CN102305861B - 弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条及其制备方法，涉及一种弓形虫抗体检测试剂。提供一种弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条及其制备方法。试剂条设有载体板、加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜、弓形虫IgG抗体检测线、弓形虫IgM抗体检测线、对照线和吸收垫。制备弓形虫重组抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7；硝酸纤维素膜的点样；制备胶体金；胶体金与弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的标记；制备弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条。

Description

弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种弓形虫抗体检测试剂，尤其是涉及一种采用金标免疫层析技术(immunochromatography)进行的弓形虫IgM与IgG抗体联合快速检测试剂条及其制备方法。

背景技术

弓形虫病(Toxoplasmosis)是刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)引起的一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病，其病原体弓形虫可寄生在人及多种动物的有核细胞内，人群及动物普遍易感。该病广泛分布于世界各地，据统计全球约有10亿人被弓形虫感染([1]奚琳琳，李威.弓形虫致病机理，毒力及基因型研究进展[J].Journal of Pathogen Biology，2009，4(11)：859-861.)。弓形虫病在我国分布很广泛，全国各省、市、自治区均有弓形虫感染的报道，我国正常人群平均感染率在4％～9％左右([2]刘敏，陈晓光.中国人群弓形虫病的流行特征分析[J].ACTA PARASITOLOGY ET MEDICA ENTOMOLOGICA SINICA，2010，17(3).)，特殊人群如肿瘤患者、精神病患者、先天缺陷婴幼儿、免疫抑制、免疫缺陷患者感染率更高。所幸的是极大多数免疫功能正常的成人或儿童被弓形虫感染后常无症状或仅有轻微症状，且多能自愈并获永久免疫力。但先天感染的胎儿、儿童以及免疫缺陷者被感染后，则预后极为严重。是造成艾滋病患者死亡的一个重要并发病。人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者约有20％～80％合并弓形虫感染，更重要的是它也是造成人类先天畸形、缺陷、智力低下、死胎、早产的重要病原体之一。

弓形虫病的的诊断方法包括直接从脏器、血液、脑脊液等组织分离弓形虫进行病原学诊断，需要几天甚至几周时间，费时费力，在实际应用中价值不大。临床上常规检测主要是应用各种血清学方法，检测其特异IgG和IgM([3]周彬，张珏，王柯，等.弓形虫igg和igm抗体双标记时间分辨荧光免疫分析的建立及其初步临床应用[J].中华检验医学杂志，2010，33(010)：957-959.)，血清学方法可以诊断先天性、急性和慢性弓形虫病，但由于大多数免疫缺陷的人或动物其抗弓形虫的IgG滴度不会上升或不会出现高的IgM滴度，所以不能有效地用血清学方法对患有免疫缺陷的人或动物诊断弓形虫病。另外，在抗原消失相当长时间后血清抗体滴度才会逐步下降，所以也不能应用于治疗效果评价。目前检测IgG抗体存在较高的假阳性，而IgM抗体检测普遍灵敏度差等问题([4]韩靖云，刘倩，郭健.弓形虫感染实验室诊断的技术进展[J].LABORATORY MEDICINE，2009，24(5).)。因此，对疾病的早期诊断帮助不大，急需建立一种具有高度敏感性，且价廉、快速、操作简单、不需特殊设备，更适合于临床的早期诊断方法。

弓形虫病的诊断与流行病学调查主要依赖于血清学试验，正常人体感染弓形虫多为隐性感染，当机体免疫力下降时，虫体大量繁殖，侵入除红细胞外的各组织细胞内寄生，造成各种组织的广泛炎症，从而出现临床症状。人类感染弓形虫后能诱导产生特异性抗体。感染早期IgM抗体增高，IgM在感染4个月后逐渐消失，在感染1个月后出现高浓度IgG抗体([5]KASPER D C，PRUSA A R，HAYDE M，et al.Evaluation of the vitros eciq immunodiagnosticsystem for detection of anti-toxoplasma immunoglobulin g and immunoglobulin m antibodies forconfirmatory testing for acute toxoplasma gondii infection in pregnant women[J].Journal of clinicalmicrobiology，2009，47(1)：164.)。因此，弓形虫IgG抗体是弓形虫病诊断和流行病学调查的一项重要指标。

早期的血清学方法使用弓形虫循环抗原。研究和诊断用的弓形虫循环抗原是以弓形虫感染小鼠腹腔获得，这种方法花费大、获得的抗原量少且不纯(常混有宿主蛋白)，因此假阳性也时有发生。随着分子生物学技术的普及及弓形虫抗原的相继克隆，将重组抗原应用于弓形虫实验已经越来越多。目前研究比较多的弓形虫的表面抗原(SAG1(P30)、SAG2(P22)、SAG3(P43)、SAG4(P18))、虫体棒状体抗原(ROP1、ROP2)、致密颗粒蛋白(GRA1、GRA7)等([6]熊美华，王秀珍，刘露霞，等.弓形虫速殖子抗原的提取及蛋白分析[J].CHINESE JOURNAL OF PARASITIC DISEASE CONTROL，2001，14(3).)。采用重组DNA技术制备的重组抗原可以克服完整弓形虫抗原的缺点，能快速、经济地制备无限量特异重组TP抗原。

弓形虫抗体检测方法包括ELISA、Western-blot等，其特异性均较高。然而，面对严峻的防制形式，不但需要特异准确的检测手段，还需要一种更简便快捷的试剂来筛查，以便为临床和疾病防控提供对策。

发明内容

本发明的目的是提供一种弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条及其制备方法。

所述弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条设有载体板、加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜(NC膜)、弓形虫IgG抗体检测线、弓形虫IgM抗体检测线、对照线和吸收垫；所述加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，弓形虫IgG抗体检测线、弓形虫IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在弓形虫IgG抗体检测线处包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在弓形虫IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗体。

所述载体板可采用PVC板。

所述弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条的制备方法，包括以下步骤：

1)制备弓形虫重组抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7：采用基因克隆技术，PCR扩增编码弓形虫抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得弓形虫重组抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7；

2)硝酸纤维素膜的点样：在硝酸纤维素膜上的弓形虫IgG抗体检测线处包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在硝酸纤维素膜上的弓形虫IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在硝酸纤维素膜上的对照线处包被羊抗弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗体，晾干；

3)制备胶体金：采用柠檬酸三钠还原方法制备25nm胶体金，取1％氯金酸1mL加入到100mL去离子双蒸水中，得到的氯金酸浓度为0.01％，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热搅拌下加入1％柠檬酸三钠水溶液2.0mL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于棕色瓶中4℃冰箱保存备用；

4)胶体金与弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的标记：

(1)胶体金与弓形虫抗原SAG1(P30)的标记：取胶体金10ml，用0.1mol/L NaOH调至pH5.4，加100μg SAG1(P30)，混匀，放置5min，加入5％BSA 1ml混匀，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10ml，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，沉淀用TBS稀释至1ml，得胶体金标记的SAG1(P30)抗原；

(2)胶体金与弓形虫抗原SAG2(P22)、ROP2和GRA7的标记方法与步骤(1)相同，分别得胶体金标记的SAG2(P22)、ROP2和GRA7抗原；

(3)将胶体金标记的SAG1(P30)抗原、胶体金标记的SAG2(P22)、胶体金标记的ROP2抗原和胶体金标记的GRA7抗原混合后，均匀地涂于玻璃纤维膜上，烘干，制备成胶体金垫；

5)制备弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条：

将加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，弓形虫IgG抗体检测线、弓形虫IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在弓形虫IgG抗体检测线处包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在弓形虫IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗体，用切条机切成条状，得弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条。

在步骤2)中，所述抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体、抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体的浓度为1～4mg/mL，羊抗弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗体由抗SAG1(P30)-IgG抗体、抗SAG2(P22)-IgG抗体和抗SAG3(P43)-IgG抗体按体积比1∶1∶1∶1混合，其终浓度为1～4mg/mL；四者点样量为1μL/cm。

在步骤3)中，所述柠檬酸三钠的百分比浓度可为2％。

在步骤4)中，所述将胶体金标记的SAG1(P30)抗原、胶体金标记的SAG2(P22)、胶体金标记的ROP2抗原和胶体金标记的GRA7抗原混合，最适胶体金标记的胶体金标记的SAG1(P30)抗原、胶体金标记的SAG2(P22)、胶体金标记的ROP2抗原和胶体金标记的GRA7抗原混合体积比为1∶(0.2～5)∶(0.2～5)∶(0.2～5)混合；所述烘干的温度可为37℃。

本发明采用弓形虫重组蛋白作为弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条的抗原，建立弓形虫IgM与IgG抗体胶体金免疫层析技术联合快速检测试剂，实现了特异性IgM和IgG抗体联合检测，不仅具有简便快速、特异性强、灵敏度高、准确可靠、成本低等优点，而且检测所需标本量极小，不需要特殊仪器，可肉眼直接判读结果的，对弓形虫诊断和防治具有非常重要的社会和经济价值。

弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条可用于全血、血清、血浆及脑脊液等标本中弓形虫IgM和IgG抗体的检测。

附图说明

图1为本发明弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条实施例的结构组成示意图。

图2为实验结果模式示意图。在图2中，A为使用前的示意图，B为无效试验(产品质量问题)，C为阴性结果，D为弓形虫-IgG阳性结果，E为弓形虫-IgM阳性结果，F为弓形虫-IgG和弓形虫-IgM均阳性结果；5为弓形虫IgG抗体检测线，6为弓形虫IgM抗体检测线，7为对照线。

具体实施方式

如图1所示，本发明所述弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条实施例设有载体板1、加样垫2、胶体金垫3、硝酸纤维膜(NC膜)4、弓形虫IgG抗体检测线5、弓形虫IgM抗体检测线6、对照线7、吸收垫8。加样垫2、胶体金垫3、硝酸纤维膜(NC膜)4和吸收垫8依次粘贴在载体板1上表面，加样垫2的一端设在胶体金垫3的一端上，胶体金垫3的另一端设在硝酸纤维膜(NC膜)4的一端上，吸收垫8的一端设在硝酸纤维膜(NC膜)4的另一端上，弓形虫IgG抗体检测线5、弓形虫IgM抗体检测线6和对照线7从胶体金垫3开始依次设在硝酸纤维膜(NC膜)4上。在弓形虫IgG抗体检测线5上包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在弓形虫IgM抗体检测线6上包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在对照线7上包被羊抗弓形虫抗原(SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7)IgG抗体。

所述载体板采用PVC板，载体板的长度为6～10cm，载体板的宽度为2～4mm，载体板的厚度为1～2mm。加样垫的材料为玻璃纤维，胶体金垫的材料是涂布胶体金结合物的玻璃纤维，所述吸收垫的长度为1～2cm，吸收垫可采用吸液纸。

实施例1

本发明所述弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条的制备方法，包括以下步骤：

1)制备弓形虫重组抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7：采用基因克隆技术，PCR扩增编码弓形虫抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得弓形虫重组抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7。

2)硝酸纤维素膜的点样：在硝酸纤维素膜(NC膜)上的弓形虫IgG抗体检测线处包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在硝酸纤维素膜(NC膜)上的弓形虫IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在硝酸纤维素膜(NC膜)上的对照线处包被羊抗弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗体，室温晾干，密封室温保存备用；所述抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体、抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体的浓度为1～4mg/mL，羊抗弓形虫抗原(SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7)IgG抗体由抗SAG1(P30)-IgG抗体、抗SAG2(P22)-IgG抗体、抗ROP2-IgG抗体和抗GRA7-IgG抗体按体积比1∶1∶1∶1混合，其终浓度为1～4mg/mL；四者点样量为1μL/cm。

3)制备胶体金：采用柠檬酸三钠还原方法制备25nm胶体金，取1％氯金酸1mL加入到100mL去离子双蒸水中，得到的氯金酸浓度为0.01％，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热搅拌下加入1％柠檬酸三钠水溶液2.0mL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于棕色瓶中4℃冰箱保存备用；所述柠檬酸三钠的浓度可为2％。

4)胶体金与弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的标记：

(1)胶体金与弓形虫抗原SAG1(P30)的标记：取胶体金10ml，用0.1mol/L NaOH调至pH5.4，加100μg SAG1(P30)，混匀，放置5min，加入5％BSA 1ml混匀，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10ml，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，沉淀用TBS稀释至1ml，得胶体金标记的SAG1(P30)抗原；

(2)胶体金与弓形虫抗原SAG2(P22)、ROP2和GRA7的标记方法与步骤(1)相同，分别得胶体金标记的SAG2(P22)、ROP2和GRA7抗原；

(3)将胶体金标记的SAG1(P30)抗原、胶体金标记的SAG2(P22)、胶体金标记的ROP2抗原和胶体金标记的GRA7抗原混合后，均匀地涂于玻璃纤维膜上，烘干，制备成胶体金垫；

将胶体金标记的SAG1(P30)抗原、胶体金标记的SAG2(P22)、胶体金标记的ROP2抗原和胶体金标记的GRA7抗原以体积比(0～5)∶(0～5)∶(0～5)∶(0～5)混合后，均匀地涂于玻璃纤维膜上，在37℃烘干，制备成胶体金垫，密封备用。

5)制备弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条：

将加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜(NC膜)和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜(NC膜)的一端上，吸收垫的一端设在硝酸纤维膜(NC膜)的另一端上，弓形虫IgG抗体检测线、弓形虫IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜(NC膜)上；在弓形虫IgG抗体检测线处包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在弓形虫IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗体，用切条机切成条状，得弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条。

取待检标本血清10μl，加样于免疫层析检测条加样区，同时滴加100μl生理盐水，静置20min观察结果。只在检测条对照区有一紫红色条带出现，则判为阴性；在检测区及对照区均有一紫红色条带出现，则判为阳性；加样检测后，检测区和对照区均不出现紫红色条带，为无效结果(见图2)。

实施例2

与实施例1相似，区别在于金结合物垫仅由SAG1(P30)、ROP2和GRA7组成，不含有SAG2(P22)。结果判断与实施例1相同。

实施例3

与实施例1相似，区别在于金结合物垫仅由SAG2(P22)、ROP2和GRA7组成，不含有SAG1(P30)。结果判断与实施例1相同。

实施例4

与实施例1相似，区别在于待检标本为脑脊液标本，结果判断与实施例1相同。

实施例5

性能验证试验：按实施例1的方案制备弓形虫IgM与IgG抗体联合快速检测试剂，然后进行性能验证。

1)外观检查：白色包被反应膜平整、干净无污染斑点、无裂缝，胶带无开胶，试剂条宽度在3±0.1mm，无切斜现象。

2)阳性标本符合率：50份经ELISA(德国欧蒙公司)检测确定的弓形虫-IgM阳性参比血清，采用发明的试剂条检出弓形虫-IgM阳性50份，阳性标本符合率100％；而50份经ELISA(德国欧蒙公司)检测确定的弓形虫-IgG阳性参比血清，采用发明的试剂条检出弓形虫-IgG阳性49份，阳性标本符合率98％。

3)阴性标本符合率：50份弓形虫抗体阴性参比血清，采用发明的试剂条检测未检出阳性标本，阴性标本符合率100％。

4)灵敏度检测：用卫生部室内质控血清(批号：200902001)检测，最低检出限度4NCU/mL。

5)批内差异：同一批次试剂条，用特征性阳性血清(FTA-ABS(德国欧蒙公司)检测确定的临床标本阳性弓形虫-IgG、弓形虫-IgM参比高、中、低血清)检测，相同滴度检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。

6)批间差异：不同批次试剂条，用特征性阳性血清(FTA-ABS(德国欧蒙公司)检测确定的临床标本阳性弓形虫-IgG、弓形虫-IgM参比高、中、低血清)检测，相同滴度检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。

7)干扰试验：检测结果不受标本溶血(n＝50)、脂血(n＝50)和黄疸(n＝50)的干扰。

8)交叉反应：采用本试剂条，进行系统性红斑狼疮(n＝30)、类风湿病(n＝38)、免疫性肝炎(n＝40)等自身免疫系统疾病的检测，未发现交叉反应。

9)稳定性检测：将试剂条放置37℃20天后检测，以上各项指标无显著变化。

Claims (5)

1.弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条的制备方法，其特征在于所述弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条设有载体板、加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜、弓形虫IgG抗体检测线、弓形虫IgM抗体检测线、对照线和吸收垫；所述加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，弓形虫IgG抗体检测线、弓形虫IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在弓形虫IgG抗体检测线处包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在弓形虫IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗体；

所述制备方法，包括以下步骤：

1）制备弓形虫重组抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7：采用基因克隆技术，PCR扩增编码弓形虫抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得弓形虫重组抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7；

2）硝酸纤维素膜的点样：在硝酸纤维素膜上的弓形虫IgG抗体检测线处包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在硝酸纤维素膜上的弓形虫IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在硝酸纤维素膜上的对照线处包被羊抗弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗体，晾干；所述羊抗弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗体由抗SAG1(P30)-IgG抗体、抗SAG2(P22)-IgG抗体、抗ROP2-IgG抗体与抗GRA7-IgG按体积比1∶1∶1∶1混合，其终浓度为1～4mg/mL；四者点样量为1μL/cm；

3）制备胶体金：采用柠檬酸三钠还原方法制备25nm胶体金，取1%氯金酸1mL加入到100mL去离子双蒸水中，得到的氯金酸浓度为0.01%，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热搅拌下加入1%柠檬酸三钠水溶液2.0mL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于棕色瓶中4℃冰箱保存备用；

4）胶体金与弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的标记：

（1）胶体金与弓形虫抗原SAG1(P30)的标记：取胶体金10ml，用0.1mol/L NaOH调至pH5.4，加100μg SAG1(P30)，混匀，放置5min，加入5%BSA1ml混匀，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10ml,4℃、10000r/min离心1h，弃上清，沉淀用TBS稀释至1ml，得胶体金标记的SAG1(P30)抗原；

（2）胶体金与弓形虫抗原SAG2(P22)、ROP2和GRA7的标记方法与步骤（1）相同，得胶体金标记的SAG2(P22)、ROP2和GRA7抗原；

（3）将胶体金标记的SAG1(P30)抗原、胶体金标记SAG2(P22)、ROP2和GRA7抗原混合后，均匀地涂于玻璃纤维膜上，烘干，制备成胶体金垫；

所述将胶体金标记的SAG1(P30)抗原、胶体金标记的SAG2(P22)抗原、胶体金标记的ROP2抗原和胶体金标记的GRA7抗原混合，胶体金标记的SAG1(P30)抗原、胶体金标记的SAG2(P22)抗原胶体金标记的ROP2抗原和胶体金标记的GRA7抗原以体积比1∶（0.2～5）∶（0.2～5）∶（0.2～5）混合；

5）制备弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条：

将加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，弓形虫IgG抗体检测线、弓形虫IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在弓形虫IgG抗体检测线处包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在弓形虫IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗体，用切条机切成条状，得弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条。

2.如权利要求1所述的弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条的制备方法，其特征在于所述载体板为PVC板。

3.如权利要求1所述的弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条的制备方法，其特征在于在步骤2）中，所述抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体、抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体的浓度为1～4mg/mL。

4.如权利要求1所述的弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条的制备方法，其特征在于在步骤3）中，所述柠檬酸三钠的百分比浓度为2%。

5.如权利要求1所述的弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条的制备方法，其特征在于在步骤4）中，所述烘干的温度为37℃。

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