CN111465853B - 液体试样检测试剂盒用膜载体和液体试样检测试剂盒 - Google Patents

液体试样检测试剂盒用膜载体和液体试样检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

提供一种液体试样检测试剂盒用膜载体(3)，其为对液体试样中的被检测物质进行检测的液体试样检测试剂盒用膜载体(3)，所述液体试样检查试剂盒用膜载体(3)具备能够输送液体试样的至少一个流路(2)，在流路(2)的底面设置有产生用于输送液体试样的毛细管作用的微细结构，在流路(2)之中设置有底面的高度水准变化的台阶。膜载体优选具有检测液体试样中的被检测物质的检测区。

Description

液体试样检测试剂盒用膜载体和液体试样检测试剂盒
技术领域
本发明涉及液体试样检测试剂盒用膜载体、液体试样检测试剂盒、液体试样检测试剂盒的制造方法、液体试样的检测方法以及膜载体。
背景技术
近年通过利用抗原抗体反应等来测定对感染症的发病、妊娠、血糖值等的即时检测(POCT、Point of Care Test、临床现场即时检测)试剂受到关注。POCT试剂具有短时间内能够辨别结果、使用方法简便、廉价这种特征。POCT试剂由于这些特征而大多用于症状为轻度的阶段的诊察、定期诊察等，在预想今后增加的居家医疗中，也成为重要的诊察工具。
对于大多的POCT试剂而言，将血液等液体试样导入到检测试剂盒，对其中含有的特定的被检测物质进行检测，由此进行判定。作为由液体试样检测特定的被检测物质的方法，经常使用免疫色谱法。免疫色谱法指的是被滴加到检测试剂盒的膜载体上的液体在膜载体上移动的过程中，被检测物质与标记物结合，进而它们与被固定化于检测试剂盒中的物质(以下称为检测物质)特异性结合，检测其结果所产生的颜色、质量的变化等这种方法。检测物质也可以换言称为试剂(reagent)。
作为对被检测物质进行检测的方法，已知对于通过使用着色胶乳颗粒、荧光胶乳颗粒、金属胶体颗粒等作为标记物而产生的颜色变化，借由吸光度测定器等光学测定机器进行检测的方法。
作为光学上判定上述颜色变化的POCT试剂，经常利用使用了硝基纤维素膜的侧向流动型的试剂盒(专利文献1)。硝基纤维素膜具有很多直径数μm程度的微细的孔，液体试样在该孔之中通过毛细管力而移动。
但是，硝基纤维素膜源自天然物，孔径、孔彼此的连接方式并非同样，因此对于各膜，液体样品流动的流速产生差异。作为控制流速的方法，示出有专利文献2，但是专利文献2中，流路为多孔体。本发明中，流路为具有凸部的微细结构、与专利文献2不同。专利文献2由于使用硝基纤维素膜，因此存在孔径、孔彼此的连接方式并非同样的这种问题。若流速产生差异则为了对被检测物质进行检测而花费的时间也变化，其结果，有可能在被检测物质产生结合之前错误判断为未检测出。
为了解决上述问题，设想人工制作微细流路这种方法(专利文献3～7)。若利用该方法则可以制作具有均匀结构的膜载体，因此可以降低在被检测物质产生结合之前错误判断为未检测出的可能性。
上述专利文献中，系统内的流路结构均匀，因此检测性能受限。专利文献8中，作为改善使用人工的微细流路时的检测性能的方法，示出了将以流速控制作为目标的槽型流路、和以灵敏度改善作为目标的柱型流路组合的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2014-062820号公报
专利文献2：国际公开第2016/051974号
专利文献3：日本专利第4597664号
专利文献4：日本特表2012-524894号公报
专利文献5：日本专利第5609648号
专利文献6：日本特开2016-011943号公报
专利文献7：日本特开2013-113633号公报
专利文献8：日本专利第5821430号
专利文献9：国际公开第2016/098740号
发明内容
发明要解决的问题
但是，对于上述专利文献1～8中记载的方法而言，仅注重检测物质，没有注重被检测物质、标记物的流动。在使用了人工的微细流路的系统中，流动容易形成单纯的层流，其结果，被检测物质和标记物的搅拌难以充分进行，因此成为检测性能降低的主要原因。特别是利用侧向流动型的免疫色谱法时，检测系统简单，流路结构的影响容易反映到检测结果。
专利文献9记载了一种液体试样检测试剂盒用膜载体，其为对液体试样中的被检测物质进行检测的检测试剂盒用的膜载体，设置有能够输送前述液体试样的至少一个流路，在前述流路的底面设置有产生用于输送前述液体试样的毛细管作用的微细结构。但是，专利文献9对于台阶没有记载。
本发明鉴于上述问题，其目的在于，提供例如在利用光学的方法能够确认被检测物质被检测出的免疫色谱法中、能够实现高灵敏度的判定的检测试剂盒。
用于解决问题的方案
即，本发明如以下所述。
(1)一种液体试样检测试剂盒用膜载体，其为对液体试样中的被检测物质进行检测的液体试样检测试剂盒用膜载体，
所述液体试样检测试剂盒用膜载体具备能够输送前述液体试样的一体成型而成的至少一个流路，
在前述流路的底面设置有产生用于输送前述液体试样的毛细管作用的微细结构，
在前述流路之中设置有前述底面的高度水准变化的至少一个台阶，
其中，前述台阶被设置成在前述液体试样的输送方向上，下游侧的前述底面的高度水准高于上游侧。
(2)根据(1)所述的液体试样检测试剂盒用膜载体，其中，前述微细结构具有圆锥、多棱锥、圆锥台、多棱锥台、圆柱、多棱柱、半球、半椭圆体中的任意一种。
(3)根据(1)或(2)所述的液体试样检测试剂盒用膜载体，其中，前述台阶中的前述底面的高度水准的变化量为前述台阶的上游侧的前述微细结构的高度的2倍以下。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的液体试样检测试剂盒用膜载体，其中，在前述流路中，在前述台阶的下游侧设置有倾斜，使得前述底面的高度水准接近于前述台阶的上游侧的高度水准。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的液体试样检测试剂盒用膜载体，其中，以前述台阶为边界，前述微细结构在其上游侧和下游侧变化。
(6)根据(1)～(5)中任一项所述的液体试样检测试剂盒用膜载体，其中，以前述台阶为边界，其下游侧的前述微细结构的高度小于上游侧的高度。
(7)根据(1)～(6)中任一项所述的液体试样检测试剂盒用膜载体，其中，前述微细结构的高度在前述流路内为10μm以上且500μm以下。
(8)一种液体试样检测试剂盒，其为对液体试样中的被检测物质进行检测的液体试样检测试剂盒，
具备(1)～(7)中任一项所述的液体试样检测试剂盒用膜载体，
前述膜载体具有检测前述液体试样中的前述被检测物质的检测区，
前述检测区中，在检测出前述被检测物质时产生颜色变化。
(9)根据(8)所述的液体试样检测试剂盒，其中，前述检测区设置于前述流路内的倾斜部。
(10)根据(8)或(9)所述的液体试样检测试剂盒，其中，具有与前述液体试样中的前述被检测物质特异性反应的抗体或其抗原结合性片段的标记物以能够与前述被检测物质反应的方式设置于前述液体试样检测试剂盒的至少一部分，
前述颜色变化是由于与前述被检测物质结合了的前述标记物而产生的。
(11)根据(10)所述的液体试样检测试剂盒，其中，前述标记物为在着色胶乳颗粒或荧光胶乳颗粒结合了前述抗体或前述抗原结合性片段的颗粒。
(12)根据(10)或(11)所述的液体试样检测试剂盒，其中，在前述检测区固定有用于检测前述被检测物质的检测物质，前述颜色变化是由于前述标记物利用前述检测物质被保持于前述检测区并显色而产生的。
(13)一种液体试样检测试剂盒的制造方法，其为(8)～(12)中任一项所述的液体试样检测试剂盒的制造方法，
其具备在前述检测区固定检测物质的工序，所述检测物质通过将前述被检测物质保持于前述检测区而产生前述颜色变化。
(14)一种液体试样的检测方法，其为使用(8)～(12)中任一项所述的液体试样检测试剂盒的液体试样的检测方法，其具备如下工序：
将前述液体试样、和与前述液体试样中的被检测物质特异性结合的标记物混合而制造混合液体试样，使前述被检测物质和前述标记物互相结合的工序；
将前述混合液体试样滴加到设置于前述膜载体的滴加区的工序；
通过前述微细结构，将前述混合液体试样从前述滴加区向前述检测区输送的工序；和
检测前述检测区中的颜色变化的工序。
(15)一种膜载体，其为对液体试样中的被检测物质进行检测的膜载体，
所述膜载体具备至少一个流路，
在前述流路的底面设置有微细结构，
在前述流路之中设置有至少一个台阶，
其中，前述台阶被设置成在前述液体试样的输送方向上，下游侧的底面的高度水准高于上游侧。
发明的效果
根据本发明，能够提供在能够利用光学的方法确认被检测物质被检测出的免疫色谱法中、能够实现高灵敏度的判定的检测试剂盒。
附图说明
通过以下所述的优选实施方式和其附带的以下附图而进一步阐明上述目的和其它目的、特征和优点。
图1为本发明的实施方式的一例、为检测试剂盒的示意性的顶视图。
图2为本发明的实施方式的一例、为膜载体的示意性的顶视图。
图3的(a)为本发明的实施方式的一例、为微细结构的俯视图(顶视图)、(b)为构成(a)所示的微细结构的凸部的立体图。
图4的(a)为本发明的实施方式的一例、为微细结构的俯视图(顶视图)、(b)为构成(a)所示的微细结构的凸部的立体图。
图5的(a)为本发明的实施方式的一例、为微细结构的俯视图(顶视图)、(b)为构成(a)所示的微细结构的凸部的立体图。
图6的(a)为本发明的实施方式的一例、为微细结构的俯视图(顶视图)、(b)为构成(a)所示的微细结构的凸部的立体图。
图7为本发明的实施方式的一例、为具有微细结构的膜载体的剖视图。
图8为本发明的实施方式的一例、为设置于流路中的台阶的剖视图。
图9为本发明的实施方式的一例、为设置于流路中的台阶的剖视图。
图10为本发明的实施方式的一例、为膜载体的示意性的顶视图。
图11为本发明的实施方式的一例、为用于形成微细结构的模具的示意图。
图12为本发明的实施方式的一例、为用于形成微细结构的模具的示意图(顶视图、剖视图)。
具体实施方式
以下使用附图对于本发明的实施方式进行说明。需要说明的是，全部附图中，对于相同的构成要素附加共通的符号、适当省略说明。另外，附图为示意图、与实际的尺寸比率不一致。
本实施方式的液体试样检测试剂盒用膜载体例如指的是对液体试样中的被检测物质进行检测的液体试样检测试剂盒用的膜载体。
在此，对于被检测物质没有任何限定，可以为各种病原体、各种临床标记物等能够与抗体进行抗原抗体反应的任何物质。作为被检测物质的具体例，可例示出流感病毒、诺如病毒、腺病毒、RS病毒、HAV、HBs、HIV等的病毒抗原、MRSA、A组溶血性链锁球菌、B组溶血性链锁球菌、军团菌属菌等的细菌抗原、细菌等所产生的毒素、支原体属、沙眼衣原体、人绒毛膜促性腺激素等激素、C反应蛋白、肌红蛋白、心肌肌钙蛋白、各种肿瘤标记物、农药和环境激素等，但是不限于它们。被检测物质特别是为流感病毒、诺如病毒、C反应蛋白、肌红蛋白和心肌肌钙蛋白等需要紧急检测出和治疗措施的物质的情况下，本实施方式的液体试样检测试剂盒和膜载体的有用性特别大。被检测物质可以为能单独诱发免疫响应的抗原，也可以为虽然不能单独诱发免疫响应、但是通过抗原抗体反应与抗体结合的情况下能诱发免疫响应的半抗原。被检测物质通常处于在液体试样中悬浮或溶解的状态。液体试样例如也可以为将上述被检测物质悬浮或溶解于缓冲液而成的试样。
本实施方式的液体试样检测试剂盒(以下有时也称为检测试剂盒)对液体试样中的被检测物质进行检测。图1为检测试剂盒的示意性的顶视图。例如如图1所示，检测试剂盒18具备膜载体3和容纳膜载体3的壳体18a。膜载体3在其表面具有滴加液体试样的滴加区3x、和用于检测液体试样中的被检测物质的检测区3y。滴加区3x在壳体18a的第一开口部18b露出。检测区3y在壳体18a的第二开口部18c露出。
图2为膜载体3的示意性的顶视图。如图2所示，膜载体3具备输送液体试样的至少一个流路2。流路2优选通过一体成型来具备。在流路2的底面设置有微细结构(没有图示、详细说明如后文所述)。微细结构至少位于滴加区3x和检测区3y之间。也可以在膜载体3的全部表面设置微细结构。也可以膜载体3的全部表面为液体试样的流路2。微细结构产生毛细管作用。通过微细结构的毛细管作用，将液体试样借由微细结构、从滴加区3x向检测区3y(沿着输送方向d)输送。若液体试样中的被检测物质在检测区3y被检测出则检测区3y的颜色变化。
对于膜载体3的整体形状没有特别限定，例如可以为四边形等多边形、圆形、或椭圆形。膜载体3为四边形的情况下，膜载体3的纵宽(宽度方向的长度)L1例如可以为2mm以上且100mm以下、膜载体3的横宽(长度方向的长度)L2例如可以为2mm以上且100mm以下。微细结构的高度除外的膜载体的厚度例如可以为0.1mm以上且10mm以下。
微细结构优选由圆锥、多棱锥、圆锥台、多棱锥台、圆柱、多棱柱、半球、半椭圆体中的任意一种形成。图3～6分别表示本实施方式中的设置于流路的底面的微细结构和构成其的凸部的一例。图3～6中、(a)为各微细结构的俯视图(顶视图)、(b)为构成各(a)所示的微细结构的凸部的立体图。如图3～6所示，微细结构7为凸部8的总体(集合体)。也就是说，微细结构7具备相当于液体试样的流路2的底面的平坦部9、和从平坦部9突出的多个凸部8。通过毛细管作用，多个凸部8之间的空间作为沿着膜载体3的表面输送液体试样的流路2发挥功能。也就是说，通过毛细管作用，微细结构7中的空隙作为沿着膜载体3的表面输送液体试样的流路2发挥功能。多个凸部8规则性地或平移对称性地排列于膜载体3的表面上。
例如如图3所示，凸部8a的形状可以为圆锥。例如如图4所示，凸部8b的形状可以为四棱锥。例如如图5所示，凸部8c的形状可以为六棱锥。例如如图6所示，凸部8d的形状可以为横置的三棱柱(以三棱柱中的一侧面(四边形的面)与平坦部9接触的方式设置的三棱柱)。从俯视(从上面观察)微细结构7时可见膜载体3的全部表面、容易利用光学的方法确认被检测物质被检测出时的颜色变化的观点考虑，它们之中，圆锥、多棱锥等锥体结构作为凸部8的形状是合适的。锥体结构之中，圆锥作为凸部8的形状是合适的。
构成微细结构7的凸部8的形状无需为几何学上正确的形状，也可以为角部圆形的形状、表面存在微细的凹凸的形状等。
在膜载体3设置有流路2的底面的高度水准变化的台阶11。图8为从分别与膜载体厚度方向和液体试样的输送方向垂直的方向观察台阶得到的图。如图9所示，台阶的下游侧的区域B可以设置倾斜，使得底面的高度水准接近于台阶的上游侧的区域A。
从在液体试样内进一步促进关于高度方向的搅拌的观点考虑，上述台阶11优选流路2的底面的高度水准不连续性地变化。
需要说明的是，上述台阶11为流路2的底面的高度水准变化的结构，凸结构(例如突出)、凹结构(例如槽)除外。
对于上述台阶11而言，与上游侧相比在下游侧，底面的高度水准升高。此时，通过液体试样的表面张力，液体试样超过台阶11展开，此时液体试样内关于高度方向的搅拌得到促进，被检测物质和标记物的反应率改善，因此检测试剂盒的性能改善。
上述台阶11的底面水准的高度的变化量优选为与台阶11相比上游侧的微细结构8A的高度的2倍以下。此时，台阶11中的利用毛细管力实现的液体试样的行进得到更进一步顺利地进行。在此，微细结构8A的高度例如为凸部8的高度。
另外，上述台阶11的底面水准的高度的变化量、即台阶11的高度例如为5μm以上且1000μm以下、优选10μm以上且500μm以下。
上述台阶11的下游侧的区域B中，可以以区域B的下游侧的高度水准(例如特定的一边20A的对边20B)接近于其上游侧的高度水准(例如特定的一边20A)的方式设置倾斜。倾斜优选向着下游侧设置。此时，流路内的液体试样由于重力的影响而容易展开，可以缩短反应时间、达成抑制由于液体试样展开后的残留标记物所导致的本底的着色。
上述凸部8的形状可以以上述台阶11为边界而变化。台阶11中，产生展开中的液体试样的液面高度的变化，而通过上述凸部8的形状变化，可以促进微细结构和液体试样的接触，可以改善灵敏度。在此所称的液面高度指的是从各区域的流路底面直至展开中的液体试样的液面为止的高度。在此所称的上述凸部8的形状也包括凸部8的尺寸。
具体而言，刚超过台阶11之后的液面高度与台阶的上游侧相比降低。因此，液体试样的流量也减小，而通过以台阶11为边界，微细结构整体和液体试样接触，可以促进微细结构和液体试样中的被检测物质的接触，可以改善灵敏度。以台阶11为边界、减小台阶11的下游侧的微细结构的高度的情况下，可以进一步促进微细结构和液体试样中的被检测物质的接触，可以进一步改善灵敏度。在此所称的流量指的是每单位时间在与液体试样的展开方向垂直方向的流路截面通过的液体试样的体积。
构成上述微细结构7的凸部8的高度6优选为10μm以上且500μm以下。凸部8的高度6可以在多个凸部8之间在该范围内变化(也可以互相不同)。凸部8的高度6为10μm以上的情况下，流路2的体积增大，液体试样能够以更短的时间展开。凸部8的高度6为500μm以下的情况下，可以降低制作微细结构7的时间和成本，微细结构7的制作变得更容易。
凸部8的高度6被定义为与平坦部9正交的方向中的凸部8的最大长度。如图3及图7所示，凸部8a的形状为圆锥的情况下，凸部8a的高度6a为与平坦部9正交的方向中的凸部8a的最大长度(圆锥的高度)。如图4所示，凸部8b的形状为四棱锥的情况下，凸部8b的高度6b为与平坦部9正交的方向中的凸部8b的最大长度(四棱锥的高度)。如图5所示，凸部8c的形状为六棱锥的情况下，凸部8c的高度6c为与平坦部9正交的方向中的凸部8c的最大长度(六棱锥的高度)。如图6所示，凸部8d的形状为横置的三棱柱的情况下，凸部8d的高度6d为与平坦部9正交的方向中的凸部8d的最大长度(横置的三棱柱的高度)。
凸部8的底面10的直径4定义为凸部8的底面10中的代表长度。底面10中的代表长度是指，在底面10的形状为圆的情况下为直径、在为三角形或四边形的情况下为最短的一边的长度、在为五边形以上的多边形的情况下为最长的对角线的长度、在为除此之外的形状的情况下为底面10中的最大长度。
图7为具有图3所示的微细结构7a的膜载体3的沿着VII-VII线的定向剖视图。如图3及图7所示，凸部8a的形状为圆锥的情况下，凸部8a的底面10a的直径4a为圆锥的底面(圆)的直径。如图4所示，凸部8b的形状为正四棱锥的情况下，凸部8b的底面10b的直径4b为底面(正方形)10b的边的长度。如图5所示，凸部8c的形状为正六棱锥的情况下，凸部8c的底面10c的直径4c为通过底面(正六角形)10c的中心的对角线的长度(最长的对角线的长度)。如图6所示，凸部8d的形状为横置的三棱柱的情况下，凸部8d的底面10d的直径4d为底面(长方形)10d的最短的一边的长度(图6中，为与液体试样的输送方向d正交的方向的长度)。
构成上述微细结构7的凸部8的底面积(凸部8的底面10每一个的面积)优选为75μm2以上且250000μm2以下。凸部8的底面积可以在多个凸部8之间在该范围内变化(可以互相不同)。凸部8的底面积为75μm2以上的情况下，容易进行微细加工，微细结构的制作的成本进一步降低。凸部8的底面积为250000μm2以下的情况下，一个检测试剂盒内，构成微细结构7的凸部8个数增多，液体试样的展开变得更容易。
构成上述微细结构7的凸部8彼此的最接近距离5优选为500μm以下、更优选2μm以上且100μm以下。凸部8彼此的最接近距离5可以在多个凸部8之间在该范围内变化(可以互相不同)。凸部8彼此的最接近距离5不可能小于0μm，为500μm以下的情况下，液体试样和流路2的接触面积增大，由此，毛细管力增大，因此使液体试样移动变得更容易。在此，“凸部8彼此的最接近距离”指的是在同一区域内邻接的一对凸部8的最接近距离。
构成上述微细结构7的凸部8的高长比优选为0.1以上且2.0以下。在此所称的高长比指的是将凸部8的高度6(Lh)除以凸部8的底面10的代表长度(直径4)(Lv)而得到的值(Lh/Lv)。高长比为0.1以上的情况下，液体试样和流路2的接触面积增大，由此毛细管力增大，因此使液体试样移动变得更容易。高长比为2.0以下的情况下，微细结构的制作变得更容易。
微细结构7可以在同一区域内、由互相相同的凸部8构成。微细结构7也可以在同一区域内、由互相不同的凸部8构成。此时互相不同的凸部8可以在同一区域内、沿着液体试样的输送方向d按照固定的规则排列。也就是说，凸部8可以在同一的区域内、例如以凸部8的底面10的直径4、凸部8的高度6、凸部8彼此的最接近距离5和凸部8的高长比(高度6/直径4)中的至少一者沿着液体试样的输送方向d按照固定的规则变化(增大或减少)的方式排列。
图10为其它一实施方式中的膜载体的顶视图。对于图2所示的膜载体3而言，在区域B设置有检测区3y，而对于图10所示的膜载体13而言，在区域B1设置有检测区13y。如图10所示，滴加区13x和检测区13y可以在膜载体13的宽度方向的大致整体形成。
本实施方式的液体试样检测试剂盒18的微细结构7和膜载体3可以由热塑性塑料形成。也就是说，通过加工由热塑性塑料形成的膜状的基材，可以制作具有微细结构7的膜载体3。作为加工方法，可列举出例如热压印、UV压印、注射成型、蚀刻、光刻、机械切削、激光加工等。其中，作为廉价地实施精密的加工的方法，对于热塑性塑料的热压印是合适的。作为热塑性塑料，可列举出聚酯系树脂、聚烯烃系树脂、聚苯乙烯系树脂、聚碳酸酯系树脂、氟系树脂和丙烯酸类树脂等，具体而言，可以使用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、环烯烃聚合物(COP)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等各种热塑性塑料。
在压印、注射成型等使用模具的加工方法的情况下，由于锥体的上部与底面相比变细，因此与制作相同底面的柱体相比，在模具制作时削出的体积少也没有问题，可以廉价地制作模具。此时，能够更廉价地进行液体试样中的被检测物质的检测。
如以上说明那样，膜载体3为对液体试样中的被检测物质进行检测的液体试样检测试剂盒18用的膜载体3，具备：设置于膜载体3的一面上的、产生用于输送液体试样的毛细管作用的微细结构7；和，通过微细结构7形成的、输送液体试样的流路2，在膜载体3上具有流路2的底面的高度水准变化的台阶11。
对于本实施方式的液体试样检测试剂盒18而言，在膜载体3所具有的检测区3y中，在被检测物质被检测时产生颜色变化。颜色变化可以为能够利用光学的方法确认的颜色变化。
作为上述光学的方法，主要可列举出利用目视进行判定和测定荧光强度的方法这两种。利用目视进行判定的情况下，优选产生以CIE1976L*a*b*颜色空间的表色系测定检测前和检测后的颜色时的、2种颜色刺激之间的色差(JIS Z8781-4：2013中记载的ΔE)为0.5以上的颜色变化。若该色差为0.5以上则容易用目视确认颜色的不同。测定荧光强度来判定的情况下，优选产生检测区3y中的荧光强度(Fl1)、与跟检测区3y邻接的上游区域和下游区域中的荧光强度(Fl2)之比(Fl1/Fl2)＝10/1以上的颜色变化。若该比为10/1以上则容易分离信号和噪音。
为了在本实施方式的液体试样检测试剂盒18中制作检测区3y，在一实施方式中，在流路2的至少一部分固定化有检测物质。也就是说，在检测区3y，固定化有用于检测被检测物质的检测物质。检测区3y中的颜色变化是由于被检测物质利用检测物质(与检测物质反应)被保持于检测区3y来产生的。
也就是说，液体试样检测试剂盒18的制造方法具备在检测区3y固定检测物质的工序。作为检测物质，优选为通过将被检测物质保持于检测区3y而产生颜色变化的检测物质。从可以更有效地在检测区3y固定化检测物质(试剂)的观点考虑，可以对于膜载体3中的设置检测区3y的部位预先实施表面处理。
作为上述表面处理的方法，没有任何限定，例如可以使用UV照射、UV/臭氧处理、各种等离子体处理、利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyltriethoxysilane)、戊二醛(Glutaraldehyde)的表面修饰等各种方法。
本实施方式中，作为上述检测物质(试剂)，可列举出例如抗体。抗体为与被检测物质进行抗原抗体反应的抗体，可以为多克隆抗体或单克隆抗体。
检测区3y中的颜色变化也可以通过具有与液体试样中的被检测物质特异性反应的抗体或其抗原结合性片段的标记物产生。颜色变化例如是由于标记物利用检测物质(与检测物质反应(结合))被保持于检测区3y并显色而产生的。
标记物例如可以为在胶体颗粒、胶乳颗粒等颗粒上结合上述抗体或其抗原结合性片段而成。抗原结合性片段指的是，可以与被检测物质特异性结合的片段，例如指的是抗体的抗原结合性片段。标记物可以借由抗体或其抗原结合性片段与被检测物质结合。颗粒可以具有磁性或荧光发光性。作为胶体颗粒，可列举出胶体金颗粒、胶体铂颗粒的金属胶体颗粒等。颗粒从粒径控制、分散稳定性和结合容易性的观点考虑优选为胶乳颗粒。作为胶乳颗粒的材料，没有特别限定，但是优选为聚苯乙烯。
颗粒从可见性的观点考虑，优选为着色颗粒或荧光颗粒、更优选着色颗粒。着色颗粒若能够用目视检测出颜色即可。荧光颗粒含有荧光物质即可。颗粒可以为着色胶乳颗粒或荧光胶乳颗粒。颗粒为着色胶乳颗粒的情况下，上述颜色变化通过目视合适地判定。颗粒为荧光胶乳颗粒的情况下，上述颜色变化通过荧光强度的测定来合适地判定。
上述标记物以能够与所滴加的液体试样中的被检测物质反应的方式设置于检测试剂盒18的至少一部分。标记物例如可以设置于检测试剂盒18中的构件、也可以设置于膜载体3的流路2的至少一部分(与检测区3y相比上游侧)。而且，与被检测物质反应(结合)的标记物利用检测物质(通过检测物质与被检测物质反应(结合))被保持于检测区3y。由此产生检测区3y中的颜色变化(利用标记物进行的显色)。
检测区3y可以设置于与台阶11相比下游侧的倾斜部。在倾斜部，流路内的液体试样通过重力的影响而容易展开，特别显著地抑制由于液体试样展开后的残留标记物所导致的本底的着色。因此特别容易识别检测区3y中的颜色变化，被检测物质的检测灵敏度改善。
本实施方式的一方案的液体试样的检测方法为使用检测试剂盒18的检测方法。
使用检测试剂盒18的液体试样的检测方法可以具备将液体试样、和与液体试样中的被检测物质特异性结合的标记物混合而制造混合液体试样(混合过的液体试样)、使被检测物质和标记物互相结合的工序；将混合液体试样滴加到设置于膜载体3的滴加区3x的工序；通过微细结构7将混合液体试样从滴加区3x向检测区3y输送的工序；和检测检测区3y中的颜色变化(标记物的显色)的工序。
例如上述检测方法可以具备：将液体试样滴加到膜载体3的表面中的滴加区3x的工序；通过形成于膜载体3的表面的微细结构7(多个凸部8)所发挥的毛细管作用、借由微细结构7、将液体试样从滴加区3x向检测区3y输送的工序；和在输送过程中、使液体试样中的被检测物质借由上述抗体或其抗原结合性片段而与标记物结合、进而使被检测物质与被固定于检测区3y的试剂结合、检测检测区3y中的颜色变化(光学上判定颜色变化的有无)的工序。
上述检测方法的使被检测物质和标记物互相结合的工序中，对于将液体试样和标记物混合的方法没有特别限制。例如可以为在装入有标记物的容器添加液体试样的方法、例如也可以将含有标记物的液体和液体试样混合。例如也可以在装入有液体试样的容器的滴加口处夹着过滤器并在该过滤器中固定化标记物。
实施例
以下对于本实施方式进行具体说明，但是本实施方式不被这些实验例所限定。
[实验例1]
＜模具的准备＞
模具通过激光加工和机械切削来制作。图11表示用于制成微细结构的模具20。图11所示的模具20具有多个区域(第一区域A、第二区域B)、在其表面形成对应于图8所示的微细结构(凸部)的凹部(没有图示)。模具20为铝合金A5052制。对于该模具(mold)的中心部在30mm×30mm的范围内实施微细加工。在模具20的加工范围中、从特定的一边(20A)起在加工范围内侧5mm的位置处，与特定的一边(20A)平行地设置深度(高度)100μm的台阶11。在台阶与特定的一边(20A)之间的区域(区域A)、和区域A以外的区域(区域B)，将微细结构彼此的最接近距离(最接近微细结构之间的距离)5设为5μm来以图3、图8的三角排列形式分别排列直径100μm、深度(表中有时称为高度)100μm的圆锥型的凹部(转印微细结构时可以形成凸部的凹部)。
对于上述模具的凹凸面，为了容易且可靠地进行转印时的模具和热塑性塑料的剥离，实施脱模处理。通过在Daikin Industries,Ltd.制的OPTOOL HD-2100TH中浸渍约1分钟并使其干燥后、静置一晩来进行脱模处理。
＜微细结构的转印＞
使用如上所述得到的模具，对于热塑性塑料转印微细结构。作为热塑性塑料，使用聚苯乙烯(Denka Company Limited制Denka苯乙烯片材、膜厚300μm)。作为加工方法，使用热压印，装置使用SCIVAX公司制X-300。成形温度为120℃、施加压力为5.5MPa，进行10分钟转印。转印后在施加压力的状态下将热塑性塑料和模具冷却至80℃，然后去除压力，由此制作从一端侧起依次具有区域A和区域B的膜载体。
[实验例2]
实验例1中的台阶的深度设为10μm、区域A和区域B的微细结构设为直径10μm、深度10μm的圆锥型的凹部，除此之外在与实验例1相同的条件下制作膜载体。
[实验例3]
实验例1中的台阶的深度设为500μm、区域A和区域B的微细结构设为直径500μm、深度500μm的圆锥型的凹部，除此之外在与实验例1相同的条件下制作膜载体。
[实验例4]
实验例1中的台阶的深度设为50μm，除此之外在与实验例1相同的条件下制作膜载体。
[实验例5]
实验例1中的台阶的深度设为200μm，除此之外在与实验例1相同的条件下制作膜载体。
[实验例6]
实验例1中的区域B的微细结构设为直径10μm、深度10μm的圆锥型的凹部，除此之外在与实验例1相同的条件下制作膜载体。
[实验例7]
实验例1中的台阶的深度设为500μm、区域A的微细结构设为直径500μm、深度500μm的圆锥型的凹部，除此之外在与实验例1相同的条件下制作膜载体。
[实验例8]
实验例1中的台阶的深度设为500μm、区域A的微细结构设为直径500μm、深度500μm的圆锥型的凹部，区域B的微细结构设为直径10μm、深度10μm的圆锥型的凹部，除此之外在与实验例1相同的条件下制作膜载体。
[实验例9]
图12表示用于制成实验例9的微细结构的模具20。只要没有特别说明则与实验例1的模具20相同。图12没有图示对应于微细结构(凸部)的凹部。区域B中，从台阶11起在与特定的一边20A相反方向，在5mm宽度量的区域(区域B1)形成倾斜，使区域B中的区域B1以外的区域(区域B2)的模具面的高度水准与区域A的模具面的高度水准一致，除此之外在与实验例1相同的条件下制作膜载体。但是，特定的一边20A的高度水准、特定的一边20A的对边20B的高度水准、区域B1和区域B2的边界线20C的高度水准相同。
[实验例10]
实验例9中的台阶的深度设为50μm，除此之外在与实验例9相同的条件下制作膜载体。
[实验例11]
实验例9中的台阶的深度设为200μm，除此之外在与实验例9相同的条件下制作膜载体。
[实验例12]
实验例9中的区域B1和区域B2的微细结构设为直径10μm、深度10μm的圆锥型的凹部，除此之外在与实验例9相同的条件下制作膜载体。
[实验例13]
实验例9中的台阶的深度设为500μm、区域A的微细结构设为直径500μm、深度500μm的圆锥型的凹部，除此之外在与实验例9相同的条件下制作膜载体。
[实验例14]
实验例9中的台阶的深度设为500μm、区域A的微细结构设为直径500μm、深度500μm的圆锥型的凹部，区域B1和区域B2的微细结构设为直径10μm、深度10μm的圆锥型的凹部，除此之外在与实验例9相同的条件下制作膜载体。
[实验例15]
实验例9中的区域B1的微细结构设为直径10μm、深度10μm的圆锥型的凹部，除此之外在与实验例9相同的条件下制作膜载体。
[实验例16]
实验例9中的台阶的深度设为500μm、区域A和区域B2的微细结构设为直径500μm、深度500μm的圆锥型的凹部，除此之外在与实验例9相同的条件下制作膜载体。
[实验例17]
实验例9中的台阶的深度设为500μm、区域A和区域B2的微细结构设为直径500μm、深度500μm的圆锥型的凹部，区域B1的微细结构设为直径10μm、深度10μm的圆锥型的凹部，除此之外在与实验例9相同的条件下制作膜载体。
[实验例18]
在模具的微细加工范围内没有设置台阶，在30mm×30mm的全部范围设置直径100μm、深度100μm的圆锥型的凹部，除此之外在与实验例1相同的条件下制作膜载体。
[实验例19]
与台阶的上游侧相比，在下游侧，底面的高度水准降低100μm，除此之外在与实验例1相同的条件下制作膜载体。
[实验例20]
台阶的深度设为300μm，除此之外在与实验例9相同的条件下制作膜载体。
＜检测区的制作＞
对于如上所述制作的膜载体的区域B中、从台阶11起在与特定的一边(20A)相反方向5mm宽度量的区域(为具有倾斜的结构、区域B1)实施UV处理。在该部分分别以线宽1mm涂布抗甲型流感NP抗体悬浮液、以及抗乙型流感NP抗体悬浮液(涂布量各3μL)，暖风下充分地干燥，将检测物质固定化。
＜标记物的组件＞
使用纯化抗甲型流感病毒NP抗体(与上述不同的抗体)和纯化抗乙型流感病毒NP抗体(与上述不同的抗体)。在抗甲型流感病毒NP抗体通过共价键合标记粒径0.394μm的蓝色胶乳颗粒(CM/BL CERADYNE制)，以胶乳颗粒的浓度为0.025w/v％的方式悬浮于含有糖、表面活性剂和蛋白质的Tris缓冲液，进行超声波处理，制造充分分散悬浮的抗甲型标记物。同样地制造在抗乙型流感病毒NP抗体标记蓝色胶乳颗粒而成的抗乙型标记物。
将抗甲型标记物和抗乙型标记物混合。对于通过混合而得到的混合物，在尺寸为3cm×1cm的玻璃纤维(33GLASS NO.10539766Schleicher&Schuell制)涂布每1平方厘米50μL的量，暖风下充分地干燥，制作标记物垫。然后仅在如实验例1～20那样制作的膜载体的区域A的端部2mm重叠标记物垫，用切刀裁断为宽度5mm的长条，制作一体化了的液体样品检测试剂盒。
＜检测评价＞
在如上所述制作的液体试样检测试剂盒的端部的标记物垫上(滴加区)滴加液体试样100μL。液体样品采用使用DENKA SEIKEN CO.,LTD.制Quick Navi-Flu所附带的检样悬浮液作为稀释溶液，将甲型流感病毒A/Beijing/32/92(H3N2)(以下也有时称为甲型)稀释到4×104倍而成的样品、和将乙型流感病毒B/Shangdong/7/97(以下也有时称为乙型)稀释到4×103倍而成的样品这2种。
[表1]
[表2]
对于检测的判定，通过在15分钟后目视检测区(甲型流感病毒检测部以及乙型流感病毒检测部)的着色线的有无进行观察来进行。
判定的结果，使用将A/Beijing/32/92(H3N2)稀释到4×104倍而成的样品的情况下，仅甲型检测区可以确认颜色变化，使用将B/Shangdong/7/97稀释到4×103倍而成的样品的情况下，仅在乙型检测区可以确认颜色的变化。
由如实验例1～20那样制作的膜载体如上所述制作液体试样检测试剂盒。接着，求出将甲型流感病毒A/Beijing/32/92(H3N2)的稀释倍率由4×104增大时、在试验开始后15分钟后不能目视着色线的有无的稀释倍率(能够目视判定甲型的极限倍率)。求出以该稀释倍率的1/2的稀释倍率进行检查时、由试验开始直至着色线的颜色浓度稳定为止的时间(直至甲型的浓度稳定为止的时间)。其结果如表1～2所示。
由如实验例1～20那样制作的膜载体如上所述制作液体试样检测试剂盒。接着，求出将乙型流感病毒B/Shangdong/7/97的稀释倍率由4×103增大时、不能目视着色线的有无的稀释倍率(能够目视判定乙型的极限倍率)。求出以该稀释倍率的1/2的稀释倍率进行检查时、从试验开始直至着色线的颜色浓度稳定为止的时间(直至乙型的浓度稳定为止的时间)。其结果如表1～2所示。
对于直至浓度稳定为止的时间，使用甲型的直至浓度稳定为止的时间和乙型的直至浓度稳定为止的时间的平均值作为直至浓度稳定为止的时间。
表1～2汇总表示对于各实验例的基于以下的基准的综合评价的结果。
A：在判定时间(直至浓度稳定为止的时间)6分钟以内对于甲型而言能够以7×104以上的稀释倍率进行判定、对于乙型而言能够以7×103以上的稀释倍率进行判定的情况，或者对于甲型而言能够以8×104以上的稀释倍率进行判定、对于乙型而言能够以8×103以上的稀释倍率进行判定的情况。
B：综合评价不适于A、C中的任意一种的情况。
C：判定时间为8分钟以上且10分钟以下的情况。
D：判定时间超过10分钟的情况、或者能够判定的稀释倍率对于甲型而言为4×104以下、或对于乙型而言为4×103以下的情况。
[实验例21～37]
对于实验例21～37中的膜载体的制作，在区域A、区域B1和区域B2中，形成如表3～4所示的台阶的深度、微细结构(凸部)的直径和微细结构(凸部)的高度，除此之外与实验例1同样地进行。
接着，所使用的颗粒由着色胶乳颗粒变更为荧光胶乳颗粒(micromer-F荧光胶乳颗粒材料聚苯乙烯Corefront Corporation制)，求出试验开始后4分钟后不能用免疫色谱读取器(C11787 Hamamatsu Photonics K.K.制)读取着色线的有无的倍率(能够进行荧光判定的极限倍率)，除此之外与实验例1～17同样地进行检测区的制作、标记物的安装和检测评价。结果如表3～4所示。
表3～4汇总表示对于各实验例的基于以下的基准的综合评价的结果。
A：在试验开始后4分钟能够进行荧光判定的极限倍率对于甲型而言为1×106以上、对于乙型而言为1×105以上的情况。
B：综合评价不适于A、C中的任意一种的情况。
C：在试验开始后4分钟能够进行荧光判定的极限倍率对于甲型而言为不足7×105、对于乙型而言不足7×104的情况。
[表3]
[表4]
由表1～4的结果可知，本实施方式的液体试样检测试剂盒通过在流路中设置台阶，可以促进被检测物质和标记物的搅拌、可以实施高灵敏度的检查。可知可以通过在台阶的下游侧的倾斜部制作检测区而抑制本底的着色，因此实现更高灵敏度化。进而由表3～4的结果确认，对于上述液体试样检测试剂盒而言，在颗粒为荧光胶乳颗粒的情况下，也能够实施高灵敏度的检查。
没有设置台阶的情况下，得不到高灵敏度(实验例18)。与台阶的上游侧相比，在下游侧、底面的高度水准低的情况下，液体没有流动到下游侧而不能测定(实验例19)。
若台阶中的底面的高度水准的变化量超过台阶的上游侧的前述微细结构的高度的2倍则判定时间长(实验例20)。
产业上的可利用性
本实施方式的液体试样检测试剂盒由于可以廉价地实施高灵敏度的检测，因此对于能够实现使完就扔掉的POCT试剂而言是有用的。
根据本实施方式，通过使用设置有设计自由度高的人工的微细凸部的流路，与如专利文献2那样调整结构不均匀的多孔体的孔径、厚度的方法相比，可以容易地控制液体试样检测试剂盒内的流动。通过在流路中设置台阶，被检测物质、标记物的搅拌得到促进，与使用平滑的人工流路的专利文献3～8的情况相比，可以改善检测区的灵敏度。
该申请主张2017年12月11日申请的日本申请特愿2017-236604号作为基础的优先权，将其全部公开引进于此。
附图标记说明
2 流路
3,13 膜载体
3x,13x 滴加区
3y,13y 检测区
4 凸部的底面中的代表长度(凸部的底面的直径)
5 最接近微细结构之间的距离
6,6a,6b,6c,6d 凸部的高度
8,8a,8b,8c,8d 凸部
7,7a,7b,7c,7d 微细结构
9 平坦部
10,10,10b,10c,10d 凸部的底面
18 液体试样检测试剂盒
18a 壳体
18b 第一开口部
18c 第二开口部
20 模具
20A 特定的一边
20B 特定的一边20A的对边
20C 区域B1和区域B2的边界线
A 第一区域
B 第二区域
B1 区域
B2 B1以外的区域
d 液体试样的流动方向(输送方向)

Claims (19)

1.一种液体试样检测试剂盒用膜载体，其为对液体试样中的被检测物质进行检测的液体试样检测试剂盒用膜载体，
所述液体试样检测试剂盒用膜载体具备能够输送所述液体试样的一体成型而成的至少一个流路，
在所述流路的底面设置有产生用于输送所述液体试样的毛细管作用的微细结构，
在所述流路之中设置有所述底面的高度水准变化的至少一个台阶，
其中，所述台阶被设置成在所述液体试样的输送方向上，下游侧的所述底面的高度水准高于上游侧，并且被设置成在所述液体试样内产生关于高度方向的搅拌作用的方式，
所述液体试样检测试剂盒用膜载体排除所述流路为多孔体的孔的情况。
2.根据权利要求1所述的液体试样检测试剂盒用膜载体，其中，所述微细结构具有圆锥、多棱锥、圆锥台、多棱锥台、圆柱、多棱柱、半球、半椭圆体中的任意一种。
3.根据权利要求1或2所述的液体试样检测试剂盒用膜载体，其中，所述台阶中的所述底面的高度水准的变化量为所述台阶的上游侧的所述微细结构的高度的2倍以下。
4.根据权利要求1或2所述的液体试样检测试剂盒用膜载体，其中，在所述流路中，在所述台阶的下游侧设置有倾斜，使得所述底面的高度水准接近于所述台阶的上游侧的高度水准。
5.根据权利要求1或2所述的液体试样检测试剂盒用膜载体，其中，在所述流路中，在所述台阶的下游侧设置有倾斜，使得所述底面的高度水准接近于所述台阶的上游侧的高度水准，
该膜载体具有检测所述液体试样中的所述被检测物质的检测区，所述检测区设置于所述流路内的倾斜部。
6.一种液体试样检测试剂盒用膜载体，其为对液体试样中的被检测物质进行检测的液体试样检测试剂盒用膜载体，
所述液体试样检测试剂盒用膜载体具备能够输送所述液体试样的一体成型而成的至少一个流路，
在所述流路的底面设置有产生用于输送所述液体试样的毛细管作用的微细结构，
在所述流路之中设置有所述底面的高度水准变化的至少一个台阶，
其中，所述台阶被设置成在所述液体试样的输送方向上，下游侧的所述底面的高度水准高于上游侧，并且被设置成在所述液体试样内产生关于高度方向的搅拌作用的方式，
在所述流路中，在所述台阶的下游侧设置有倾斜，使得所述底面的高度水准接近于所述台阶的上游侧的高度水准，
该液体试样检测试剂盒用膜载体具有检测所述液体试样中的所述被检测物质的检测区，所述检测区设置于所述流路内的倾斜部。
7.根据权利要求1或6所述的液体试样检测试剂盒用膜载体，其中，以所述台阶为边界，所述微细结构在其上游侧和下游侧变化。
8.根据权利要求1或6所述的液体试样检测试剂盒用膜载体，其中，以所述台阶为边界，其下游侧的所述微细结构的高度小于上游侧的高度。
9.根据权利要求1或6所述的液体试样检测试剂盒用膜载体，其中，所述微细结构的高度在所述流路内为10μm以上且500μm以下。
10.一种液体试样检测试剂盒，其为对液体试样中的被检测物质进行检测的液体试样检测试剂盒，
具备权利要求1～9中任一项所述的液体试样检测试剂盒用膜载体，
所述膜载体具有检测所述液体试样中的所述被检测物质的检测区，
所述检测区中，在检测出所述被检测物质时产生颜色变化。
11.根据权利要求10所述的液体试样检测试剂盒，其中，所述检测区设置于所述流路内的倾斜部。
12.根据权利要求10或11所述的液体试样检测试剂盒，其中，具有与所述液体试样中的所述被检测物质特异性反应的抗体或其抗原结合性片段的标记物以能够与所述被检测物质反应的方式设置于所述液体试样检测试剂盒的至少一部分，
所述颜色变化是由于与所述被检测物质结合了的所述标记物而产生的。
13.根据权利要求12所述的液体试样检测试剂盒，其中，所述标记物为在着色胶乳颗粒或荧光胶乳颗粒结合了所述抗体或所述抗原结合性片段的颗粒。
14.根据权利要求12所述的液体试样检测试剂盒，其中，在所述检测区固定有用于检测所述被检测物质的检测物质，
所述颜色变化是由于所述标记物利用所述检测物质被保持于所述检测区并显色而产生的。
15.根据权利要求10或11所述的液体试样检测试剂盒，其中，所述台阶被设置在设置有标记物处的下游侧且在所述检测区的上游侧。
16.一种液体试样检测试剂盒的制造方法，其为权利要求10～15中任一项所述的液体试样检测试剂盒的制造方法，
其具备在所述检测区固定检测物质的工序，所述检测物质通过将所述被检测物质保持于所述检测区而产生所述颜色变化。
17.一种液体试样的检测方法，其为使用权利要求10～15中任一项所述的液体试样检测试剂盒的液体试样的检测方法，
其具备如下工序：
将所述液体试样、和与所述液体试样中的被检测物质特异性结合的标记物混合而制造混合液体试样，使所述被检测物质和所述标记物互相结合的工序；
将所述混合液体试样滴加到设置于所述膜载体的滴加区的工序；
通过所述微细结构，将所述混合液体试样从所述滴加区向所述检测区输送的工序；和
检测所述检测区中的颜色变化的工序。
18.一种膜载体，其为对液体试样中的被检测物质进行检测的膜载体，
所述膜载体具备至少一个流路，
在所述流路的底面设置有微细结构，
在所述流路之中设置有至少一个台阶，
其中，所述台阶被设置成在所述液体试样的输送方向上，下游侧的所述底面的高度水准高于上游侧，并且被设置成在所述液体试样内产生关于高度方向的搅拌作用的方式，
所述膜载体排除所述流路为多孔体的孔的情况。
19.一种膜载体，其为对液体试样中的被检测物质进行检测的膜载体，
所述膜载体具备至少一个流路，
在所述流路的底面设置有微细结构，
在所述流路之中设置有至少一个台阶，
其中，所述台阶被设置成在所述液体试样的输送方向上，下游侧的所述底面的高度水准高于上游侧，并且被设置成在所述液体试样内产生关于高度方向的搅拌作用的方式，
在所述流路中，在所述台阶的下游侧设置有倾斜，使得所述底面的高度水准接近于所述台阶的上游侧的高度水准，
该膜载体具有检测所述液体试样中的所述被检测物质的检测区，所述检测区设置于所述流路内的倾斜部。
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