the detection portion. The presence or absence of color development of A and B was visually determined. 2. 2.
  • Test Results Tables 1 and 2 show the results of determining the presence or absence of color development on the test line B, which indicates the detection of influenza B virus. Demor, Emar, Anchtor, Emargen, and Tween are registered trademarks. In the table, "-" indicates that the test line B, which indicates the detection of influenza B virus, did not develop color and false positives did not occur, and "+” indicates that the line developed color and false positives occurred. .. All the samples to which the nonionic surfactant was added caused a non-specific reaction 30 minutes after the strip for immunochromatography was inserted, and all the samples to which the anionic surfactant or the amphoteric surfactant was added did not cause a non-specific reaction. It was.
  • Test line A which shows the detection of influenza A virus, did not produce a non-specific reaction in all the samples tested. Therefore, it was shown that by adding an anionic surfactant or an amphoteric surfactant to the sample diluent, the non-specific reaction that occurs in the detection of influenza B virus can be prevented.
  • Example 2 [Example 2] 1.
  • Test method A detection test for influenza A and B viruses was performed in the same manner as in Example 1 except that the type and concentration of the surfactant were changed.
  • 2. Test Results Tables 3, 4, and 5 below show the results of determining the presence or absence of color development on the test line B, which indicates the detection of influenza B virus.
  • "-" indicates that the test line B indicating the detection of influenza B virus was not colored and false positives did not occur
  • "+" indicates that the line was detected and colored and false. Represents a positive occurrence.
  • the sample to which 0.5% of Emar 20CM was added did not cause a non-specific reaction, but the sample to which 0.25% was added produced a slight non-specific reaction 45 minutes after the reaction.
  • Example 3 1. Test Method In order to verify the reproducibility, a detection test for influenza A and B viruses was performed in the same manner as in Example 2 using the nasal mucus of another healthy subject not suffering from influenza. .. 2. 2. Test Results Tables 6 and 7 show the results of determining the presence or absence of color development on the test line B, which indicates the detection of influenza B virus. In Tables 6 to 7, "-" indicates that the test line B indicating the detection of influenza B virus was not colored and false positives did not occur, and "+” indicates that the line was detected and colored and was false. Represents a positive occurrence.
  • Example 2 Similar to Example 2, a sample to which 0.5% to 2.00% of Emar 20C was added did not cause a non-specific reaction, but a sample to which 0.25% was added showed a slight non-specific reaction 45 minutes after the reaction. occured. Therefore, the reproducibility of Example 2 was confirmed. In addition, influenza A virus did not produce a non-specific reaction in all the samples tested.

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Abstract

非特異反応を抑制した、呼吸器感染ウイルスの免疫学的分析方法を行うことを課題とする。　（Ａ）呼吸器感染ウイルスを含有する可能性のある生物学的サンプルとアニオン界面活性剤とを接触させることと、（Ｂ）前記呼吸器感染ウイルスとコンジュゲートとを接触させ、第一複合体を形成させることと、（Ｃ）前記第一複合体と前記呼吸器感染ウイルスに対して免疫学的に反応する抗体とを接触させ、第二複合体を形成させることと、（Ｄ）コンジュゲートに由来するシグナルを測定することとを含む、呼吸器感染ウイルスの免疫学的分析方法により、前記課題を解決することができる。

Description

呼吸器感染ウイルスの免疫学的分析方法及び検出キット
　本発明は、インフルエンザウイルス等の呼吸器感染ウイルスを検出するための免疫学的分析方法及び検出キットに関する。本発明は、インフルエンザウイルス等の呼吸器感染ウイルスを検出するための免疫学的分析方法におけるサンプル希釈液にも関する。
　ヒトなどの哺乳類の呼吸器に感染するウイルスとしては、ＲＳウイルス、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス及びアデノウイルス等がある。その中でも、インフルエンザは流行性のウイルス性呼吸器感染症であり、幅広い年齢層が罹患する疾患である。インフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルス科に属する一本鎖ＲＮＡウイルスである。インフルエンザウイルスは、Ｍ１タンパク質とＮＰタンパク質の抗原性の違いに基づき、Ａ、Ｂ、及びＣの３型に分類される。流行的な広がりを見せるのは、Ａ型とＢ型である。インフルエンザの症状は、発熱（通常３８℃以上の高熱）、頭痛、全身倦怠感、筋肉痛、及び関節痛などの全身症状である。また、高齢者では肺炎、小児では脳症などを併発する場合があり、致命的になることがある。さらに、世界的な大流行（パンデミック）を引き起こすこともある。
　呼吸器感染症に対しては、感染初期の未だ重症化していない時期に治療を開始するため、及び家族や友人に伝染させないためにも早期診断が重要となる。そこで患者の傍らでリアルタイムに実施して、診断及び治療に役立つ有益な情報を迅速に得るＰＯＣＴ（ポイントオブケアテスティング）が実施されている。ＰＯＣＴにおいて、呼吸器感染ウイルスに特異的に反応する抗体を用いて呼吸器感染症の原因となるウイルスを検出する免疫法が広く行われている。しかしながら、このような免疫法では、交差抗原性の細菌、ウイルス、タンパク質などの夾雑物が検体中に含まれているときに、非特異的な反応を伴いやすい。そのような偽陽性反応により正確な判定が妨げられる場合もあり、問題となっている。
　特許文献１は、インフルエンザウイルスを含む検体を、特定の非イオン界面活性剤と接触させることにより、免疫測定によるインフルエンザＭ１タンパク質の測定感度が向上することを開示する。しかしながら、本発明者らが特許文献１において使用されている非イオン性界面活性剤のいくつかを試験したところ、インフルエンザウイルスの検出に関して非特異反応が生じる結果となっている。
　特許文献２は、イオン性界面活性剤を含む免疫測定に供する検体浮遊液調製用媒体組成物を開示する。しかしながら、試験されているのはカチオン界面活性剤又は両性界面活性剤のみである。さらに、効果を生じる要因が、イオン性面活性剤ではない他の要因、例えばアルギニンの添加量増加によるものなのか、イオン性界面活性剤の添加によるものなのかを明確に特定できない。
国際公開２０１５／０３７６３５号パンフレット 特開２００５－２９１７８３号公報
　本発明の目的は、非特異反応を抑制した、呼吸器感染ウイルスの免疫学的分析方法を提供することである。
　本発明者らは、呼吸器感染ウイルスを含む可能性のある生物学的サンプルとアニオン界面活性剤とを接触させ、その後、抗原－抗体反応を行うこと、すなわち前記呼吸器感染ウイルスとコンジュゲートとを反応させることにより、非特異反応を効果的に抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は具体的には、以下の通りである。
＜１＞（Ａ）呼吸器感染ウイルスを含有する可能性のある生物学的サンプルとアニオン界面活性剤とを接触させることと
（Ｂ）前記呼吸器感染ウイルスとコンジュゲートとを接触させ、第一複合体を形成させることと
（Ｃ）前記第一複合体と前記呼吸器感染ウイルスに対して免疫学的に反応する抗体とを接触させ、第二複合体を形成させることと
（Ｄ）コンジュゲートに由来するシグナルを測定することと
を含む、呼吸器感染ウイルスの免疫学的分析方法。
＜２＞前記呼吸器感染ウイルスが、インフルエンザウイルスである、＜１＞に記載の免疫学的分析方法。
＜３＞イムノクロマトグラフィーを利用する、＜１＞又は＜２＞に記載の免疫学的分析方法。
＜４＞下記の構成を有するイムノクロマトグラフィー用テストストリップを使用すること
を特徴とする、＜３＞に記載の免疫学的分析方法。
以下の（１）および（２）を含み、（１）または（２）において、サンプル供給部と検出部の間に、コンジュゲートを含有するコンジュゲート部が設けられているテストストリップ
（１）呼吸器感染ウイルスを含有する可能性のある前記生物学的サンプルを供給するサンプル供給部を有する、サンプルパッド
（２）呼吸器感染ウイルスに対して免疫学的に反応する抗体が固定された検出部を少なくとも１つ有する、不溶性メンブレン担体。
＜５＞前記工程（Ａ）が、前記生物学的サンプルと、前記アニオン界面活性剤を含むサンプル希釈液とを混合する工程である、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
＜６＞前記アニオン界面活性剤を含むサンプル希釈液におけるアニオン界面活性剤の濃度が、０．１～１０質量％である、＜５＞に記載の免疫学的分析方法。
＜７＞前記生物学的サンプルが呼吸器分泌液である、＜１＞～＜６＞のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
＜８＞前記呼吸器感染ウイルスが、Ｂ型インフルエンザウイルスである、＜１＞～＜７＞のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
＜９＞前記アニオン界面活性剤が、スルホン酸塩系アニオン界面活性剤、カルボン酸塩系アニオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム系アニオン界面活性剤、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、＜１＞～＜８＞のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
＜１０＞以下の（１）および（２）を含む、呼吸器感染ウイルス検出キット
（１）呼吸器感染ウイルスに対する抗体を用いた検出試薬
（２）アニオン界面活性剤を含む生物学的サンプル希釈液。
＜１１＞前記呼吸器感染ウイルスが、インフルエンザウイルスである、＜１０＞に記載の呼吸器感染ウイルス検出キット。
＜１２＞下記の構成を有するイムノクロマトグラフィー用テストストリップを含む、＜１０＞又は＜１１＞に記載の呼吸器感染ウイルス検出キット。
以下の（３）および（４）を含み、（３）または（４）において、サンプル供給部と検出部の間に、コンジュゲートを含有するコンジュゲート部が設けられているテストストリップ
（３）呼吸器感染ウイルスを含有する可能性のある前記生物学的サンプルを供給するサンプル供給部を有する、サンプルパッド
（４）呼吸器感染ウイルスに対して免疫学的に反応する抗体が固定された検出部を少なくとも１つ有する、不溶性メンブレン担体。
＜１３＞前記アニオン界面活性剤を含むサンプル希釈液におけるアニオン界面活性剤の濃度が、０．１～１０質量％である、＜１０＞～＜１２＞のいずれかに記載の呼吸器感染ウイルス検出キット。
＜１４＞前記生物学的サンプルが、呼吸器分泌液である、＜１０＞～＜１３＞のいずれかに記載の呼吸器感染ウイルス検出キット。
＜１５＞前記呼吸器感染ウイルスが、Ｂ型インフルエンザウイルスである、＜１０＞～＜１４＞のいずれかに記載の呼吸器感染ウイルス検出キット。
＜１６＞前記アニオン界面活性剤が、スルホン酸塩系アニオン界面活性剤、カルボン酸塩系アニオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム系アニオン界面活性剤、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、＜１０＞～＜１５＞のいずれかに記載の呼吸器感染ウイルス検出キット。
＜１７＞呼吸器感染ウイルスに対する抗体を用いた免疫学的検出方法における生物学的サンプル希釈液であって、アニオン界面活性剤を含む前記生物学的サンプル希釈液。
＜１８＞前記呼吸器感染ウイルスが、インフルエンザウイルスである、＜１７＞に記載の生物学的サンプル希釈液。
＜１９＞前記アニオン界面活性剤の濃度が、０．１～１０質量％である、＜１７＞又は＜１８＞に記載の生物学的サンプル希釈液。
＜２０＞前記生物学的サンプルが、呼吸器分泌液である、＜１７＞～＜１９＞のいずれかに記載の生物学的サンプル希釈液。
＜２１＞前記呼吸器感染ウイルスが、Ｂ型インフルエンザウイルスである、＜１７＞～＜２０＞のいずれかに記載の生物学的サンプル希釈液。
＜２２＞前記アニオン界面活性剤が、スルホン酸塩系アニオン界面活性剤、カルボン酸塩系アニオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム系アニオン界面活性剤、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、＜１７＞～＜２１＞のいずれかに記載の生物学的サンプル希釈液。
　本発明は、呼吸器感染ウイルスを含む可能性のある生物学的サンプルとアニオン界面活性剤とを接触させ、その後、抗原－抗体反応を行うことにより、交差抗原性を有する物質による非特異反応を効果的に抑制できる。
本発明の一実施形態において使用するテストストリップの模式構成図である。 本発明の一実施形態において使用するテストストリップの模式構成図である。
（呼吸器感染ウイルス）
　本発明における被検出物質である呼吸器感染ウイルスは、呼吸器系疾患の原因となるウイルスである。本発明における呼吸器感染ウイルスとしては、抗原抗体反応を利用して検出され得るウイルスが好ましい。
　呼吸器感染ウイルスは、これらに限定されないが、コロナウイルス２２９Ｅ、コロナウイルスＯＣ４３、及びコロナウイルスＮＬ６３等のコロナウイルス；Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス１、パラインフルエンザウイルス２、及びパラインフルエンザウイルス３等のインフルエンザウイルス；ＲＳウイルスＡ型及びＲＳウイルスＢ型等のＲＳウイルス；アデノウイルス；ライノウイルス；メタニューモウイルス；サイトメガロウイルス；並びにボカウイルス等を挙げることができる。中でも、インフルエンザウイルスを被検出物質とするのが好ましく、Ｂ型インフルエンザウイルスを被検出物質とするのがより好ましく、後述する検出部を複数箇所（例えば２箇所）形成して、Ａ型インフルエンザウイルスおよびＢ型インフルエンザウイルスを検出することが最も好ましい。
　なお、本明細書において「呼吸器」とは、呼吸に関係する器官の総称であり、鼻前庭から、鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支、細気管支を経た肺胞（肺）までの器官をいう。
（生物学的サンプル）
　本発明において使用される、呼吸器感染ウイルスを含有する可能性のある生物学的サンプルとしては、体液などの主に生体（生物）由来の物質やそれらから呼吸器感染ウイルスを抽出した抽出液等が挙げられる。生体（生物）由来の物質としては、具体的には、血液、尿、便、及び呼吸器分泌液が挙げられる。中でも、生物学的サンプルとしては、呼吸器分泌液、具体的には、鼻孔・鼻腔・咽頭・鼻咽頭などを由来とする鼻汁液、喀痰、又は唾液等が好ましい。上記の生体（生物）由来物質やその抽出液は、そのままサンプルとして用いてもよく、適宜サンプル希釈液によって希釈してサンプルとしてもよい。また、適宜濾過したものをサンプルとして用いてもよい。なお、サンプル希釈液は、検体希釈液、サンプル抽出液、サンプル展開液、サンプル浮遊液などと呼ばれることもあるが、いずれも同義で用いられる。
（アニオン界面活性剤）
　本明細書において、アニオン界面活性剤とは、水に溶解した時に、疎水基の部分がマイナス（負）に電離する界面活性剤を意味する。本明細書では、水に溶解した時に、イオンとならない界面活性剤を、非イオン性界面活性剤と称し、疎水基の部分がプラス（正）に電離する界面活性剤をカチオン界面活性剤と称し、アルカリ性領域ではアニオン界面活性剤の性質を、酸性領域ではカチオン界面活性剤の性質を示す界面活性剤を両性界面活性剤と称する。
　アニオン界面活性剤としては、スルホン酸塩系アニオン界面活性剤、カルボン酸塩系アニオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム系アニオン界面活性剤等が好ましく、β‐ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物ナトリウム塩、特殊ポリカルボン酸型高分子界面活性剤、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるアニオン界面活性剤がより好ましい。具体的には、スルホン酸塩系アニオン界面活性剤としてβ‐ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物ナトリウム塩（商品名：デモールＮＬ）；カルボン酸塩系アニオン界面活性剤として特殊ポリカルボン酸型高分子界面活性剤（商品名：デモールＥＰ）；ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム系アニオン界面活性剤として、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム（商品名：エマール２０Ｃ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム（商品名：エマール２０ＣＭ）等が挙げられる。これらのアニオン界面活性剤は単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
　なお、本明細書において、「スルホン酸塩系アニオン界面活性剤」とは、スルホン酸基（－ＳＯ３Ｈ）を有する物質の塩である界面活性剤をいい、「カルボン酸塩系アニオン界面活性剤」とはカルボン酸基（－ＣＯＯＨ）を有する物質の塩であるアニオン界面活性剤をいい、「ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム系アニオン界面活性剤」とは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウムの化学構造を有するアニオン界面活性剤を意味する。
　本発明の効果を損なわない範囲内で、アニオン界面活性剤に加えて、他の種類の界面活性剤を使用することも可能である。他の種類の界面活性剤は使用しないことが好ましい。
　アニオン界面活性剤の濃度は、アニオン界面活性剤や免疫学的分析方法の種類に応じて適宜調整することが可能であるが、例えば、アニオン界面活性剤を含む、生物学的サンプルと混合するためのサンプル希釈液における濃度、又はアニオン界面活性剤を含む、不溶性メンブレンに含浸させるための含浸液における濃度において、非特異反応抑制効果の観点から、０．０１～１０質量％、好ましくは０．１～１０質量％、より好ましくは０．２～１０質量％、さらに好ましくは０．２５～１０質量％、最も好ましくは０．３～１０質量％である。上限は、８質量％、５質量％、３質量％、又は２質量％であってもよい。
　生物学的サンプルとアニオン界面活性剤とを接触させる手段としては、本発明の効果が得られる限りにおいて特に限定されることはない。サンプル希釈液にアニオン界面活性剤を含有させてもよく、当初より測定系内に存在させておいてもよい。サンプル希釈液にアニオン界面活性剤を含有させておき、サンプル希釈液と生物学的サンプルとを混合させることが好ましい。
（コンジュゲート）
　コンジュゲートは、呼吸器感染ウイルスに対して免疫学的に反応する抗体が標識体に固定されたものである。コンジュゲートの存在様式としては、コンジュゲートパッドとして、サンプルパッド、サードパッド、不溶性メンブレン以外の別のパッドに含浸された状態で存在してもよいし（タイプＡ）、サンプルパッドの一部もしくは不溶性メンブレンの一部にコンジュゲート部として存在してもよいし（タイプＢ）、さらには、検体と混合されるように個別のコンジュゲート試薬として存在してもよい（タイプＣ）。
　本発明で用いられる標識体は、従来から呼吸器感染ウイルスの検出に用いられている公知の標識体を用いることができる。例えば、金コロイド粒子や白金コロイド粒子などのコロイド状金属粒子、カラーラテックス粒子、磁性粒子などが好ましく、特に金コロイド粒子が好ましい。
　インフルエンザウイルスを検出する場合、コンジュゲートは、金コロイド粒子に抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体が固定されたものが好ましい。
　以下、コンジュゲートの存在様式が上記タイプＡのテストストリップについて説明する。
　サンプルの流れ方向の上流より下流に向かって、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、サードパッド、不溶性メンブレンの順で配置される。それぞれの層は、上下の層と少なくとも一部が重複するように配置される。このような配置例のテストストリップを図１に示す。
　テストストリップのサンプルパッドに、呼吸器感染ウイルスを含有するサンプルが供給されると、呼吸器感染ウイルスはサンプルパッドを通過して下流側のコンジュゲートパッドへと流れる。コンジュゲートパッドでは、呼吸器感染ウイルスとコンジュゲートが接触して第一複合体（凝集体）を形成しながら当該パッドを通過する。その後、第一複合体はコンジュゲートパッドの下面に接触して配置された多孔質サードパッドを通過し、不溶性メンブレンへと展開される。
　不溶性メンブレンには、その一部に呼吸器感染ウイルスに対して免疫学的に反応する抗体が固定されている。ここで、第一複合体と呼吸器感染ウイルスに対して免疫学的に反応する抗体とが免疫反応により結合して、第二複合体として固定されることになる。固定された第二複合体は、コンジュゲートに由来する吸光度、反射光、蛍光、磁気等のシグナルを検出する手段により検出される。
　アニオン界面活性剤は、サンプル希釈液に含有させておいてもよく、当初より測定系内に存在させておいてもよく、例えばサンプルパッドに含ませておいてもよい。
　次に、コンジュゲートの存在様式がタイプＢのテストストリップについて説明する。
　上記タイプＡのテストストリップとの違いは、サンプルパッドもしくは不溶性メンブレンとコンジュゲートパッドが一体になった点である。サンプルパッドの一部にサンプル供給部およびコンジュゲート部が構成されている配置例のテストストリップを図２に示す。
　上記サンプル供給部は、呼吸器感染ウイルスを含有するサンプルを供給する部位であり、上記コンジュゲート部は、コンジュゲートを含有する部位であり、サンプル供給部がコンジュゲート部の上流側となる。
　コンジュゲート部は、上記サンプル供給部よりも下流側のサンプルパッド上又は不溶性メンブレン担体上に形成される。コンジュゲート部は、サンプル展開方向、即ち、サンプルパッドのサンプル供給部の中心と後述する不溶性メンブレン担体の下流側端部の中心を結ぶ線、に対して直行する方向にライン状に配置されているのが好ましい。換言すれば、ライン状のコンジュゲート部は、サンプルパッド及び不溶性メンブレン担体の長手方向に対して垂直の方向にライン状に配置されているのが好ましい。コンジュゲート部は、不溶性メンブレン担体の検出部より上流に存在することもできるが、サンプルパッドに形成されていることが好ましい。この場合、サンプルパッドのコンジュゲート部よりも下流側の全てがコンジュゲート部である必要はなく、コンジュゲート部のさらに下流側にはコンジュゲートを含まない多孔質材料部分が存在していてもよい。
　コンジュゲート部の位置は、当業者であれば適切に調節することができるが、ライン状のコンジュゲート部のラインの中心線が、サンプルパッドの下流側端部から少なくとも３ｍｍ以上上流側に配置されているのが好ましい。なお、本明細書において、コンジュゲート部又は検出部の「中心線」とは、サンプルパッドの長手方向に対して垂直方向に引かれる中心線を意味し、サンプルパッドの長手方向に対して平行方向に引かれる中心線を意味するものではない。
　サンプル供給部に供給された呼吸器感染ウイルスを含有するサンプルは、上流から下流へ移動する。コンジュゲート部において、呼吸器感染ウイルスとコンジュゲートとが、第一複合体を形成する。第一複合体はさらに下流へ移動する。そして、第一複合体は、検出部に固定された、呼吸器感染ウイルスに対して免疫学的に反応する抗体と第二複合体を形成する。検出部に固定された第二複合体は、コンジュゲートに由来する吸光度、反射光、蛍光、磁気等のシグナルを検出する手段により検出される。
　アニオン界面活性剤は、サンプル希釈液に含有させておいてもよく、当初より測定系内に存在させておいてもよく、例えばサンプルパッドに含ませておいてもよい。
　次に、コンジュゲートの存在様式がタイプＣのテストストリップについて説明する。
　上記タイプＡのテストストリップとの違いは、コンジュゲートパッドが存在せず、コンジュゲートは個別のコンジュゲート試薬として存在する点である。例えば、フィルター中にコンジュゲートが内蔵されたフィルターチップが挙げられる。このようなフィルターチップを使って、サンプル希釈液及び呼吸器感染ウイルスを通過させることでコンジュゲートと呼吸器感染ウイルスが結合し、第一複合体（凝集体）を形成する。第一複合体を含むフィルター通過液をコンジュゲートパッドを有さないこと以外はタイプＡと同一の前記テストストリップに供給することで、呼吸器感染ウイルスに対して免疫学的に反応する抗体が固定されている検出部において第二複合体が形成される。そして固定された第二複合体は、コンジュゲートに由来する吸光度、反射光、蛍光、磁気等のシグナルを検出する手段により検出される。
（呼吸器感染ウイルスに対して免疫学的に反応する抗体）
　本発明で用いられる、呼吸器感染ウイルスに対して免疫学的に反応する抗体は、呼吸器感染ウイルスに結合可能な抗体である。呼吸器感染ウイルスに対して免疫学的に反応する抗体は、標識体および検出部に固定される。標識体および検出部に固定される抗体は同一であってもよいが、標識体と検出部とで別のものであることが好ましい。標識体に固定される抗体と、検出部に固定される抗体とで別のものを用いることにより、イムノクロマトグラフィー用テストストリップにおいて、コンジュゲートと結合した呼吸器感染ウイルスと検出部の抗体との反応と、コンジュゲートと結合した呼吸器感染ウイルスと未反応のコンジュゲートとの反応とが競合するのを抑制することができる。さらに、コンジュゲートと結合した呼吸器感染ウイルスと検出部の抗体との反応性を上げることができる。そして、結果としてイムノクロマトグラフィー用テストストリップの感度が良好になる。なお、別のものとは、種類が異なることをいい、異なるエピトープを認識する抗体であることをいう。
　さらに、標識体および検出部に固定される抗体はモノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体を用いることで、反応の特異性を上げることができる。
　また、これらの抗体の分子全体のほかに、抗原抗体反応活性を有する抗体の機能性断片も本発明では同じく抗体として取り扱う。抗体の機能性断片としては、動物への免疫工程を経て得られたもののほか、遺伝子組み換え技術を使用して得られたものや、キメラ抗体が挙げられる。抗体の機能性断片としては、例えば、F(ab')2、Fab’などが挙げられる。これらの機能性断片は前記抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理することにより製造できる。
（サンプルパッド）
　サンプルパッドは、その下流側の端部の下面がコンジュゲートパッド又は後述する不溶性メンブレン担体の上面に接触するようにコンジュゲートパッド又は不溶性メンブレン担体と積層される。サンプルパッドを構成する多孔質材料としては、紙、セルロース混合物、ニトロセルロース、ポリエステル、アクリロニトリルコポリマー、ガラス、レーヨン等のような不織繊維からなるパッドが挙げられる。中でもガラス繊維からなるパッド（グラスファイバー製パッド）が好ましい。
（サードパッド）
　サードパッドは、生物学的サンプル中の非特異反応物質の除去の目的で、前記タイプＡのテストストリップにおいて、コンジュゲートパッドと不溶性メンブレンとの間に配置される。サードパッドは、試料の性状等により必要に応じて配置されることが望ましく、サンプル中の呼吸器感染ウイルスとコンジュゲートの複合体を透過させることができるものであればいずれでもよい。
（不溶性メンブレン担体）
　本発明で使用することができる不溶性メンブレン担体は、呼吸器感染ウイルスに対して免疫学的に反応する抗体が固定された少なくとも１つの検出部を有する。呼吸器感染ウイルスに対して免疫学的に反応する抗体の不溶性メンブレン担体への固定は、公知の方法で実施することができる。ラテラルフロー式のイムノクロマト試薬の場合には、上記の抗体を所定の濃度で含有する液を調製する。そして、ノズルから液を一定の速度で吐出しながら水平方向に移動させることのできる機構を有する装置などを用いて、上記液をライン状に不溶性メンブレン担体に塗布し、乾燥させることにより上記抗体を不溶性メンブレン担体に固定させることができる。
　また、上記の抗体を所定の濃度で含有する液は、緩衝液に抗体を添加することにより調製することができる。該緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。緩衝液のｐＨは６．０～９．５の範囲が好ましく、６．５～８．５がより好ましく、７．０～８．０がさらに好ましい。緩衝液には、さらに塩化ナトリウムなどの塩類、糖類などの安定剤や保存剤、プロクリンなどの防腐剤等を含んでもよい。塩類は塩化ナトリウムなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する目的で添加するものも含まれる。
　不溶性メンブレンに抗体を固定した後、さらに、通常使用されるブロッキング剤を溶液あるいは蒸気状にして抗体を固定した部位以外を被覆し、ブロッキングを行うこともできる。
　本発明で使用することができる不溶性メンブレン担体を構成するメンブレンとしては、従来からイムノクロマトグラフィー用テストストリップの不溶性メンブレン担体として用いられている公知のメンブレンが使用できる。例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体などの多糖類、セラミックス等からなる繊維から構成されるメンブレンがあげられる。具体的には、ザルトリウス社、ミリポア社、東洋濾紙社、ワットマン社などから市販されているガラス繊維ろ紙やニトロセルロース膜などが挙げられる。
　本発明で使用することができるイムノクロマトグラフィー用テストストリップにおいては、上記不溶性メンブレン担体の下流側端部に吸収パッドを設置するのが好ましい。吸収パッドとは、不溶性メンブレン担体を移動・通過したサンプルを吸収することにより、サンプルの展開を制御する液体吸収性を有する部位である。吸収パッドとしては、従来からイムノクロマトグラフィー用テストストリップに用いられている公知の吸収パッドを用いることができ、例えば、ろ紙を用いることができる。
　本明細書において非特異反応とは、被検出物質である呼吸器感染ウイルスが生物学的サンプル中に存在しない、あるいは検出限界以下であるなど実質的に存在しないにも拘わらず、コンジュゲートに由来するシグナルが検出され、陽性と判断されることを意味する。本発明の工程（Ａ）～（Ｄ）を含む呼吸器感染ウイルスの免疫学的分析方法は、工程（Ａ）～（Ｄ）を含む、呼吸器感染ウイルスの免疫学的分析方法における非特異反応抑制方法であることができ、好ましくは、工程（Ａ）～（Ｄ）を含む、インフルエンザウイルスの免疫学的分析方法における非特異反応抑制方法であることができ、より好ましくは工程（Ａ）～（Ｄ）を含む、Ｂ型インフルエンザウイルスの免疫学的分析方法における非特異反応抑制方法であることができる。
（イムノクロマトグラフィー用テストストリップ）
　本明細書において、「イムノクロマトグラフィー」とは、セルロース膜等の多孔質材料上を被検体が試薬を溶解しながらゆっくりと流れる性質（毛細管現象）を応用した免疫測定法を意味する。イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、プラスチック製粘着シートのような固相支持体上に配置させることが好ましい。該固相支持体は、サンプル及びコンジュゲートの毛管流を妨げない物質で構成する。また、イムノクロマトグラフィー用テストストリップを固相支持体上に接着剤等で固定してもよい。この場合、接着剤の成分等においてもサンプル及びコンジュゲートの毛管流を妨げない物質で構成する。なお、不溶性メンブレン担体の機械的強度を上げ且つアッセイ中の水分の蒸発（乾燥）を防ぐ目的でポリエステルフィルムなどをラミネートすることも可能である。該イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、イムノクロマトグラフィー用テストストリップの大きさ、サンプルの添加方法や添加位置、不溶性メンブレン担体の検出部の形成位置、シグナルの検出方法などを考慮した適当な容器（ハウジング）に格納・搭載して使用することができる。このように格納・搭載された状態を「デバイス」という。
（その他）
　イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製は実施例に記載の方法を適宜、修飾・改変して行うことができる。
　次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、本明細書において、特に説明のない限り、％は質量％を示す。
〔抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体の調製〕
　以下の試験に用いた抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体及び抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体は、抗原としてリコンビナントインフルエンザ核タンパクを用い、マウスに免疫し、当業者がモノクローナル抗体を製造するために通常行う方法を用いて得られた。
〔テストストリップ作製例１〕イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
１）金コロイド粒子標識抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体（コンジュゲート）の作製
　抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体および抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を１００μｇ／ｍLの濃度で含むPBSをそれぞれ調製した。１　ＯＤ／ｍＬの金コロイド粒子溶液２０ｍＬに対し各抗体溶液を１ｍＬ添加し、室温で１０分間撹拌した。該金コロイド粒子－抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体混合液および該金コロイド－抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体混合液に対し、１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を２ｍＬ添加し、さらに５分間撹拌後、１０℃にて、１０，０００ｒｐｍで４５分間遠心し、沈渣（コンジュゲート）を得た。得られたコンジュゲートに対し、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｄｉｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｃｒｉｐｐｓ社製）を添加しコンジュゲートを懸濁させた。
２）サンプルパッドの作製
　上記１）で調製したコンジュゲートを、８～２０ＯＤ／ｍＬとなるように、１．３３％カゼイン、４％スクロース溶液（ｐＨ７．５）と混合してコンジュゲート液を作製し、全長２８ｍｍのグラスファイバー製パッドに、ライン幅４ｍｍのラインを形成するように滲みこませた。７０℃、３０分間加温することにより乾燥させ、コンジュゲート部を含むサンプルパッドとした。
３）抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体が固定された不溶性メンブレン担体（抗体固定メンブレン）の作製
　ニトロセルロースメンブレン（孔径８μｍ）の短辺の一端に、リン酸緩衝液で０．７５ｍｇ／ｍＬに調整した抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体、１．０ｍｇ／ｍＬに調整した抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体及び０．７５ｍｇ／ｍＬに調整した抗マウスＩｇＧ抗体を、不溶性メンブレン担体の長手方向に対して垂直の方向にライン状に塗布した。その後、７０℃、４５分乾燥し、抗体固定メンブレンとした。ラインは、テストストリップを組み立てた際に上流側から、Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体（ｃ１）、抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体（ｃ２）、コントロール抗体（ｃ３）の順になるように塗布した。
４）イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
　２）で作製したサンプルパッドを、３）で得られた不溶性メンブレン担体に積層し、イムノクロマトグラフィー用テストストリップを作製した。
〔実施例１〕
　上記テストストリップ作製例１で作製したイムノクロマトグラフィー用テストストリップを用いて、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスの検出試験を行った。
１．試験方法
（１）試料　
　インフルエンザに罹患していない健康な対象の鼻腔粘液を、各界面活性剤を１％濃度で含有するサンプル希釈液と混合して希釈し、試料として用いた。
（２）手順
　上記（１）で調製した試料１３５μＬをテストチューブに分注し、イムノクロマトグラフィー用ストリップを挿入し、５、１５、３０、及び４５分後に、検出部分の抗体固定メンブレン上のテストラインＡ及びＢの発色の有無を目視にて判定した。
２．試験結果
　Ｂ型インフルエンザウイルスの検出を示すテストラインＢの発色有無の判定結果を表１、２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　なお、デモール、エマール、アンヒトール、エマルゲン、及びＴｗｅｅｎは、登録商標である。
　表中、「－」はＢ型インフルエンザウイルスの検出をしめすテストラインＢが発色せず、偽陽性が発生しなかったものを表し、「＋」はラインが発色し偽陽性が発生したものを表す。ノニオン界面活性剤を添加したサンプルは、イムノクロマトグラフィー用ストリップを挿入した３０分後に、全て非特異反応を生じ、アニオン界面活性剤又は両性界面活性剤を添加したサンプルは、全て非特異反応を生じなかった。Ａ型インフルエンザウイルスの検出を示すテストラインＡは、試験したサンプル全てにおいて非特異反応を生じなかった。したがって、アニオン界面活性剤又は両性界面活性剤を検体希釈液に添加することにより、Ｂ型インフルエンザウイルスの検出において生じる非特異反応を防止できることが示された。
〔実施例２〕
１．試験方法
　界面活性剤の種類及び濃度を変更した以外は実施例１と同様にして、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスの検出試験を行った。
２．試験結果
　Ｂ型インフルエンザウイルスの検出を示すテストラインＢの発色有無の発色有無の判定結果を以下表３、４、５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　表３～表５中、「－」はＢ型インフルエンザウイルスの検出を示すテストラインＢが発色されず、偽陽性が発生しなかったものを表し、「＋」はラインが検出され発色し、偽陽性が発生したものを表す。エマール２０ＣＭを０．５％添加したサンプルでは、非特異反応を生じなかったが、０．２５％添加したサンプルでは、反応４５分後に僅かに非特異反応を生じた。アンヒトール２０Ｎを０．５％添加したサンプルでは、反応３０分後に非特異反応を生じた。
　エマール２０Ｃを０．５％～２．００％添加したサンプルでは非特異反応を生じなかったが、０．２５％添加したサンプルでは、反応４５分後に僅かに非特異反応を生じた。
　したがって、アニオン界面活性剤は、界面活性剤濃度を低くしても、Ｂ型インフルエンザウイルスの検出において生じる非特異反応を抑制する効果があることが分かった。また、Ａ型インフルエンザウイルスの検出においては、試験したサンプル全てにおいて非特異反応を生じなかった。
〔実施例３〕
１．試験方法
　再現性を検証するために、インフルエンザに罹患していない別の健康な対象の鼻腔粘液を使用して、実施例２と同様にして、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスの検出試験を行った。
２．試験結果
　Ｂ型インフルエンザウイルスの検出を示すテストラインＢの発色有無の判定結果を表６、７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　表６～表７中、「－」はＢ型インフルエンザウイルスの検出を示すテストラインＢが発色されず、偽陽性が発生しなかったものを表し、「＋」はラインが検出され発色し、偽陽性が発生したものを表す。実施例２と同様にエマール２０Ｃを０．５％～２．００％添加したサンプルでは非特異反応を生じなかったが、０．２５％添加したサンプルでは、反応４５分後に僅かに非特異反応を生じた。したがって、実施例２の再現性が確認された。また、Ａ型インフルエンザウイルスは、試験したサンプル全てにおいて非特異反応を生じなかった。
　本発明によれば、非特異反応を抑制した、呼吸器感染ウイルスの免疫学的分析を行うことが可能である。
（ａ）プラスチック製粘着シート
（ｂ）不溶性メンブレン
（ｃ１）テストラインＡ
（ｃ２）テストラインＢ
（ｃ３）コントロールライン
（ｄ）コンジュゲートパッド
（ｅ）サンプルパッド
（ｆ）吸収パッド
（ｇ）サードパッド
（ｈ）コンジュゲート部
（ｉ）フィルム 

Claims (17)

  1. （Ａ）呼吸器感染ウイルスを含有する可能性のある生物学的サンプルとアニオン界面活性剤とを接触させることと
    （Ｂ）前記呼吸器感染ウイルスとコンジュゲートとを接触させ、第一複合体を形成させることと
    （Ｃ）前記第一複合体と前記呼吸器感染ウイルスに対して免疫学的に反応する抗体とを接触させ、第二複合体を形成させることと
    （Ｄ）コンジュゲートに由来するシグナルを測定することと
    を含む、呼吸器感染ウイルスの免疫学的分析方法。
  2. 　前記呼吸器感染ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項１に記載の免疫学的分析方法。
  3. 　イムノクロマトグラフィーを利用する、請求項１又は２に記載の免疫学的分析方法。
  4. 　下記の構成を有するイムノクロマトグラフィー用テストストリップを使用することを特徴とする、請求項３に記載の免疫学的分析方法。
    以下の（１）および（２）を含み、（１）または（２）において、サンプル供給部と検出部の間に、コンジュゲートを含有するコンジュゲート部が設けられているテストストリップ
    （１）呼吸器感染ウイルスを含有する可能性のある前記生物学的サンプルを供給するサンプル供給部を有する、サンプルパッド
    （２）呼吸器感染ウイルスに対して免疫学的に反応する抗体が固定された検出部を少なくとも１つ有する、不溶性メンブレン担体。
  5. 　前記工程（Ａ）が、前記生物学的サンプルと、前記アニオン界面活性剤を含むサンプル希釈液とを混合する工程である、請求項１～４のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
  6. 　前記アニオン界面活性剤を含むサンプル希釈液におけるアニオン界面活性剤の濃度が、０．１～１０質量％である、請求項５に記載の免疫学的分析方法。
  7. 　前記生物学的サンプルが、呼吸器分泌液である、請求項１～６のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
  8. 　前記呼吸器感染ウイルスが、Ｂ型インフルエンザウイルスである、請求項１～７のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
  9. 　前記アニオン界面活性剤が、スルホン酸塩系アニオン界面活性剤、カルボン酸塩系アニオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム系アニオン界面活性剤、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１～８のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
  10. 　以下の（１）および（２）を含む、呼吸器感染ウイルス検出キット
    （１）呼吸器感染ウイルスに対する抗体を用いた検出試薬
    （２）アニオン界面活性剤を含む生物学的サンプル希釈液。
  11. 　前記呼吸器感染ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項１０に記載の呼吸器感染ウイルス検出キット。
  12. 　下記の構成を有するイムノクロマトグラフィー用テストストリップを含む、請求項１０又は１１に記載の呼吸器感染ウイルス検出キット。
    以下の（３）および（４）を含み、（３）または（４）において、サンプル供給部と検出部の間に、コンジュゲートを含有するコンジュゲート部が設けられているテストストリップ
    （３）呼吸器感染ウイルスを含有する可能性のある前記生物学的サンプルを供給するサンプル供給部を有する、サンプルパッド
    （４）呼吸器感染ウイルスに対して免疫学的に反応する抗体が固定された検出部を少なくとも１つ有する、不溶性メンブレン担体。
  13. 　前記（２）アニオン界面活性剤を含むサンプル希釈液におけるアニオン界面活性剤の濃度が、０．１～１０質量％である、請求項１０～１２のいずれかに記載の呼吸器感染ウイルス検出キット。
  14. 　前記生物学的サンプルが、呼吸器分泌液である、請求項１０～１３のいずれかに記載の呼吸器感染ウイルス検出キット。
  15. 　前記呼吸器感染ウイルスが、Ｂ型インフルエンザウイルスである、請求項１０～１４のいずれかに記載の呼吸器感染ウイルス検出キット。
  16. 　前記アニオン界面活性剤が、スルホン酸塩系アニオン界面活性剤、カルボン酸塩系アニオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム系アニオン界面活性剤、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１０～１５のいずれかに記載の呼吸器感染ウイルス検出キット。
  17. 　呼吸器感染ウイルスに対する抗体を用いた免疫学的検出方法における生物学的サンプル希釈液であって、アニオン界面活性剤を含む前記生物学的サンプル希釈液。 
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