KR101894753B1 - 크로마토그래프 키트 및 크로마토그래프 방법 - Google Patents

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Abstract

(과제) 크로마토그래프 상의 증폭시키고 싶은 부위가 제1번째의 액으로 채워져 있는 것을 용이하게 확인할 수 있고, 제1번째의 액으로 채워지기 전에 제2번째의 액을 첨가하는 것에 의한 증폭 불량이 생기는 것을 방지할 수 있는 크로마토그래프 키트 및 크로마토그래프 방법을 제공하는 것.
(해결수단) 피험물질에 대한 제 1 결합물질로 수식한 표식물질을 갖는 표식물질 유지영역과, 상기 피험물질에 대한 제 2 결합물질 또는 상기 제 1 결합물질에 대한 결합물질을 갖는 표식물질 포착영역을 피검물질을 포함하는 피검시료의 전개방향에 대해서 상류방향으로부터 하류방향으로 이 순서로 갖고, 또한 상기 표식물질을 검출할 때에 표식물질의 시그널을 증폭시키기 위해서 사용하는 2종의 증폭시약 중 제 1 증폭시약을 검출하기 위한 발색시약을 갖는 영역을 갖는 크로마토그래프 키트.

Description

크로마토그래프 키트 및 크로마토그래프 방법{CHROMATOGRAPH KIT AND CHROMATOGRAPH METHOD}
본 발명은 검출 감도를 높이기 위한 시그널 증폭 조작을 행하는 크로마토그래프 키트 및 크로마토그래프 방법에 관한 것이다.
면역 측정 방법 중에서도 이뮤노크로마토그래프법은 조작이 간편하며, 단시간에 측정 가능한 점에서 일반적으로 잘 이용되고 있다. 이뮤노크로마토그래프법에서 사용되고 있는 면역반응으로서는 경합적 반응 또는 샌드위치형 반응이 널리 사용되고 있다. 그 중에서도 이뮤노크로마토그래프법에서는 샌드위치형 반응이 주류이며, 그 전형예에 있어서는 시료 중의 항원으로 이루어지는 피검물질을 검출하기 위해서 이하와 같은 조작이 행해진다. 우선, 피검물질인 항원에 대한 항체에 의해 감작시킨 미립자를 고상 미립자로서 크로마토그래프 담체에 고정화함으로써, 또는 이 항체 자체를 크로마토그래프 담체에 직접 고정화함으로써 반응 부위를 갖는 크로마토그래프 담체를 조제한다. 한편, 표식 미립자에 피검물질과 특이적으로 결합 가능한 항체를 감작시켜서 감작 표식 미립자를 조제한다. 이 감작 표식 미립자를 시료와 함께 크로마토그래프 담체 상에서 크로마토그래프적으로 이동시킨다. 이상의 조작에 의해, 크로마토그래프 담체에 형성된 반응 부위에 있어서 고정화된 항체가 고정화 시약이 되고, 이것에 피검물질인 항원을 통해 감작 표식 미립자가 특이적으로 결합한다. 그 결과, 감작 표식 미립자가 반응 부위에 포착되게 되고, 그것에 의해 발생되는 시그널의 유무 또는 정도를 육안으로 판정함으로써 시료 중의 피검물질의 존재의 유무 또는 양을 측정할 수 있다.
이뮤노크로마토그래프법 중에는 감도가 낮기 때문에 항원이 검출되지 않는(위음성) 문제를 회피하기 위해서 검출 시그널을 증폭시키는 방법이 행해지는 경우가 있다. 시그널 증폭의 방법으로서 표식으로서 알칼리 포스파타아제, 퍼옥시다아제 등의 효소를 사용하는 경우가 있지만, 금속 콜로이드 표식 및 금속 황화물 표식으로 이루어지는 군으로부터 선택한 표식에 은을 포함하는 화합물 및 은이온을 위한 환원제를 사용해서 증감시키는 것(은 증폭)에 의해 검출을 행하는 경우도 있다. 상기와 같은 증폭을 사용한 이뮤노크로마토그래프는 특허문헌 1~3 및 비특허문헌 1 등에 기재되어 있으며, 특히 특허문헌 2 및 특허문헌 3에는 2액의 증폭액을 사용해서 증폭을 행하는 것이 기재되어 있다. 그러나, 특허문헌 2 및 특허문헌 3에는 2액의 증폭액을 사용해서 증폭을 행할 때에 2액째의 첨가를 개시하는 타이밍을 판단하기 위한 수단에 대해서는 기재가 없다.
일본 특허 공개 2002-202307호 공보 일본 특허 공개 2010-71827호 공보 일본 특허 공개 2011-99724호 공보
Journal of Chromatography, 878(2010) 271-277
상기와 같이 크로마토그래프법에 있어서는 증폭을 촉매하는 액과 증폭을 행하는 액의 2액을 사용해서 증폭을 행하는 경우가 있다. 이 경우, 크로마토그래프 담체 상의 증폭시키고 싶은 부위가 제1번째의 액으로 채워져 있지 않으면 안되지만, 지지체의 길이나 플로우 레이트 및 외부환경의 온도 등에 의해 제1번째의 액(환원제 등)이 흐르는 속도가 변화되어 버린다. 그 때문에, 제2번째의 액의 첨가 시기를 시간으로 지정하면 제1번째의 액으로 채워지기 전에 제2번째의 액을 첨가하고, 증폭 불량이 생기거나, 증폭 불량의 발생을 방지하기 위해서 제2번째의 액의 첨가 시기를 필요 이상으로 늦게 설정할 필요가 발생한다는 문제가 있었다. 또한, 옥외에서의 측정이나, 대량의 검체를 단기간에 측정하는 경우 등 필요한 수의 시계를 준비할 수 없는 상황도 상정된다.
즉, 본 발명은 크로마토그래프 담체 상의 증폭시키고 싶은 부위가 제1번째의 액으로 채워져 있는 것을 용이하게 확인할 수 있고, 제1번째의 액으로 채워지기 전에 제2번째의 액을 첨가하는 것에 의한 증폭 불량이 생기는 것을 방지할 수 있는 크로마토그래프 키트 및 크로마토그래프 방법을 제공하는 것을 해결해야 할 과제로 했다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토한 결과, 증폭을 촉매하는 액과 증폭을 행하는 액의 2액을 사용해서 증폭을 행하는 크로마토그래프 키트 및 크로마토그래프 방법에 있어서, 증폭을 행하는 액을 첨가하는 타이밍을 시각적으로 알게 하기 위한 수단을 설치함으로써 증폭 불량의 발생을 방지하는 것에 성공했다. 본 발명은 이들 지견에 의거해서 완성된 것이다.
즉, 본 발명에 의하면,
(1) 피검물질에 대한 제 1 결합물질로 수식한 표식물질을 갖는 표식물질 유지영역과,
(2) 피검물질에 대한 제 2 결합물질 또는 상기 제 1 결합물질에 대한 결합물질을 갖는 표식물질 포착영역을 피검물질을 포함하는 피검시료의 전개방향에 대해서 상류방향으로부터 하류방향으로 이 순서로 갖고, 또한
(3) 상기 표식물질을 검출할 때에 표식물질의 시그널을 증폭시키기 위해서 사용하는 2종의 증폭시약 중 제 1 증폭시약을 검출하기 위한 발색시약을 갖는 영역을 갖는 크로마토그래프 키트가 제공된다.
바람직하게는 발색시약을 갖는 영역은 상기 표식물질 포착영역보다 하류에 위치하고 있다.
바람직하게는 상기 발색시약은 이온에 반응해서 발색되는 화합물이다.
바람직하게는 상기 발색시약은 Fe2+이온과 반응해서 발색되는 화합물이다.
바람직하게는 상기 발색시약은 페난트롤린 골격을 갖는 화합물이다.
바람직하게는 상기 발색시약은 H+이온과 반응해서 발색되는 화합물이다.
바람직하게는 상기 표식물질은 금속 콜로이드이다.
바람직하게는 상기 금속 콜로이드는 금 콜로이드이다.
바람직하게는 본 발명의 크로마토그래프 키트는 표식물질의 시그널을 증폭시키기 위해서 사용하는 2종의 증폭시약을 내장하고 있다.
바람직하게는 제 1 증폭시약은 은이온을 위한 환원제이며, 제 2 증폭시약은 은을 포함하는 화합물이다.
바람직하게는 제 1 증폭시약은 2가의 철이온을 포함하는 시약이다.
바람직하게는 크로마토그래프 키트는 표식물질 유지영역을 갖는 표식물질 유지패드, 표식물질 포착영역을 갖는 결합물질 고정화 멤브레인, 및 흡수패드를 적어도 포함하고, 상기 발색시약은 결합물질 고정화 멤브레인에 담지되어 있다.
바람직하게는 상기 발색시약은 피검시료를 포함하는 수용액 또는 제 1 증폭시약을 포함하는 수용액 중 어느 하나를 전개했을 때에 결합물질 고정화 멤브레인내를 실질적으로 이동하지 않는 발색시약이다.
또한 본 발명에 의하면,
(1) 피검물질과, 상기 피검물질에 대한 제 1 결합물질로 수식한 표식물질의 복합체를 형성시킨 상태로 전개하고, 상기 피검물질에 대한 제 2 결합물질 또는 상기 제 1 결합물질에 대한 결합물질을 갖는 표식물질 포착영역에 있어서 표식물질을 포착하는 공정;
(2) 상기 표식물질 포착영역에 포착된 표식물질의 시그널을 증폭시키기 위해서 사용하는 2종의 증폭시약 중 제 1 증폭시약을 표식물질 포착영역의 상류방향으로부터 표식물질 포착영역의 하류방향으로 전개하는 공정;
(3) 발색시약을 갖는 영역에 있어서의 물리 또는 화학적 변화를 검출함으로써 표식물질 포착영역이 제 1 증폭시약으로 채워져 있는 것을 확인하는 공정; 및
(4) 표식물질 포착영역이 제 1 증폭시약으로 채워져 있는 것을 확인한 후에 상기 2종의 증폭시약 중 제 2 증폭시약으로 표식물질 포착영역을 채우는 공정을 포함하는 크로마토그래프 방법이 제공된다.
바람직하게는 제 1 증폭시약은 은이온을 위한 환원제이며, 제 2 증폭시약은 은을 포함하는 화합물이다.
바람직하게는 제 1 증폭시약은 2가의 철이온을 포함하는 시약이다.
(발명의 효과)
본 발명의 크로마토그래프 키트 및 크로마토그래프 방법에 의하면 증폭을 행하는 액을 첨가하는 타이밍을 시각적으로 알게 하기 위한 수단을 설치함으로써 증폭 불량의 발생을 방지할 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 사용한 키트의 실시형태를 나타낸다. 본 발명의 키트의 외부를 구성하는 상부의 부재에는 제 2 증폭시약인 은이온 용액 충전 구멍이 형성되어 있다. 하부의 부재에는 제 1 증폭시약인 환원제 용액을 송액하기 위한 패드, 표식물질 유지영역인 금 콜로이드 유지패드, 표식물질 포착영역인 항체 고정화 라인을 갖는 항체 고정화 멤브레인, 및 발색시약을 갖는 영역인 흡수패드가 점착 시트 상에 이 순서대로 배치되어 있다. 도 1에 나타내어져 있는 바와 같이 피검물질을 포함하는 피검시료의 전개방향에 대해서 상류, 하류로 정의한다.
도 2는 실시예 2 및 실시예 3에서 사용한 키트의 실시형태를 나타낸다. 본 발명의 키트의 외부를 구성하는 상부의 부재에는 제 2 증폭시약인 은이온 용액 충전 구멍, 및 제 1 증폭시약인 환원제 용액 첨가 구멍이 형성되어 있다. 하부의 부재에는 제 1 증폭시약인 환원제 용액을 송액하기 위한 패드, 표식물질 유지영역인 금 콜로이드 유지패드, 표식물질 포착영역인 항체 고정화 라인과 발색시약을 갖는 영역인 발색시약 고정화 라인을 갖는 항체 고정화 멤브레인, 및 흡수패드가 점착 시트 상에 이 순서대로 배치되어 있다. 도 1과 마찬가지로 피검물질을 포함하는 피검시료의 전개방향에 대해서 상류, 하류로 정의한다.
본 발명의 크로마토그래프 키트 및 크로마토그래프 방법에 있어서는 피검물질의 검출 감도를 높이는 것을 목적으로 해서 증폭 조작을 행할 때에 사용하는 2종의 증폭시약을 첨가하는 타이밍을 시각적으로 판단하는 것이 가능하다.
1. 제 1 증폭시약을 검출하기 위한 발색시약
본 발명의 크로마토그래프 키트는 표식물질의 시그널을 증폭시키기 위해서 사용하는 2종의 증폭시약 중 제 1 증폭시약을 검출하기 위한 발색시약을 갖는 영역을 갖고 있다.
본 발명에 있어서, 제 1 증폭시약을 검출하기 위한 발색시약으로서는 예를 들면, 이온에 반응해서 발색되는 화합물을 사용하는 것이 바람직하다. 제 1 증폭시약에 대해서는 본 명세서 중에서 후기하지만, 예를 들면, 제 1 증폭시약이 2가의 철이온(Fe2+)을 포함하는 시약인 경우에는 그 발색시약으로서는 Fe2+이온과 반응해서 발색되는 화합물을 사용할 수 있다. Fe2+이온과 반응해서 발색되는 화합물로서는 Fe2+이온과 착형성함으로써 발색될 수 있는 화합물을 사용할 수 있다. Fe2+이온과 반응해서 발색되는 화합물의 구체예로서는 페난트롤린 골격을 갖는 화합물[예를 들면, 1,10-페난트롤린, 5-메틸페난트롤린, 5-니트로페난트롤린, 바소페난트롤린(4,7-디페닐-1,10-페난트롤린), 또는 바소페난트롤린디술폰산 등], 또는 -비피리딘 골격을 갖는 화합물[예를 들면, 2,2'-비피리딘 등]을 사용할 수 있고, 바람직하게는 페난트롤린 골격을 갖는 화합물을 사용할 수 있다. 또한, 피검시료를 포함하는 수용액과 제 1 증폭시약을 포함하는 수용액의 pH가 다른 경우에는 제 1 증폭시약을 검출하기 위해서 프로톤에 의해 구조변화가 일어나서 색미가 변화되는 시약을 바람직하게 사용할 수 있다. 특히 제 1 증폭시약을 포함하는 수용액이 산성(pH7보다 작고, 프로톤 농도가 높다)인 경우에는 산성영역용 pH 지시약으로서 공지의 발색시약인 H+이온과 반응해서 발색되는 화합물(예를 들면, 메틸오렌지, 메틸레드, 콩고레드 및 메틸옐로우 등의 디아조계의 발색시약, 및 티몰블루, 브로모크레졸그린, 브로모크레졸퍼플 및 브로모티몰블루 등의 술톤계의 발색시약) 등을 증폭시약을 포함하는 수용액의 pH에 맞춰서 적당히 선택해서 사용하는 것이 바람직하다. 상기 중에서도 1,10-페난트롤린, 바소페난트롤린 또는 브로모크레졸그린을 보다 바람직하게 사용할 수 있다.
피검시료를 포함하는 수용액 또는 제 1 증폭시약을 포함하는 수용액을 전개했을 때에 결합물질 고정화 멤브레인위를 발색시약이 이동하지 않는 것이 바람직한 점에서 발색시약의 LogP(물과 옥타놀 중에서의 분배 계수)가 4.0 이상인 것이 바람직하고, 5.0 이상인 것이 보다 바람직하다. LogP로서는 실측값을 사용해도 좋지만, 간편하게 판단하는 방법으로서 화학구조 등으로부터 얻어지는 계산값을 사용할 수도 있다. LogP를 계산하는 방법으로서는 CambridgeSoft사의 ChemDrawPro version 12에서 사용되고 있는 계산 방법이 바람직하다. 대표적인 발색시약의 응답성 및 LogP(ChemDrawPro version 12에 의함)를 이하의 표 1에 나타냈다.
Figure 112012074025117-pat00001
발색시약을 크로마토그래프 키트 내에 유지하는 방법으로서는 후술하는 흡수패드를 발색시약 용액에 침지하여 감압 건조하는 방법, 결합물질 고정화 멤브레인의 표식물질 보충영역보다 하류방향으로 라인상으로 도포하는 방법 등이 있다.
피검시료를 포함하는 수용액 또는 제 1 증폭시약을 포함하는 수용액 중 어느 하나를 전개했을 때에 발색시약이 결합물질 고정화 멤브레인내를 실질적으로 이동하는 경우에는 발색시약을 흡수패드에 함유시켜서 사용하는 것이 바람직하다.
피검시료를 포함하는 수용액 또는 제 1 증폭시약을 포함하는 수용액 중 어느 하나를 전개했을 때에 발색시약이 결합물질 고정화 멤브레인내를 실질적으로 이동하지 않는 경우에는 표식물질 포착영역을 갖는 결합물질 고정화 멤브레인에 발색시약을 담지시키는 것이 바람직하다.
표식물질 보충영역에 제 1 증폭시약이 도달한 것을 보다 작은 타임 래그로 표시하는 것을 가능하게 하기 위해서 본 발명에 있어서는 발색시약을 결합물질 고정화 멤브레인에 담지시키는 형태가 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서, 표식물질 유지영역을 상류방향, 표식물질 보충영역을 하류방향으로 갖는다란 피검시료를 모세관현상이나, 흡수패드를 사용한 경우의 흡인력 등을 이용해서 전개시키는 경우에 피검물질을 포함하는 피검시료의 전개방향에 대해서 상류방향, 하류방향으로 정의한다. 본 발명의 구체적인 형태에서는 도 1, 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 표식물질 유지영역으로부터 표식물질 보충영역을 향해서 피검시료 등을 전개한 경우에 표식물질 유지영역의 방향을 상류방향, 표식물질 보충영역의 방향을 하류방향으로 정의한다.
본 발명에 있어서는 표식물질 포착영역에 포착된 표식물질의 시그널을 증폭시키기 위해서 사용하는 2종의 증폭시약 중 제 1 증폭시약을 표식물질 포착영역의 상류방향으로부터 표식물질 포착영역의 하류방향으로 전개하고, 발색시약을 갖는 영역에 있어서의 물리 또는 화학적 변화를 검출함으로써 표식물질 포착영역이 제 1 증폭시약으로 채워져 있는 것을 확인한다. 발색시약을 갖는 영역에 있어서의 물리 또는 화학적 변화로서는 제 1 증폭시약과 발색시약의 반응에 의해 발생되는 발색이나 형광의 변화 등을 검출할 수 있다. 바람직하게는 발색을 검출할 수 있다. 이러한 물리 또는 화학적 변화는 시각적으로 검출해도 좋고, 검출기기를 이용해서 검출해도 좋다.
2. 크로마토그래프
일반적으로 크로마토그래프 방법이란 이하와 같은 방법으로 피검물질을 간편·신속·특이적으로 판정·측정하는 방법이다. 즉, 피검물질과 결합 가능한 고정화 시약(피검물질에 대한 제 2 결합물질, 또는 하기의 제 1 결합물질에 대한 결합물질에 상당하는 것; 구체적으로는 항체, 항원 등)을 포함하는 적어도 1개의 표식물질 포착영역을 갖는 것이 가능한 결합물질 고정화 멤브레인을 고정상으로서 사용한다. 이 결합물질 고정화 멤브레인 상에서 피검물질에 대한 제 1 결합물질에 의해 수식된 표식물질을 포함하는 액을 이동층으로 하여 결합물질 고정화 멤브레인내를 크로마토그래프적으로 이동시킴과 아울러 피검물질과 표식물질이 특이적으로 결합하면서 표식물질 포착영역까지 도달한다. 표식물질 포착영역에 있어서 피검물질과 표식물질의 복합체가 고정화된 제 2 결합물질 또는 제 1 결합물질에 대한 결합물질에 특이적 결합함으로써 피검시료 중에 피검물질이 존재하는 경우에만 제 2 결합물질 또는 제 1 결합물질에 대한 결합물질에 표식물질이 농축되는 것을 이용하고, 이들을 육안 또는 적당한 기기를 사용해서 피검시료 중에 피검물질이 존재하는 것을 정성 및 정량적으로 분석하는 방법이다.
본 발명에 있어서의 크로마토그래프 방법을 행하는 키트는 표식물질의 시그널을 증폭시키기 위해서 사용하는 2종의 증폭시약, 예를 들면, 바람직하게는 은을 포함하는 화합물 및 은이온을 위한 환원제를 내장하고 있어도 좋고, 표식물질 포착영역 상의 고정화 시약에 결합한 피검물질과 표식물질의 복합체를 핵으로 해서 증폭 반응에 의해 시그널을 증폭하여 결과적으로 고감도화를 달성할 수 있다. 본 발명에 의하면, 신속한 고감도 크로마토그래프를 행할 수 있다.
3. 피검시료
본 발명의 크로마토그래프 키트를 사용해서 분석할 수 있는 피검시료로서는 피검물질을 포함할 가능성이 있는 시료인 한 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면, 생물학적 시료, 특히 동물(특히 인간)의 체액(예를 들면, 혈액, 혈청, 혈장, 수액, 누액, 땀, 소변, 고름, 콧물, 또는 객담) 또는 배설물(예를 들면, 대변), 장기, 조직, 점막이나 피부, 이들을 포함한다고 생각되는 찰과검체(면봉), 양치액, 또는 동식물 그 자체 또는 이들의 건조체를 들 수 있다. 피검물질로서는 예를 들면, 천연물, 독소, 호르몬, 농약 등의 생리활성물질, 환경오염물질, 바이러스, 항원, 항체 등을 들 수 있다.
4. 피검시료의 전처리
본 발명의 크로마토그래프 키트를 사용해서 측정하는 방법에서는 피검시료를 그대로 또는 피검시료를 적당한 추출용 용매를 사용해서 추출해서 얻어지는 추출액의 형태로, 또한 추출액을 적당한 희석제로 희석해서 얻어지는 희석액의 형태, 또는 추출액을 적당한 방법으로 농축한 형태로 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 추출용 용매로서는 통상의 면역학적 분석법에서 사용되는 용매(예를 들면, 물, 생리식염액, 또는 완충액 등), 또는 이러한 용매로 희석함으로써 직접 항원항체반응을 실시할 수 있는 수혼화성 유기용매를 사용할 수도 있다.
5. 구성
본 발명의 크로마토그래프 키트에 있어서는 크로마토그래프용 스트립을 장착하여 사용할 수 있다. 사용할 수 있는 크로마토그래프용 스트립으로서는 통상의 크로마토그래프법에서 사용할 수 있는 크로마토그래프용 스트립인 한 특별히 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 사용할 수 있는 크로마토그래프용 스트립으로서는 피검물질을 포함하는 피검시료의 전개방향의 상류방향으로부터 하류방향을 향해서 표식물질 유지영역, 표식물질 보충영역을 갖고 있고, 발색시약을 갖는 영역을 더 갖고 있다. 본 발명에 있어서, 보다 바람직한 형태로서는 발색시약을 갖는 영역은 표식물질 보충영역의 하류방향에 위치하고 있는 형태이며, 또한 시료 첨가 패드, 표식물질 유지영역을 갖는 표식물질 유지패드(예를 들면 금 콜로이드 항체 유지패드), 결합물질 고정화 멤브레인(예를 들면, 표식물질 포착영역을 갖는 항체 고정화 멤브레인), 및 흡수패드를 이 순서대로 점착 시트 상에 배치하는 형태가 바람직하게 사용된다. 결합물질 고정화 멤브레인으로서는 피검물질과 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원을 고정화한 영역 등인 표식물질 포착영역을 갖고, 소망에 의해 컨트롤용 항체 또는 항원을 고정화한 영역인 컨트롤존(컨트롤영역이라고 기재하는 경우도 있음)을 더 갖고 있어도 좋다.
본 발명에서 사용할 수 있는 표식물질 유지영역을 갖는 표식물질 유지패드는 표식물질을 포함하는 현탁액을 조제하고, 그 현탁액을 적당한 흡수패드(예를 들면, 유리섬유 패드)에 도포한 후 그것을 건조함으로써 조제할 수 있다.
5-1. 표식물질
본 발명에서 사용되는 표식물질로서는 통상의 크로마토그래프 방법에 사용할 수 있는 금속황화물, 면역 응집 반응에 사용되고 있는 착색 입자를 사용할 수 있고, 바람직하게는 금속 콜로이드, 색소를 함유한 리포좀이나 마이크로캡슐을 착색 입자로서 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 금속 콜로이드를 사용할 수 있다. 종래 공지의 착색 금속 콜로이드는 모두 표식용 착색 입자로서 사용할 수 있고, 예를 들면, 금 콜로이드, 은 콜로이드, 백금 콜로이드, 철 콜로이드, 수산화 알루미늄 콜로이드, 및 이들의 복합 콜로이드 등을 들 수 있고, 특히, 적당한 입경에 있어서 금 콜로이드는 적색, 은 콜로이드는 황색을 나타내는 점에서 바람직하고, 그 중에서 금 콜로이드가 가장 바람직하다. 금속 콜로이드로서 금 콜로이드 입자를 사용하는 경우에는 시판의 것을 사용해도 좋다. 또는 상법, 예를 들면 염화금산을 시트르산 나트륨으로 환원하는 방법(Nature Physical Science, 241(1973) 20 등)에 의해 금 콜로이드 입자를 조제할 수 있다.
금속 콜로이드의 평균 입경으로서는 약 1nm∼500nm가 바람직하고, 1∼50nm가 더욱 바람직하고, 1∼15nm가 특히 바람직하다. 본 발명에 사용되는 금속 콜로이드의 평균 입경은 시판의 입도 분포계 등으로 계측할 수 있다. 입도 분포의 측정법으로서는 광학 현미경법, 공초점 레이저 현미경법, 전자 현미경법, 원자간력 현미경법, 정적 광산란법, 레이저 회절법, 동적 광산란법, 원심 침강법, 전기 펄스 계측법, 크로마토그래피법, 초음파 감쇠법 등이 알려져 있고, 각각의 원리에 대응한 장치가 시판되고 있다.
입경범위 및 측정의 용이함에서 본 발명에 있어서는 동적 광산란법을 바람직하게 사용할 수 있다. 동적 광산란을 사용한 시판의 측정 장치로서는 나노트랙 UPA(니키소(주)), 동적 광산란식 입경 분포 측정 장치 LB-550((주)호리바 세이사쿠쇼), 농후계 입경 애널라이저 FPAR-1000(오츠카 덴시(주)) 등을 들 수 있고, 본 발명에 있어서는 25℃의 측정 온도에서 측정한 메디안 직경(d=50)의 값으로서 구한다.
본 발명에 의하면, 검출용 표식물질로서 금속 콜로이드 표식 또는 금속황화물 표식, 기타 금속합금 표식(이하, 금속계 표식이라고 칭하는 경우가 있다), 또 금속을 포함하는 폴리머-입자 표식을 사용하는 크로마토그래프에 있어서 금속계 표식의 신호를 증폭시킬 수 있다. 구체적으로는 피검물질과 검출용 표식물의 복합체의 형성 후에 무기은염이나 유기은염 등의 은을 포함하는 화합물로부터 공급되는 은이온 및 은이온을 위한 환원제를 접촉시켜 환원제에 의해 은이온을 환원해서 은입자를 생성시키면 그 은입자가 금속계 표식을 핵으로 해서 금속계 표식 상에 침착되므로, 금속계 표식이 증폭되어 피검물질의 분석을 고감도로 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명의 크로마토그래프 방법에 있어서는 환원제에 의한 은이온의 환원 작용에 의해 발생된 은입자를 사용해서 면역 복합체의 표식에 침착시키는 반응을 실시하고, 이렇게 해서 증폭된 신호를 분석하는 것을 제외하면 그 이외의 점에서는 종래 공지의 크로마토그래프법을 그대로 적용할 수 있다.
5-2. 결합물질
본 발명에서는 표식물질은 피검물질에 대한 제 1 결합물질로 수식되어 있다. 제 1 결합물질이란 예를 들면 피검물질(항원)에 대한 항체, 피검물질(항체)에 대한 항원, 피검물질(단백질, 저분자 화합물 등)에 대한 앱타머 등 피검물질에 대해서 친화성을 갖는 화합물이면 무엇이든지 좋다.
본 발명의 크로마토그래프 키트는 (a) 피검물질에 대한 제 2 결합물질, 또는 (b) 제 1 결합물질에 대한 결합물질을 표식물질 포착영역에 갖고 있다. 피검물질에 대한 제 2 결합물질이란 예를 들면 피검물질(항원)에 대한 항체, 피검물질(항체)에 대한 항원, 피검물질(단백질, 저분자 화합물 등)에 대한 앱타머 등 피검물질에 대해서 친화성을 갖는 화합물이면 무엇이든지 좋다. 또한, 제 2 결합물질과 제 1 결합물질은 다른 것이어도 좋고, 동일한 것이어도 좋다. 제 1 결합물질에 대한 결합물질이란 피검물질 그 자체이어도 좋고, 제 1 결합물질이 인식하는 부위를 갖는 화합물이어도 좋고, 예를 들면 피검물질의 유도체와 단백질(예를 들면 BSA 등)을 결합시킨 화합물 등이 그것에 해당된다.
바람직하게는 제 1 결합물질이 항체이며, 및/또는 제 2 결합물질이 항체이다. 보다 바람직하게는 제 1 결합물질이 항체이며, 제 2 결합물질이 제 1 결합물질과 결합하는 항체이다.
본 발명의 크로마토그래프 방법에 있어서는 피검물질에 대해서 특이성을 갖는 항체로서 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 그 피검물질에 의해 면역 된 동물의 혈청으로부터 조제하는 항혈청, 항혈청으로부터 정제된 면역 글로불린 획분, 그 피검물질에 의해 면역된 동물의 비장세포를 사용하는 세포융합에 의해 얻어지는 단일클론 항체, 또는 이들의 단편[예를 들면, F(ab')2, Fab, Fab', 또는 Fv]을 사용할 수 있다. 이들 항체의 조제는 상법에 의해 행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 제 1 결합물질을 사용해서 표식물질을 수식하는 방법으로서는 예를 들면, 금속 콜로이드와 특이 결합물질의 결합의 경우는 이하에 기재되어 있는 종래 공지의 방법(예를 들면 The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 30, 7(1982)691-696)에 따라 행할 수 있다. 구체예로서는 금속 콜로이드와 특이 결합물질(예를 들면 항체)을 적당한 완충액 중에서 실온 하에서 5분 이상 혼합한다. 반응 후 원심분리에 의해 얻은 침전을 폴리에틸렌글리콜 등의 분산제를 포함하는 용액 중에 분산시킴으로써 목적의 금속 콜로이드 표식 특이 결합물질을 얻을 수 있다.
5-3. 결합물질 고정화 멤브레인
본 발명에서 사용할 수 있는 결합물질 고정화 멤브레인으로서는 다공성 담체가 바람직하다. 특히, 니트로셀룰로오스막, 셀룰로오스막, 아세틸셀룰로오스막, 폴리술폰막, 폴리에테르술폰막, 나일론막, 유리섬유, 부직포, 천, 또는 실 등이 바람직하다.
본 발명에 있어서는 결합물질 고정화 멤브레인의 일부에 피검물질에 대한 제 2 결합물질 또는 상기 제 1 결합물질에 대한 결합물질을 고정화시킨 표식물질 포착영역을 갖는 것이 바람직하다. 피검물질에 대한 제 2 결합물질 또는 상기 제 1 결합물질에 대한 결합물질은 결합물질 고정화 멤브레인의 일부에 물리적 또는 화학적 결합에 의해 직접 고정화시켜서 표식물질 포착영역을 형성시켜도 좋고, 또는 라텍스 입자 등의 미립자에 물리적 또는 화학적으로 결합시키고, 이 미립자를 결합물질 고정화 멤브레인의 일부에 트랩시켜서 고정화하여 표식물질 포착영역을 형성해도 좋다. 또한, 결합물질 고정화 멤브레인은 제 2 결합물질 또는 상기 제 1 결합물질에 대한 결합물질을 고정화한 후, 불활성 단백에 의한 처리 등에 의해 비특이적 흡착 방지 처리를 실시해서 사용하는 것이 바람직하다.
5-4. 표식물질 유지패드
본 발명에 있어서는 표식물질 유지영역을 갖는 표식물질 유지패드를 크로마토그래프 키트에 장착하여 사용하는 형태가 바람직하다. 표식물질 유지패드의 소재로서는 예를 들면, 셀룰로오스 여과지, 유리섬유, 및 부직포 등을 바람직하게 사용할 수 있고, 상술과 같이 조제한 표식물질을 일정량 함침시키고, 건조시켜서 표식물질 유지영역으로 할 수 있다.
5-5. 시료 첨가 패드
본 발명의 크로마토그래프 키트는 또한 시료 첨가 패드를 장착하여 사용하는 것이 바람직하다. 시료 첨가 패드는 첨가된 피검물질을 포함하는 시료를 수용할 뿐만 아니라, 시료 중의 불용물 입자 등을 여과하는 기능도 겸하는 형태가 바람직하다. 시료 첨가 패드의 재질로서는 셀룰로오스 여과지, 유리섬유, 폴리우레탄, 폴리아세테이트, 아세트산 셀룰로오스, 나일론, 및 면포 등의 균일한 특성을 갖는 것을 들 수 있다. 또한, 분석시 시료 중의 피검물질이 시료 첨가 패드의 재질에 비특이적으로 흡착하여 분석의 정밀도를 저하시키는 것을 방지하기 위해서 시료 첨가부를 구성하는 재질은 미리 비특이적 흡착 방지 처리해서 사용할 수도 있다. 시료 첨가 패드는 5-4에서 서술한 표식물질 유지영역을 갖는 표식물질 유지 패드를 겸하고 있어도 좋다.
5-6. 흡수패드
본 발명에 있어서는 흡수패드를 크로마토그래프 키트에 바람직하게 장착하여 사용할 수 있다. 흡수패드는 첨가된 시료가 크로마토 이동에 의해 물리적으로 흡수됨과 아울러 크로마토그래프 담체의 검출부에 불용화되지 않는 미반응 표식물질 등을 흡수 제거하는 부위이며, 셀룰로오스 여과지, 부직포, 천, 셀룰로오스아세테이트 등 흡수성 재료가 사용된다. 첨가된 시료의 크로마토 선단부가 흡수패드에 닿고 나서부터의 크로마토의 속도는 흡수패드의 재질, 크기 등에 따라 다르므로, 그 선정에 의해 피검물질의 측정에 맞는 속도를 설정할 수 있다.
6. 면역검사의 방법
이하, 본 발명의 크로마토그래프 방법에 대해서 그 구체적인 실시형태인 샌드위치법 및 경합법에 대해서 설명한다.
샌드위치법에서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 이하의 순서에 의해 피검물질의 분석을 실시할 수 있다. 우선, 피검물질(항원)에 대해서 특이성을 갖는 제 1 결합물질(예를 들면, 제 1 항체) 및 제 2 결합물질을 앞서 서술한 방법에 의해 미리 조제해 둔다. 또한, 제 1 결합물질로 미리 표식물질을 수식해 둔다. 제 2 결합물질을 적당한 결합물질 고정화 멤브레인(예를 들면, 니트로셀룰로오스막, 유리섬유막, 나일론막, 또는 셀룰로오스막 등) 상에 고정해서 표식물질 포착영역으로 하고, 피검물질(항원)을 포함할 가능성이 있는 피검시료(또는 그 추출액)와 접촉시키면 그 피검시료 중에 피검물질이 존재할 경우에는 제 2 결합물질과의 결합(예를 들면, 제 2 항체와의 항원항체반응)이 일어난다. 피검물질과 제 2 결합물질의 결합과 동시 또는 결합 후에 또한 제 1 결합물질로 수식한 표식물질을 과잉량 접촉시키면 피검시료 중에 피검물질이 존재할 경우에는 고정화된 제 2 결합물질과 피검물질(항원)과 제 1 결합물질로 수식한 표식물질로 이루어지는 복합체가 형성된다.
샌드위치법에서는 고정화된 제 2 결합물질과 피검물질(항원), 및 피검물질과 표식물질을 수식한 제 1 결합물질의 반응이 종료된 후, 면역 복합체를 형성하지 않은 표식물질을 제거하고, 계속해서, 예를 들면, 결합물질 고정화 멤브레인의 표식물질 포착영역을 그대로 관찰하여 그 표식물질을 검출, 또는 정량하고, 피검시료 중의 피검물질의 유무판정 또는 양을 측정할 수 있다. 본 발명에 있어서는 예를 들면, 환원제 및 은이온 함유 화합물을 공급함으로써 이러한 복합체를 형성한 표식물질로부터의 신호를 증폭하여 검출한다.
경합법에서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 이하의 순서에 의해 피검물질의 분석을 실시할 수 있다. 경합법은 샌드위치법으로 어세이(assay)할 수 없는 저분자 화합물의 항원을 검출하는 방법으로서 알려져 있다. 우선, 피검물질(항원)에 대해서 특이성을 갖는 제 1 결합물질을 미리 조제해 둔다. 또한, 제 1 결합물질로 미리 표식물질을 수식해 둔다. 제 1 결합물질에 대한 결합물질인 피검물질 자체, 또는 피검물질과 유사한 부위를 갖는 피검물질의 유사 화합물을 적당한 결합물질 고정화 멤브레인(예를 들면, 니트로셀룰로오스막, 유리섬유막, 나일론막, 또는 셀룰로오스막 등) 상에 고정해서 표식물질 포착영역으로 한다. 피검물질(항원)을 포함할 가능성이 있는 피검시료(또는 그 추출액) 및, 미리 제 1 결합물질로 수식한 표식물질을 접촉시키면 그 피검시료 중에 피검물질이 존재하지 않는 경우에는 표식물질을 수식한 제 1 결합물질과, 표식물질 포착영역 상에 고정화된 제 1 결합물질에 대해서 결합성을 갖는 피검물질 자체 또는 피검물질의 유사 화합물에 의해 복합체가 형성된다. 한편, 피검시료 중에 피검물질이 존재할 경우에는 표식물질을 수식한 제 1 결합물질에 피검물질(항원)이 결합되므로 그 후의 제 1 결합물질에 대해서 결합성을 갖는 표식물질 포착영역에 고정화된 피검물질 자체, 또는 피험물질의 유사 화합물과의 결합이 저해되어 복합체가 형성되지 않는다.
제 2 결합물질에 고정화된 피검물질 자체, 또는 피검물질과 유사한 부위를 갖는 피검물질과의 유사 화합물과, 표식물질을 수식한 제 1 결합물질의 반응이 종료된 후, 결합하지 않은 표식물질을 수식한 제 1 결합물질을 제거하고, 계속해서 표식물질 포착영역의 제 1 결합물질로 수식한 표식물질의 양을 검출, 또는 정량하고, 피검시료 중의 피검물질의 유무판정 또는 양을 측정할 수 있다. 본 발명에 있어서는 고정한 영역에, 예를 들면, 환원제 및 은이온 함유 화합물을 공급함으로써 이러한 복합체를 형성한 표식물질로부터의 신호를 증폭해서 검출한다.
7. 증폭액
증폭액은 포함되는 약제가 표식물질이나 피검물질의 작용에 의해 촉매적으로 반응함으로써 착색된 화합물이나 발광 등을 발생하여 시그널의 증폭을 일으킬 수 있는 용액이다. 예를 들면, 금속 표식 상에서 물리현상에 의해 금속은의 석출을 일으키는 은이온 용액이나, 퍼옥시다아제 표식과 과산화수소의 작용에 의해 색소가 되는 페닐렌디아민 화합물과 나프톨 화합물의 용액 등을 들 수 있다.
상세하게는 사진화학의 분야에서의 일반서적(예를 들면, 「개정 사진공학의 기초-은염사진편-」(일본 사진학회편, 코로나사), 「사진의 화학」 (사사이 아키라, 사진공업출판사), 「최신 처방 핸드북」 (키쿠치 신이치 외, 아미코 출판사))에 기재되어 있는 소위 현상액을 사용할 수 있고, 액 중에 은이온을 포함하고, 액 중의 은이온이 현상의 핵이 되는 금속 콜로이드 등을 중심으로 환원되는 물리 현상액이면 특별히 한정되지 않고 증폭 용액으로서 사용할 수 있다.
본 발명에서는 2종의 증폭시약을 사용한다. 표식물질 포착영역에 포착된 표식물질의 시그널을 증폭시키기 위해서 사용하는 2종의 증폭시약 중 제 1 증폭시약을 제 1 액에, 제 2 증폭시약을 제 2 액에 함유시켜 두고, 제 1 액 및 제 2 액을 순차 첨가함으로써 증폭을 행하는 것이 바람직하다. 제 1 액은 표식물질 유지패드 및 시료 첨가 패드보다 상류방향에 위치하는 환원제 용액을 송액하기 위한 패드에 첨가하는 것이 바람직하다.
증폭액의 구체예로서는 은이온을 위한 환원제를 포함하는 제 1 액, 및 은이온을 포함하는 화합물을 포함하는 제 2 액의 조합을 사용할 수 있다.
이하, 제 1 액에 포함되는 은이온을 위한 환원제와 제 2 액에 포함되는 은이온을 포함하는 화합물 등에 대해서 설명한다.
7-1. 은이온을 포함하는 화합물
은이온 함유 화합물로서는 유기 은염, 무기 은염, 또는 은착체를 사용할 수 있다. 바람직하게는 물 등의 용매에 대해서 용해도가 높은 은이온 함유 화합물이며, 질산은, 아세트산은, 락트산은, 부티르산은, 티오황산은 등을 들 수 있다. 특히 바람직하게는 질산은이다. 은착체로서는 수산기나 술폰기 등 수용성기를 갖는 배위자에 배위된 은착체가 바람직하고, 히드록시티오에테르은 등을 들 수 있다.
무기 은염, 또는 은착체는 은으로서 일반적으로 0.001몰/㎡∼0.2몰/㎡, 바람직하게는 0.01몰/㎡∼0.05몰/㎡ 함유되는 것이 바람직하다.
7-2. 은이온을 위한 환원제
은이온을 위한 환원제는 은이온을 은으로 환원할 수 있으면 무기·유기 중 어느 재료, 또는 그 혼합물로도 사용할 수 있다.
무기 환원제로서는 Fe2+, V2+, Ti3+ 등의 금속 이온으로 원자가가 변화될 수 있는 환원성 금속염, 환원성 금속착염을 바람직하게 들 수 있다. 무기 환원제를 사용할 때는 산화된 이온을 착형성하거나 환원해서, 제거하거나 무해화할 필요가 있다. 예를 들면, Fe2+를 환원제로서 사용하는 계에서는 시트르산이나 EDTA를 사용해서 산화물인 Fe3+의 착체를 형성하여 무해화할 수 있다. 본 계에서는 이러한 무기 환원제를 사용하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 Fe2+의 금속염이 바람직하다.
또한, 습식의 할로겐화 은사진 감광 재료에 사용되는 현상 주약(예를 들면 메틸몰식자산염, 히드로퀴논, 치환 히드로퀴논, 3-피라졸리돈류, p-아미노페놀류, p-페닐렌디아민류, 힌더드페놀류, 아미독심류, 아진류, 카테콜류, 피로갈롤류, 아스코르브산(또는 그 유도체), 및 류코 색소류), 및 본 분야에서의 기술에 숙련되어 있는 것에 있어서 명백한 그 밖의 재료, 예를 들면 미국 특허 제6,020,117호에 기재되어 있는 재료도 사용할 수 있다.
환원제로서는 아스코르브산 환원제도 바람직하다. 유용한 아스코르브산 환원제는 아스코르브산과 유사물, 이성체와 그 유도체를 포함하고, 예를 들면, D- 또는 L-아스코르브산과 그 당유도체(예를 들면 γ-락트아스코르브산, 글루코아스코르브산, 푸코아스크르브산, 글루코헵토아스코르브산, 말토아스코르브산), 아스코르브산의 나트륨염, 아스코르브산의 칼륨염, 이소아스코르브산(또는 L-에리스로아스코르브산), 그 염(예를 들면 알칼리금속염, 암모늄염 또는 당 기술분야에 있어서 알려져 있는 염), 엔디올타입의 아스코르브산, 에나미놀타입의 아스코르브산, 티오에놀타입의 아스코르브산 등을 바람직하게 들 수 있고, 특히는 D, L 또는 D, L-아스코르브산(그리고, 그 알칼리금속염) 또는 이소아스코르브산(또는 그 알칼리금속염)이 바람직하고, 나트륨염이 바람직한 염이다. 필요에 따라 이들 환원제의 혼합물을 사용할 수 있다.
8. 기타 조제
증폭액의 기타 조제로서는 완충제, 방부제, 예를 들면 산화 방지제 또는 유기 안정제, 속도 조절제를 포함하는 경우가 있다. 완충제로서는 예를 들면, 아세트산, 시트르산, 수산화 나트륨 또는 이들 중 어느 하나의 염, 또는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄을 사용한 완충제, 기타 일반적 화학실험에 사용되는 완충제를 사용할 수 있다. 이들 완충제를 적당히 사용해서 그 증폭 용액에 최적인 pH로 조정할 수 있다. 또한, 포그 방지제로서 알킬아민을 첨가제로서 사용할 수 있고, 특히 바람직하게는 도데실아민이다. 또한 이들 첨가제의 용해성 향상을 위해서 계면활성제를 사용할 수 있고, 특히 바람직하게는 C9H19-C6H4-O-(CH2CH2O)50H이다.
증폭시약을 크로마토 키트에 점착하는 방법으로서는 환원제 용액을 송액하기 위한 패드에 제 1 액으로서의 환원제 용액을 점착하고, 제 2 액으로서의 은이온 용액을 표식물질 포착영역에 위에서부터 점착하는 방법이 바람직하다.
2종의 증폭시약을 크로마토 키트에 내장하는 방법으로서는 각 증폭시약을 포함하는 용액을 포함하는 포트를 각 증폭시약을 점착하는 부위의 상부에 배치하는 방법을 들 수 있다. 환원제 용액(제 1 액)을 환원제 용액을 송액 하기 위한 패드의 상부에 두고, 은이온 용액(제 2 액)을 포함하는 포트를 은이온 용액 충전 구멍의 바로 상부에 설치하는 것이 바람직하다. 이렇게 배치함으로써 각각의 포트를 미는 것에 의해 액이 흘러 소정의 부위에 점착할 수 있다.
이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
(실시예)
(1) 인풀루엔자 바이러스 항원 검출 이뮤노크로마토 키트의 제작
(1-1) 항인풀루엔자 A형 단일클론 항체 수식 금 콜로이드(피검물질에 대한 제 1 결합물질로 수식한 표식물질)의 제작
지름 50nm 금 콜로이드 용액(EM.GC50, BBI사) 9mL에 50mM KH2PO4 버퍼(pH 7.5) 1mL를 첨가함으로써 pH를 조정한 금 콜로이드 용액에 160μg/mL의 항인풀루엔자 A형 단일클론 항체(Anti-Influenza A SPTN-57307, Medix Biochemica사) 용액 1 mL를 첨가하여 교반했다. 10분간 정치한 후, 1질량% 폴리에틸렌글리콜(PEG Mw.20000, 품번 168-11285, 와코준야쿠사제) 수용액을 550μL 첨가하여 교반하고, 계속해서 10질량% 소혈청 알부민(BSA FractionV, 품번A-7906, SIGMA사제) 수용액을 1.1mL 첨가하여 교반했다. 이 용액을 8000×g, 4℃, 30분 원심(himacCF16RX, 히타치사제)한 후, 1mL 정도를 남겨서 상청을 제거하고, 초음파 세정기에 의해 금 콜로이드를 재분산했다. 이 후, 20mL의 금 콜로이드 보존액(20mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.2), 0.05질량% PEG(Mw.20000), 150mM NaCl, 1질량% BSA)에 분산시키고, 다시 8000×g, 4℃, 30분간 원심한 후, 1mL 정도를 남겨서 상청을 제거하고, 초음파 세정기에 의해 금 콜로이드를 재분산하고, 항체 수식 금 콜로이드(50nm) 용액을 얻었다.
(1-2) 금 콜로이드 유지패드(표식물질 유지영역)의 제작
(1-1)에서 작성한 항인풀루엔자 A형 단일클론 항체 수식 금 콜로이드를 금 콜로이드 도포액(20mM Tris-HCl 버퍼(pH8.2), 0.05질량% PEG(Mw.20000), 5질량% 수크로오스) 및 물로 희석하고, 520nm의 광학농도(OD)가 0.1이 되도록 희석했다. 이 용액을 8mm×150mm로 자른 유리섬유 패드(Glass Fiber Conjugate Pad, 미리포어사) 1장당 0.8 mL씩 균일하게 도포하고, 12시간 감압 건조한 후 5mm로 재단함으로써 항인풀루엔자 A형 단일클론 항체 수식 금 콜로이드 유지패드를 얻었다. 금 콜로이드 항체를 유지하는 부분이 표식물질 유지영역에 상당한다.
(1-3-1) 항체 고정화 멤브레인-1(결합물질 고정화 멤브레인-1)의 제작
60mm×300mm로 절단한 니트로셀룰로오스 멤브레인(플라스틱의 뒷바침 있음, HiFlow Plus HF120, 미리포아사)에 관하여 이하와 같은 방법에 의해 항체를 고정해서 항체 고정화 멤브레인을 작성했다. 멤브레인의 긴변을 아래로 하고, 밑에서부터 15mm의 위치에 1.5mg/mL가 되도록 조제한 항인풀루엔자 A형 단일클론 항체(Anti-Influenza A SPTN-57307, Medix Biochemica사제) 용액을 라인상으로 도포하고, 항체 고정화 라인으로 했다. 또한 밑에서부터 11mm의 위치에 0.2mg/mL가 되도록 조제한 항마우스 IgG 항체(항마우스 IgG(H+L), 토끼 F(ab')2, 품번 566-70621, 와코준야쿠사제) 용액을 라인상으로 도포했다. 도포한 멤브레인은 온풍식 건조기로 50℃, 30분간 건조했다. 블록킹액(0.5질량% 카제인(젖유래, 품번 030-01505, 와코준야쿠사제) 함유 50mM 붕산 버퍼(pH8.5)) 500mL를 배트에 넣고, 그대로 30분간 정치했다. 그 후, 같은 배트에 넣은 세정·안정화 액(0.5질량% 수크로오스 및 0.05질량% 콜산 나트륨을 포함하는 50mM Tris-HCl(pH7.5) 버퍼) 500mL에 옮겨서 침지하고, 그대로 30분간 정치했다. 멤브레인을 액으로부터 인출하고, 실온에서 12시간 건조하고, 5mm폭으로 재단한 것을 항체 고정화 멤브레인-1로 했다. 항인풀루엔자 A형 단일클론 항체를 고정화한 부분이 표식물질 포착영역에 상당하고, 항마우스 IgG 항체 고정화한 부분은 포지티브 컨트롤영역에 상당한다. 또한, 본 실시예에서 사용하는 항인풀루엔자 A형 단일클론 항체가 인식하는 단백질은 동일 유닛의 3량체이기 때문에 표식된 항체와 고정화된 항체가 같은 것이어도 샌드위치법에 의한 어세이가 가능하다.
(1-3-2) 항체 고정화 멤브레인-2(결합물질 고정화 멤브레인-2)의 제작
60mm×300mm로 절단한 니트로셀룰로오스 멤브레인(플라스틱의 뒷바침 있음, HiFlow Plus HF120, 미리포아사제)에 관해서 이하와 같은 방법에 의해 항체 및 발색시약을 고정하고, 항체 고정화 멤브레인-2를 작성했다. 멤브레인의 긴변을 밑으로 하고, 밑에서부터 15mm의 위치에 1.5mg/mL가 되도록 조제한 항인풀루엔자 A형 단일클론 항체(Anti-Influenza A SPTN-57307, Medix Biochemica사제) 용액을 라인상으로 도포하고, 항체 고정화 라인으로 했다. 또한 밑에서부터 11mm의 위치에 0.2mg/mL가 되도록 조제한 항마우스 IgG 항체(항마우스 IgG(H+L), 토끼F(ab')2, 품번 566-70621, 와코준야쿠사제) 용액을 라인상으로 도포했다. 도포한 멤브레인은 온풍식 건조기로 50℃, 30분간 건조했다. 블록킹액(0.5질량% 카제인(젖유래, 품번 030-01505, 와코준야쿠사제) 함유 50mM 붕산 버퍼(pH8.5)) 500mL를 배트에 넣고, 그대로 30분간 정치했다. 그 후, 같은 배트에 넣은 세정·안정화 액(0.5질량% 수크로오스 및 0.05질량% 콜산 나트륨을 포함하는 50mM Tris-HCl(pH7.5) 버퍼) 500mL에 옮겨서 침지하고, 그대로 30분간 정치했다. 멤브레인을 액으로부터 인출하고, 실온에서 12시간 건조했다. 밑에서부터 9mm의 위치에 20mM로 조정한 바소페난트롤린(도우진 카가쿠사제)을 라인상으로 도포하고, 발색 시약 고정화 라인으로 했다. 5mm폭으로 재단한 것을 항체 고정화 멤브레인-2로 했다. 항인풀루엔자 A형 단일클론 항체를 고정화한 부분이 표식물질 포착영역에 상당하고, 항 마우스 IgG 항체 고정화한 부분은 포지티브 컨트롤영역에 상당한다.
(1-3-3) 항체 고정화 멤브레인-3(결합물질 고정화 멤브레인-3)의 제작
60mm×300mm로 절단한 니트로스 셀룰로오스 멤브레인(플라스틱의 뒷바침 있음, HiFlow Plus HF120, 미리포아사제)에 관해서 이하와 같은 방법에 의해 항체 및 발색시약을 고정하고, 항체 고정화 멤브레인-3을 작성했다. 멤브레인의 긴변을 아래로 하고, 밑에서부터 15mm의 위치에 1.5mg/mL가 되도록 조제한 항인풀루엔자 A형 단일클론 항체(Anti-Influenza A SPTN-57307, Medix Biochemica사제) 용액을 라인상으로 도포하고, 항체 고정화 라인으로 했다. 또한 밑에서부터 11mm의 위치에 0.2mg/mL가 되도록 조제한 항마우스 IgG 항체(항마우스 IgG(H+L), 토끼F(ab')2, 품번 566-70621, 와코준야쿠사제) 용액을 라인상으로 도포했다. 또한 밑에서부터 9mm의 위치에 30mM로 조정한 브로모크레졸그린(와코준야쿠사제)을 라인상으로 도포하고, 발색시약 고정화 라인으로 했다. 도포한 멤브레인은 온풍식 건조기로 50℃, 30분간 건조했다. 블록킹액(0.5질량% 카제인(젖유래, 품번 030-01505, 와코준야쿠사제) 함유 50mM 붕산 버퍼(pH8.5)) 500mL를 배트에 넣고, 그대로 30분간 정치했다. 그 후, 같은 배트에 넣은 세정·안정화 액(0.5질량% 수크로오스 및 0.05질량% 콜산 나트륨을 포함하는 50mM Tris-HCl(pH7.5) 버퍼) 500mL에 옮겨서 침지하고, 그대로 30분간 정치했다. 멤브레인을 액으로부터 인출하고, 실온에서 12시간 건조하고, 5mm폭으로 재단한 것을 항체 고정화 멤브레인-3으로 했다. 항인풀루엔자A형 단일클론 항체를 고정화한 부분이 표식물질 포착영역에 상당하고, 항마우스 IgG 항체 고정화한 부분은 포지티브 컨트롤영역에 상당한다.
(1-4) 은 증폭액의 제작
(1-4-1) 환원제 용액(제 1 증폭시약)의 제작
물 290g에 질산철(III) 9수화물(와코준야쿠사제, 095-00995)을 물에 용해해서 제작한 1mol/l의 질산철 수용액 23.6ml, 시트르산(와코준야쿠사제, 038-06925) 13.1g을 용해시켰다. 모두 용해되면 스터러로 교반하면서 질산(10질량%)을 36ml 첨가하고, 황산 암모늄철(II) 6수화물(와코준야쿠사제, 091-00855)을 60.8g 첨가하여 이것을 환원제 용액으로 했다.
(1-4-2) 은이온 용액(제 2 증폭시약)의 제작
물 66g에 질산은 용액 8ml(10g의 질산은을 포함한다)와 1mol/l의 질산철 수용액 24ml를 첨가했다. 또한, 이 용액과, 질산(10질량%) 5.9ml, 도데실아민(와코준야쿠사제, 123-00246) 0.1g, 계면활성제 C12H25-C6H4-O-(CH2CH2O)50H 0.1g을 미리 47.6g의 물에 용해한 용액을 혼합하고, 이것을 은이온 용액으로 했다.
(1-5) 1,10-페난트롤린 함유 흡수패드(발색시약을 갖는 영역)의 제작
흡수패드(GB-140, ADVANTEC)를 100mm×150mm로 재단하고, 1,10-페난트롤린 용액(21mM)에 침지했다. 1,10-페난트롤린 용액으로부터 인출한 후에 12시간 감압 건조함으로써 페난트롤린 함유 흡수패드를 얻었다. 페난트롤린을 함유하는 영역이 발색시약을 갖는 영역에 상당한다.
(1-6-1) 어세이용 키트-1의 제작
도 1에 어세이용 키트 부품의 모식도를 나타냈다. 키트의 외부를 구성하는 상부 및 하부의 재질은 폴리프로필렌제로 사출 성형에 의해 제작했다. 도 1에서 나타낸 바와 같이 (1-3-1)에서 제작한 항체 고정화 멤브레인-1(항인풀루엔자 A형 항체 및 항마우스 IgG 항체 고정화 멤브레인), 발색시약에 침지하지 않은 흡수패드(GB-140, ADVANTEC제, 100mm×150mm로 재단), 환원제 용액을 송액하기 위한 패드(Glass Fiber Conjugate Pad, 미리포아사제), 및 중앙에 금 콜로이드 유지패드로서 (1-2)에서 제작한 항인풀루엔자 A형 단일클론 항체 수식 금 콜로이드 유지패드를 도 1과 같이 장전하고, 어세이용 키트-1(비교예-1)을 제작했다.
(1-6-2) 어세이용 키트-2의 제작
(1-6-1)의 어세이용 키트-1의 제작에 있어서 발색시약에 침지되어 있지 않은 흡수패드로 바꾸고, (1-5)에서 제작한 1,10-페난트롤린 함유 흡수패드를 장전한 이외는 동일하게 해서 어세이용 키트-2(실시예-1)를 제작했다.
(1-6-3) 어세이용 키트-3의 제작
도 2에 어세이용 키트 부품의 모식도를 나타냈다. 키트의 외부를 구성하는 상부 및 하부의 재질은 폴리프로필렌제로 사출 성형에 의해 제작했다. 도 2에서 나타낸 바와 같이 (1-3-2)에서 제작한 항체 고정화 멤브레인-2(발색시약, 항인풀루엔자 A형 단일클론 항체 및 항마우스 IgG 항체 고정화 멤브레인), 발색시약을 함유하지 않는 흡수패드(GB-140, ADVANTEC사제, 100mm×150mm로 재단), 환원제 용액을 송액하기 위한 패드(Glass Fiber Conjugate Pad, 미리포아사제), 및 중앙에 금 콜로이드 유지패드로서 (1-2)에서 제작한 항인풀루엔자 A형 단일클론 항체수식 금 콜로이드 유지패드를 배치함으로써 어세이용 키트-3(실시예-2)을 제작했다.
(1-6-4) 어세이용 키트-4의 제작
(1-6-3)의 어세이용 키트-3의 제작에 있어서 (1-3-2)에서 제작한 항체 고정화 멤브레인-2로 바꾸고, (1-3-3)에서 제작한 항체 고정화 멤브레인-3(발색시약, 항인풀루엔자 A형 단일클론 항체 및 항마우스 IgG 항체 고정화 멤브레인)을 장전한 이외는 동일하게 해서 어세이용 키트-4(실시예-3)를 제작했다.
(2) 평가
(2-1) 피검 시료액의 전개
모의 양성 검체(BD Flu 에그자만컨트롤 A+B-(벡톤 디킨슨사제))를 추출액(1질량% BIGCHAP 함유 1질량% BSA-PBS)으로 128배 희석해서 피검 시료액을 준비했다. 이 피검 시료액 30μL를 (1-6-1)로부터 (1-6-4)로 제작한 어세이용 키트-1∼4의 항인풀루엔자 A형 단일클론 항체 수식 금 콜로이드 유지패드에 점착하고, 각각 피검 시료액을 전개했다.
(2-2) 환원제 용액의 전개
(2-1)에 있어서 피검 시료액을 점착한 후 바로 어세이용 키트-1∼4의 환원제 용액을 송액하기 위한 패드에 (1-4-1)에서 제작한 환원제 용액을 200μL 점착함으로써 환원제 용액을 전개했다.
(3) 은 증폭
(3-1) 은 증폭 개시 시그널 없음(비교예 1)
환원제 용액을 (2-2)에 기재된 방법으로 점착한 후 임의의 타이밍으로 어세이용 디바이스-1∼4의 은이온 용액 충전 구멍으로부터 (1-4-2)에서 제작한 은이온 용액 95μL를 첨가해서 은 증폭을 행하고, 점착 4분 후에 표식물질 보충영역의 흑화를 관찰했다. 이 시행을 10명의 다른 실험자가 각각 행하여 증폭된 흑색 라인이 확인되면 성공으로 하여 성공률을 산출했다. 결과를 표 2에 나타낸다.
(3-2) 은 증폭 개시 시그널 있음(실시예 1)
1,10-페난트롤린을 함유하는 흡수패드를 사용한 어세이용 키트-2에 대해서 환원제액을 (2-2)에 기재된 방법으로 점착한 후, 1,10-페난트롤린을 함유하는 흡수패드에 적색의 시그널이 관찰된 후 바로 (3-1)과 동일하게 해서 은이온 용액을 첨가해서 증폭을 행했다. 이 시행을 10명의 다른 실험자가 각각 행하여 증폭된 흑색 라인이 확인되면 성공으로 하여 성공률을 산출했다. 결과를 표 2에 나타낸다.
(3-3) 은 증폭 개시 시그널 있음(실시예 2)
(1-6-3)에서 제작한 발색 시약 바소페난트롤린을 고정화한 어세이용 키트-3에 대해서 환원제액을 (2-2)와 동일하게 해서 점착한 후, 발색시약 바소페난트롤린을 도포한 라인이 적색으로 발색된 후 바로 (3-1)과 동일하게 해서 은이온 용액을 첨가해서 증폭을 행했다. 이 시행을 복수인의 다른 실험자가 각각 행하여 증폭된 흑색 라인이 확인되면 성공으로 하여 성공률을 산출했다. 결과를 표 2에 나타낸다.
(3-4) 은 증폭 개시 시그널 있음(실시예 3)
(1-6-4)에서 제작한 발색시약 브로모크레졸그린을 고정화한 어세이용 키트-4에 대해서 환원제액을 (2-2)와 동일하게 해서 점착한 후, 발색시약 브로모크레졸그린을 도포한 라인이 심녹색으로부터 오렌지색으로 변화된 후 바로 (3-1)과 동일하게 해서 은이온 용액을 첨가해서 증폭을 행했다. 이 시행을 복수인의 다른 실험자가 각각 행하여 증폭된 흑색 라인이 확인되면 성공으로 하여 성공률을 산출했다. 결과를 표 2에 나타낸다.
Figure 112012074025117-pat00002
표 2의 결과로부터 증폭을 행하는 타이밍을 시각적으로 판단 가능으로 함으로써 증폭의 실패를 없애는 것에 성공했다. 본 발명의 효과는 이 결과로부터 명백해졌다.

Claims (16)

  1. (1) 피검물질에 대한 제 1 결합물질로 수식한 표식물질을 갖는 표식물질 유지영역과,
    (2) 상기 피검물질에 대한 제 2 결합물질 또는 상기 제 1 결합물질에 대한 결합물질을 갖는 표식물질 포착영역을 상기 피검물질을 포함하는 피검시료의 전개방향에 대해서 상류방향으로부터 하류방향으로 이 순서로 갖고, 또한,
    (3) 상기 표식물질을 검출할 때에 표식물질의 시그널을 증폭시키기 위해서 사용하는 2종의 증폭시약 중 제 1 증폭시약을 검출하기 위한 발색시약을 갖는 영역을 갖는 것을 특징으로 하는 크로마토그래프 키트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 발색시약을 갖는 영역은 상기 표식물질 포착영역보다 하류에 위치하고 있는 것을 특징으로 하는 크로마토그래프 키트.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 발색시약은 이온에 반응해서 발색되는 화합물인 것을 특징으로 하는 크로마토그래프 키트.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 발색시약은 Fe2+이온과 반응해서 발색되는 화합물인 것을 특징으로 하는 크로마토그래프 키트.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 발색시약은 페난트롤린 골격을 갖는 화합물인 것을 특징으로 하는 크로마토그래프 키트.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 발색시약은 H+이온과 반응해서 발색되는 화합물인 것을 특징으로 하는 크로마토그래프 키트.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 표식물질은 금속 콜로이드인 것을 특징으로 하는 크로마토그래프 키트.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 금속 콜로이드는 금 콜로이드인 것을 특징으로 하는 크로마토그래프 키트.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    표식물질의 시그널을 증폭시키기 위해서 사용하는 2종의 증폭시약을 내장하고 있는 것을 특징으로 하는 크로마토그래프 키트.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 제 1 증폭시약은 은이온을 위한 환원제이며, 상기 제 2 증폭시약은 은을 포함하는 화합물인 것을 특징으로 하는 크로마토그래프 키트.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 제 1 증폭시약은 2가의 철이온을 포함하는 시약인 것을 특징으로 하는 크로마토그래프 키트.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    표식물질 유지영역을 갖는 표식물질 유지패드, 표식물질 포착영역을 갖는 결합물질 고정화 멤브레인, 및 흡수패드를 적어도 포함하고, 상기 발색시약은 상기 결합물질 고정화 멤브레인에 담지되어 있는 것을 특징으로 하는 크로마토그래프 키트.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 발색시약은 피검시료를 포함하는 수용액 또는 상기 제 1 증폭시약을 포함하는 수용액 중 어느 하나를 전개했을 때 상기 결합물질 고정화 멤브레인내를 이동하지 않는 발색시약인 것을 특징으로 하는 크로마토그래프 키트.
  14. (1) 피검물질과 상기 피검물질에 대한 제 1 결합물질로 수식한 표식물질의 복합체를 형성시킨 상태로 전개하고, 상기 피검물질에 대한 제 2 결합물질 또는 상기 제 1 결합물질에 대한 결합물질을 갖는 표식물질 포착영역에 있어서 상기 표식물질을 포착하는 공정;
    (2) 상기 표식물질 포착영역에 포착된 표식물질의 시그널을 증폭시키기 위해서 사용하는 2종의 증폭시약 중 제 1 증폭시약을 상기 표식물질 포착영역의 상류측으로부터 표식물질 포착영역의 하류측으로 전개하는 공정;
    (3) 발색시약을 갖는 영역에 있어서의 물리 또는 화학적 변화를 검출함으로써 상기 표식물질 포착영역이 제 1 증폭시약으로 채워져 있는 것을 확인하는 공정; 및
    (4) 상기 표식물질 포착영역이 제 1 증폭시약으로 채워져 있는 것을 확인한 후에 상기 2종의 증폭시약 중 제 2 증폭시약으로 표식물질 포착영역을 채우는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 크로마토그래프 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 제 1 증폭시약은 은이온을 위한 환원제이며, 상기 제 2 증폭시약은 은을 포함하는 화합물인 것을 특징으로 하는 크로마토그래프 방법.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    상기 제 1 증폭시약은 2가의 철이온을 포함하는 시약인 것을 특징으로 하는 크로마토그래프 방법.
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