KR102505285B1 - 막 담체 및 이를 이용한 액체 시료 검사 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유로(2)와 검지 존(3y)을 구비하고, 유로(2)의 바닥면에 미세 구조가 설치되며, 미세 구조에서의 표면 평균 거칠기가 0.005~10.0μm인 막 담체(3)를 제공한다.

Description

막 담체 및 이를 이용한 액체 시료 검사 키트
본 발명은 막 담체 및 이를 이용한 액체 시료 검사 키트에 관한 것이다.
최근에 항원 항체 반응 등을 이용함으로써 감염증으로의 이환이나 임신, 혈당치 등을 측정하는 Point of Care Test(POCT, 임상 현장 즉시 검사) 시약이 주목받고 있다. POCT 시약은 예를 들어 피검자 옆에서 행해지는 검사 혹은 피검자 자신이 행하는 검사 시약으로, 단시간에 결과의 판별이 가능하고 사용 방법이 간편하며 저가라는 특징을 가진다. 이들 특징으로부터 증상이 경도인 단계에서의 진찰이나 정기 진찰 등에 많이 사용되고 있고, 앞으로 증가할 것이 예상되는 재택 의료에서도 중요한 진찰 도구가 되고 있다.
대부분의 POCT 시약에서는 혈액 등의 액체 시료를 검사 키트에 도입하여 그 중에 포함되는 특정의 피검출 물질을 검출함으로써 판정을 행하고 있다. 액체 시료로부터 특정의 피검출 물질을 검출하는 방법으로서 면역크로마토그래피법이 자주 이용되고 있다. 면역크로마토그래피법이란 검사 키트의 막 담체 상에 적하된 액체가 막 담체 상을 이동하는 도중에 피검출 물질과 표지 물질이 결합하고 나아가 이들이 검사 키트 중에 고정화된 물질(이하, 검출 물질이라고 함)과 특이적으로 결합하여 그 결과 발생한 색이나 질량 변화 등을 검출한다는 수법이다. 검출 물질은 시약(reagent)이라고 바꿔 말해도 된다.
액체 시료를 이동시키기 위한 막 담체로서는 니트로셀룰로오스막이 자주 이용되고 있다(특허문헌 1). 니트로셀룰로오스막은 직경이 수μm 정도의 미세한 구멍을 다수 가지고 있고, 그 구멍 안을 액체 시료가 모세관력에 의해 이동한다.
그러나, 니트로셀룰로오스막은 천연물 유래이며 구멍 지름이나 구멍끼리 연결되는 방법이 똑같지 않기 때문에 각각의 막에서 액체 샘플이 흐르는 유속에 차이가 생긴다. 유속에 차이가 생기면 피검출 물질을 검출하기 위해 걸리는 시간도 변화하고, 그 결과 피검출 물질이 결합을 일으키기 전에 비검출로서 잘못 판단해 버릴 가능성이 있다.
상기 과제를 해결하기 위해 미세 유로를 인공적으로 제작한 액체 시료 검사 키트가 고안되어 있다(특허문헌 2). 특허문헌 2는 합성 재료를 이용함으로써 균일한 구조를 갖는 막 담체를 제작할 수 있기 때문에 피검출 물질이 결합을 일으키기 전에 비검출로서 잘못 판단해 버릴 가능성을 저감할 수 있다.
합성 재료를 이용하였을 때 검출 감도 향상을 위해서는 검출 물질과 재료의 친화성을 높일 필요가 있어 미리 재료에 각종 표면 처리를 행하는 것이 유효하다고 생각된다(특허문헌 3~4). 특허문헌 5는 액체 시료 중의 피검출 물질을 검출하는 검사 키트용의 막 담체로서, 액체 시료를 수송할 수 있는 적어도 하나의 유로를 구비하고, 유로의 바닥면에 액체 시료를 수송하기 위한 모세관 작용을 발생시키는 미세 구조가 설치되어 있는 액체 시료 검사 키트용 막 담체를 개시하고 있다.
특허문헌 1: 일본공개특허 2014-062820호 공보 특허문헌 2: 일본특허 제5799395호 공보 특허문헌 3: 일본공개특허 2013-113633호 공보 특허문헌 4: 미국특허출원공개 제2011/0284110호 명세서 특허문헌 5: 국제공개 제2016/098740호
특허문헌 3~4에서는 표면 처리에 의한 재료에 대한 영향이나 보다 고감도로 하기 위한 적정한 처리 조건이 제시되지 않고, 그 결과 계의 성능이 충분히 발휘되지 않았다. 또한, 특허문헌 3~5에서는 막 담체의 미세 구조에서의 표면 평균 거칠기 및 검지 존의 표면의 산소 원자수비(산소 원자수/(탄소 원자수+질소 원자수+산소 원자수))에 대해서는 기재되지 않았다.
본 발명은 고감도의 판정이 가능한 막 담체를 제공한다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) 유로와 검지 존을 구비하고, 유로의 바닥면에 미세 구조가 설치되며, 미세 구조에서의 표면 평균 거칠기가 0.005~10.0μm인 막 담체.
(2) 유로와 검지 존을 구비하고, 유로의 바닥면에 미세 구조가 설치되며, 검지 존의 표면에는 탄소 원자 및 질소 원자 중 적어도 한쪽의 원자와 산소 원자가 존재하고 있고, 각 원자의 원자수의 합계에 대한 산소 원자수비(산소 원자수/(탄소 원자수+질소 원자수+산소 원자수))가 0.01~0.50인 막 담체.
(3) 미세 구조의 높이가 5~1000μm인, (1) 또는 (2)에 기재된 막 담체.
(4) 미세 구조의 바닥면의 지름이 5~1000μm인, (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 막 담체.
(5) 미세 구조끼리의 최근접 거리가 유로 내에서 0~500μm인, (1)~(4) 중 어느 하나에 기재된 막 담체.
(6) 미세 구조의 애스펙트비가 0.1~10인, (1)~(5) 중 어느 하나에 기재된 막 담체.
(7) 막 담체가 액체 시료 중의 피검출 물질을 검출하는 검사 키트용 막 담체인, (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 막 담체.
(8) 검지 존이 피검출 물질을 검출하였을 때에 색변화를 나타내는, (7)에 기재된 막 담체.
(9) 피검출 물질을 검출하였을 때에 색변화를 발생시키는 검출 물질이 검지 존에 고정되어 있는, (7) 또는 (8)에 기재된 막 담체.
(10) (1)~(9) 중 어느 하나에 기재된 막 담체를 갖는 액체 시료 검사 키트.
본 발명은 고감도의 판정이 가능한 막 담체를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명에 의한 실시형태의 일례로서, 검사 키트의 모식적인 상면도이다.
도 2는 본 발명에 의한 실시형태의 일례로서, 막 담체의 모식적인 상면도이다.
도 3의 (a)는 본 발명에 의한 실시형태의 일례로서, 미세 구조의 부감도(상면도)이고, (b)는 (a)에 도시된 미세 구조를 구성하는 볼록부의 사시도이다.
도 4의 (a)는 본 발명에 의한 실시형태의 일례로서, 미세 구조의 부감도(상면도)이고, (b)는 (a)에 도시된 미세 구조를 구성하는 볼록부의 사시도이다.
도 5의 (a)는 본 발명에 의한 실시형태의 일례로서, 미세 구조의 부감도(상면도)이고, (b)는 (a)에 도시된 미세 구조를 구성하는 볼록부의 사시도이다.
도 6의 (a)는 본 발명에 의한 실시형태의 일례로서, 미세 구조의 부감도(상면도)이고, (b)는 (a)에 도시된 미세 구조를 구성하는 볼록부의 사시도이다.
도 7은 본 발명에 의한 실시형태의 일례로서, 미세 구조의 모식적인 상면도이다.
도 8은 본 발명에 의한 실시형태의 일례로서, 표면 처리의 개략도이다.
이하, 본 발명의 실시형태를 설명한다. 본 발명의 실시형태는 후술하는 형태예에 한정되는 것은 아니고, 그 기술 사상의 범위에서 여러 가지 변형이 가능하다.
막 담체는 일 실시형태에 있어서 액체 시료 중의 피검출 물질을 검출하는 액체 시료 검사 키트용의 막 담체이다.
여기서, 피검출 물질은 전혀 한정되는 것은 아니고, 각종 병원체, 각종 임상 마커 등 항체와 항원 항체 반응하는 것이 가능한 어떠한 물질이어도 된다. 피검출 물질의 구체예로서는 인플루엔자 바이러스, 노로 바이러스, 아데노 바이러스, RS 바이러스, HAV, HBs, HIV 등의 바이러스 항원, MRSA, A군 용련균, B군 용련균, 레지오넬라속균 등의 세균 항원, 세균 등이 만들어내는 독소, 마이코플라즈마, 클라미디아ㆍ트라코마티스, 인간 융모성 고나도트로핀 등의 호르몬, C 반응성 단백질, 미오글로빈, 심근 트로포닌, 각종 종양 마커, 농약 및 환경 호르몬 등을 예시할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 피검출 물질이 특히 인플루엔자 바이러스, 노로 바이러스, C 반응성 단백질, 미오글로빈 및 심근 트로포닌과 같은 검출과 치료 조치에 긴급을 요하는 항목인 경우에는 그 유용성이 특히 크다. 피검출 물질은 단독으로 면역 반응을 야기할 수 있는 항원이어도 되고, 단독으로는 면역 반응을 야기할 수 없지만 항체와 항원 항체 반응에 의해 결합하는 것이 가능한 합텐이어도 된다. 피검출 물질은 통상 액체 시료 중에서 부유 또는 용해된 상태에 있다. 액체 시료는 예를 들어 상기 피검출 물질을 완충액에 부유 또는 용해시킨 시료이어도 된다.
본 실시형태에 관한 액체 시료 검사 키트(이하, 단지 「검사 키트」라고도 함)는 액체 시료 중의 피검출 물질을 검출한다. 도 1은 검사 키트의 모식적인 상면도이다. 예를 들어 도 1에 도시된 바와 같이 검사 키트(18)는 막 담체(3)와, 막 담체(3)를 수용하는 하우징(18a)을 구비한다. 막 담체(3)는 그 표면에 액체 시료가 적하되는 적하 존(3x)과, 액체 시료 중의 피검출 물질을 검출하기 위한 검지 존(3y)을 가지고 있다. 적하 존(3x)은 하우징(18a)의 제1 개구부(18b)에서 노출되어 있다. 검지 존(3y)은 하우징(18a)의 제2 개구부(18c)에서 노출되어 있다.
도 2는 막 담체(3)의 모식적인 상면도이다. 도 2에 도시된 바와 같이 막 담체(3)는 액체 시료를 수송하는 적어도 하나의 유로(2)를 구비하고 있다. 유로(2)의 바닥면에는 미세 구조가 설치되어 있다(도시생략, 상세는 후술). 미세 구조는 적어도 적하 존(3x)과 검지 존(3y)의 사이에 위치한다. 막 담체(3)의 표면 전체에 걸쳐 미세 구조가 설치되어 있어도 된다. 막 담체(3)의 표면 전체가 액체 시료의 유로(2)이어도 된다. 미세 구조는 모세관 작용을 발생시킨다. 미세 구조의 모세관 작용에 의해 액체 시료는 미세 구조를 통해 적하 존(3x)에서 검지 존(3y)으로(수송 방향(d)을 따라) 수송된다. 액체 시료 중의 피검출 물질이 검지 존(3y)에서 검출되면 검지 존(3y)의 색이 변화한다.
막 담체(3)의 전체 형상은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 사각형 등의 다각형, 원형 또는 타원형이어도 된다. 막 담체(3)가 사각형인 경우 막 담체(3)의 세로폭(짧은 방향의 길이)(L1)은 예를 들어 2mm~100mm이어도 되고, 막 담체(3)의 가로폭(길이 방향의 길이)(L2)은 예를 들어 2mm~100mm이어도 된다. 미세 구조의 높이를 제외한 막 담체의 두께는 예를 들어 0.1mm~10mm이어도 된다.
도 3~6은 각각 본 실시형태에서의 유로의 바닥면에 설치된 미세 구조 및 이를 구성하는 볼록부의 일례를 나타낸다. 도 3~6 중, (a)는 각각 미세 구조의 부감도(상면도)이며, (b)는 각각 (a)에 도시된 미세 구조를 구성하는 볼록부의 사시도이다. 도 3~6에 도시된 바와 같이 미세 구조(7)는 볼록부(8)의 총체이다. 즉, 막 담체(3)는 액체 시료의 유로(2)의 바닥면에 상당하는 평탄부(9)와, 평탄부(9)로부터 돌출되는 복수의 볼록부(8)를 구비한다. 모세관 작용에 의해 복수의 볼록부(8) 사이의 공간이 액체 시료를 막 담체(3)의 표면을 따라 수송하는 유로(2)로서 기능한다. 바꿔 말하면 모세관 작용에 의해 미세 구조(7)에서의 공극이 액체 시료를 막 담체(3)의 표면을 따라 수송하는 유로(2)로서 기능한다. 복수의 볼록부(8)는 규칙적으로 또는 병진 대칭적으로 막 담체(3)의 표면 상에 나열되어도 된다.
상기 미세 구조(7)를 구성하는 복수의 볼록부(8)의 형상은 자유롭게 선택할 수 있다. 볼록부(8)의 형상으로서는 예를 들어 원뿔, 다각뿔, 원뿔대, 다각뿔대, 원기둥, 다각기둥, 반구, 반타원체 등을 들 수 있다. 미세 구조의 바닥면으로서는 원형 또는 다각형(예를 들어 정사각형, 마름모, 직사각형, 삼각형 혹은 육각형 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어 도 3에 도시된 바와 같이 볼록부(8a)의 형상은 원뿔이어도 된다. 예를 들어 도 4에 도시된 바와 같이 볼록부(8b)의 형상은 사각뿔이어도 된다. 예를 들어 도 5에 도시된 바와 같이 볼록부(8c)의 형상은 육각뿔이어도 된다. 예를 들어 도 6에 도시된 바와 같이 볼록부(8d)의 형상은 사각기둥(볼록부(8d)가 라인 형상인 라인 & 스페이스 구조)이어도 된다. 미세 구조(7)를 부감하였을(상면에서 보았을) 때에 막 담체(3)의 전체 표면을 시인할 수 있고 피검출 물질이 검출되었을 때의 색변화를 광학적 수법으로 확인하기 쉬운 점에서 이들 중에서는 원뿔이나 다각뿔 등의 뿔체 구조가 볼록부(8)의 형상으로서 적합하다. 뿔체 구조 중에서는 원뿔이 바람직하다.
미세 구조(7)를 구성하는 볼록부(8)의 형상은 기하학적으로 정확한 형상일 필요는 없고, 모서리부가 둥그스름한 형상이나 표면에 미세한 요철이 존재하는 형상 등이어도 된다.
상기 미세 구조(7)를 구성하는 볼록부(8)의 바닥면(10)의 지름(4)은 바람직하게는 5μm 이상 1000μm 이하이며, 보다 바람직하게는 10μm 이상 500μm 이하이다. 볼록부(8)의 바닥면(10)의 지름(4)이 5μm 이상인 경우 미세 가공의 정밀도를 낮게 억제할 수 있어 미세 구조(7)를 형성하기 위한 비용이 낮아지기 쉽다. 볼록부(8)의 바닥면(10)의 지름(4)이 1000μm 이하인 경우 하나의 검사 키트 내의 볼록부(8)의 수가 많아져 액체 시료를 전개하기 쉬워진다.
볼록부(8)의 바닥면(10)의 지름(4)은 볼록부(8)의 바닥면(10)에서의 대표 길이로서 정의된다. 바닥면(10)에서의 대표 길이는 바닥면(10)의 형상이 원인 경우는 직경, 삼각형 또는 사각형인 경우는 가장 짧은 한 변의 길이, 오각형 이상의 다각형인 경우는 가장 긴 대각선의 길이, 그 이외의 형상인 경우는 바닥면(10)에서의 최대 길이로 한다.
도 3에 도시된 바와 같이 볼록부(8a)의 형상이 원뿔인 경우 볼록부(8a)의 바닥면(10a)의 지름(4a)은 원뿔의 바닥면(원)의 직경이다. 도 4에 도시된 바와 같이, 볼록부(8b)의 형상이 정사각뿔인 경우 볼록부(8b)의 바닥면(10b)의 지름(4b)은 바닥면(정사각형)(10b)의 변의 길이이다. 도 5에 도시된 바와 같이 볼록부(8c)의 형상이 정육각뿔인 경우 볼록부(8c)의 바닥면(10c)의 지름(4c)은 바닥면(정육각형)(10c)의 중심을 통과하는 대각선의 길이(가장 긴 대각선의 길이)이다. 도 6에 도시된 바와 같이 볼록부(8d)의 형상이 직사각형인 경우 볼록부(8d)의 바닥면(10d)의 지름(4d)은 바닥면(직사각형)(10d)의 가장 짧은 한 변의 길이(도 6에서는 액체 시료의 수송 방향(d)과 직교하는 방향의 길이)이다.
상기 미세 구조(7)를 구성하는 볼록부(8)의 높이(6)는 바람직하게는 5μm~1000μm이고, 보다 바람직하게는 10μm~500μm이다. 볼록부(8)의 높이(6)가 5μm 이상인 경우 유로(2)의 부피가 커지고 액체 시료가 보다 단시간에 전개 가능해진다. 볼록부(8)의 높이(6)가 1000μm 이하인 경우 미세 구조(7)를 제작하는 시간과 비용을 저감할 수 있고 미세 구조(7)의 제작이 보다 용이해진다.
볼록부(8)의 높이(6)는 평탄부(9)에 직교하는 방향에서의 볼록부(8)의 최대 길이로서 정의된다. 도 3에 도시된 바와 같이 볼록부(8a)의 형상이 원뿔인 경우 볼록부(8a)의 높이(6a)는 평탄부(9)에 직교하는 방향에서의 볼록부(8a)의 최대 길이(원뿔의 높이)이다. 도 4에 도시된 바와 같이 볼록부(8b)의 형상이 사각뿔인 경우 볼록부(8b)의 높이(6b)는 평탄부(9)에 직교하는 방향에서의 볼록부(8b)의 최대 길이(사각뿔의 높이)이다. 도 5에 도시된 바와 같이 볼록부(8c)의 형상이 육각뿔인 경우 볼록부(8c)의 높이(6c)는 평탄부(9)에 직교하는 방향에서의 볼록부(8c)의 최대 길이(육각뿔의 높이)이다. 도 6에 도시된 바와 같이 볼록부(8d)의 형상이 사각기둥인 경우 볼록부(8d)의 높이(6d)는 평탄부(9)에 직교하는 방향에서의 볼록부(8d)의 최대 길이(사각기둥의 높이)이다.
상기 미세 구조(7)를 구성하는 볼록부(8)끼리의 최근접 거리(5)는 0~500μm가 바람직하다. 바람직하게는 500μm 이하, 보다 바람직하게는 2μm 이상 100μm 이하이다. 볼록부(8)끼리의 최근접 거리(5)는 0μm보다 작은 경우는 있을 수 없고, 500μm 이하인 경우 액체 시료와 유로(2)의 접촉 면적이 증대하고, 이에 의해 모세관력이 증대하기 때문에 액체 시료를 이동시키는 것이 보다 용이해진다. 여기서, 「볼록부(8)끼리의 최근접 거리」란 인접하는 한 쌍의 볼록부(8)의 최근접 거리이다.
상기 미세 구조(7)를 구성하는 볼록부(8)의 애스펙트비는 0.1~10이 바람직하고, 0.1~2.0이 보다 바람직하다. 여기서 말하는 애스펙트비란 볼록부(8)의 높이(6(Lh))를 볼록부(8)의 바닥면(10)의 대표 길이(지름(4)(Lv))로 나눈 값(Lh/Lv)이다. 애스펙트비가 0.1 이상인 경우 액체 시료와 유로(2)의 접촉 면적이 증대하고, 이에 의해 모세관력이 증대하기 때문에 액체 시료를 이동시키는 것이 보다 용이해진다. 애스펙트비가 10 이하인 경우 미세 구조의 제작이 보다 용이해진다.
본 실시형태의 액체 시료 검사 키트(18)의 미세 구조(7) 및 막 담체(3)는 열가소성 플라스틱으로 이루어져도 된다. 바꿔 말하면 열가소성 플라스틱으로 이루어지는 막형상의 베이스재(基材)를 가공함으로써 미세 구조(7)를 갖는 막 담체(3)를 제작할 수 있다.
가공 방법으로서는 예를 들어 열 임프린트, UV 임프린트, 사출 성형, 에칭, 포토리소그래피, 기계 절삭, 레이저 가공 등을 들 수 있다. 이 중에서도 저가로 정밀한 가공을 실시하는 수법으로서 열가소성 플라스틱에 대한 열 임프린트가 적합하다. 열가소성 플라스틱으로서는 폴리에스테르계 수지, 폴리올레핀계 수지, 폴리스티렌계 수지, 폴리카보네이트계 수지, 불소계 수지 및 아크릴계 수지 등을 들 수 있고, 구체적으로는 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 시클로올레핀 폴리머(COP), 폴리프로필렌(PP), 폴리스티렌(PS), 폴리카보네이트(PC), 폴리불화비닐리덴(PVDF), 폴리메타크릴산 메틸(PMMA), 폴리에틸렌(PE) 등 다양한 종류의 것을 이용할 수 있다.
임프린트나 사출 성형 등의 금형을 이용한 가공 방법의 경우 뿔체는 바닥면에 비해 상부가 가늘어지기 때문에 동일 바닥면의 기둥체를 제작하는 것보다 금형 제작시에 깎아내는 부피는 적어도 되므로 금형을 저가로 제작할 수 있다. 이 경우 액체 시료 중의 피검출 물질의 검출을 보다 저가로 행하는 것이 가능해진다.
이상 설명한 바와 같이 막 담체(3)는 막 담체(3)의 일면 상에 설치된 미세 구조(7)와, 미세 구조(7)에 의해 형성된, 액체 시료를 수송하는 유로(2)와, 액체 시료 중의 피검출 물질을 검출하기 위한 검지 존(검출부)(3y)을 구비하고 있다. 막 담체(3)는 액체 시료 중의 피검출 물질을 검출하는 액체 시료 검사 키트(18)용의 막 담체(3)이어도 된다.
일 실시형태에 있어서 막 담체(3)의 미세 구조(7)에서의 표면 평균 거칠기(Ra)는 0.005~10.0μm이다. 막 담체(3)의 미세 구조(7)에서의 표면 평균 거칠기는 0.1μm 이상이 바람직하고, 0.2μm 이상이 보다 바람직하며, 0.5μm 이상이 더욱 바람직하고, 1μm 이상이 보다 더 바람직하다. 막 담체(3)의 표면 평균 거칠기는 10μm 이하, 5μm 이하, 1μm 이하 또는 0.1μm 이하이어도 된다. 막 담체(3)의 미세 구조(7)에서의 표면 평균 거칠기(Ra)란 볼록부(8)의 표면 평균 거칠기를 의미하고, JIS B0601: 2013에서 규정된 정의를 이용하는 것으로 한다. 막 담체(3)의 미세 구조(7)에서의 표면 평균 거칠기는 막 담체(3)의 미세 구조(7)에서의 볼록부(8)의 표면 평균 거칠기라고 바꿔 말할 수도 있다.
막 담체(3)에서는 평탄부(9)의 표면 평균 거칠기(Ra)는 0.005~10.0μm이어도 된다. 평탄부(9)의 표면 평균 거칠기는 상기 막 담체의 평균 거칠기로서 예시한 값이어도 된다. 평탄부(9)의 표면 평균 거칠기(Ra)는 10μm 이하가 바람직하고, 5μm 이하가 보다 바람직하며, 3μm 이하가 더욱 바람직하고, 2μm 이하가 보다 더 바람직하다.
도 7은 미세 구조(7)에서의 볼록부(8)의 표면 평균 거칠기의 측정 방법을 설명하기 위한 도면이다. 볼록부(8)의 정점 중심부(예를 들어 볼록부 중심(19))를 중심점으로 하여 볼록부(8)의 표면을 따라(상면에서 보았을 때에 직선(20)을 따라) 요철 프로파일을 측정한다. 직선(20)은 정점 중심부(예를 들어 볼록부 중심(19))를 중심점으로 하고 길이(20d)의 임의의 하나의 직선이다. 길이(20d)는 볼록부(8)의 바닥면의 지름과 동일한 길이이다. 직선(20)이 동일 평면 상의 직선인 경우(예를 들어 양단 및 중심이 동일 평면 상에 있는 경우), 즉 볼록부(8)가 원뿔대, 다각뿔대, 원기둥, 다각기둥 등의 형상인 경우 요철 프로파일로부터 JIS B0601에서 규정된 표면 평균 거칠기(Ra)를 산출한다. 직선(20)이 동일 평면 상의 직선이 아닌 경우, 즉 볼록부(8)가 원뿔, 다각뿔, 반구, 반타원체 등의 형상인 경우 요철 프로파일로부터 기울기 보정을 실시하여 평면으로서 JIS B0601에서 규정된 표면 평균 거칠기(Ra)를 산출한다.
막 담체(3)의 미세 구조(7)에서의 표면 평균 거칠기는 열 임프린트에 의해 미세 구조(7)를 갖는 막 담체(3)를 제작할 때에는 예를 들어 에칭, 포토리소그래피, 기계 절삭, 레이저 가공 등에 의해 상기 수치 범위 내로 조정할 수 있다. 특히, 열 임프린트에 사용되는 금형(몰드) 표면의 표면 평균 거칠기를 소정의 값으로 함으로써 막 담체(3)의 미세 구조(7)에서의 표면 평균 거칠기를 조정하는 것이 바람직하다. 예를 들어 금형(몰드)의 표면을 에칭, 포토리소그래피, 기계 절삭, 연마 가공, 레이저 가공 등에 의해 막 담체(3)의 미세 구조(7)에서의 표면 평균 거칠기를 조정하는 것이 바람직하다. 연마 가공으로서는 다이싱, 샌드블라스트 등에 의한 절삭을 들 수 있다. 레이저 가공은 레이저의 출력을 제어함으로써 표면 평균 거칠기를 조정할 수 있다.
즉, 본 실시형태에 관한 검사 키트(18)의 제조 방법은 열 임프린트에 의해 미세 구조(7)를 갖는 막 담체(3)를 제작하는 공정(열 임프린트 공정)을 구비하는 것이 바람직하다. 열 임프린트 공정에서는 복수의 오목부가 형성된 금형(몰드)의 표면을 예를 들어 열가소성 플라스틱으로 이루어지는 막형상의 베이스재에 대고 베이스재를 가열함으로써 오목부의 형상에 대응하는 미세 구조(7)(복수의 볼록부(8))와 평탄부(9)를 갖는 막 담체(3)가 형성된다.
일 실시형태에 있어서, 검지 존의 표면에는 탄소 원자 및 질소 원자 중 적어도 한쪽의 원자와 산소 원자가 존재하고 있다.
각 원자의 원자수의 합계에 대한 산소 원자수비(산소 원자수/(탄소 원자수+질소 원자수+산소 원자수))는 0.01~0.50이다. 일 실시형태의 막 담체에 있어서, 검지 존의 표면의 산소 원자수비(산소 원자수/(탄소 원자수+질소 원자수+산소 원자수))는 0.01 이상이며, 0.05 이상이 바람직하고, 0.10 이상이 보다 바람직하며, 0.20 이상이 더욱 바람직하다. 일 실시형태의 막 담체에 있어서, 검지 존의 표면의 산소 원자수비(산소 원자수/(탄소 원자수+질소 원자수+산소 원자수))는 0.50 이하이며, 0.40 이하가 바람직하고, 0.38 이하가 보다 바람직하며, 0.36 이하가 더욱 바람직하고, 0.30 이하가 보다 더 바람직하며, 0.10 이하가 더욱 더 바람직하다. 검지 존의 표면의 산소 원자수비가 높아질수록 검출 물질이 표면에 고착되기 쉬워진다. 검출 물질이 표면에 고착됨으로써 액체 시료를 전개하였을 때에 흐르는 검출 물질을 줄여 고감도의 검사가 가능해진다. 검지 존의 표면의 산소 원자수비가 0.50 이하이면 피검출 물질을 포함하지 않는 용액을 전개하였을 때의, 표지 물질과 검출 물질의 반응에 의한 오검출의 발생이 보다 억제된다.
검지 존의 표면의 산소 원자수비는 X선 전자 분광 분석(XPS)에 의해 산출된다. XPS에 의한 산소 원자수비의 산출에 대해 이하에 기록한다. 측정에 의해 얻어진 스펙트럼의 결합 에너지 보정을 C1s 스펙트럼에서의 C-C 결합으로 행한다. 결합 에너지 보정을 행한 스펙트럼의 C1s 스펙트럼, N1s 스펙트럼, O1s 스펙트럼의 각 피크에 대해 백그라운드(BG)를 뺀다. 각 피크에서 BG를 빼고 산출된 각 원자의 피크 면적(신호 강도)을 보정 계수(상대 감도 계수, 투과 함수 및 운동 에너지 보정)로 나누고 보정 후의 면적의 합계가 100이 되도록 계산하였다. 얻어진 각 값을 각각 탄소 원자수, 질소 원자수, 산소 원자수로 하고 산소 원자수비(산소 원자수/(탄소 원자수+질소 원자수+산소 원자수))를 산출한다.
검지 존의 표면의 산소 원자수비는 검지 존의 표면을 표면 처리함으로써 상기 범위 내로 조정할 수 있다. 표면 처리의 방법으로서는 전혀 한정되는 것은 아니고, 예를 들어 각종 플라즈마 처리, 코로나 처리, UV 조사, UV/오존 처리, 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-Aminopropyltriethoxysilane)이나 글루타르알데히드(Glutaraldehyde)에 의한 표면 수식 등 여러 가지 수법을 이용할 수 있다.
표면 처리는 검지 존에만 행하는 것이 바람직하다. 검지 존에만 행함으로써 유로 내의 비검지 존(검지 존 이외의 영역)에서는 검출 물질이 고착되지 않고, 검지 존에만 높은 효율로 검출 물질을 고착할 수 있다. 그 결과, 검지 존에서 검출 시그널을 인식하기 쉬워진다(S/N 비가 높아진다).
검지 존의 표면을 선택적으로 표면 처리하여 검지 존의 표면을 개질시키는 방법으로서는 검지 존 이외의 개소를 차폐 가능한 마스크(차폐물)로 피복하고, 노출시킨 검지 존에 대해 표면 처리를 실시하는 방법을 들 수 있다. 도 8은 검지 존의 표면을 선택적으로 표면 처리하는 방법을 설명하기 위한 도면이다. 공극부를 갖는 차폐물(14)을 막 담체(3) 상에 배치하여 검지 존(표면 처리부)을 노출시킨다. 막 담체(3) 중 차폐물(14)로 덮은 부분은 미처리부(비검지 존)(15)가 된다. 차폐물(14)로서는 금속판이 바람직하다. 노출시킨 개소를 표면 처리함으로써 검지 존의 표면의 산소 원자수비가 상기 범위 내인 막 담체(3)를 얻는다.
상기 실시형태에서 막 담체의 재료로서는 표면의 산소 원자수비(산소 원자수/(탄소 원자수+질소 원자수+산소 원자수))가 0.01 미만의 수지를 이용하는 것이 바람직하고, 0.005 이하의 수지를 이용하는 것이 보다 바람직하다. 표면의 산소 원자수비가 0.01 미만의 수지는 주성분의 구조식에 산소 원자를 포함하지 않는 수지이며, 폴리올레핀계 수지, 폴리스티렌계 수지, 불소계 수지 등의 탄소 원자를 포함하고 질소 원자 및 산소 원자를 포함하지 않는 수지이어도 된다. 이러한 수지로서 구체적으로는 폴리에틸렌(PE), 시클로올레핀 폴리머(COP), 폴리프로필렌(PP), 폴리스티렌(PS), 폴리불화비닐리덴(PVDF) 등을 들 수 있다. 표면의 산소 원자수비가 0.01 미만의 수지는 폴리이미드 수지 등의 탄소 원자 및 질소 원자를 포함하고 산소 원자를 포함하지 않는 수지이어도 된다. 탄소 원자를 포함하고 질소 원자 및 산소 원자를 포함하지 않는 수지를 이용하는 경우 검지 존의 산소 원자수비(산소 원자수/(탄소 원자수+질소 원자수+산소 원자수))는 산소 원자수/(탄소 원자수+산소 원자수)의 값과 실질적으로 동일해진다.
표면의 산소 원자수비가 0.005 이하인 경우 막 담체를 제작하고 제작한 막 담체를 이용하여 검사 키트를 제작하여 액체 시료를 전개하였을 때의 비검지 존에서의 표지 물질의 부착이 보다 억제된다. 비검지 존에서 표지 물질이 부착되면 검지 존에서 동일 강도의 시그널이 발생해도 인식하기 어려워진다(S/N 비가 낮아진다).
본 실시형태에 관한 액체 시료 검사 키트(18)에서는 막 담체(3)가 갖는 검지 존(3y)이 피검출 물질을 검출하였을 때에 색변화를 나타낸다. 색변화는 광학적 수법으로 확인 가능한 색변화이어도 된다.
상기 광학적 수법으로서는 주로 육안에 의한 판정과 형광 강도를 측정하는 수법 2가지를 들 수 있다. 육안에 의해 판정하는 경우에는 검지 전과 검지 후의 색을 CIE1976L*a*b* 색공간의 표색계로 측정하였을 때의 2개의 색자극 간의 색차(JIS Z8781-4: 2013에 기재된 ΔE)가 0.5 이상이 되는 색변화가 발생하는 것이 바람직하다. 이 색차가 0.5 이상이면 색의 차이를 육안으로 확인하는 것이 용이해진다. 형광 강도를 측정하여 판정하는 경우에는 검지 존(3y)에서의 형광 강도(Fl1)와 검지 존(3y)에 인접하는 상류역 및 하류역에서의 형광 강도(Fl2)의 비(Fl1/Fl2)=10/1 이상이 되는 색변화가 발생하는 것이 바람직하다. 이 비가 10/1 이상이면 시그널과 잡음의 분리가 용이해진다.
본 실시형태의 액체 시료 검사 키트(18)에 검지 존(3y)을 제작하기 위해서는 일 실시형태에 있어서 유로(2)의 적어도 일부에 검출 물질이 고정화되어 있다. 즉, 검지 존(3y)에는 피검출 물질을 검출하는 검출 물질이 고정되어 있다. 검지 존(3y)에서의 색변화는 피검출 물질이 검출 물질에 의해(검출 물질과 반응하여) 검지 존(3y)에 보유됨으로써 발생한다.
바꿔 말하면 액체 시료 검사 키트(18)의 제조 방법은 검지 존(3y)에 피검출 물질을 검지 존(3y)에 보유함으로써 색변화를 발생시키는 검출 물질을 고정하는 공정을 구비하고 있다. 검지 존(3y)에 검출 물질(시약)을 보다 효율적으로 고정화할 수 있는 점에서 막 담체(3)에서의 검지 존(3y)을 설치하는 개소에 미리 표면 처리를 실시해도 된다. 표면 처리의 방법으로서는 상기 예시한 방법을 이용할 수 있다.
본 실시형태에 있어서, 상기 검출 물질(시약)로서는 예를 들어 항체를 들 수 있다. 항체는 피검출 물질과 항원 항체 반응하는 항체로서 폴리클로날 항체이어도 되고 모노클로날 항체이어도 된다.
검지 존(3y)에서의 색변화는 액체 시료 중의 피검출 물질과 특이적으로 반응하는 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 갖는 표지체에 의해 발생하는 것이어도 된다. 색변화는 예를 들어 표지체가 검출 물질에 의해(검출 물질과 반응(결합)하여) 검지 존(3y)에 보유되어 색을 나타냄으로써 발생한다.
표지체는 예를 들어 콜로이드 입자, 라텍스 입자 등의 입자에 상기 항체 또는 그 항원 결합성 단편이 결합된 것이어도 된다. 항원 결합성 단편이란 피검출 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 단편을 말하고, 예를 들어 항체의 항원 결합성 단편을 말한다. 표지체는 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 통해 피검출 물질에 결합할 수 있다. 입자는 자성 또는 형광 발광성을 가져도 된다. 콜로이드 입자로서는 금 콜로이드 입자, 백금 콜로이드 입자의 금속 콜로이드 입자 등을 들 수 있다. 입자는 입경 제어, 분산 안정성 및 결합 용이성의 점에서 바람직하게는 라텍스 입자이다. 라텍스 입자의 재료로서는 특별히 한정되지 않지만, 폴리스티렌이 바람직하다.
입자는 시인성의 점에서 바람직하게는 착색 입자 또는 형광 입자이며, 보다 바람직하게는 착색 입자이다. 착색 입자는 육안으로 색이 검출 가능한 것이면 된다. 형광 입자는 형광 물질을 함유하면 된다. 입자는 착색 라텍스 입자 또는 형광 라텍스 입자이어도 된다. 입자가 착색 라텍스 입자인 경우 상술한 색변화가 육안에 의해 적합하게 판정된다. 또한, 입자가 형광 라텍스 입자인 경우 상술한 색변화가 형광 강도의 측정에 의해 적합하게 판정된다.
상술한 바와 같은 표지체가 적하되는 액체 시료 중의 피검출 물질과 반응할 수 있도록 검사 키트(18)의 적어도 일부에 설치되어 있다. 표지체는 예를 들어 검사 키트(18) 중의 부재에 설치되어 있어도 되고, 막 담체(3)의 유로(2)의 적어도 일부(검지 존(3y)보다 상류측)에 설치되어 있어도 된다. 그리고, 피검출 물질과 반응(결합)한 표지체는 검출 물질에 의해(검출 물질이 피검출 물질과 반응(결합)함으로써) 검지 존(3y)에 보유된다. 이에 의해 검지 존(3y)에서의 색변화(표지체에 의해 색을 나타냄)가 발생한다.
본 실시형태의 일 측면에 관한 액체 시료의 검사 방법은 검사 키트(18)를 이용하는 검사 방법이다.
검사 키트(18)를 이용하는 액체 시료의 검사 방법은 액체 시료와 액체 시료 중의 피검출 물질과 특이적으로 결합하는 표지체를 혼합하여 혼합 액체 시료(혼합 완료된 액체 시료)를 조제하고 피검출 물질과 표지체를 서로 결합시키는 공정과, 혼합 액체 시료를 막 담체(3)에 설치된 적하 존(3x)에 적하하는 공정과, 미세 구조(7)에 의해 혼합 액체 시료를 적하 존(3x)에서 검지 존(3y)으로 수송하는 공정과, 검지 존(3y)에서의 색변화(표지체의 색을 나타냄)를 검지하는 공정을 구비해도 된다.
또한, 예를 들어 상기 검사 방법은 액체 시료를 막 담체(3)의 표면 중 적하 존(3x)에 적하하는 공정과, 막 담체(3)의 표면에 형성되어 있는 미세 구조(7)(복수의 볼록부(8))가 나타내는 모세관 작용에 의해 미세 구조(7)를 통해 액체 시료를 적하 존(3x)에서 검지 존(3y)으로 수송하는 공정과, 수송 과정에서 액체 시료 중의 피검출 물질을 상기 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 통해 표지체와 결합시키고, 나아가 피검출 물질을 검지 존(3y)에 고정된 시약과 결합시켜 검지 존(3y)에서의 색변화를 검지하는(색변화의 유무를 광학적으로 판정하는) 공정을 구비해도 된다.
상기 검사 방법의 피검출 물질과 표지체를 서로 결합시키는 공정에서는 액체 시료와 표지체를 혼합하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어 표지체가 들어간 용기에 액체 시료를 첨가하는 방법으로도 되고, 예를 들어 표지체를 포함한 액체와 액체 시료를 혼합해도 된다. 또한, 예를 들어 액체 시료가 들어간 용기의 적하구에 필터를 끼워 그 필터 중에 표지체를 고정화해도 된다.
실시예
이하, 본 실시형태를 실시예 및 비교예를 들어 구체적으로 설명하지만, 본 실시형태는 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1-1]
<막 담체의 준비>
폴리스티렌 시트(덴카 주식회사 제품 덴카 스티렌시트, 막두께 300μm)에 열 임프린트를 실시하여 미세 구조(볼록부)의 바닥면의 지름(이하, 「볼록부의 지름」 또는 「지름」이라고 하기도 함) 10μm, 미세 구조(볼록부)의 높이(이하, 「높이」라고 하기도 함) 10μm의 원뿔형의 볼록부(8)가 미세 구조끼리의 최근접 거리를 5μm로 하여 도 3과 같은 삼각 배열 형식으로 나열된 표면 평균 거칠기 0.102μm의 막 담체를 제작하였다. 표면 평균 거칠기는 금형(몰드)의 표면에 샌드블라스트 처리를 실시함으로써 소정의 값으로 하였다. 표 1 및 2의 표면 평균 거칠기는 미세 구조에서의 표면 평균 거칠기(볼록부의 표면 평균 거칠기)의 값을 나타내었다. 표면 평균 거칠기의 측정에는 3차원 거칠기 해석 전자 현미경(주식회사 에리오닉스 제품 ERA-600)을 이용하였다(도 7 참조). 원뿔형의 볼록부(8)를 임의로 3개 선택하였다. 3개의 볼록부(8)에 대해 볼록부(8)의 정점 중심부(볼록부의 중심점(19))를 중심점으로 한, 길이(20d)가 10μm인 직선(20)의 요철 프로파일을 각각 측정하였다. 3개의 직선(20)의 요철 프로파일에 기울기 보정을 실시하여 평면으로서 JIS B0601에서 규정된 표면 평균 거칠기(Ra)를 각각 산출하였다. 얻어진 3개의 데이터를 평균한 값을 평가값으로 하였다.
<검지 존(검출부)의 제작>
상기와 같이 제작한 막 담체의 미세 구조의 끝으로부터 0.7~1.0cm의 부분에만 에너지 조사할 수 있도록 금속판으로 마스크한 후 UV를 조사하였다. 금속판은 0.7~1.0cm의 부분에 공극을 마련하여 막 담체를 노출시켰다. 마스크하는 방법으로서는 막 담체에 금속판을 배치하는 방법을 이용하였다. 이와 같이 하여 표면 처리한 막 담체(3)를 얻었다. 도 8에서 0.7~1.0cm의 부분은 검지 존(3y)(표면 처리부), 금속판은 차폐물(14)에 상당한다.
<검출 물질의 세팅>
상기와 같이 UV 처리를 실시한 부분에 항A형 인플루엔자 NP 항체 부유액 및 항B형 인플루엔자 NP 항체 부유액을 선폭 1mm로 도포하고(도포량 3μL) 온풍 하에서 잘 건조시켰다. 이와 같이 하여 항A형 인플루엔자 NP 항체 및 항B형 인플루엔자 NP 항체를 검지 존(3y)에 고정하였다.
<표지 물질의 세팅>
정제 항A형 인플루엔자 바이러스 NP 항체(상기와 별도의 항체) 및 정제 항B형 인플루엔자 바이러스 NP 항체(상기와 별도의 항체)를 사용하였다. 항A형 인플루엔자 바이러스 NP 항체에 입자경 0.394μm의 적색 라텍스 입자(CM/BL 셀라다인 제품)를 공유 결합으로 표지하고, 당, 계면활성제 및 단백질을 포함한 트리스 완충액에 라텍스 입자의 농도가 0.025w/v%가 되도록 현탁하고 초음파 처리를 행하여 충분히 분산 부유시킨 항A형 표지체를 조제하였다. 마찬가지로 항B형 인플루엔자 바이러스 NP 항체에 청색 라텍스 입자(CM/BL 셀라다인 제품)를 표지한 항B형 표지체를 조제하였다.
항A형 표지체와 항B형 표지체를 혼합하여 혼합액을 조제하였다. 크기가 3cm×1cm인 유리 섬유(33GLASS NO.10539766 Schleicher & Schuell 제품)에 1평방 센티미터당 50μL가 되는 양의 혼합액을 도포하고 온풍 하에서 잘 건조시켜 표지체 패드를 제작하였다. 그 후, 상기와 같이 제작한 막 담체(표면 처리한 막 담체(3)에 상당)의 검지 존(13y)에 가까운 쪽의 단부에 표지 물질 패드를 겹쳤다. 표지 물질 패드가 겹치는 막 담체의 폭(단부의 폭)은 2mm이었다. 표지 물질 패드가 겹치는 막 담체를 폭 5mm의 단책(短冊) 형상으로 커터로 재단하여 일체화된 막 담체 및 표지 물질 패드로 구성되는 액체 샘플 검사 키트를 제작하였다.
상기와 같이 제작된 액체 시료 검사 키트의 단부에 액체 시료(액체 샘플)를 100μL 적하하였다. 액체 시료가 적하된 액체 시료 검사 키트의 단부는 검지 존에 가까운 쪽의 단부이었다. 액체 샘플은 희석 용액으로서 덴카 세이켄사 제품 퀵나비 Flu에 부속되어 있는 검체 부유액을 이용하여 A형 인플루엔자 바이러스 A/Beijing/32/92(H3N2)를 2×104배로 희석한 것과 B형 인플루엔자 바이러스 B/Shangdong/7/97을 2×103배로 희석한 것의 2종을 이용하였다.
검출의 판정은 액체 시료 적하 15분 경과 후에 검지 존(A형 인플루엔자 바이러스 검출부 및 B형 인플루엔자 바이러스 검출부)의 착색 라인(항A형 인플루엔자 NP 항체 및 항B형 인플루엔자 NP 항체를 고정한 부분)의 유무를 육안에 의해 관찰하여 행하였다. 적하 후의 액체 시료가 검사 키트 상에서 이동하는 모습을 평균 유속에 의해 확인하여 액체 샘플의 이동 유무를 확인하였다. 평균 유속은 액체 시료를 액체 시료 검사 키트의 단부에 적하하여 액체 시료가 막 담체에 흐르기 시작하고 나서 검지 존의 착색 라인에 도달하기까지의 시간으로부터 산출하였다.
판정 결과 A/Beijing/32/92(H3N2)를 2×104배로 희석한 것을 이용한 경우는 A형 검지 존에만 색 변화를 확인할 수 있고, B/Shangdong/7/97을 2×103배로 희석한 것을 이용한 경우는 B형 검지 존에만 색 변화를 확인할 수 있었다.
다음으로 A형 인플루엔자 바이러스 A/Beijing/32/92(H3N2)의 희석 배율을 2×104부터 크게 하였을 때 시험 개시 15분 후에 착색 라인의 유무를 볼 수 없게 되는 배율을 구하여 A형 육안 판정 가능한 한계 배율로 하였다. 다음으로 B형 인플루엔자 바이러스 B/Shangdong/7/97의 희석 배율을 2×103부터 크게 하였을 때에 착색 라인의 유무를 볼 수 없게 되는 배율을 구하여 B형 육안 판정 가능한 한계 배율로 하였다.
[실시예 1-2]
실시예 1-1에서의 미세 구조를 지름이 100μm, 높이가 100μm인 원뿔형의 볼록부, 표면 평균 거칠기 0.094μm로 한 것 이외에는 실시예 1-1과 같은 조건으로 액체 샘플 검사 키트를 제작하였다.
[실시예 1-3]
실시예 1-1에서의 미세 구조를 지름이 500μm, 높이가 500μm인 원뿔형의 볼록부, 표면 평균 거칠기 0.109μm로 한 것 이외에는 실시예 1-1과 같은 조건으로 액체 샘플 검사 키트를 제작하였다.
[실시예 1-4]
실시예 1-1에서의 미세 구조를 지름이 1000μm, 높이가 100μm인 원뿔형의 볼록부, 표면 평균 거칠기 0.121μm로 한 것 이외에는 실시예 1-1과 같은 조건으로 액체 샘플 검사 키트를 제작하였다.
[실시예 1-5]
실시예 1-1에서의 미세 구조를 지름이 100μm, 높이가 10μm인 원뿔형의 볼록부, 표면 평균 거칠기 0.094μm로 한 것 이외에는 실시예 1-1과 같은 조건으로 액체 샘플 검사 키트를 제작하였다.
[실시예 1-6]
실시예 1-1에서의 미세 구조를 지름이 100μm, 높이가 200μm인 원뿔형의 볼록부, 표면 평균 거칠기 0.120μm로 한 것 이외에는 실시예 1-1과 같은 조건으로 액체 샘플 검사 키트를 제작하였다.
[실시예 1-7]
실시예 1-1에서의 미세 구조를 지름이 100μm, 높이가 100μm인 원뿔형의 볼록부, 표면 평균 거칠기 0.048μm로 한 것 이외에는 실시예 1-1과 같은 조건으로 액체 샘플 검사 키트를 제작하였다.
[실시예 1-8]
실시예 1-1에서의 미세 구조를 지름이 100μm, 높이가 100μm인 원뿔형의 볼록부, 표면 평균 거칠기 0.015μm로 한 것 이외에는 실시예 1-1과 같은 조건으로 액체 샘플 검사 키트를 제작하였다.
[실시예 1-9]
실시예 1-1에서의 미세 구조를 지름이 100μm, 높이가 100μm인 원뿔형의 볼록부, 표면 평균 거칠기 0.27μm로 한 것 이외에는 실시예 1-1과 같은 조건으로 액체 샘플 검사 키트를 제작하였다.
[실시예 1-10]
실시예 1-1에서의 미세 구조를 지름이 100μm, 높이가 100μm인 원뿔형의 볼록부, 표면 평균 거칠기 6.8μm로 한 것 이외에는 실시예 1-1과 같은 조건으로 액체 샘플 검사 키트를 제작하였다.
[실시예 1-11]
실시예 1-1에서의 미세 구조를 지름이 100μm, 높이가 100μm인 원뿔형의 볼록부, 미세 구조끼리의 최근접 거리를 100μm, 표면 평균 거칠기 0.095μm로 한 것 이외에는 실시예 1-1과 같은 조건으로 액체 샘플 검사 키트를 제작하였다.
[실시예 1-12]
실시예 1-1에서의 미세 구조를 지름이 100μm, 높이가 100μm인 원뿔형의 볼록부로 하고, 미세 구조끼리의 최근접 거리를 500μm, 표면 평균 거칠기 0.058μm로 한 것 이외에는 실시예 1-1과 같은 조건으로 액체 샘플 검사 키트를 제작하였다.
[비교예 1-1]
실시예 1-1에서의 미세 구조를 지름이 100μm, 높이가 100μm인 원뿔형의 볼록부, 표면 평균 거칠기 0.002μm로 한 것 이외에는 실시예 1-1과 같은 조건으로 액체 샘플 검사 키트를 제작하였다.
[비교예 1-2]
실시예 1-1에서의 미세 구조를 지름이 100μm, 높이가 100μm인 원뿔형의 볼록부, 표면 평균 거칠기 17μm로 한 것 이외에는 실시예 1-1과 같은 조건으로 액체 샘플 검사 키트를 제작하였다.
상기 실시예 1-1~1-12 및 비교예 1-1~1-2에서 얻어진 액체 샘플 검사 막 담체 및 액체 샘플 검사 키트의 평가 결과를 표 1에 나타낸다.
Figure 112019071064798-pct00001
표 1의 결과로부터 본 실시형태에 의한 액체 시료 검사 키트는 유로 중의 미세 구조의 높이, 미세 구조의 지름, 미세 구조끼리의 최근접 거리, 애스펙트비를 적절한 범위의 값으로 함으로써 모세관 흐름을 발생시키는 것이 나타났다. 미세 구조에서의 표면 평균 거칠기를 적절한 범위의 값으로 함으로써 검지 존의 항체 담지량을 증가시켜 검출 물질을 고감도로 검출할 수 있는 것이 나타났다.
[실시예 1-13~1-24]
이용하는 입자를 착색 라텍스 입자에서 형광 라텍스 입자(micromer-F 형광 라텍스 입자 재료 폴리스티렌 코어프런트사 제품)로 변경하고, 시험 개시 10분 후에 착색 라인의 유무를 면역크로마토 리더(C11787 하마마츠 포토닉스 주식회사 제품)로 판독할 수 없게 되는 배율(형광 판정 가능한 한계 배율), 즉 S/N 비가 10 이하를 나타내는 배율을 구하였다. 미세 구조의 지름, 미세 구조의 최근접 거리, 미세 구조의 높이, 애스펙트비는 표 2에 나타내는 값으로 하였다. 그 이외의 내용은 실시예 1-1~1-12와 같이 행하였다.
상기 실시예 1-13~1-24에서 얻어진 액체 시료 검사 키트용 막 담체, 액체 시료 검사 키트의 평가 결과를 표 2에 나타낸다.
Figure 112019071064798-pct00002
본 실시형태는 막 담체 표면의 표면 평균 거칠기를 제어함으로써 담지할 수 있는 검출 물질의 양을 늘릴 수 있어 검출 감도를 향상시킬 수 있다.
본 실시형태는 피검출 물질이 검출되었음을 광학적으로 검출 가능한 면역크로마토그래피법에 있어서 재료의 표면 평균 거칠기를 컨트롤함으로써 검지 존의 시그널을 증강시켜 고감도의 판정이 가능한 액체 시료 검사 키트를 제공한다.
[실시예 2-1]
<막 담체의 준비>
폴리스티렌 시트(덴카 주식회사 제품 덴카 스티렌시트, 막두께 300μm)에 열 임프린트를 실시하여 미세 구조의 바닥면의 지름(이하, 미세 구조의 지름이나 지름이라고 하기도 함) 10μm, 미세 구조의 높이(이하, 높이라고 하기도 함) 10μm의 원뿔형의 볼록부(8)가 미세 구조끼리의 최근접 거리를 5μm로 하여 도 3과 같은 삼각 배열 형식으로 나열된 막 담체(3)를 제작하였다. 제작한 막 담체의 미세 구조의 끝으로부터 0.7~1.0cm의 부분에만 에너지 조사할 수 있도록 금속판으로 마스크한 후 UV를 조사하여 산소 원자수비(산소 원자수/(탄소 원자수+질소 원자수+산소 원자수)) 0.35의 막 담체를 제작하였다. UV 처리시에 UV의 광량, 강도, 파장, 조사 시간, UV 조사 에너지를 변경함으로써 산소 원자수비를 조정하였다.
금속판은 0.7~1.0cm의 부분에 공극을 마련하고 막 담체를 노출시켰다. 마스크하는 방법으로서는 막 담체에 금속판을 배치하는 방법을 이용하였다. 이와 같이 하여 표면 처리한 막 담체(3)를 얻었다. 도 8에서 0.7~1.0cm의 부분은 검지 존(3y), 금속판은 차폐물(14)에 상당한다.
<산소 원자수비의 산출>
각 원자의 반정량값을 XPS에 의해 구하였다. 측정 장치는 Thermo SCIENTIFIC사 제품, K-ALPHA를 이용하였다. 측정 조건에 관하여 X선원으로서 모노크로미터 부착된 Al-Kα선, 대전 중화는 저속 전자와 저속 Ar+ 이온의 동축 조사형의 듀얼 빔, 검출 각도는 90°, 출력: 36W, 측정 영역은 약 400μm×200μm, 패스 에너지는 50eV, 데이터는 0.1eV/step, 50msec의 조건 하에서 도입하여 적산 횟수 5회, 측정 범위는 이하에서 행하였다. 탄소 C1s 스펙트럼: 279~298eV, 산소 O1s 스펙트럼: 525~545eV, 질소 N1s 스펙트럼: 392~410eV. 얻어진 스펙트럼의 결합 에너지 보정을 C1s 스펙트럼에서의 C-C 결합(284.8eV)으로 행하였다. 결합 에너지 보정을 행한 상기 기재된 스펙트럼에 대해 이하의 범위에서 Shirley법을 이용하여 백그라운드(BG)를 빼고 하기와 같이 수정하였다. 탄소 C1s 스펙트럼: 281~292eV, 산소 O1s 스펙트럼: 526~536eV, 질소 N1s 스펙트럼: 395~403eV. 상기 측정 범위에서 얻어진 피크에서 BG를 빼고 산출된 각 원자의 피크 면적(신호 강도)을 보정 계수(상대 감도 계수, 투과 함수, 운동 에너지 보정)로 나누고 보정 후의 면적의 합계가 100이 되도록 계산하였다. 얻어진 각 값을 각각 탄소 원자수, 질소 원자수, 산소 원자수로 하고, 산소 원자수비(산소 원자수/(탄소 원자수+질소 원자수+산소 원자수))를 산출하였다.
<검출 물질의 세팅>
막 담체의 표면 처리를 실시한 부분(검지 존(3y)에 상당)에 항A형 인플루엔자 NP 항체의 부유액 및 항B형 인플루엔자 NP 항체의 부유액을 선폭 1mm로 도포하고(도포량 3μL) 온풍 하에서 잘 건조시켰다. 이와 같이 하여 항A형 인플루엔자 NP 항체 및 항B형 인플루엔자 NP 항체를 검지 존(3y)에 고정하였다.
<표지 물질의 세팅>
정제 항A형 인플루엔자 바이러스 NP 항체(상기와 별도의 항체) 및 정제 항B형 인플루엔자 바이러스 NP 항체(상기와 별도의 항체)를 사용하였다. 항A형 인플루엔자 바이러스 NP 항체에 입자경 0.394μm의 적색 라텍스 입자(CM/BL 셀라다인 제품)를 공유 결합으로 표지하고, 당, 계면활성제 및 단백질을 포함한 트리스 완충액에 라텍스 입자의 농도가 0.025w/v%가 되도록 현탁하고 초음파 처리를 행하여 충분히 분산 부유시킨 항A형 표지체를 조제하였다. 마찬가지로 항B형 인플루엔자 바이러스 NP 항체에 청색 라텍스 입자(CM/BL 셀라다인 제품)를 표지한 항B형 표지체를 조제하였다.
항A형 표지체와 항B형 표지체를 혼합하여 혼합액을 조제하였다. 크기가 3cm×1cm인 유리 섬유(33GLASS NO.10539766 Schleicher & Schuell 제품)에 1평방 센티미터당 50μL가 되는 양의 혼합액을 도포하고 온풍 하에서 잘 건조시켜 표지체 패드를 제작하였다. 그 후, 상기와 같이 제작한 막 담체(표면 처리한 막 담체(3)에 상당)의 검지 존(3y)에 가까운 쪽의 단부에 표지 물질 패드를 겹쳤다. 표지 물질 패드가 겹치는 막 담체의 폭(단부의 폭)은 2mm이었다. 표지 물질 패드가 겹치는 막 담체를 폭 5mm의 단책 형상으로 커터로 재단하여 일체화된 막 담체 및 표지 물질 패드로 구성되는 액체 시료 검사 키트를 제작하였다.
상기와 같이 제작된 액체 시료 검사 키트의 단부에 액체 시료(액체 샘플)를 100μL 적하하였다. 액체 시료가 적하된 액체 시료 검사 키트의 단부는 검지 존에 가까운 쪽의 단부이었다. 액체 시료는 이하와 같이 2종을 조제하였다. 검출 물질로서 A형 인플루엔자 바이러스 A/Beijing/32/92(H3N2)와 B형 인플루엔자 바이러스 B/Shangdong/7/97을 이용하였다. 희석 용액으로서 덴카 세이켄 주식회사 제품 퀵나비 Flu에 부속되어 있는 검체 부유액을 이용하였다. A형 인플루엔자 바이러스 A/Beijing/32/92(H3N2)를 검체 부유액으로 2×104배로 희석한 것을 액체 시료 A로 하였다. B형 인플루엔자 바이러스 B/Shangdong/7/97을 검체 부유액으로 2×103배로 희석한 것을 액체 시료 B로 하였다. 액체 시료 A와 액체 시료 B는 각각 개별적으로 적하하였다.
검출의 판정은 액체 시료 적하 15분 경과 후에 검지 존(A형 인플루엔자 바이러스 검출부 및 B형 인플루엔자 바이러스 검출부)의 착색 라인(항A형 인플루엔자 NP 항체 및 항B형 인플루엔자 NP 항체를 고정한 부분)의 유무를 육안에 의해 관찰하여 행하였다. 적하 후의 액체 시료가 검사 키트 상에서 이동하는 모습을 보고 액체 시료의 이동 유무를 확인하였다.
판정 결과 A/Beijing/32/92(H3N2)를 2×104배로 희석한 것을 이용한 경우는 A형 검지 존에만 색 변화를 확인할 수 있고, B/Shangdong/7/97을 2×103배로 희석한 것을 이용한 경우는 B형 검지 존에만 색 변화를 확인할 수 있었다.
다음으로 A형 인플루엔자 바이러스 A/Beijing/32/92(H3N2)의 희석 배율을 2×104부터 크게 하였을 때 시험 개시 15분 후에 착색 라인의 유무를 볼 수 없게 되는 배율을 구하였다. 다음으로 B형 인플루엔자 바이러스 B/Shangdong/7/97의 희석 배율을 2×103부터 크게 하였을 때에 착색 라인의 유무를 볼 수 없게 되는 배율을 구하였다.
[실시예 2-2]
실시예 2-1의 미세 구조를 지름이 100μm, 높이가 100μm인 원뿔형의 볼록부로 한 것 이외에는 실시예 2-1과 같은 조건으로 액체 샘플 검사 키트를 제작하였다.
[실시예 2-3]
실시예 2-1의 미세 구조를 지름이 500μm, 높이가 500μm인 원뿔형의 볼록부로 한 것 이외에는 실시예 2-1과 같은 조건으로 액체 샘플 검사 키트를 제작하였다.
[실시예 2-4]
실시예 2-1의 미세 구조를 지름이 1000μm, 높이가 100μm인 원뿔형의 볼록부로 한 것 이외에는 실시예 2-1과 같은 조건으로 액체 샘플 검사 키트를 제작하였다.
[실시예 2-5]
실시예 2-1의 미세 구조를 지름이 100μm, 높이가 10μm인 원뿔형의 볼록부로 한 것 이외에는 실시예 2-1과 같은 조건으로 액체 시료 검사 키트를 제작하였다.
[실시예 2-6]
실시예 2-1의 미세 구조를 지름이 100μm, 높이가 200μm인 원뿔형의 볼록부로 한 것 이외에는 실시예 2-1과 같은 조건으로 액체 시료 검사 키트를 제작하였다.
[실시예 2-7]
실시예 2-1의 미세 구조를 지름이 100μm, 높이가 100μm인 원뿔형의 볼록부로 하고, 산소 원자수비를 0.12로 한 것 이외에는 실시예 2-1과 같은 조건으로 액체 시료 검사 키트를 제작하였다.
[실시예 2-8]
실시예 2-1의 미세 구조를 지름이 100μm, 높이가 100μm인 원뿔형의 볼록부로 하고, 산소 원자수비를 0.05로 한 것 이외에는 실시예 2-1과 같은 조건으로 액체 시료 검사 키트를 제작하였다.
[실시예 2-9]
실시예 2-1의 미세 구조를 지름이 100μm, 높이가 100μm인 원뿔형의 볼록부로 하고, 산소 원자수비를 0.01로 한 것 이외에는 실시예 2-1과 같은 조건으로 액체 시료 검사 키트를 제작하였다.
[실시예 2-10]
실시예 2-1의 미세 구조를 지름이 100μm, 높이가 100μm인 원뿔형의 볼록부로 하고, 미세 구조끼리의 최근접 거리를 100μm로 한 것 이외에는 실시예 2-1과 같은 조건으로 액체 시료 검사 키트를 제작하였다.
[실시예 2-11]
실시예 2-1의 미세 구조를 지름이 100μm, 높이가 100μm인 원뿔형의 볼록부로 하고, 미세 구조끼리의 최근접 거리를 500μm로 한 것 이외에는 실시예 2-1과 같은 조건으로 액체 시료 검사 키트를 제작하였다.
[실시예 2-12]
실시예 2-1의 미세 구조를 지름이 100μm, 높이가 100μm인 원뿔형의 볼록부로 하고, 산소 원자수비를 0.50으로 한 것 이외에는 실시예 2-1과 같은 조건으로 액체 시료 검사 키트를 제작하였다.
[비교예 2-1]
실시예 2-1의 미세 구조를 지름이 100μm, 높이가 100μm인 원뿔형의 볼록부로 하고, UV 조사를 행하지 않고 산소 원자수비를 0.005로 한 것 이외에는 실시예 2-1과 같은 조건으로 액체 시료 검사 키트를 제작하였다.
상기 실시예 2-1~2-12 및 비교예 2-1에서 얻어진 액체 시료 검사 키트용 막 담체, 액체 시료 검사 키트의 평가 결과를 표 3에 나타낸다.
Figure 112019071064798-pct00003
[비교예 2-2]
실시예 2-1의 미세 구조를 지름이 100μm, 높이가 100μm인 원뿔형의 볼록부로 하고, 산소 원자수비를 0.50으로 한 것 이외에는 실시예 2-1과 같은 조건으로 액체 시료 검사 키트를 제작하였다.
상기 비교예 2-2에서 얻어진 액체 시료 검사 막 담체의 평가 결과를 표 4에 나타낸다. 액체 시료로서 바이러스를 포함하지 않는 액체 시료를 사용하였다. 실시예 2-2, 실시예 2-12에 대해서도 마찬가지로 실시하였다.
Figure 112019071064798-pct00004
표 3~4의 결과로부터 본 실시형태에 의한 액체 시료 검사 키트는 모세관 흐름을 발생시키는 것이 나타났다. 본 실시형태는 산소 원자수비를 적절한 범위의 값으로 함으로써 검출 물질을 고감도로 검출할 수 있어 오검출의 가능성이 작은 것이 나타났다(예를 들어 실시예 2-2와 실시예 2-7~2-9와 실시예 2-12를 참조). 본 실시형태는 유로 중의 미세 구조의 높이를 적절한 범위의 값으로 함으로써 검출 물질을 고감도로 검출할 수 있는 것이 나타났다(예를 들어 실시예 2-2와 실시예 2-4를 참조). 산소 원자수비가 작으면 고감도의 판정이 불가능하였다(비교예 2-1). 산소 원자수비가 크면 오검출되었다(비교예 2-2).
[실시예 2-13~2-24]
이용하는 입자를 착색 라텍스 입자에서 형광 라텍스 입자(micromer-F 형광 라텍스 입자 재료 폴리스티렌 코어프런트사 제품)로 변경하고, 시험 개시 10분 후에 착색 라인의 유무를 면역크로마토 리더(C11787 하마마츠 포토닉스 주식회사 제품)로 판독할 수 없게 되는 배율(형광 판정 가능한 한계 배율), 즉 S/N 비가 10 이하를 나타내는 배율을 구하였다. 미세 구조의 지름, 미세 구조의 최근접 거리, 미세 구조의 높이, 애스펙트비는 표 5에 나타내는 값으로 하였다. 그 이외의 내용은 실시예 2-1~2-12와 같이 행하였다.
상기 실시예 2-13~2-24에서 얻어진 액체 시료 검사 키트용 막 담체, 액체 시료 검사 키트의 평가 결과를 표 5에 나타낸다.
Figure 112019071064798-pct00005
본 실시형태는 피검출 물질이 검출되었음을 육안으로 확인 가능한 면역크로마토그래피법에 있어서 검지 존의 산소 원자수를 컨트롤함으로써 검지 존의 시그널을 증강시켜 고감도의 판정이 가능한 액체 시료 검사 키트를 제공한다.
검사 키트용 막 담체는 단시간에 양산하기 때문에 재료에 대한 표면 처리량이 비교적 높아 표면의 산소 원자수비가 높은 경향이 있었다. 본 실시형태는 예를 들어 산소 원자수비를 특정함으로써 피검출 물질을 포함하지 않는 용액을 전개하였을 때에 표지 물질이 검출 물질과 반응하여 오검출될 가능성이 작다는 효과를 가진다. 예를 들어 본 실시형태는 검지 존의 표면의 산소 원자수비를 높임으로써 검지 존의 항체 고착량을 증가시켜 검출 물질을 고감도로 검출할 수 있다.
본 실시형태의 액체 시료 검사 키트는 단시간에 고감도의 검사를 실시할 수 있기 때문에 일회용 가능한 POCT 시약에 유용하다.
2 유로
3 미세 구조가 설치된 막 담체
3x 적하 존
3y 검지 존(검출부)
4, 4a, 4b, 4c, 4d 볼록부의 바닥면에서의 대표 길이(볼록부의 바닥면의 지름)
5 최근접 미세 구조간 거리
6, 6a, 6b, 6c, 6d 볼록부의 높이
7, 7a, 7b, 7c, 7d 미세 구조
8, 8a, 8b, 8c, 8d 볼록부
9 평탄부
10, 10a, 10b, 10c, 10d 볼록부의 바닥면
14 차폐부
18 액체 시료용의 검사 키트
18a 하우징
18b 제1 개구부
18c 제2 개구부
19 볼록부의 중심
20 볼록부의 중심을 통과하는 직선
20d 볼록부의 중심을 통과하는 직선이 길이
d 액체 시료가 흐르는 방향(수송 방향)

Claims (10)

  1. 유로와 검지 존을 구비하고,
    상기 유로의 바닥면에 미세 구조가 설치되며,
    상기 미세 구조를 구성하는 볼록부의 표면 평균 거칠기가 0.005~10.0μm인 막 담체.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 검지 존의 표면에는 탄소 원자 및 질소 원자 중 적어도 한쪽의 원자와 산소 원자가 존재하고 있고, 상기 각 원자의 원자수의 합계에 대한 상기 산소 원자수비(상기 산소 원자수/(상기 탄소 원자수+상기 질소 원자수+상기 산소 원자수))가 0.01~0.50인 막 담체.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 미세 구조를 구성하는 볼록부의 높이가 5~1000μm인 막 담체.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 미세 구조를 구성하는 볼록부의 바닥면의 지름이 5~1000μm인 막 담체.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 미세 구조를 구성하는 볼록부끼리의 최근접 거리가 상기 유로 내에서 0~500μm인 막 담체.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 미세 구조를 구성하는 볼록부의 애스펙트비가 0.1~10인 막 담체.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 막 담체가 액체 시료 중의 피검출 물질을 검출하는 검사 키트용 막 담체인 막 담체.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 검지 존이 상기 피검출 물질을 검출하였을 때에 색변화를 나타내는 막 담체.
  9. 청구항 7에 있어서,
    상기 피검출 물질을 검출하였을 때에 색변화를 발생시키는 검출 물질이 상기 검지 존에 고정되어 있는 막 담체.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 기재된 막 담체를 갖는 액체 시료 검사 키트.
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