CN103033610A - 色谱试剂盒及色谱方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供能够容易地确认色谱上欲放大的部位被第1液充满、能够防止发生在被第1液充满之前添加第2液所导致的放大故障的色谱试剂盒及色谱方法。本发明的色谱试剂盒相对于含有待测物质的待测试样的展开方向从上游方向至下游方向依次具有下述区域：具有用针对待测物质的第一结合物质修饰过的标记物质的标记物质保持区域和具有针对所述待测物质的第二结合物质或针对所述第一结合物质的结合物质的标记物质捕获区域，所述色谱试剂盒进一步具有：具有显色试剂的区域，所述显色试剂用于对在检测所述标记物质时为了放大标记物质的信号而使用的2种放大试剂中的第1放大试剂进行检测。

Description

色谱试剂盒及色谱方法
技术领域
本发明涉及进行用于提高检测灵敏度的信号放大操作的色谱试剂盒及色谱方法。
背景技术
免疫测定方法中的免疫色谱法由于操作简便、在短时间内即可进行测定，因而通常被广泛利用。作为免疫色谱法中使用的免疫反应，广泛使用竞争反应或夹心型反应。其中，在免疫色谱法中夹心型反应为主流，在其典型例中，为了对试样中的由抗原构成的待测物质进行检测，进行以下的操作。首先，通过将利用针对作为待测物质的抗原的抗体进行了致敏的微粒作为固相微粒固定化在色谱载体上、或者将该抗体本身直接固定在色谱载体上，由此制备具有反应部位的色谱载体。另一方面，使能够与待测物质特异性结合的抗体致敏标记微粒，从而制备致敏标记微粒。使该致敏标记微粒与试样一起在色谱载体上色谱地移动。通过以上的操作，在形成于色谱载体的反应部位上，经固定化的抗体变为固定化试剂，致敏标记微粒介由作为待测物质的抗原特异地结合在其上。结果变成致敏标记微粒被反应部位捕获，通过目视判定由此产生的信号的有无或程度，可以测定试样中待测物质的存在的有无或其量。
免疫色谱法中，为了避免由于敏感度低而无法检测到抗原(假阴性)的问题，有时进行将检测信号放大的方法。作为信号放大的方法，有时使用碱性磷酸酶、过氧化物酶等酶作为标记，也有时通过使用含有银的化合物和用于银离子的还原剂对选自金属胶体标记及金属硫化物标记的标记进行敏化(银放大)来进行检测。使用了上述放大的免疫色谱记载于专利文献1~3及非专利文献1等中，特别是专利文献2及专利文献3中记载了使用2液的放大液来进行放大。但是，专利文献2及专利文献3中并未记载在使用2液的放大液进行放大时用于判断开始添加第2液的时机的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2002-202307号公报
专利文献2：日本特开2010-71827号公报
专利文献3：日本特开2011-99724号公报
非专利文献
非专利文献1：Journal of Chromatography，878(2010)271-277
发明内容
发明要解决的课题
如上所述，在色谱法中，有时使用催化放大的溶液和进行放大的溶液这2液来进行放大。此时，色谱载体上的欲放大的部位必须被第1液充满，但随着支撑体的长度或流速及外部环境的温度等不同，第1液（还原剂等）的流动速度会发生变化。因此，当以时间指定第2液的添加时期时，则存在下述问题：在被第1液充满之前添加第2液会发生放大故障，或者为了防止放大故障的发生而需要过分晚地设定第2液的添加时期。另外，当在屋外进行测定或者在短期间内测定大量检体等情况下，还可以预想到会有无法准备所需数量的钟表的状况。
即，本发明要解决的课题在于提供可容易地确认色谱载体上的欲放大部位被第1液充满、可以防止发生由于在被第1液充满之前添加第2液所导致的放大故障的色谱试剂盒及色谱方法。
用于解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现：在使用催化放大的溶液和进行放大的溶液这2液进行放大的色谱试剂盒及色谱方法中，通过设置用于在视觉上显示添加进行放大的溶液的时机的手段，成功地防止了放大故障的发生。本发明基于这些发现而完成。
即，根据本发明，提供一种色谱试剂盒，其相对于含有待测物质的待测试样的展开方向从上游方向至下游方向依次具有下述区域：
（1）具有用针对待测物质的第一结合物质修饰过的标记物质的标记物质保持区域；和
（2）具有针对待测物质的第二结合物质或者针对上述第一结合物质的结合物质的标记物质捕获区域，
且所述色谱试剂盒进一步具有（3）具有显色试剂的区域，该显色试剂用于对在检测上述标记物质时为了放大标记物质的信号而使用的2种放大试剂中的第1放大试剂进行检测。
优选具有显色试剂的区域位于上述标记物质捕获区域的下游。
优选上述显色试剂是与离子发生反应而显色的化合物。
优选上述显色试剂是与Fe2+离子发生反应而显色的化合物。
优选上述显色试剂是具有菲绕啉骨架的化合物。
优选上述显色试剂是与H+离子发生反应而显色的化合物。
优选上述标记物质为金属胶体。
优选上述金属胶体为金胶体。
优选本发明的色谱试剂盒内置有为了放大标记物质的信号而使用的2种放大试剂。
优选第1放大试剂是用于银离子的还原剂、第2放大试剂是含有银的化合物。
优选第1放大试剂是含有2价铁离子的试剂。
优选色谱试剂盒至少含有：具有标记物质保持区域的标记物质保持衬垫、具有标记物质捕获区域的结合物质固定化膜以及吸水衬垫，且上述显色试剂被担载于结合物质固定化膜。
优选上述显色试剂是在将含有待测试样的水溶液或含有第1放大试剂的水溶液的任一者进行展开时实质上不会在结合物质固定化膜中移动的显色试剂。
进而，根据本发明，提供一种色谱方法，其包含下述工序：
（1）在形成了待测物质和用针对上述待测物质的第一结合物质修饰过的标记物质的复合体的状态下进行展开、在具有针对上述待测物质的第二结合物质或针对上述第一结合物质的结合物质的标记物质捕获区域上将标记物质捕获的工序；
（2）使为了将被上述标记物质捕获区域捕获的标记物质的信号进行放大而使用的2种放大试剂中的第1放大试剂从标记物质捕获区域的上游方向向标记物质捕获区域的下游方向展开的工序；
（3）通过检测具有显色试剂的区域上的物理或化学变化来确认标记物质捕获区域被第1放大试剂充满的工序；以及
（4）在确认到标记物质捕获区域被第1放大试剂充满后使上述2种放大试剂中的第2放大试剂充满标记物质捕获区域的工序。
优选第1放大试剂是用于银离子的还原剂、第2放大试剂是含有银的化合物。
优选第1放大试剂是含有2价铁离子的试剂。
发明效果
根据本发明的色谱试剂盒及色谱方法，通过设置用于在视觉上显示添加进行放大的溶液的时机的手段，可以防止放大故障的发生。
附图说明
图1表示实施例1中使用的试剂盒的实施方式。在构成本发明试剂盒外部的上部的构件上设置有作为第2放大试剂的银离子溶液的填充孔。在下部的构件上，在粘合片材上依次配置有用于输送作为第1放大试剂的还原剂溶液的衬垫、作为标记物质保持区域的金胶体保持衬垫、具有作为标记物质捕获区域的抗体固定化线的抗体固定化膜、以及作为具有显色试剂的区域的吸水衬垫。如图1所示，相对于含有待测物质的待测试样的展开方向来定义为上游、下游。
图2表示实施例2及实施例3中使用的试剂盒的实施方式。在构成本发明试剂盒外部的上部的构件上设置有作为第2放大试剂的银离子溶液的填充孔及作为第1放大试剂的还原剂溶液的添加孔。在下部的构件上，在粘合片材上依次配置有用于输送作为第1放大试剂的还原剂溶液的衬垫、作为标记物质保持区域的金胶体保持衬垫、具有作为标记物质捕获区域的抗体固定化线和作为具有显色试剂的区域的显色试剂固定化线的抗体固定化膜、以及吸水衬垫。与图1同样，相对于含有待测物质的待测试样的展开方向来定义为上游、下游。
具体实施方式
本发明的色谱试剂盒及色谱方法中，可以在视觉上判断添加在以提高待测物质的检测灵敏度为目的而进行放大操作时所使用的2种放大试剂的时机。
1.用于检测第1放大试剂的显色试剂
本发明的色谱试剂盒具有下述区域：具有用于对为了放大标记物质的信号而使用的2种放大试剂中的第1放大试剂进行检测的显色试剂的区域。
本发明中，作为用于对第1放大试剂进行检测的显色试剂，例如优选使用与离子发生反应而显色的化合物。对于第1放大试剂，会在本说明书中后面叙述，但例如当第1放大试剂为含有2价铁离子（Fe2+）的试剂时，作为其显色试剂，可以使用与Fe2+离子发生反应而显色的化合物。作为与Fe2+离子发生反应而显色的化合物，可以使用通过与Fe2+离子形成络合物而能够显色的化合物。作为与Fe2+离子发生反应而显色的化合物的具体例子，可以使用具有菲绕啉骨架的化合物[例如1,10-菲绕啉、5-甲基菲绕啉、5-硝基菲绕啉、红菲绕啉（4,7-二苯基-1,10-菲绕啉）或红菲绕啉二磺酸等]或者具有联二吡啶骨架的化合物[例如2,2′-联二吡啶等]，可以优选使用具有菲绕啉骨架的化合物。另外，当含有待测试样的水溶液与含有第1放大试剂的水溶液的pH不同时，为了检测第1放大试剂，可优选使用通过质子引起结构变化、从而色调发生变化的试剂。特别是含有第1放大试剂的水溶液为酸性(pH小于7、质子浓度高)时，作为酸性区域用的pH指示剂而公知的作为显色试剂的与H+离子发生反应而显色的化合物(例如甲基橙、甲基红、刚果红及甲基黄等重氮系的显色试剂，以及百里香酚蓝、溴甲酚绿、溴甲酚紫及溴百里香酚蓝等磺酸内酯系的显色试剂)等可以根据含有放大试剂的水溶液的pH来适当选择使用。上述中，可以更优选地使用1,10-菲绕啉、红菲绕啉或溴甲酚绿。
在将含有待测试样的水溶液或含有第1放大试剂的水溶液进行展开时，优选显色试剂不在结合物质固定化膜上移动，因而优选显色试剂的LogP（在水和辛醇中的分配系数）为4.0以上、更优选为5.0以上。作为LogP，可以使用实测值，但作为简便判断的方法，也可以使用由化学结构等获得的计算值。作为计算LogP的方法，优选在CambridgeSoft公司的ChemDrawPro version 12中使用的计算方法。将代表性的显色试剂的响应性及LogP（根据ChemDrawPro version 12）示于以下的表1中。
表1
  化合物名   响应性   LogP
  2,2’-联二吡啶   Fe2+响应   1.88
  红菲绕啉二磺酸   Fe2+响应   0.52
  1,10-菲绕啉   Fe2+响应   2.2
  5-甲基菲绕啉   Fe2+响应   2.69
  5-硝基菲绕啉   Fe2+响应   2.34
  百里香酚蓝   pH响应   4.01
  甲基橙   pH响应   2.95
  甲基红   pH响应   3.63
  刚果红   pH响应   3.63
  甲基黄   pH响应   4.76
  红菲绕啉   Fe2+响应   5.55
  溴甲酚绿   pH响应   7.99
  溴甲酚紫   pH响应   6.33
  溴百里香酚蓝   pH响应   8.8
作为将显色试剂保持在色谱试剂盒内的方法，有将后述的吸水衬垫浸渍于显色试剂溶液并进行减压干燥的方法、在结合物质固定化膜的标记物质捕获区域的下游方向上涂布成线状的方法等。
当在将含有待测试样的水溶液或含有第1放大试剂的水溶液的任一者进行展开时、显色试剂会实质上在结合物质固定化膜中发生移动时，优选使显色试剂含有在吸水衬垫中进行使用。
当将含有待测试样的水溶液或含有第1放大试剂的水溶液的任一者进行展开时、显色试剂实质上不会在结合物质固定化膜中移动时，优选使显色试剂担载于具有标记物质捕获区域的结合物质固定化膜上。
为了能够以更小的时延（时间滞后）来显示第1放大试剂已到达标记物质捕获区域，本发明中更优选使显色试剂担载于结合物质固定化膜的方式。
本发明中，在上游方向具有标记物质保持区域、在下游方向具有标记物质捕获区域是指：在利用毛细管现象或者使用吸水衬垫时的吸引力等使待测试样展开时，相对于含有待测物质的待测试样的展开方向来定义为上游方向、下游方向。本发明的具体方式中，如图1及图2所示，当将待测试样等从标记物质保持区域向着标记物质捕获区域展开时，将标记物质保持区域的方向定义为上游方向、将标记物质捕获区域的方向定义为下游方向。
本发明中，通过将为了将被标记物质捕获区域捕获的标记物质的信号进行放大而使用的2种放大试剂中的第1放大试剂从标记物质捕获区域的上游方向向标记物质捕获区域的下游方向进行展开，并对具有显色试剂的区域上的物理或化学变化进行检测，从而确认标记物质捕获区域被第1放大试剂充满。作为具有显色试剂的区域上的物理或化学变化，可以对通过第1放大试剂与显色试剂的反应所产生的显色或荧光的变化等进行检测。优选对显色进行检测。这种物理或化学变化可以在视觉上进行检测、也可利用检测设备进行检测。
2.色谱
一般来说，色谱方法是利用以下的手法简便、迅速、特异性地对待测物质进行判定和测定的方法。即是以下的方法。将含有能够与待测物质结合的固定化试剂（相当于针对待测物质的第二结合物质或针对下述第一结合物质的结合物质的试剂，具体地为抗体、抗原等）的可具有至少1个标记物质捕获区域的结合物质固定化膜作为固定相使用。在该结合物质固定化膜上，使含有用针对待测物质的第一结合物质修饰过的标记物质的溶液作为流动相在结合物质固定化膜中色谱地移动，同时待测物质与标记物质一边特异性地结合一边到达标记物质捕获区域。在标记物质捕获区域中，通过待测物质和标记物质的复合体与已固定化的第二结合物质或针对第一结合物质的结合物质发生特异性结合，仅在待测试样中存在待测物质时，利用使标记物质浓缩在第二结合物质或针对第一结合物质的结合物质上，目视地或者使用适当的设备对待测试样中待测物质的存在进行定性及定量的分析。
进行本发明的色谱方法的试剂盒可以内置有为了放大标记物质的信号而使用的2种放大试剂、例如优选含银的化合物及用于银离子的还原剂，通过以结合在标记物质捕获区域上的固定化试剂的待测物质和标记物质的复合体为核的放大反应，将信号放大，结果可以实现高灵敏度化。根据本发明，可以进行迅速的高灵敏度色谱。
3.待测试样
作为可使用本发明的色谱试剂盒进行分析的待测试样，只要是有可能含有待测物质的试样，则无特别限定，例如可以举出生物学试样、特别是动物（尤其是人）的体液（例如血液、血清、血浆、髓液、泪液、汗、尿、脓、鼻涕或痰）或者排泄物（例如粪便）、脏器、组织、粘膜或皮肤、认为含有这些物质的擦拭检体（擦拭片）、漱口液或者动植物其本身或它们的干燥体。作为待测物质，例如可举出天然物、毒素、激素、农药等生理活性物质、环境污染物质、病毒、抗原、抗体等。
4.待测试样的前处理
使用本发明的色谱试剂盒进行测定的方法中，可以直接使用待测试样，或者可以以使用适当的抽提用溶剂对待测试样进行抽提所获得的抽提液的形态使用，还可以以用适当的稀释剂对抽提液进行稀释所获得的稀释液的形态使用，或者可以以利用适当的方法将抽提液进行浓缩的形态使用。作为本发明中使用的抽提用溶剂，可以使用通常的免疫学分析法中使用的溶剂（例如水、生理盐水或缓冲液等）或者通过用该溶剂进行稀释可直接实施抗原抗体反应的水混和性有机溶剂。
5.构成
本发明的色谱试剂盒中，可以组装色谱用条（色谱条）进行使用。作为能够使用的色谱用条，只要是可以用于通常色谱法的色谱用条，则无特别限定。
作为本发明中能够使用的色谱用条，从含有待测物质的待测试样的展开方向的上游方向向着下游方向具有标记物质保持区域、标记物质捕获区域，进而还含有具有显色试剂的区域。本发明中，作为更优选的方式，优选具有显色试剂的区域位于标记物质捕获区域的下游方向的方式，进一步优选使用在粘合片材上依次配置试样添加衬垫、具有标记物质保持区域的标记物质保持衬垫（例如金胶体抗体保持衬垫）、结合物质固定化膜（例如具有标记物质捕获区域的抗体固定化膜）以及吸水衬垫的方式。作为结合物质固定化膜，具有作为将与待测物质特异性结合的抗体或抗原固定化了的区域等的标记物质捕获区域，根据需要还可以进一步具有作为将对照用抗体或抗原固定化了的区域的对照区（有时也记为对照区域）。
本发明中能够使用的具有标记物质保持区域的标记物质保持衬垫可如下制备：制备含有标记物质的悬浮液，将该悬浮液涂布在适当的吸收衬垫（例如玻璃纤维衬垫）上后，将其进行干燥，从而制得。
5-1.标记物质
作为本发明中使用的标记物质，可以使用能在通常的色谱方法中使用的金属硫化物、免疫凝集反应中使用的着色粒子，优选可以将金属胶体、含色素的核糖体或微胶囊制成着色粒子来使用，更优选可以使用金属胶体。以往公知的着色金属胶体均可作为标记用着色粒子使用，例如可举出金胶体、银胶体、铂胶体、铁胶体、氢氧化铝胶体和它们的复合胶体等，特别是就适当的粒径而言，金胶体从显示红色的方面来看优选、银胶体从显示黄色的方面来看优选，其中最优选金胶体。使用金胶体粒子作为金属胶体时，也可以使用市售品。或者，可以通过常规方法、例如用柠檬酸钠对氯金酸进行还原的方法（Nature Physical Science，241(1973)20等）来制备金胶体粒子。
作为金属胶体的平均粒径，优选为约1nm～500nm、更优选为1～50nm、特别优选为1～15nm。本发明中使用的金属胶体的平均粒径可利用市售的粒度分布计等来测量。作为粒度分布的测定法，已知有光学显微镜法、共聚焦激光显微镜法、电子显微镜法、原子力显微镜法、静态光散射法、激光衍射法、动态光散射法、离心沉降法、电脉冲测量法、色谱法、超声波衰减法等，对应于各个原理的装置都有市售。
从粒径范围及测定的容易性出发，本发明中可优选使用动态光散射法。作为使用了动态光散射的市售测定装置，可举出Nanotrac UPA（日机装株式会社）、动态光散射式粒径分布测定装置LB-550（株式会社堀场制作所）、浓厚系粒径分析仪FPAR-1000（大塚电子株式会社）等，本发明中是作为在25℃的测定温度下测得的中位径（d＝50）的值求得的。
根据本发明，在使用作为检测用标记物质的金属胶体标记或金属硫化物标记、其它金属合金标记（以下有时称作金属系标记）及含金属的聚合物粒子标记的色谱中，可以将金属系标记的信号放大。具体地说，在形成待测物质和检测用标记物的复合体后，使由无机银盐或有机银盐等含银化合物提供的银离子与用于银离子的还原剂相接触，通过还原剂将银离子还原而产生银粒子，则该银粒子以金属系标记为核而沉降在金属系标记上，因而金属系标记被放大，从而可以高灵敏度地实施待测物质的分析。因此，本发明的色谱方法中，使用通过利用还原剂的银离子的还原作用所产生的银粒子，实施使其沉降在免疫复合体的标记上的反应，对如此被放大的信号进行分析，除此之外的方面可以直接适用以往公知的色谱法。
5-2.结合物质
本发明中，标记物质用针对待测物质的第一结合物质修饰。第一结合物质例如只要是针对待测物质（抗原）的抗体、针对待测物质（抗体）的抗原、针对待测物质（蛋白质、低分子化合物等）的适配体等对待测物质具有亲和性的化合物，则可以是任何物质。
本发明的色谱试剂盒在标记物质捕获区域上具有（a）针对待测物质的第二结合物质或（b）针对第一结合物质的结合物质。针对待测物质的第二结合物质例如只要是针对待测物质（抗原）的抗体、针对待测物质（抗体）的抗原、针对待测物质（蛋白质、低分子化合物等）的适配体等对待测物质具有亲和性的化合物，则可以是任何物质。另外，第二结合物质与第一结合物质可以是不同物质、也可以是相同物质。针对第一结合物质的结合物质可以是待测物质本身，也可以是具有第一结合物质进行识别的部位的化合物，例如使待测物质的衍生物与蛋白质（例如BSA等）结合而成的化合物等与其相当。
优选第一结合物质为抗体和/或第二结合物质为抗体。更优选第一结合物质为抗体、第二结合物质为结合于第一结合物质的抗体。
本发明的色谱方法中，作为对待测物质具有特异性的抗体，并无特别限定，例如可以使用由被该待测物质免疫的动物的血清制备的抗血清、由抗血清纯化得到的免疫球蛋白级分、通过使用被该待测物质免疫的动物的脾脏细胞的细胞融合所获得的单克隆抗体或者它们的片段[例如F(ab’)2、Fab、Fab’或Fv]。这些抗体的制备可通过常规方法进行。
本发明中，作为使用第一结合物质修饰标记物质的方法，例如在为金属胶体与特异结合物质的结合时，可以按照以下记载的以往公知的方法（例如The Journal of Histochemistry and Cytochemistry，30,7(1982)691-696）进行。作为具体例子，在适当的缓冲液中于室温下将金属胶体和特异结合物质（例如抗体）混合5分钟以上。反应后，将通过离心分离获得的沉淀分散在含有聚乙二醇等分散剂的溶液中，从而可获得目标的金属胶体标记特异结合物质。
5-3.结合物质固定化膜
作为本发明中能够使用的结合物质固定化膜，优选多孔性载体。特别优选硝化纤维素膜、纤维素膜、乙酰纤维素膜、聚砜膜、聚醚砜膜、尼龙膜、玻璃纤维、无纺布、布或丝线等。
本发明中，优选在结合物质固定化膜的一部分上具有已固定化有针对待测物质的第二结合物质或针对上述第一结合物质的结合物质的标记物质捕获区域。针对待测物质的第二结合物质或针对上述第一结合物质的结合物质可以通过物理的或化学的结合直接固定化在结合物质固定化膜的一部分上而形成标记物质捕获区域；或者可以物理地或化学地结合在胶乳粒子等微粒上并使该微粒被结合物质固定化膜的一部分捕获而固定化、从而形成标记物质捕获区域。此外，结合物质固定化膜优选在将第二结合物质或针对上述第一结合物质的结合物质固定化后通过利用惰性蛋白的处理等来实施防非特异性吸附的处理后使用。
5-4.标记物质保持衬垫
本发明中，优选将具有标记物质保持区域的标记物质保持衬垫组装在色谱试剂盒内进行使用的方式。作为标记物质保持衬垫的原材料，例如可优选使用纤维素滤纸、玻璃纤维及无纺布等，可以含浸一定量的如上制备的标记物质并将其干燥而制成标记物质保持区域。
5-5.试样添加衬垫
本发明的色谱试剂盒还优选组装试样添加衬垫进行使用。试样添加衬垫优选下述方式：不仅具有接收所添加的含待测物质的试样的功能，还兼具对试样中的不溶物粒子等进行过滤的功能。作为试样添加衬垫的材质，可举出纤维素滤纸、玻璃纤维、聚氨酯、聚醋酸酯、醋酸纤维素、尼龙及棉布等具有均匀特性的材质。另外，在进行分析时，为了防止试样中的待测物质非特异地吸附在试样添加衬垫的材质上而降低分析的精度，构成试样添加部的材质还可预先进行防非特异性吸附处理后使用。试样添加衬垫还可兼作5-4中所述的具有标记物质保持区域的标记物质保持衬垫。
5-6.吸水衬垫
本发明中，可以优选将吸水衬垫组装到色谱试剂盒中进行使用。吸水衬垫是在所添加的试样通过色谱移动被物理性地吸收的同时、将不溶于色谱载体检测部的未反应标记物质等吸收除去的部位，可以使用纤维素滤纸、无纺布、布、醋酸纤维素等吸水性材料。所添加的试样的色谱前端部到达吸水衬垫后的色谱速度根据吸水衬垫的材质、大小等而不同，因而根据其选择，可以设定适合待测物质测定的速度。
6.免疫检查的方法
以下对于本发明的色谱方法，就作为其具体实施方式的夹心法及竞争法进行说明。
夹心法中虽无特别限定，但例如可通过以下的顺序实施待测物质的分析。首先，通过前述的方法预先制备对待测物质（抗原）具有特异性的第一结合物质（例如第1抗体）及第二结合物质。另外，用第一结合物质预先修饰标记物质。将第二结合物质固定在适当的结合物质固定化膜（例如硝化纤维素膜、玻璃纤维膜、尼龙膜或纤维素膜等）上而制成标记物质捕获区域，使其与可能含有待测物质（抗原）的待测试样（或其抽提液）相接触时，当该待测试样中存在待测物质时，则发生与第二结合物质的结合（例如与第二抗体的抗原抗体反应）。在待测物质与第二结合物质的结合的同时或者结合后，进一步过量地接触用第一结合物质修饰过的标记物质时，当待测试样中存在待测物质时，形成由固定化了的第二结合物质、待测物质（抗原）、用第一结合物质修饰过的标记物质构成的复合体。
夹心法中，在固定化了的第二结合物质与待测物质（抗原）、以及待测物质与修饰过标记物质的第一结合物质的反应结束后，将未形成免疫复合体的标记物质除去，接着例如直接观察结合物质固定化膜的标记物质捕获区域，对该标记物质进行检测或定量，可以判定待测试样中的待测物质的有无或测定其量。本发明中，例如通过供给还原剂及含银离子的化合物，将来自形成了该复合体的标记物质的信号放大而进行检测。
竞争法中虽无特别限定，但例如可通过以下的顺序实施待测物质的分析。竞争法作为对利用夹心法无法分析的低分子化合物的抗原进行检测的手法而为人所知。首先，预先制备对待测物质（抗原）具有特异性的第一结合物质。另外，用第一结合物质预先对标记物质进行修饰。将作为针对第一结合物质的结合物质的待测物质本身或具有与待测物质相类似的部位的待测物质的类似化合物固定在适当的结合物质固定化膜（例如硝化纤维素膜、玻璃纤维膜、尼龙膜或纤维素膜等）上，制成标记物质捕获区域。当使其与可能含有待测物质（抗原）的待测试样（或其抽提液）和预先用第一结合物质修饰过的标记物质相接触时，当该待测试样中不存在待测物质时，由修饰标记物质的第一结合物质和固定在标记物质捕获区域上的对第一结合物质具有结合性的待测物质本身或待测物质的类似化合物形成复合体。另一方面，当待测试样中存在待测物质时，由于待测物质（抗原）结合在修饰标记物质的第一结合物质上，因而阻碍了之后的与对第一结合物质具有结合性且固定化在标记物质捕获区域上的待测物质本身或待测物质的类似化合物的结合，从而无法形成复合体。
在固定化在第二结合物质上的待测物质本身或具有与待测物质相类似部位的待测物质的类似化合物与修饰标记物质的第一结合物质的反应结束后，将未结合的修饰标记物质的第一结合物质除去，接着对标记物质捕获区域上的用第一结合物质修饰过的标记物质的量进行检测或定量，可以判定待测试样中的待测物质的有无或测定其量。本发明中，通过将例如还原剂及含银离子的化合物供给至固定的区域上，将来自形成了该复合体的标记物质的信号放大而进行检测。
7.放大液
放大液是所含的药剂在标记物质或待测物质的作用下催化地反应而产生着色的化合物或发光等、从而可以引起信号放大的溶液。例如可以举出在金属标记上利用物理显影引起金属银的析出的银离子溶液；通过过氧化物酶标记和过氧化氢的作用而变为色素的苯二胺化合物和萘酚化合物的溶液等。
详细地说，可以使用在照片化学的领域中的一般书籍（例如《修订照片工学的基础-银盐照片篇-》（改訂写真工学の基礎-銀塩写真編-）（日本照片学会（日本写真学会）编、Corona公司）、《照片的化学》（写真の化学）（笹井明、照片工业出版社（写真工業出版社））、《最新处方手册》（最新処方ハンドブツク）（菊池真一等、アミコ出版社））所记载的所谓显影液，只要是溶液中含有银离子且溶液中的银离子以成为显影的核的金属胶体等为中心被还原的所谓物理显影液，则可以没有特别限定地作为放大溶液使用。
本发明中使用2种放大试剂。优选：使为了将被标记物质捕获区域捕获的标记物质的信号进行放大而使用的2种放大试剂中的、第1放大试剂预先含有在第1液中、使第2放大试剂预先含有在第2液中，通过依次添加第1液和第2液来进行放大。第1液优选添加在位于比标记物质保持衬垫和试样添加衬垫更为上游方向上的、用于输送还原剂溶液的衬垫上。
作为放大液的具体例子，可以使用含有用于银离子的还原剂的第1液和含有含银离子的化合物的第2液的组合。
以下，对第1液所含的用于银离子的还原剂和第2液所含的含银离子的化合物等进行说明。
7-1.含银离子的化合物
作为含银离子的化合物，可以使用有机银盐、无机银盐或银络合物。优选为对水等溶剂的溶解度高的含银离子的化合物，可举出硝酸银、醋酸银、乳酸银、丁酸银、硫代硫酸银等。特别优选硝酸银。作为银络合物，优选与具有羟基或磺酸基等水溶性基团的配位体配位而成的银络合物，可举出羟基硫醚银等。
无机银盐或银络合物优选以银计通常含有0.001摩尔/m2～0.2摩尔/m2、优选含有0.01摩尔/m2～0.05摩尔/m2。
7-2.用于银离子的还原剂
用于银离子的还原剂只要是能够将银离子还原成银，则可以使用无机、有机的所有材料或其混合物。
作为无机还原剂，可优选举出通过Fe2+、V2+、Ti3+等金属离子可发生原子价变化的还原性金属盐、还原性金属络盐。使用无机还原剂时，需要将被氧化的离子形成络合物，或者进行还原除去，从而实施无害化。例如在使用Fe2+作为还原剂的体系中，可以使用柠檬酸或EDTA形成作为氧化物的Fe3+的络合物，从而实施无害化。本体系中，优选使用这种无机还原剂，更优选Fe2+的金属盐。
另外，还可以使用在湿式的卤化银照片感光材料中使用的显影主剂（例如没食子酸甲酯、氢醌、取代氢醌、3-吡唑烷酮类、对氨基苯酚类、对苯二胺类、受阻酚类、氨肟类、吖嗪类、儿茶酚类、焦棓酚类、抗坏血酸（或其衍生物）、以及无色色素类）和对于熟知本领域技术的人来说显而易见的其它材料、例如美国专利第6,020,117号所记载的材料。
作为还原剂，还优选抗坏血酸还原剂。有用的抗坏血酸还原剂包括抗坏血酸和类似物、异构体及其衍生物，例如可优选举出D-或L-抗坏血酸及其糖衍生物（例如γ-乳糖抗坏血酸、葡糖型抗坏血酸、岩藻糖抗坏血酸、葡庚糖抗坏血酸、麦芽糖抗坏血酸）、抗坏血酸的钠盐、抗坏血酸的钾盐、异抗坏血酸（或L-赤藓糖抗坏血酸）、其盐（例如碱金属盐、铵盐或本技术领域中已知的盐）、烯二醇型的抗坏血酸、烯胺醇(enaminol)型的抗坏血酸、硫烯醇(thioenol)型的抗坏血酸等，特别优选D、L或D,L-抗坏血酸（及其碱金属盐）或异抗坏血酸（或其碱金属盐），钠盐是优选的盐。根据需要还可使用这些还原剂的混合物。
8.其它辅助剂
作为放大液的其它辅助剂，有时含有缓冲剂、防腐剂、例如抗氧化剂或有机稳定剂、速度调节剂。作为缓冲剂，例如可使用使用了醋酸、柠檬酸、氢氧化钠或它们的任一种盐或者三（羟基甲基）氨基甲烷的缓冲剂、其它一般的化学实验中使用的缓冲剂。适当使用这些缓冲剂，可以将该放大溶液调整至最佳的pH。另外，可以将作为防雾剂的烷基胺作为添加剂使用，特别优选十二烷基胺。另外，为了提高这些添加剂的溶解性，可以使用表面活性剂，特别优选为C9H19-C6H4-O-（CH2CH2O）50H。
作为将放大试剂滴加于色谱试剂盒的方法，优选将作为第1液的还原剂溶液滴加在用于输送还原剂溶液的衬垫上、将作为第2液的银离子溶液从上方滴加在标记物质捕获区域上的方法。
作为将2种放大试剂内置于色谱试剂盒中的方法，可以举出将含有包含放大试剂的溶液的壶配置在滴加各放大试剂的部位的上部的方法。优选将还原剂溶液（第1液）放置在用于输送还原剂溶液的衬垫的上部、将含银离子溶液（第2液）的壶设置在银离子溶液填充孔的正上部。通过如此配置，可以通过按压各个壶使溶液流动，从而滴加在规定的部位上。
通过以下的实施例更为具体地说明本发明，但本发明并非受实施例限定。
【实施例】
(1）流感病毒抗原检测免疫色谱试剂盒的制作
（1-1）抗流感A型单克隆抗体修饰金胶体（用针对待测物质的第一结合物质修饰过的标记物质）的制作
向通过在直径为50nm的金胶体溶液（EM.GC50、BBI公司）9mL中添加50mM KH2PO4缓冲液（pH为7.5）1mL而调节了pH的金胶体溶液中添加160μg/mL的抗流感A型单克隆抗体（Anti-Influenza A SPTN-57307、Medix Biochemica公司）溶液1mL并进行搅拌。静置10分钟后，添加1质量%聚乙二醇（PEG Mw.20000、型号168-11285、和光纯药公司制）水溶液550μL并进行搅拌，接着添加10质量%牛血清白蛋白（BSA FractionV、型号A-7906、SIGMA公司制）水溶液1.1mL并进行搅拌。将该溶液进行8000×g、4℃、30分钟的离心（himacCF16RX、日立公司制）后，残留1mL左右而将上清除去，利用超声波洗涤机将金胶体再分散。之后，分散于20mL的金胶体保存液（20mM Tris-HCl缓冲液(pH为8.2)、0.05质量%PEG（Mw.20000）、150mM NaCl、1质量%BSA）中，再次进行8000×g、4℃、30分钟的离心后，残留1mL左右而将上清除去，利用超声波洗涤机将金胶体再分散，获得抗体修饰金胶体（50nm）溶液。
（1-2）金胶体保持衬垫（标记物质保持区域）的制作
将（1-1）中制作的抗流感A型单克隆抗体修饰金胶体用金胶体涂布液（20mM Tris-HCl缓冲液(pH为8.2)、0.05质量%PEG（Mw.20000）、5质量%蔗糖）及水进行稀释，按照520nm的光学浓度（OD）达到0.1的方式进行稀释。将该溶液按照每1张各为0.8mL均匀地涂布在剪切成8mm×150mm的玻璃纤维衬垫（Glass Fiber Conjugate Pad、Millipore公司）上，减压干燥12小时后，裁剪成5mm，从而获得抗流感A型单克隆抗体修饰金胶体保持衬垫。保持金胶体抗体的部分相当于标记物质保持区域。
（1-3-1）抗体固定化膜-1（结合物质固定化膜-1）的制作
就剪切成60mm×300mm的硝化纤维素膜（有塑料的衬里、HiFlow PlusHF120、Millipore公司）而言，利用以下的方法固定抗体，制作抗体固定化膜。使膜的长边朝下，在距离下面15mm的位置上将制备成1.5mg/mL的抗流感A型单克隆抗体（Anti-Influenza A SPTN-57307、Medix Biochemica公司制）溶液涂布成线状，制成抗体固定化线。然后，在距离下面11mm的位置上将制备成0.2mg/mL的抗小鼠IgG抗体（抗小鼠IgG(H+L)、兔子F(ab′)2、型号566-70621、和光纯药公司制）溶液涂布成线状。涂布后的膜在热风式干燥机中于50℃下干燥30分钟。将封闭液（含0.5质量%酪蛋白（奶来源、型号030-01505、和光纯药公司制）的50mM硼酸缓冲液(pH为8.5)）500mL放在容器（vat）中，在此状态下静置30分钟。之后，移至放在同样容器中的洗涤-稳定化液（含0.5质量%蔗糖和0.05质量%胆酸钠的50mM Tris-HCl（pH为7.5）缓冲液）500mL中进行浸渍，在此状态下静置30分钟。将膜从溶液中取出，在室温下干燥12小时，将裁剪为5mm宽的膜制成了抗体固定化膜-1。固定化有抗流感A型单克隆抗体的部分相当于标记物质捕获区域、固定化有抗小鼠IgG抗体的部分相当于阳性对照区域。另外，本实施例中使用的抗流感A型单克隆抗体所识别的蛋白质是同一单元的三聚物，因而即便所标记的抗体与固定化的抗体相同，也可利用夹心法进行分析。
（1-3-2）抗体固定化膜-2（结合物质固定化膜-2）的制作
就剪切成60mm×300mm的硝化纤维素膜（有塑料的衬里、HiFlow PlusHF120、Millipore公司）而言，利用以下的方法固定抗体及显色试剂，制作抗体固定化膜-2。使膜的长边朝下，在距离下面15mm的位置上将制备成1.5mg/mL的抗流感A型单克隆抗体（Anti-Influenza A SPTN-57307、Medix Biochemica公司制）溶液涂布成线状，制成抗体固定化线。然后，在距离下面11mm的位置上将制备成0.2mg/mL的抗小鼠IgG抗体（抗小鼠IgG(H+L)、兔子F(ab′)2、型号566-70621、和光纯药公司制）溶液涂布成线状。涂布后的膜在热风式干燥机中于50℃下干燥30分钟。将封闭液（含0.5质量%酪蛋白（奶来源、型号030-01505、和光纯药公司制）的50mM硼酸缓冲液(pH为8.5)）500mL放在容器中，在此状态下静置30分钟。之后，移至放在同样容器中的洗涤-稳定化液（含0.5质量%蔗糖和0.05质量%胆酸钠的50mM Tris-HCl（pH为7.5）缓冲液）500mL中进行浸渍，在此状态下静置30分钟。将膜从溶液中取出，在室温下干燥12小时。在距离下面9mm的位置上将调整成20mM的红菲绕啉(同仁化学公司制)涂布成线状，制成显色试剂固定化线。将裁剪为5mm宽的膜制成抗体固定化膜-2。固定化有抗流感A型单克隆抗体的部分相当于标记物质捕获区域、固定化有抗小鼠IgG抗体的部分相当于阳性对照区域。
（1-3-3）抗体固定化膜-3（结合物质固定化膜-3）的制作
就剪切成60mm×300mm的硝化纤维素膜（有塑料的衬里、HiFlow PlusHF120、Millipore公司）而言，利用以下的方法固定抗体及显色试剂，制作抗体固定化膜-3。使膜的长边朝下，在距离下面15mm的位置上将制备成1.5mg/mL的抗流感A型单克隆抗体（Anti-Influenza A SPTN-57307、Medix Biochemica公司制）溶液涂布成线状，制成抗体固定化线。然后，在距离下面11mm的位置上将制备成0.2mg/mL的抗小鼠IgG抗体（抗小鼠IgG(H+L)、兔子F(ab′)2、型号566-70621、和光纯药公司制）溶液涂布成线状。然后，在距离下面9mm的位置上将调整至30mM的溴甲酚绿(和光纯药公司制)涂布成线状，制成显色试剂固定化线。涂布后的膜在热风式干燥机中于50℃下干燥30分钟。将封闭液（含0.5质量%酪蛋白（奶来源、型号030-01505、和光纯药公司制）的50mM硼酸缓冲液(pH为8.5)）500mL放在容器中，在此状态下静置30分钟。之后，移至放在同样容器中的洗涤-稳定化液（含0.5质量%蔗糖和0.05质量%胆酸钠的50mM Tris-HCl（pH为7.5）缓冲液）500mL中进行浸渍，在此状态下静置30分钟。将膜从溶液中取出，在室温下干燥12小时，将裁剪为5mm宽的膜制成抗体固定化膜-3。固定化有抗流感A型单克隆抗体的部分相当于标记物质捕获区域、固定化有抗小鼠IgG抗体的部分相当于阳性对照区域。
（1-4）银放大液的制作
（1-4-1）还原剂溶液（第1放大试剂）的制作
在水290g中溶解将硝酸铁(III)九水合物（和光纯药公司制、095-00995）溶解于水中所制作的1mol/l硝酸铁水溶液23.6ml、柠檬酸（和光纯药公司制、038-06925）13.1g。全部溶解后，一边用搅拌器搅拌一边添加硝酸（10质量%）36ml，并添加硫酸铁（II）铵六水合物（和光纯药公司制、091-00855）60.8g，将其作为还原剂溶液。
（1-4-2）银离子溶液（第2放大试剂）的制作
在水66g中添加硝酸银溶液8ml（含10g的硝酸银）和1mol/l的硝酸铁水溶液24ml。然后，将该溶液与预先在47.6g水中溶解硝酸（10质量%）5.9ml、十二烷基胺（和光纯药公司制、123-00246）0.1g、0.1g的表面活性剂C12H25-C6H4-O-（CH2CH2O）50H而得到的溶液混合，将其作为银离子溶液。
（1-5）含1,10-菲绕啉的吸水衬垫（具有显色试剂的区域）的制作
将吸水衬垫(GB-140，ADVANTEC)裁剪为100mm×150mm，浸渍于1,10-菲绕啉溶液(21mM)中。从1,10-菲绕啉溶液中取出后减压干燥12小时，从而获得含菲绕啉的吸水衬垫。含菲绕啉的区域相当于具有显色试剂的区域。
（1-6-1）分析用试剂盒-1的制作
图1表示分析用试剂盒部件的示意图。构成试剂盒外部的上部及下部的材质为聚丙烯制，通过注塑成形而制成。如图1所示，按照图1所示装填（1-3-1）中制作的抗体固定化膜-1（抗流感A型抗体及抗小鼠IgG抗体固定化膜)、未浸渍于显色试剂的吸水衬垫（GB-140，ADVANTEC制、裁剪为100mm×150mm）、用于输送还原剂溶液的衬垫(Glass Fiber ConjugatePad、Millipore公司制)、以及在中央作为金胶体保持衬垫的（1-2）中制作的抗流感A型单克隆抗体修饰金胶体保持衬垫，制作分析用试剂盒-1（比较例-1）。
（1-6-2）分析用试剂盒-2的制作
在（1-6-1）的分析用试剂盒-1的制作中代替未浸渍于显色试剂的吸水衬垫而装填（1-5）中制作的含1,10-菲绕啉的吸水衬垫，除此之外同样地制作分析用试剂盒-2（实施例-1）。
（1-6-3）分析用试剂盒-3的制作
图2表示分析用试剂盒部件的示意图。构成试剂盒外部的上部及下部的材质为聚丙烯制，通过注塑成形而制成。按照图2所示配置（1-3-2）中制作的抗体固定化膜-2（显色试剂、抗流感A型单克隆抗体及抗小鼠IgG抗体固定化膜)、不含显色试剂的吸水衬垫（GB-140，ADVANTEC制、裁剪为100mm×150mm）、用于输送还原剂溶液的衬垫(Glass Fiber ConjugatePad、Millipore公司制)、以及在中央作为金胶体保持衬垫的（1-2）中制作的抗流感A型单克隆抗体修饰金胶体保持衬垫，由此制作分析用试剂盒-3（实施例-2）。
（1-6-4）分析用试剂盒-4的制作
在（1-6-3）的分析用试剂盒-3的制作中代替（1-3-2）中制作的抗体固定化膜-2而装填（1-3-3）中制作的抗体固定化膜-3(显色试剂、抗流感A型单克隆抗体及抗小鼠IgG抗体固定化膜)，除此之外同样地制作分析用试剂盒-4（实施例-3）。
（2）评价
（2-1）待测试样液的展开
将模拟阳性检体（BD Flu Examan Control A+B-(Becton,Dickinson andCompany制)）用抽提液（含1质量%BIGCHAP的1质量%BSA-PBS)稀释128倍，准备待测试样液。将该待测试样液30μL滴加在（1-6-1）~（1-6-4）中作制的分析用试剂盒-1～4的抗流感A型单克隆抗体修饰金胶体保持衬垫上，将各个待测试样液展开。
（2-2）还原剂溶液的展开
在（2-1）中滴加待测试样液后，立即在分析用试剂盒-1～4的用于输送还原剂溶液的衬垫上滴加（1-4-1）中制作的还原剂溶液200μL，从而将还原剂溶液展开。
（3）银放大
（3-1）无银放大开始信号（比较例1）
利用（2-2）记载的方法滴加还原剂溶液后，在任意的时机从分析用试剂盒-1～4的银离子溶液填充孔添加（1-4-2）中制作的银离子溶液95μL，进行银放大，滴加4分钟后，观察标记物质捕获区域的黑化。由10位不同的实验者分别进行该试验，如果可见经放大的黑色线则为成功，计算成功率。将结果示于表2。
（3-2）有银放大开始信号（实施例1）
对使用了含1,10-菲绕啉的吸水衬垫的分析用试剂盒-2利用（2-2）记载的方法滴加还原剂溶液后，在含有1,10-菲绕啉的吸水衬垫上观察到红色的信号后，立即与（3-1）同样地添加银离子溶液进行放大。由10位不同的实验者分别进行该试验，如果可见经放大的黑色线则为成功，计算成功率。将结果示于表2。
（3-3）有银放大开始信号（实施例2）
对（1-6-3）中制作的固定化有显色试剂红菲绕啉的分析用试剂盒-3，与（2-2）同样地滴加还原剂溶液后，在涂布有显色试剂红菲绕啉的线显示出红色后，立即与（3-1）同样地添加银离子溶液进行放大。由多位不同的实验者分别进行该试验，如果可见经放大的黑色线则为成功，计算成功率。将结果示于表2。
（3-4）有银放大开始信号（实施例3）
对（1-6-4）中制作的固定化有显色试剂溴甲酚绿的分析用试剂盒-4，与（2-2）同样地滴加还原剂溶液后，在涂布有显色试剂溴甲酚绿的线从深绿色变成橙色后，立即与（3-1）同样地添加银离子溶液进行放大。由多位不同的实验者分别进行该试验，如果可见经放大的黑色线则为成功，计算成功率。将结果示于表2。
表2
Figure BDA00002205979800211
由表2的结果可知，由于可在视觉上判断进行放大的时机，从而成功地消除了放大的失败。本发明的效果由此结果可以明了。

Claims (16)

1.一种色谱试剂盒，其相对于含有待测物质的待测试样的展开方向从上游方向至下游方向依次具有下述区域：
（1）具有用针对待测物质的第一结合物质修饰过的标记物质的标记物质保持区域；和
（2）具有针对所述待测物质的第二结合物质或针对所述第一结合物质的结合物质的标记物质捕获区域，
所述色谱试剂盒进一步具有（3）具有显色试剂的区域，所述显色试剂用于对在检测所述标记物质时为了放大标记物质的信号而使用的2种放大试剂中的第1放大试剂进行检测。
2.根据权利要求1所述的色谱试剂盒，其中，所述具有显色试剂的区域位于所述标记物质捕获区域的下游。
3.根据权利要求1或2所述的色谱试剂盒，其中，所述显色试剂是与离子发生反应而显色的化合物。
4.根据权利要求1或2所述的色谱试剂盒，其中，所述显色试剂是与Fe2+离子发生反应而显色的化合物。
5.根据权利要求1或2所述的色谱试剂盒，其中，所述显色试剂是具有菲绕啉骨架的化合物。
6.根据权利要求1或2所述的色谱试剂盒，其中，所述显色试剂是与H+离子发生反应而显色的化合物。
7.根据权利要求1或2所述的色谱试剂盒，其中，所述标记物质是金属胶体。
8.根据权利要求7所述的色谱试剂盒，其中，所述金属胶体是金胶体。
9.根据权利要求1或2所述的色谱试剂盒，其内置有为了放大标记物质的信号而使用的2种放大试剂。
10.根据权利要求9所述的色谱试剂盒，其中，所述第1放大试剂是用于银离子的还原剂，所述第2放大试剂是含银的化合物。
11.根据权利要求9或10所述的色谱试剂盒，其中，所述第1放大试剂是含有2价铁离子的试剂。
12.根据权利要求1或2所述的色谱试剂盒，其至少含有：具有标记物质保持区域的标记物质保持衬垫、具有标记物质捕获区域的结合物质固定化膜以及吸水衬垫，所述显色试剂被担载于结合物质固定化膜。
13.根据权利要求12所述的色谱试剂盒，其中，所述显色试剂是在将含有待测试样的水溶液或含有所述第1放大试剂的水溶液的任一者进行展开时不会在结合物质固定化膜中移动的显色试剂。
14.一种色谱方法，其包含下述工序：
（1）在形成了待测物质和用针对待测物质的第一结合物质修饰过的标记物质的复合体的状态下进行展开、在具有针对所述待测物质的第二结合物质或针对所述第一结合物质的结合物质的标记物质捕获区域上将所述标记物质捕获的工序；
（2）使为了将被所述标记物质捕获区域捕获的标记物质的信号进行放大而使用的2种放大试剂中的第1放大试剂从标记物质捕获区域的上游方向向标记物质捕获区域的下游方向展开的工序；
（3）通过检测具有显色试剂的区域上的物理或化学变化来确认所述标记物质捕获区域被第1放大试剂充满的工序；以及
（4）在确认到所述标记物质捕获区域被第1放大试剂充满后使所述2种放大试剂中的第2放大试剂充满标记物质捕获区域的工序。
15.根据权利要求14所述的色谱方法，其中，第1放大试剂是用于银离子的还原剂，第2放大试剂是含银的化合物。
16.根据权利要求14或15所述的色谱方法，其中，第1放大试剂是含有2价铁离子的试剂。
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