CN104833798A - 基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条，包括PVC底板、样品垫、玻璃纤维垫、包被C线以及T线的硝酸纤维素膜、吸水垫；玻璃纤维垫中包被有偶联了特异性抗体Ⅰ的供体微球；硝酸纤维素膜的T线为偶联了特异性抗体Ⅱ的受体微球，硝酸纤维素膜的C线为偶联了能与所述特异性抗体Ⅰ相结合的特异性抗体Ⅲ的受体微球；所述特异性抗体Ⅰ和特异性抗体Ⅱ均能与待测蛋白特异性结合，且结合在待测蛋白质的不同表位。该诊断试纸条具有特异性强、灵敏度高、快捷、简便、可定量，适合快速诊断等特点。

Description

基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条

技术领域

本发明涉及一种基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条。

背景技术

均相化学发光(Amplified Luminscent Proximity Homogeneous Assay,AlphaLISA)是一种新型的免疫检测技术。均相化学发光技术整个过程中不需要洗涤，操作非常简单，灵敏度高。并且，均相化学发光动态范围宽(3-5个数量级)，亲和范围大(高低亲和力的抗体均可应用)，抗干扰能力强，易于实现自动化。已广泛用于药物筛选，其检测原理如图1所示。在均相条件下将带有染料的供体微球、包被有活性分子且带有发光化合物的受体微球以及检测样本混合。此时供体微球和包被有活性分子的受体微球可迅速有效地捕捉靶分子而形成免疫夹心复合物。在680nm的激发光照射下，供体微球中的光敏物质受到激发并催化周围的氧分子形成高能态的单线态氧，该高能态的单线态氧扩散至受体微球，产生一系列的化学发光反应，最后将能量传递给铕，发射出波长为615nm的信号。由于单线态氧在溶液中维持活性的时间很短(约4us)，只能扩散约200nm的距离，因此只有那些通过待测物质连接在一起的受体微球和供体微球才能产生信号，当生物分子不存在特异的相互作用时，单线态氧无法扩散到受体微球，则不会产生信号。

均相化学发光技术具有以下特点：

1、不用洗涤：

反应在液体均相中进行，只需要按次序加入样品、受体微球、供体微球后温浴，就可以进行检测，无需洗涤，操作简便，自动化程度高，可在96孔板、384孔板、1536孔板、3456孔板中进行反应，可高通量，自动化检测大量样品。

2、高灵敏度：

均相化学发光技术的检测灵敏度较高，这是因为供体微球含有高密度的光敏剂，每个微球每秒可释放高达60000个单线态氧分子，极大的扩增了信号。

3、适合生物大分子及相互作用的检测：

单线态氧分子在溶液中可以扩散到200nm的距离，故在小于200nm的距离供体微球与受体微球之间的相互作用均可以被检测到，因此应用光激化学发光技术可检测完整蛋白质、酶复合体、唾菌体等复杂的生物大分子及相互间的作用。其他均相技术，如时间分辨荧光、荧光偏振，仅限于直径为10nm以内的分子的检测。由于均相化学发光技术具有以上特点，已主要被应用到药物的大规模筛选方面。

胶体金免疫层析技术的原理是以硝酸纤维素膜为固相载体，以胶体金作为示踪标记物，与抗体结合，在微孔膜的渗滤作用或毛细管作用下，利用抗体反应的高度特异性和胶体金特有的颜色对金标抗体与二抗的结合进行示踪，显示肉眼可见的红色条带或斑点，从而实现对待测物的定性或定量分析。胶体金是由氯金酸在柠檬酸三钠、白磷或其他还原剂的作用下，聚合成大小不同的金颗粒，金颗粒之间是依赖于静电作用，因而呈现一种稳定的胶体状态，故而称为胶体金。因为胶体金颜色比较明显，肉眼即可辨别，因此无需任何仪器；检测速度快，只需要10分钟左右；产品为干式，没有液体，运输和保存方便；操作简单等特点。胶体金免疫层析试纸条得到了广泛应用。根据胶体金标记目标物的不同分为夹心法、间接法和竞争抑制法。夹心法和间接法主要针对大分子待测物，而对于小分子待测物因其分子量比较小，空间结构简单，一般采用竞争抑制法。但是，胶体金试纸条具有灵敏度偏低，容易产生假阳性等缺点，很多需要高灵敏度检测的物质使用胶体金试纸条的方法达不到要求。因此，胶体金免疫层析试纸条的检测方法还不能满足很多临床检测的需要，急需进行改进。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条，该诊断试纸条具有特异性强、灵敏度高、快捷、简便、可定量，适合快速诊断等优点。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条，包括PVC底板、样品垫、玻璃纤维垫、包被C线(即，控制线)以及T线(即，测试线)的硝酸纤维素膜、吸水垫；

在PVC底板的上表面固定设置硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜的两侧分别设有玻璃纤维垫和吸水垫；除玻璃纤维垫的右端下表面与硝酸纤维素膜的左端上表面固定相连之外，玻璃纤维垫的其余下表面与PVC底板的上表面固定相连；除吸水垫的左端下表面与硝酸纤维素膜的右端上表面固定相连之外，吸水垫的其余下表面与PVC底板的上表面固定相连；在玻璃纤维垫的左侧还设有样品垫，除样品垫的右端下表面与玻璃纤维垫的左端上表面固定相连之外，样品垫的其余下表面与PVC底板的上表面固定相连。

作为本发明的基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条的改进：

玻璃纤维垫中包被有偶联了特异性抗体Ⅰ的供体微球；

该玻璃纤维垫的制备方法为：

将偶联了特异性抗体Ⅰ的供体微球用释放缓冲液稀释至浓度为80～100ug/ml，喷至玻璃纤维垫上，用量为：1～5ul/cm；

备注说明：喷好后37℃烘干4小时；

所述释放缓冲液为：在100ml的10～100mmol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液中，加入10～40g蔗糖、3～10g海藻糖、0.5～1g的N，O-双三甲硅基乙酰胺、0.2～0.5g庆大霉素；

硝酸纤维素膜(简称为NC膜)的制备方法为：

将偶联了特异性抗体Ⅱ的受体微球用分析缓冲液稀释至浓度为200～300ug/ml，然后喷至硝酸纤维素膜的T线位置；用量为：1～1.5ul/cm；

将偶联了能与所述特异性抗体Ⅰ相结合的特异性抗体Ⅲ的受体微球用分析缓冲液稀释至浓度为200～300ug/ml，然后喷至硝酸纤维素膜的C线位置；用量为：1～1.5ul/cm；

备注说明：T线与C线是相互平行的两条线，间距一般为5～7mm；喷好后37℃烘干4小时；

所述分析缓冲液为：在100ml的25mM、pH7.4的HEPES缓冲液中加入100～500mg的Dextran-500，加入NaCl直至其浓度为10～100mM、加入0.1～1g的BSA、0.01～0.05g的牛γ-球蛋白、0.001～0.5g的Tween-20、0.01～0.05g的Proclin-300；

所述特异性抗体Ⅰ和特异性抗体Ⅱ均能与待测蛋白特异性结合，且结合在待测蛋白质的不同表位。

作为本发明的基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条的进一步改进：

特异性抗体Ⅰ和特异性抗体Ⅱ为以下任意一种：

兔、羊、鸡来源的抗待测蛋白质的多抗，或者鼠、兔来源的抗待测蛋白质的单克隆抗体。

作为本发明的基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条的进一步改进：

所述玻璃纤维垫中：

所述供体微球为酞菁颗粒；

所述特异性抗体Ⅰ为兔抗人心肌肌钙蛋白cTnI抗体、鼠抗人C反应蛋白(CRP)单克隆抗体1；

硝酸纤维素膜(4)中：

特异性抗体Ⅱ为：鼠抗人心肌肌钙蛋白cTnI单克隆抗体、鼠抗人C反应蛋白(CRP)单克隆抗体2；

特异性抗体Ⅲ为：羊抗兔IgG多克隆抗体、羊抗鼠IgG多克隆抗体；

受体微球为：聚苯乙烯微球(即，掺杂有铕配合物等物质的聚苯乙烯微球，在吸收溶液中的单线态氧后，可被激发出615nm的光)。

作为本发明的基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条的进一步改进：

玻璃纤维垫的制备方法中：将偶联了兔抗人心肌肌钙蛋白cTnI抗体的供体微球用释放缓冲液混合稀释到80ug/ml，喷至(可采用BIO-DOT点膜仪)玻璃纤维垫上，用量为1ul/cm；

硝酸纤维素膜(4)(以下简称NC膜)的制备方法中：将偶联了鼠抗人心肌肌钙蛋白cTnI单克隆抗体的受体微球用分析缓冲液稀释到200ug/ml，喷至硝酸纤维素膜(4)的T线(7)位置，用量为1ul/cm；将偶联了羊抗兔IgG多克隆抗体的受体微球用分析缓冲液稀释到200ug/ml，喷至硝酸纤维素膜(4)的C线(6)位置，用量为1ul/cm。

作为本发明的基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条的进一步改进：

所述释放缓冲液为：在100ml的20mmol/L、pH 7.4的的磷酸盐缓冲液中加入30g蔗糖、5g海藻糖、0.5g的N，O-双三甲硅基乙酰胺、0.3g庆大霉素；

所述分析缓冲液的制备方法为：在100ml的25mM，pH7.4的HEPES缓冲液中加入200mg的Dextran-500，加入NaCl直至其浓度为50mM、加入0.5g的BSA、0.02g的牛γ-球蛋白、0.1g的Tween-20、0.01g的Proclin-300。

在本发明中，试纸条的组装方式如下：

在PVC底板上，依次粘贴上硝酸纤维素膜(长30cm，宽2.5cm，即，层析膜)、玻璃纤维垫(长30cm，宽8mm)、样品垫(长30cm，宽17mm)和吸水垫(长30cm，宽17mm)。用切条机将粘贴好的塑料板纵向切成3.8mm宽的试纸条，4℃避光保存。即，把包被好微球的试纸条放在25℃～37℃烘箱内烘干4～12小时。最后4℃避光保存。

本发明中的试纸条结构如图2所示，主要部件由三部分组成：玻璃纤维垫、硝酸纤维素膜、吸水垫。玻璃纤维中间包被有偶联了特异性抗体Ⅰ的供体微球，包被于玻璃纤维上的供体微球与玻璃纤维的结合并不牢固，只要有液体通过就能使供体微球顺着液体方向流动。

在本发明中，样品垫、吸水垫均属于常规技术；例如，样品垫可选用美国millipore公司生产的编号为PTFEPET02205产品、吸水垫可选用美国mllipore公司生产的编号为IBFP0813C产品。

在本发明中，试纸条检测原理及方式为：直接将试纸条平放在桌面上，或者将试纸条装到专用的试纸条卡壳中，取100ul待测样品加到试纸条的样品垫上。在毛细作用下待测样品被缓缓吸到吸水垫处，流经玻璃纤维垫上的偶联了特异性抗体Ⅰ的供体微球时，待测样品中的目标蛋白与供体微球颗粒复合物结合，这种复合物流经T线时，与偶联了特异性抗体Ⅱ的受体微球结合形成供体微球-样品-受体微球复合物，从而固定在T线处，待达到动态平衡后，将试纸条置于PerkinElmer公司的2300EnSpire^TM光激化学发光免疫分析系统中测试。

本发明的基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条，具有特异性强、灵敏度高、快捷、简便、可定量，适合快速诊断的优点。因此，本发明具有较高的社会和经济价值。

本发明研发出的基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条与胶体金试纸条相比，具有对目标蛋白的检测灵敏度更高的优点。

在发明过程中，通过研究，发明人发现用均相化学发光方法中的供体微球代替免疫层析方法中的胶体金颗粒和抗体偶联，将此微球包被到试纸条的玻璃纤维上；用均相化学发光方法中所用的发光微球供体和另一抗体偶联，包被到NC膜上，用于测量样品中的目标蛋白，可以让试纸条检测蛋白的灵敏度大大提高。这是由于以下原因：1、胶体金试纸条反应的强弱是通过胶体金纳米粒在T线上产生的颜色深浅来判断的，而本发明的均相发光免疫层析技术是通过荧光的强弱来判断的，灵敏度会更高；2、胶体金试纸条检测过程中，胶体金颗粒随样品在NC膜上，从加样端向吸水纸端扩散，没有和T线上抗体结合的胶体金颗粒很难被样品中的液体冲洗干净，从而滞留在NC膜上产生背景。而在均相化学发光试纸条中，供体微粒替代胶体金颗粒在NC膜上扩散，供体微粒在检测时本身不产生615nm荧光，即便没有冲洗干净也不产生背景；在T线附近，即使有残留的供体微粒存在，只要和受体微粒距离大于200nm就不会产生背景荧光，就如同在均相反应过程中一样。因此，对目标蛋白的检测灵敏度会有很大提高。3、均相化学发光方法中受体微粒中包裹的铕配合物被激发后发射出的615nm荧光的寿命很长，可以达到1毫秒以上，而一般物质的荧光的寿命只有几十纳秒。因此，可以通过时间分辨技术，只检测激发光源关闭后100微秒以后的光强度，就可以去除生物样本如血液产生的背景荧光的干扰，检测的灵敏度和特异性也会由此提高。一般认为，用试纸条方法检测，加样后液体会扩散到吸水纸端，NC膜上就会干燥，均相化学发光方法中单线态氧的传输又是依赖水的存在才能从供体微球扩散到受体微球，一旦NC膜失去水分，即使两种微球相互结合了也不会发生信号，造成假阴性。但本发明发现，只要样品多加一些，能通过NC膜扩散到滤纸端的水溶液的量是有限的，滤纸端能吸收的水溶液量也是有限的。在半小时内，NC膜其实还是保持湿润状态，单线态氧还是可以从供体微球传输到供体微球，不会影响检测结果。另外，由于担心两种微球再干燥后复溶，会造成微球破裂和包裹物质泄漏，造成检测结果不准确，因此两种微球一般都液态保存。本发明发现只要缓冲液中加入合适的保护剂(即，采用本发明的缓冲液)，微球容易复溶并且与干燥前的性质变化不大。

因此，本发明的均相化学发光免疫层析试纸条，不但对目标蛋白的检测灵敏度比胶体金试纸条高，而且还保留了胶体金免疫层析试纸条的检测速度快、产品为干式、操作简单等特点。检测灵敏度的提高，可以大大扩展试纸条的应用范围。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为AlhpaLISA原理图(现有技术)；

图2为试纸条的立体结构示意图；

图3为图2的俯视示意图；

图4是图2的实际使用状态示意图；

图5是均相化学发光试纸条检测cTnI剂量-反应曲线。

图6是均相化学发光试纸条检测CRP剂量-反应曲线。

具体实施方式

实施例1、一种基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条，包括PVC底板1、样品垫2、玻璃纤维垫3、包被C线(即，控制线)6以及T线(即，测试线)7的硝酸纤维素膜4、吸水垫5。

在PVC底板1的上表面固定设置硝酸纤维素膜4，在硝酸纤维素膜4的两侧分别设有玻璃纤维垫3和吸水垫5；除玻璃纤维垫3的右端下表面与硝酸纤维素膜4的左端上表面固定相连之外，玻璃纤维垫3的其余下表面与PVC底板1的上表面固定相连；除吸水垫5的左端下表面与硝酸纤维素膜4的右端上表面固定相连之外，吸水垫5的其余下表面与PVC底板1的上表面固定相连；在玻璃纤维垫3的左侧还设有样品垫2，除样品垫2的右端下表面与玻璃纤维垫3的左端上表面固定相连之外，样品垫2的的其余下表面与PVC底板1的上表面固定相连。

该玻璃纤维垫3的制备方法为：

将结合了(偶联了)兔抗人心肌肌钙蛋白cTnI抗体的供体微球用释放缓冲液混合稀释到80ug/ml，用BIO-DOT点膜仪喷到玻璃纤维垫3的中间区域(如图3所示)，用量为1ul/cm；喷好后37℃烘干4小时。释放缓冲液为：在100ml的20mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中加入30g蔗糖、5g海藻糖、0.5g的N，O-双三甲硅基乙酰胺、0.3g庆大霉素。

上述结合了兔抗人心肌肌钙蛋白cTnI抗体的供体微球的制备方法为：

兔抗人心肌肌钙蛋白cTnI抗体购自美国ABCAM公司。供体微球为酞菁颗粒购自美国PerkinElmer公司，货号为6762013；这种微球直径约200nm，其表面有官能团。根据该供体微球的说明书，将兔抗人心肌肌钙蛋白cTnI偶联到供体微球上。在使用前，用释放缓冲液将结合了兔抗人心肌肌钙蛋白cTnI抗体的供体微球稀释至80ug/ml(为兔抗人心肌肌钙蛋白cTnI抗体的浓度)。

硝酸纤维素膜4的制备方法为：

将偶联了鼠抗人心肌肌钙蛋白cTnI单克隆抗体的受体微球和偶联了羊抗兔IgG多克隆抗体的受体微球，分别用分析缓冲液稀释到200ug/ml，然后用喷膜仪将该液体喷到NC膜上，用量是1ul/cm。具体为：偶联了鼠单抗(鼠抗人心肌肌钙蛋白cTnI单克隆抗体)的受体微球喷到硝酸纤维素膜4的T线位置，偶联了羊抗兔(羊抗兔IgG多克隆抗体)的受体微球喷到硝酸纤维素膜4的C线位置。T线与C线是相互平行的两条线(如图3所示)，间距一般为5mm。喷好后37℃烘干4小时。

上述偶联了鼠抗人心肌肌钙蛋白cTnI单克隆抗体的受体微球和偶联了羊抗兔多克隆抗体受体微球的制备方法为：

鼠抗人心肌肌钙蛋白cTnI单克隆抗体和羊抗兔多克隆抗体均购自美国ABCAM公司；受体微球(掺杂有铕配合物的聚苯乙烯微球)购自美国PerkinElmer公司，货号为6772001；这种微球直径约200nm，其表面有官能团。根据该受体微球的说明书，将鼠抗人心肌肌钙蛋白cTnI单克隆抗体偶联到受体微球上，将羊抗兔IgG多克隆抗体偶联到另外的受体微球上。在使用前，用分析缓冲液将偶联了鼠抗人心肌肌钙蛋白cTnI单克隆抗体的受体微球和偶联了羊抗兔IgG多克隆抗体的受体微球稀释至200ug/ml(为鼠抗人心肌肌钙蛋白cTnI单克隆抗体的浓度、羊抗兔IgG多克隆抗体的浓度)。

该分析缓冲液为：在100ml的HEPES缓冲液(25mM，pH7.4)中加入200mg的Dextran-500，加入NaCl直至其浓度为50mM、加入0.5g的BSA、0.02g的牛γ-球蛋白、0.1g的Tween-20、0.01g的Proclin-300。

试纸条的组装：

在PVC底板1上，依次粘贴上层析膜--硝酸纤维素膜4(长30cm，宽2.5cm)、玻璃纤维垫3(长30cm，宽8mm)、样品垫2(长30cm，宽17mm)和吸水垫5(长30cm，宽17mm)。用切条机将粘贴好的塑料板纵向切成3.8mm宽的试纸条(即，本发明的基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条)，放入扣卡中组装成免疫层析试剂盒，干燥后密封，4℃避光保存。

实验1、

材料：cTnI标准品(1mg/ml)购自美国Sigma-Aldrich公司；实施例1制备所得的基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条。

步骤：

1.用20mM，pH7.4的PBS缓冲液配置100、10、1、0.1、0.01、0ng/ml的cTnI溶液；

2.将不同浓度的cTnI各100ul溶液，分别加到不同试纸条的样品垫2上(如图4所示)；每个浓度用不同的试纸条检测6次。

避光静置10min，取出试纸条；将试纸条置于PerkinElmer公司的2300EnSpire^TM光激化学发光免疫分析系统中测试，读取实验数据，如表1所示。

表1

以标准品cTnI浓度的对数为横坐标，615nm荧光数为纵坐标，由双对数数学模型Log-Log函数处理，测得线性回归方程为Y＝3.576X-9.35，R²＝0.9916(图5)，表明该试纸条个体差异较小，具有良好的剂量反应线性关系。标准偏差计算方法为：

代表所采用的样本X1,X2,...,Xn的均值。变异系数是标准差和相应平均数的比值。以浓度为0ng/ml样品检测后的平均荧光强度加上3倍标准差来计算，其结果小于0.01ng/ml样品的平均荧光强度。说明本发明产品的检测灵敏度达到0.01ng/ml的cTnI。

目前，市场上心肌肌钙蛋白cTnI的胶体金检测试纸条最低检测浓度为0.5ng/ml，而本发明开发的基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条经测试，最低检测浓度为0.01ng/ml，与胶体金试纸条相比灵敏度大幅提高。

备注说明：在试纸条制成产品后，可在产品说明书中给出615nm荧光强度值与待测物浓度的对应关系。或者告知当615nm荧光强度值大于一定的值，就表明检测结果为阳性。

实施例2、一种基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条，包括PVC底板1、样品垫2、玻璃纤维垫3、包被C线(即，控制线)6以及T线(即，测试线)7的硝酸纤维素膜4、吸水垫5。

在PVC底板1的上表面固定设置硝酸纤维素膜4，在硝酸纤维素膜4的两侧分别设有玻璃纤维垫3和吸水垫5；除玻璃纤维垫3的右端下表面与硝酸纤维素膜4的左端上表面固定相连之外，玻璃纤维垫3的其余下表面与PVC底板1的上表面固定相连；除吸水垫5的左端下表面与硝酸纤维素膜4的右端上表面固定相连之外，吸水垫5的其余下表面与PVC底板1的上表面固定相连；在玻璃纤维垫3的左侧还设有样品垫2，除样品垫2的右端下表面与玻璃纤维垫3的左端上表面固定相连之外，样品垫2的的其余下表面与PVC底板1的上表面固定相连。

该玻璃纤维垫3的制备方法具体为：

将偶联了鼠抗人C反应蛋白(CRP)单克隆抗体1的供体微球用释放缓冲液稀释到80ug/ml，用点膜仪喷到玻璃纤维垫3的中间区域(如图3所示)，用量为1ul/cm。喷好后37℃烘干4小时。释放缓冲液为：在100ml的20mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中加入30g蔗糖、5g海藻糖、0.5g的N，O-双三甲硅基乙酰胺、0.3g庆大霉素。

上述偶联了鼠抗人C反应蛋白(CRP)单克隆抗体1的供体微球的制备方法为：

鼠抗人C反应蛋白(CRP)单克隆抗体1购自美国ABCAM公司，货号：Ab13426。供体微球为酞菁颗粒，购自美国PerkinElmer公司，货号为6762013；这种微球直径约200nm，其表面有官能团。根据说明书，将鼠抗人C反应蛋白(CRP)单克隆抗体1偶联到供体微球上。在使用前，用释放缓冲液将偶联了鼠抗人C反应蛋白(CRP)单克隆抗体1的供体微球稀释至80ug/ml(为鼠抗人C反应蛋白(CRP)单克隆抗体1浓度)。

硝酸纤维素膜4的制备方法为：

将结合了鼠抗人C反应蛋白(CRP)单克隆抗体2的受体微球和结合了羊抗鼠IgG多克隆抗体的受体微球，分别用分析缓冲液稀释到200ug/ml，然后用喷膜仪将该液体喷到NC膜上，用量是1ul/cm。具体为：偶联了鼠单抗(鼠抗人C反应蛋白(CRP)单克隆抗体2)的微球喷到硝酸纤维素膜4的T线位置，偶联了羊抗鼠IgG多克隆抗体的微球喷到硝酸纤维素膜4的C线位置。T线与C线是相互平行的两条线(如图3所示)，间距一般为5mm。喷好后37℃烘干4小时。

鼠抗人C反应蛋白(CRP)单克隆抗体2购自美国ABCAM公司，货号：Ab76434；羊抗鼠IgG多克隆抗体购自美国ABCAM公司。受体微球购自美国PerkinElmer公司，货号为6772001；这种微球直径约200nm，其表面有官能团。根据说明书，将鼠抗人C反应蛋白(CRP)单克隆抗体2偶联到受体微球上，将羊抗鼠IgG多克隆抗体偶联到另外的受体微球上。在使用前，用分析缓冲液将偶联了鼠抗人C反应蛋白(CRP)单克隆抗体2的受体微球和偶联了羊抗鼠IgG多克隆抗体的受体微球均稀释至200ug/ml(鼠抗人C反应蛋白(CRP)单克隆抗体2的浓度、羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度)。

该分析缓冲液为：在100ml HEPES缓冲液(25mM，pH7.4)中加入200mg的Dextran-500，加入NaCl直至其浓度为50mM、加入0.5g的BSA、0.02g的牛γ-球蛋白、0.1g的Tween-20、0.01g的Proclin-300。

实验2、

材料：C反应蛋白(CRP)标准品(1mg/ml)购自美国Sigma-Aldrich公司，货号C1617-1MG；实施例2制备所得的基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条。

步骤：

1、用20mM，pH7.4的PBS缓冲液配置100、10、1、0.1、0.01、0ng/ml的C反应蛋白(CRP)溶液；

2、将不同浓度的CRP各100ul溶液，分别加到不同试纸条的样品垫2上。每个浓度用不同的试纸条检测6次；

3、避光静置10min，取出试纸条；

将试纸条置于PerkinElmer公司的2300EnSpire^TM光激化学发光免疫分析系统中测试，读取实验数据；如表2所示。

表2

以标准品CRP浓度的对数为横坐标，615nm荧光数为纵坐标，由双对数数学模型Log-Log函数处理，测得线性回归方程为Y＝3.576X-9.35，R²＝0.9916(图6)，表明该试纸条个体差异较小，具有良好的剂量反应线性关系。标准偏差计算方法为：

代表所采用的样本X1,X2,...,Xn的均值。变异系数是标准差和相应平均数的比值。以浓度为0ng/ml样品检测后的平均荧光强度加上3倍标准差来计算，其结果小于0.01ng/ml样品的平均荧光强度。说明本发明产品的检测灵敏度达到0.01ng/ml的CRP。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (6)

1.基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条，其特征是：包括PVC底板(1)、样品垫(2)、玻璃纤维垫(3)、包被C线(6)以及T线(7)的硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(5)；

在PVC底板(1)的上表面固定设置硝酸纤维素膜(4)，在硝酸纤维素膜(4)的两侧分别设有玻璃纤维垫(3)和吸水垫(5)；除玻璃纤维垫(3)的右端下表面与硝酸纤维素膜(4)的左端上表面固定相连之外，玻璃纤维垫(3)的其余下表面与PVC底板(1)的上表面固定相连；除吸水垫(5)的左端下表面与硝酸纤维素膜(4)的右端上表面固定相连之外，吸水垫(5)的其余下表面与PVC底板(1)的上表面固定相连；在玻璃纤维垫(3)的左侧还设有样品垫(2)，除样品垫(2)的右端下表面与玻璃纤维垫(3)的左端上表面固定相连之外，样品垫(2)的其余下表面与PVC底板(1)的上表面固定相连。

2.根据权利要求1所述的基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条，其特征是：

玻璃纤维垫(3)中包被有偶联了特异性抗体Ⅰ的供体微球；

玻璃纤维垫(3)的制备方法为：

将偶联了特异性抗体Ⅰ的供体微球用释放缓冲液稀释至浓度为80～100ug/ml，喷至玻璃纤维垫(3)上，用量为：1～5ul/cm；

所述释放缓冲液为：在100ml的10～100mmol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液中，加入10～40g蔗糖、3～10g海藻糖、0.5～1g的N，O-双三甲硅基乙酰胺、0.2～0.5g庆大霉素；

硝酸纤维素膜(4)的制备方法为：

将偶联了特异性抗体Ⅱ的受体微球用分析缓冲液稀释至浓度为200～300ug/ml，然后喷至硝酸纤维素膜(4)的T线(7)位置；用量为：1～1.5ul/cm；

将偶联了能与所述特异性抗体Ⅰ相结合的特异性抗体Ⅲ的受体微球用分析缓冲液稀释至浓度为200～300ug/ml，然后喷至硝酸纤维素膜(4)的C线(6)位置；用量为：1～1.5ul/cm；

所述分析缓冲液为：在100ml的25mM、pH7.4的HEPES缓冲液中加入100～500mg的Dextran-500，加入NaCl直至其浓度为10～100mM、加入0.1～1g的BSA、0.01～0.05g的牛γ-球蛋白、0.001～0.5g的Tween-20、0.01～0.05g的Proclin-300；

所述特异性抗体Ⅰ和特异性抗体Ⅱ均能与待测蛋白特异性结合，且结合在待测蛋白质的不同表位。

3.根据权利要求2所述的基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条，其特征是：

特异性抗体Ⅰ和特异性抗体Ⅱ为以下任意一种：

兔、羊、鸡来源的抗待测蛋白质的多抗，或者鼠、兔来源的抗待测蛋白质的单克隆抗体。

4.根据权利要求2或3所述的基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条，其特征是：

所述玻璃纤维垫(3)中：

所述供体微球为酞菁颗粒；

所述特异性抗体Ⅰ为兔抗人心肌肌钙蛋白cTnI抗体、鼠抗人C反应蛋白(CRP)单克隆抗体1；

硝酸纤维素膜(4)中：

特异性抗体Ⅱ为：鼠抗人心肌肌钙蛋白cTnI单克隆抗体、鼠抗人C反应蛋白(CRP)单克隆抗体2；

特异性抗体Ⅲ为：羊抗兔IgG多克隆抗体、羊抗鼠IgG多克隆抗体；

受体微球为：聚苯乙烯微球。

5.根据权利要求4所述的基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条，其特征是：

玻璃纤维垫(3)的制备方法中：将偶联了兔抗人心肌肌钙蛋白cTnI抗体的供体微球用释放缓冲液混合稀释到80ug/ml，喷至玻璃纤维垫(3)上，用量为1ul/cm；

硝酸纤维素膜(4)的制备方法中：将偶联了鼠抗人心肌肌钙蛋白cTnI单克隆抗体的受体微球用分析缓冲液稀释到200ug/ml，喷至硝酸纤维素膜(4)的T线(7)位置，用量为1ul/cm；将偶联了羊抗兔IgG多克隆抗体的受体微球用分析缓冲液稀释到200ug/ml，喷至硝酸纤维素膜(4)的C线(6)位置，用量为1ul/cm。

6.根据权利要求5所述的基于均相化学发光技术的快速诊断试纸条，其特征是：

所述释放缓冲液为：在100ml的20mmol/L、pH 7.4的的磷酸盐缓冲液中加入30g蔗糖、5g海藻糖、0.5g的N，O-双三甲硅基乙酰胺、0.3g庆大霉素；

所述分析缓冲液的制备方法为：在100ml的25mM，pH7.4的HEPES缓冲液中加入200mg的Dextran-500，加入NaCl直至其浓度为50mM、加入0.5g的BSA、0.02g的牛γ-球蛋白、0.1g的Tween-20、0.01g的Proclin-300。