CN201673156U - 梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条 - Google Patents

Abstract

梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条，涉及一种梅毒特异性IgM抗体检测试剂。提供一种梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条。试剂条设有载体板、加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜、梅毒特异性IgM抗体检测线、对照线和吸收垫。加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体。

Description

梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条

技术领域

本实用新型涉及一种梅毒特异性IgM抗体检测试剂，尤其是涉及一种采用胶体金免疫层析技术(immunochromatography)进行的梅毒特异性IgM抗体快速检测试剂条。

背景技术

梅毒(Syphilis)是一种由梅毒螺旋体(Treponema pallidum，TP)引起的性传播性疾病，其病原体是梅毒螺旋体，属螺旋体科。梅毒螺旋体主要通过性接触、输血、创口或者胎盘等途径传播。梅毒螺旋体从感染区附近的淋巴结进入血液，播散全身，使机体几乎所有的组织及器官受累，临床表现为全身性，可分为不同临床阶段，包括一期、二期、三期和潜伏期。世界卫生组织(WHO)曾乐观地预言：“由于有高敏度检测方法和高效的治疗方案，梅毒是一种能够通过公共卫生措施得到成功控制的性传播性疾病”。遗憾的是，至今梅毒依然是世界范围的公共卫生问题，缺乏有效的行政控制措施，每年全球大约有1200万的患者，其中60万孕妇患者。(参见：Health Protection Agency Centre for Infections.International Encyclopediaof Public Health-Syphilis[M].London，UK：Health Protection Agency Centre，2008，289-297)事实上，梅毒的感染现状可能要比想象中的更让人悲观。

调查发现，梅毒感染者已经较广泛地存在于普通人群中。

梅毒螺旋体尚不能进行体外培养，梅毒诊断与流行病学调查主要依赖于血清学试验，包括特异性抗体和反应素检测两大类型。梅毒特异性抗体IgM(TP-IgM)和IgG(TP-IgG)抗体分别于2周和4周后产生，即使患者经过足够治疗，其仍能长期存在，甚至终身不消失(参见：Luis J F，Felipe U S，Santa G C，et al.Evaluation of a rapid strip and a particle agglutinationtests for syphilis diagnosis[J].Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2007，59：123-126)；而另一种抗体物质反应素产生较晚，一般在受感染后5～7周产生(参见：林月圆.TPPA和TRUST在梅毒诊断中的价值与临床相关问题[J].放射免疫学杂志，2009，22(3)：295-297.)，而且晚期梅毒、梅毒治疗后期以及潜伏梅毒可能阴性。因此梅毒特异性抗体的阳性率、敏感性显著高于反应素。TP-IgM是梅毒感染后，机体最先出现的特异性抗体。只要有活的梅毒螺旋体存在，其TP-IgM将会维持在一定的水平。Martina H等(参见：Martina H，Daan W N，Mart M，et al.Comparison of a Treponema pallidum IgM immunoblot with a 19S fluorescenttreponemal antibody absorption test for the diagnosis of congenital syphilis[J].DiagnosticMicrobiology and Infectious Disease，2007，59：61-66.)认为TP-IgM是梅毒早期感染并活动的一项血清学标志，李步荣等(参见：李步荣，贺军涛，张毅，等.梅毒螺旋体IgM抗体检测的临床意义[J].第四军医大学学报，2007，28(16)：1495-1497)认为TP-IgM与TP-DNA一样，代表着梅毒传染性指标。在排除近期抗梅毒治疗的前提下，TP-IgM若不转阴，提示体内可能残存梅毒螺旋体或治疗不彻底。TP-IgM阴转者随访时再转阳性，表明再次感染梅毒(参见：Rawstron SA，Mehta S，Bromberg K，et al.Evaluation of a Treponema pallidum2specific IgMenzyme immunoassay and Treponema pallidum western blot antibody detection in the diagnosisofmaternal and congenital syphilis[J].Sex Transm Dis，2004，31(2)：123-126)。尽管TP-IgM阴性不能完全排除传染性，但TP-IgM阳性必定提示该患者具有传染性。

早期的血清学方法使用完整梅毒螺旋体作为抗原，研究和诊断用的TP是以TP感染兔睾丸获得，这种方法花费大、获得的TP量少、不纯(混有宿主蛋白)，与其他病原体存在交叉反应，因此假阳性也时有发生。随着分子生物学技术的普及及梅毒螺旋体抗原的相继克隆，将重组抗原应用于梅毒实验已经越来越多。目前研究比较多的TP抗原有TPN17、TPN47、TPN15、TPN44.5、TPN36、TP0453、TP0684及TPr家族。采用重组DNA技术制备的重组抗原可以克服完整TP抗原的缺点，能快速、经济地制备无限量特异重组TP抗原。

梅毒特异性抗体检测是梅毒确证试验，包括TPHA，TPPA，ELISA，FTA-ABS及Western-blot等，其特异性均较高。然而，面对严峻的防制形式，不但需要特异准确的检测手段，还需要一种更简便快捷的试剂来筛查，以便为临床和疾病防控提供对策。

发明内容

本实用新型的目的是提供一种梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条。

本实用新型设有载体板、加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜(NC膜)、梅毒特异性IgM抗体检测线、对照线和吸收垫。

加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体。

所述载体板可采用PVC板。

以下给出所述梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条的制备方法，包括以下步骤：

1)制备梅毒重组抗原TPN17、TPN47

采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒重组抗原TPN17和TPN47

2)硝酸纤维素膜的点样

在硝酸纤维素膜IgM检测线上包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47IgG抗体，晾干，所述抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体的浓度为1～4mg/mL，羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体由抗TPN17-IgG抗体与抗TPN47-IgG抗体按体积比1∶1混合，其终浓度为1～4mg/mL；三者点样量为1μL/cm；

3)制备胶体金

采用柠檬酸三钠还原方法制备25nm胶体金，取1％氯金酸1mL加入到100mL去离子双蒸水中，得到的氯金酸浓度为0.01％，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热搅拌下加入1％柠檬酸三钠水溶液2.0mL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于棕色瓶中4℃冰箱保存备用，所述柠檬酸三钠的浓度可为2％；

4)胶体金与TPN17、TPN47的标记

胶体金与梅毒特异性抗原TPN17的标记：取胶体金10m L，用0.1mol/L NaOH调至pH5.4，加100μg TPN17，混匀，放置5min，加入5％BSA 1m L混匀，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10m L，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，沉淀用TBS稀释至1mL，得胶体金标记的TPN17抗原。

胶体金与梅毒特异性抗原TPN47的标记同上操作，得胶体金标记的TPN47抗原；

将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合后，均匀地涂于玻璃纤维膜上，烘干，制备成胶体金垫；

所述将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合，最好胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原以体积比1∶(0.2～5)混合；所述烘干的温度可为37℃；

5)制备免疫层析检测条

将加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体，用切条机切成条状，得梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条。

本实用新型提供了一种采用胶体金免疫层析技术建立梅毒特异性IgM抗体快速检测试剂条，可用于全血、血清、血浆及脑脊液等标本中梅毒特异性IgM抗体的检测。检测时所需的标本量极小，不需要特殊仪器，肉眼直接判读结果，且检测简便快速，特异性强，灵敏度高，准确可靠，成本低，应用广泛。

附图说明

图1为本实用新型实施例的结构组成示意图。

图2为实验结果模式示意图。在图2中，A为使用前的示意图，B为无效试验(产品质量问题)，C为阴性结果，D为TP-IgM阳性结果；6为梅毒特异性IgM抗体检测线，7为对照线。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本实用新型作进一步的说明。

参见图1，本实用新型实施例设有载体板1、加样垫2、胶体金垫3、硝酸纤维膜(NC膜)4、梅毒特异性IgM抗体检测线6、对照线7和吸收垫8。

加样垫2、胶体金垫3、硝酸纤维膜4和吸收垫8依次粘贴在载体板1上表面，加样垫2的一端设在胶体金垫3的一端上，胶体金垫3的另一端设在硝酸纤维膜4的一端上，吸收垫8的一端设在硝酸纤维膜4的另一端上，梅毒特异性IgM抗体检测线6和对照线7依次设在硝酸纤维膜4上；在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体。

所述载体板采用PVC板。

以下给出所述梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条的制备方法，包括以下步骤：

1)制备梅毒重组抗原TPN17、TPN47

采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒重组抗原TPN17和TPN47；

2)硝酸纤维素膜的点样

在硝酸纤维素膜IgM检测线上包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47IgG抗体，晾干；所述抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体的浓度为1～4mg/mL，羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体由抗TPN17-IgG抗体与抗TPN47-IgG抗体按体积比1∶1混合，其终浓度为1～4mg/mL；三者点样量为1μL/cm。

3)制备胶体金

采用柠檬酸三钠还原方法制备25nm胶体金，取1％氯金酸1mL加入到100mL去离子双蒸水中，得到的氯金酸浓度为0.01％，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热搅拌下加入1％柠檬酸三钠水溶液2.0mL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于棕色瓶中4℃冰箱保存备用；所述柠檬酸三钠的浓度为2％。

4)胶体金与TPN17、TPN47的标记

胶体金与梅毒特异性抗原TPN17的标记：取胶体金10m L，用0.1mol/L NaOH调至pH5.4，加100μg TPN17，混匀，放置5min，加入5％BSA 1mL混匀，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10m L，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，沉淀用TBS稀释至1mL，得胶体金标记的TPN17抗原。

胶体金与梅毒特异性抗原TPN47的标记同上操作，得胶体金标记的TPN47抗原。

将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合后，均匀地涂于玻璃纤维膜上，烘干，制备成胶体金垫；所述将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合，是胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原以体积比1∶(0.2～5)混合；所述烘干的温度为37℃。

5)制备免疫层析检测条

将加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体，用切条机切成条状，得梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条。

以下给出采用梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条检测患者的临床标本：

取待检标本(全血、血清、血浆、脑脊液)5～40μL，加样于梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条样品处，滴加100μL生理盐水，静置20min观察结果。只在检测条对照区有一紫红色条带出现，则判为阴性；在检测区(T)及对照区均有一紫红色条带出现，则判为阳性；加样检测后，检测区和对照区均不出现紫红色条带，为无效结果(见图2)。

以下给出梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条的性能检定：

1)外观检查：白色包被反应膜平整、干净无污染斑点、无裂缝，胶带无开胶，无切斜现象。

2)阳性标本符合率：用TP-IgM阳性的不同滴度的阳性参比血清各50份采用梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条检定，计算阳性符合率。阳性参比血清的确定采用FTA-ABS(德国欧蒙公司)法确定的临床标本。

3)阴性标本符合率：用50份阴性参比血清检定，计算阳性符合率。阴性参比血清的确定采用TPPA(日本富士株式会社)法确定的临床标本。

4)批内差异：同一批次梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条，用特征性血清检测，要求阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。

5)批间差异：不同批次梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条，用特征性血清检测，要求阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。

6)干扰试验：检测结果不受标本溶血(n＝50)、脂血(n＝50)和黄疸(n＝50)的干扰。血清(或血浆)来自本申请人临床标本。

7)交叉反应：采用本梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条，进行系统性红斑狼疮(n＝30)、类风湿病(n＝30)、免疫性肝炎(n＝30)等自身免疫系统疾病的检测，未发现交叉反应。自身免疫系统疾病的血清来自本申请人临床确诊患者。

8)稳定性检测：应用Arrhenius法则，将梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条放置37℃20天后检测，以上各项指标无显著变化，确保成品在室温干燥条件下保存，有效期为18个月。

本实用新型的检测在一条梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条上进行，通过以下两种方式实现梅毒特异性IgM抗体的检测：

方式一：利用胶体金免疫层析技术，在硝酸纤维素膜上IgM检测线和对照线处分别包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体和羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47IgG抗体。将已纯化的金标记的梅毒重组抗原TPN17和TPN47以一定的比例混合后预包被在玻璃纤维纸上，干燥处理，制备成金胶体垫，再辅以恰当的加样垫，组合梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条(组装方式见图1)。检测阳性样本时，样本中梅毒特异性IgM抗体与胶体金标记的重组抗原TPN17和/或TPN47结合形成免疫复合物。由于层析作用，复合物沿吸收垫的吸水纸方向向前移动。经过检测线时，①TP-IgM类免疫复合物与预包被的抗人IgM单克隆抗体结合形成“Au-TPN17(和/或TPN47)-特异性抗梅毒IgM抗体-抗人IgM单克隆抗体-固相材料”夹心物而凝聚显色；②游离金标抗原则在对照线处与羊抗梅毒抗原(TPN17和TPN47)抗体结合而富集显色。阴性标本则仅在对照线处显色。

方式二，将方式一的包被抗原、抗体对调：在硝酸纤维素膜上IgM检测线和对照线处分别包被梅毒重组抗原(TPN17/TPN47组合)和羊抗鼠IgG抗体，将金标记的抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体预包被在玻璃纤维纸上。

以下给出具体实施例。

实施例1

在硝酸纤维素膜(NC膜)IgM检测线上包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗梅毒抗原(TPN17和TPN47)抗体，室温晾干，密封室温保存备用。其中，抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体的浓度为1mg/mL，羊抗梅毒抗原(TPN17和TPN47)IgG抗体由抗TPN17-IgG抗体与抗TPN47-IgG抗体按体积比1∶1混合，其终浓度为1mg/mL；二者点样量为1μL/cm。

将已纯化的金标记的梅毒重组抗原TPN17和TPN47以体积比1∶1混合后，均匀地涂于玻璃纤维纸上，在37℃烘干，制备成金胶体垫，密封备用。将固相化的纤维膜与胶体金结合的玻璃纤维、吸水纸等按一定顺序，通过PVC不干胶底板组合在一起，用切条机切成一定宽度检测条。把梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条与干燥剂一起装入铝箔袋中，机器封口，密封保存。

取待检标本血清10μL，加样于梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条加样区，同时滴加100μL生理盐水，静置20min观察结果。只在梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条对照区有一紫红色条带出现，则判为阴性；在检测区及对照区均有一紫红色条带出现，则判为阳性；加样检测后，检测区和对照区均不出现紫红色条带，为无效结果。(见图2)

实施例2

与实施例1相似，区别在于金胶体垫仅由TPN17组成，不含有TPN47。结果判断与实施例1相同。

实施例3

与实施例1相似，区别在于金胶体垫仅由TPN47组成，不含有TPN17。结果判断与实施例1相同。

实施例4

与实施例1相似，区别在于待检标本为脑脊液标本，结果判断与实施例1相同。

实施例4

性能验证试验：按实施例1的方案制备梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条，然后进行性能验证。

1)外观检查：白色包被反应膜平整、干净无污染斑点、无裂缝，胶带无开胶，梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条宽度在3±0.1mm，无切斜现象。

2)阳性标本符合率：50份经FTA-ABS(德国欧蒙公司)检测确定的TP-IgM阳性参比血清，采用发明的梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条检出TP-IgM阳性50份，阳性标本符合率100％。

3)阴性标本符合率：50份梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验(TPPA)(日本富士株式会社)阴性参比血清，采用梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条检测未检出阳性标本，阴性标本符合率100％。

4)批内差异：同一批次梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条，用特征性阳性血清(FTA-ABS(德国欧蒙公司)检测确定的临床标本阳性TP-IgM参比高、中、低血清)检测，相同滴度检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。

5)批间差异：不同批次梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条，用特征性阳性血清(FTA-ABS(德国欧蒙公司)检测确定的临床标本阳性TP-IgM参比高、中、低血清)检测，相同滴度检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。

6)干扰试验：检测结果不受标本溶血(n＝50)、脂血(n＝50)和黄疸(n＝50)的干扰。

7)交叉反应：采用本梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条，进行系统性红斑狼疮(n＝30)、类风湿病(n＝38)、免疫性肝炎(n＝40)等自身免疫系统疾病的检测，未发现交叉反应。

8)稳定性检测：将梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条放置37℃20天后检测，以上各项指标无显著变化。

Claims (2)

1.梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条，其特征在于设有载体板、加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜、梅毒特异性IgM抗体检测线、对照线和吸收垫；加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体。

2.如权利要求1所述的梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条，其特征在于所述载体板为PVC板。

Images