CN107110858A - 免疫层析试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种不需要专用分析装置的实现高灵敏度的测定的免疫层析试剂盒。所述免疫层析试剂盒的外壳(9)内具备：检验用试纸条(1)；第1罐(40)，配置于送液用垫(4)的下方，并封入有第1扩增液(41)；及第2罐(50)，配置于吸收垫(5)的上方，并封入有第2扩增液(51)，所述检验用试纸条(1)具备：不溶性载体(2)，使试样液展开；标记保持垫(3)，包含修饰有可以与被检物质结合的第1物质的标记物质；送液用垫(4)，将第1扩增液(41)送至不溶性载体(2)；及吸收垫(5)，与不溶性载体(2)的另一端接触而配置，在不溶性载体(2)的标记保持垫(3)与吸收垫(5)之间，从标记保持垫侧依次具有包含与被检物质结合的第2物质的检查区域(L1)、包含能够与第1物质结合的物质的确认区域(L2)及包含与第1扩增液进行反应的物质的扩增指标区域(L3)。

Description

免疫层析试剂盒
技术领域
本发明涉及一种进行用于提高检测灵敏度的信号扩增操作的免疫层析试剂盒。
背景技术
在免疫测定方法中，免疫层析法的操作简单且可以在短时间内进行测定，由此通常作为简易的被检物质检测方法而被广泛利用。
在免疫层析法中，为了避免尽管包含被检物质，却因灵敏度低而未被检测出并显示假阴性的问题，提出有使检测信号扩增的技术。作为使检测信号扩增的方法，已知有使用催化扩增的溶液和进行扩增的溶液这两种溶液的方法。尤其，使包含银离子的溶液及包含银离子还原剂的溶液与包括金属胶体或金属硫化物等的标记进行反应而敏化的方法，作为以高灵敏度简便地测定被检物质的量的技术而备受期待。这种利用扩增的免疫层析法记载于专利文献1～4等。
在上述检测信号的扩增方法中，需要控制供给如包含银离子还原剂的溶液那样的催化扩增的溶液和如包含银离子的溶液那样的进行扩增的溶液这两种溶液的定时、及供给溶液的方法和供给位置。若不规定溶液的流动方向和溶液的供给定时，则无法正常地进行扩增反应，或者背景信号增大，有时无法适当地检测被检物质。从而，为了以高精度控制供给两种溶液的定时、方法、位置而使用专用装置来控制测定，这在保障重复再现性等的精度方面是优选的。
在专利文献1中，采用将进行扩增的溶液的展开方向设为相对于被检体溶液的展开方向为90°的方法，但未提及关于溶液的供给定时的详细内容。另一方面，在专利文献2中公开了通过规定上述溶液的供给定时而可以进行再现性良好且高灵敏度的检测的专用分析装置。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2011-99724号公报
专利文献2：日本特开2012-103150号公报
专利文献3：日本特开2013-213803号公报
专利文献4：日本特开2014-066674号公报
发明内容
发明要解决的技术课题
然而，如专利文献2中所记载的分析装置在紧急灾害时等电力基础设施停止的状况、及未接通电力的环境下无法使用。从而，在这种紧急时刻或者未设置有分析装置的环境下，即使根据利用多种溶液的扩增技术进行高灵敏度的测定，也存在无法实现良好的重复再现性和高精度的测定的问题。
为了信号扩增，有时在免疫层析载体上的欲扩增的部位被填充上述两种溶液中的第1溶液之后，供给第2溶液以进行扩增。在专利文献3中公开有如下色谱试剂盒：其为了防止因第2溶液的供给定时的偏差而产生扩增不良，以能够容易确认色谱载体上的欲扩增的部位被填充第1溶液的方式设置有用于检测第1溶液的区域。
并且，在专利文献4中公开有如下方法：在与专利文献3相同结构的色谱试剂盒中，通过规定被检试样对色谱载体的添加和第1溶液的添加定时而可以进行正常的扩增反应。
另一方面，在专利文献3、4中记载的色谱试剂盒中，用于信号扩增的第1溶液及第2溶液构成为从设置在内含色谱试剂盒的色谱载体的外壳上的填充孔注入，第1溶液及第2溶液在外壳内未构成为一体。
然而，作为免疫层析试剂盒，若作为至少在测定中所需化学物质的用于扩增的溶液在试剂盒中未构成为一体，则在如上述紧急灾害时、各种基础设施停止的状况、未接通电力的环境和未设置有装置的环境等中，难以实现高灵敏度的测定。
本发明的第1方式是鉴于上述情况而完成的，其目的在于提供一种实现不需要专用分析装置的高灵敏度的测定的免疫层析试剂盒。
并且，在进行如上述信号扩增的免疫层析法中，需要将试样液、用于扩增的两种溶液供给到免疫层析载体，与不进行扩增的测定方法的情况相比，被供给的溶液量更多。从而，根据免疫层析试纸条的长度和吸收液体的垫(吸收垫)的吸水力，存在导致检验时间变得过长的问题。在病院等诊所进行测定的POCT(即时检验，Point of care testing)中，并不希望导致检验时间变长。
本发明的第2方式是鉴于上述情况而完成的，其目的在于提供一种在适当的检验时间内实现不需要专用分析装置的高灵敏度的测定的免疫层析试剂盒。
用于解决技术课题的手段
本发明的第1方式的免疫层析试剂盒为检测试样液中的被检物质的免疫层析试剂盒，其具备：
检验用试纸条，其具备：不溶性载体，使试样液展开；标记保持垫，包含修饰有第1物质的标记物质，该第1物质可以与固定在不溶性载体上的被检物质结合；送液用垫，与不溶性载体的一端接触而配置，并将第1扩增液送至不溶性载体；及吸收垫，与不溶性载体的另一端接触而配置，在不溶性载体的标记保持垫与吸收垫之间，从标记保持垫侧依次具有包含与被检物质结合的第2物质的检查区域、包含可以与第1物质结合的物质的确认区域、包含与第1扩增液进行反应的物质的扩增指标区域；
第1罐，配置于送液用垫的下方，并封入有第1扩增液；
第2罐，配置于吸收垫的上方，并封入有第2扩增液；及
外壳，内含检验用试纸条、第1罐及第2罐，并具有面向标记保持垫的试样液滴注用开孔。
另外，在此，第2扩增液为与第1扩增液不同的溶液，与第1扩增液一同作用于标记物质而发挥对来自标记的信号进行扩增的效果。
本发明的第1方式的免疫层析试剂盒，优选将外壳设为包括：上部壳体，具有开口；下部壳体，具有配置检验用试纸条的容纳部；及中间部件，配置于上部壳体及下部壳体之间，中间部件具有罐容纳部，该罐容纳部收容第2罐，在底面具备用于使第2扩增液流下来的孔。
在上述发明中，优选第1罐及第2罐分别具有具备片材部件的一面。在此，片材部件设为包括通过外部的按压作用而有可能破裂的片材。
此时，优选在中间部件的罐容纳部内具备使第2罐的片材部件破裂的突起部，该突起部朝向第2罐的片材部件，
并具备可动部件，该可动部件使第2罐相对于突起部相对移动，直至片材部件通过突起部而破裂的位置。
在此，“相对移动”是指可以使第2罐向突起部移动，也可以使突起部向第2罐移动，另外，也可以使第2罐及突起部双方朝向彼此而移动。
在本发明的第1方式的免疫层析试剂盒中，优选第1罐的具备片材部件的一面朝向送液用垫而配置，
并具备可动部件，该可动部件隔着送液用垫而配置在与第1罐的片材部件对置的位置，由来自外部的按压力按压送液用垫而使其位移，从而使第1罐的片材部件破裂，由此将送液用垫压入第1罐的内部。
在本发明的第1方式的免疫层析试剂盒中，优选标记保持垫的至少两边被薄膜状固定部件覆盖而固定于不溶性载体，标记保持垫的面向外壳的试样液滴注用开孔的区域未被薄膜状固定部件覆盖。
在本发明的第1方式的免疫层析试剂盒中，优选将第1扩增液设为银离子用还原剂溶液，将第2扩增液设为包含银离子的溶液。
在此，第1扩增液尤其优选为包含2价铁离子的溶液。
在本发明的第1方式的免疫层析试剂盒中，优选扩增指标区域中所包含的、与第1扩增液进行反应的物质是经由氢离子进行反应的物质。
并且，作为标记保持垫中所包含的、修饰有第1物质的标记物质，优选为金属胶体，该第1物质可以与固定在不溶性载体上的被检物质结合。
本发明的第2方式的免疫层析试剂盒为检测试样液中的被检物质的免疫层析试剂盒，其具备：
检验用试纸条，其具备：不溶性载体，使试样液展开；标记保持垫，包含修饰有第1物质的标记物质，该第1物质可以与固定在不溶性载体上的被检物质结合；送液用垫，与不溶性载体的一端接触而配置，并将第1扩增液送至不溶性载体；及吸收垫，与不溶性载体的另一端接触而配置，在不溶性载体的标记保持垫与吸收垫之间具有包含与被检物质结合的第2物质的检查区域；
第1罐，配置于送液用垫的下方，并封入有第1扩增液；
第2罐，配置于吸收垫的上方，并封入有第2扩增液；及
外壳，内含检验用试纸条、第1罐及第2罐，
外壳具备：下部壳体，具备配置有检验用试纸条的容纳部；上部壳体，与下部壳体嵌合；及流路形成部件，配置于上部壳体及下部壳体之间，
流路形成部件具有在与不溶性载体的表面之间形成将滴注不溶性载体上的第2扩增液引导至检查区域上的间隙的一面，
吸收垫的吸水力为45μL/分钟以上且90μL/分钟以下，
在检验用试纸条中，将送液用垫侧设为上游，且将吸收垫侧设为下游时，不溶性载体的一端与吸收垫的上游侧的端部的距离为44mm以上且64mm以下，
流路形成部件的上述一面的上游侧的端部与标记保持垫的下游侧的端部的距离为1mm以上且19mm以下。
另外，在此，第2扩增液是与第1扩增液不同的溶液，与第1扩增液一同作用于标记物质而发挥将来自标记的信号进行扩增的效果。
在本发明的第2方式的免疫层析试剂盒中，优选将第2扩增液引导至检查区域上的上述间隙为0.01mm以上且1.00mm以下。
在本发明的第2方式的免疫层析试剂盒中，优选标记保持垫的上游侧的端部与送液用垫的下游侧的端部的距离为12mm以上且30mm以下。
在本发明的第2方式的免疫层析试剂盒中，优选不溶性载体的一端与吸收垫的上游侧的端部的距离为49mm以上且59mm以下。
在本发明的第2方式的免疫层析试剂盒中，优选吸收垫的吸水力为65μL/分钟以上且75μL/分钟以下。
在本发明的第2方式的免疫层析试剂盒中，优选在不溶性载体上的检查区域与吸收垫之间，从检查区域侧依次具有包含可以与第1物质结合的物质的确认区域、及包含与第1扩增液进行反应的物质的扩增指标区域。
上述扩增指标区域中所包含的与第1扩增液进行反应的物质，优选为经由氢离子进行反应的物质。
在本发明的第2方式的免疫层析试剂盒中，优选具备配置于上部壳体与下部壳体之间的中间部件，中间部件具有罐容纳部，该罐容纳部收容第2罐，且在底面具备用于将第2扩增液滴注不溶性载体上的孔。
另外，中间部件优选与流路形成部件形成为一体。
在本发明的第2方式的免疫层析试剂盒中，优选构成为将第2扩增液比不溶性载体的检查区域更靠下游侧滴注。
在本发明的第2方式的免疫层析试剂盒中，优选将第1扩增液设为银离子用还原剂溶液，将第2扩增液设为包含银离子的溶液。
在本发明的第2方式的免疫层析试剂盒中，优选将第1扩增液设为包含2价铁离子的溶液。
并且，作为标记保持垫中所包含的、修饰有第1物质的标记物质，优选为金属胶体，该第1物质可以与固定在不溶性载体上的被检物质结合。
发明效果
本发明的第1方式的免疫层析试剂盒在外壳内具备封入有用于信号扩增的第1扩增液的第1罐及封入有第2扩增液的第2罐和检验用试纸条，因此为了从外部注入第1扩增液及第2扩增液，无需另外准备，而仅用1个免疫层析试剂盒便能够进行基于信号扩增的高灵敏度的检测。并且，由于具备在不溶性载体中包含与第1扩增液进行反应的物质的扩增指标区域，且能够肉眼识别第2扩增液的供给定时，因此即使没有专用分析装置，也能够正常地进行扩增反应。从而，本发明的免疫层析试剂盒在不具备专用分析装置或者无法使用分析装置的紧急时刻及灾害时刻等尤其有用。
并且，构成为在送液用垫的下方具备第1扩增液罐，因此通过将送液用垫浸渍于第1扩增液中，使送液用垫内部因毛细管现象而渗透，从而能够使第1扩增液的送液向标记保持垫侧展开，因此能够使第1扩增液从送液用垫的内部展开。与从送液用垫的上方滴注扩增液的情况相比，能够使第1扩增液在不溶性载体的内部可靠地渗透，能够得到更高的扩增效果。
本发明的第2方式的免疫层析试剂盒在外壳内具备封入有用于信号扩增的第1扩增液的第1罐及封入有第2扩增液的第2罐和检验用试纸条，因此为了从外部注入第1扩增液及第2扩增液，无需另外准备，而仅用1个免疫层析试剂盒便能够进行基于信号扩增的高灵敏度的检测。本发明的免疫层析试剂盒在不具备专用分析装置或者无法使用分析装置的紧急时刻及灾害时刻等尤其有用。
并且，构成为在送液用垫的下方具备第1扩增液罐，因此通过将送液用垫浸渍于第1扩增液中，使送液用垫内部因毛细管现象而渗透，从而能够使第1扩增液的送液向标记保持垫侧展开，因此能够使第1扩增液从送液用垫的内部展开。与从送液用垫的上方滴注扩增液的情况相比，能够使第1扩增液在不溶性载体的内部可靠地渗透，能够得到更高的扩增效果。
外壳具备：下部壳体，具备配置有检验用试纸条的容纳部；上部壳体，与下部壳体嵌合；及流路形成部件，配置于上部壳体及下部壳体之间，流路形成部件在与不溶性载体的表面之间具有形成将滴注不溶性载体上的第2扩增液引导至检查区域上的间隙的一面，吸收垫的吸水力为45μL/分钟以上且90μL/分钟以下，在检验用试纸条中，将送液用垫侧设为上游，且将吸收垫侧设为下游时，不溶性载体的一端与吸收垫的上游侧的端部的距离为44mm以上且64mm以下，流路形成部件的上述一面的上游侧的端部与标记保持垫的下游侧的端部的距离为1mm以上且19mm以下，因此检验时间不会变得过长，而能够实现适合于POCT的检验时间。
附图说明
图1是表示本发明的免疫层析试剂盒的一实施方式的形式的分解概略立体图。
图2是表示与检验用试纸条及流路形成部件形成为一体的中间部件的位置关系的概略侧视图。
图3A是表示免疫层析试剂盒的外壳的试样液滴注用开孔部分的概略俯视图。
图3B是表示免疫层析试剂盒的外壳的试样液滴注用开孔部分的概略俯视图。
图4是表示图1所示的免疫层析试剂盒的可动部件按压前的概略剖视图。
图5是表示图1所示的免疫层析试剂盒的可动部件按压后的概略剖视图。
图6是表示图1所示的免疫层析试剂盒的中间部件的上部壳体侧的结构的概略立体图。
图7是表示图1所示的免疫层析试剂盒的中间部件的下部壳体侧的结构的概略立体图。
图8是表示图1所示的免疫层析试剂盒的中间部件的下部壳体侧的面的概略仰视图。
图9是表示免疫层析试剂盒的第1可动部件的一方式的概略剖视图。
图10是表示免疫层析试剂盒的第1可动部件的另一方式的概略剖视图。
具体实施方式
以下，利用附图对本发明的实施方式进行说明，但本发明并不限定于此。另外，为了便于辨识，附图中的各构成要素的比例尺等与实际的适当地有改变。另外，以下进行说明的本实施方式为本发明的第1实施方式，并且，也是本发明的第2实施方式。
图1是本发明的实施方式所涉及的免疫层析试剂盒100的分解概略立体图。
如图1所示，本实施方式的免疫层析试剂盒100构成为在外壳9中包含：检验用试纸条1，包含用于使试样液展开的不溶性载体2；第1罐40，封入有用于信号扩增的第1扩增液；及第2罐50，封入有第2扩增液。外壳9具备：下部壳体10，具备载置不溶性载体2的不溶性载体容纳部11；上部壳体20，与下部壳体10嵌合；及流路形成部件65，配置于上部壳体20与下部壳体10之间。另外，在本实施方式中，上部壳体20在检验用试纸条1上的规定位置具有试样液滴注用开孔21。
图2是表示检验用试纸条1及流路形成部件65的配置的概略剖视图。
流路形成部件65具有在与不溶性载体2的表面2S之间形成间隙60的一面62，该间隙60将滴注不溶性载体2上的第2扩增液引导至后述的检查区域上，在本实施方式中，与具有罐容纳部32的中间部件30形成为一体，该罐容纳部32收容第2罐50，并且在底面具备用于将第2扩增液51滴注不溶性载体2上的扩增液填充孔34。另外，具有罐容纳部32的中间部件30与流路形成部件65可以分体构成，但优选通过构成为一体而能够抑制组件数量。以下，在本实施方式中如下说明：中间部件30包含流路形成部件65，即，流路形成部件65构成中间部件30的一部分。即，在本实施方式中，外壳9由以下部分构成：下部壳体10，具有载置检验用试纸条1的试纸条容纳部11；上部壳体20，在检验用试纸条1上的规定位置具有试样液滴注用开孔21；及中间部件30，配置于下部壳体10与上部壳体20之间。
在图1中，为了便于理解内部，外壳9分为上部壳体20、中间部件30及下部壳体10的组件而示出，但实际使用时，使这些组件嵌合而作为一体来使用。
如图2所示，检验用试纸条1具备：不溶性载体2，使试样液展开；标记保持垫3，包含被第1物质修饰的标记物质，该第1物质可以与固定在不溶性载体2上的被检物质结合；送液用垫4，与不溶性载体2的一端2a接触而配置，并将第1扩增液41送至不溶性载体2；及吸收垫5，与不溶性载体2的另一端接触而配置。不溶性载体2固定于背面粘接片7上而被支撑。而且，不溶性载体2在标记保持垫3与吸收垫5之间，从标记保持垫3侧依次具有包含可以与被检物质结合的第2物质的检查区域L1、包含可以与第1物质结合的物质的确认区域L2、包含与第1扩增液进行反应的物质的扩增指标区域L3。
另外，在本说明书中，有时将通过形成检查区域L1、确认区域L2及扩增指标区域L3而成的不溶性载体2称作色谱载体。并且，在本说明书中，如图1、图2所记载，将送液用垫4侧定义为上游，将吸收垫5侧定义为下游。并且，根据图1的纸面上的上下方向来定义上部、下部。
在本实施方式中，作为不溶性载体2的上述一端2a的上游侧的端部(以下为上游端2a)与吸收垫5的上游侧的端部(上游端)5a的距离A为44mm以上且64mm以下。若该距离A为44mm以上，则扩增后的灵敏度良好，若为64mm以下，则可以将检验时间设为15分钟以下，因此优选。更优选的范围为49mm以上且59mm以下。
在本实施方式中，吸收垫5的吸水力为45μL/分钟以上且90μL/分钟以下。作为吸收垫5，为了吸收被供给到不溶性载体2的试样液、第1扩增液41及第2扩增液51且在短时间内完成检验而需要使用吸收速度较快的(吸水力较大的)垫。若为45μL/分钟以上，则可以将检验时间设为15分钟以下，若为90μL/分钟以下，则无需过度提高作为吸收垫的厚度便能够构成紧凑的试剂盒，因此优选。更优选的范围为65μL/分钟以上且75μL/分钟以下。另外，关于吸水力的定义及测定方法，后面将进行记载。
流路形成部件65的与不溶性载体2的表面2S之间形成间隙60的一面62的上游侧的端部(上游端)64与标记保持垫3的下游侧的端部(下游端)3b的距离B为1mm以上且19mm以下。若该距离B为1mm以上，则能够抑制滴注标记保持垫3上的试样液进入到间隙60，并能够避免产生扩增异常，因此优选，若为19mm以下，则可以将检验时间设为15分钟以内，因此优选。另外，在此，一面62的上游端64与由不溶性载体2的表面2S与流路形成部件65的一面62形成的间隙60的上游端一致。
关于流路形成部件65的一面62与不溶性载体2的表面2S的间隙60的距离D，为了可以以无浓度不均而均匀且迅速地实施第2扩增，需要由第2扩增液均匀地润湿该间隙60内部，且由第2扩增液迅速地填充间隙60内部。为了实现这一目标，优选将该间隙60的距离D设为0.01mm以上且1.00mm以下。
标记保持垫3的上游侧的端部(上游端)3a与送液用垫4的下游侧的端部(下游端)4b的距离C优选为12mm以上且30mm以下。若该距离C为12mm以上，则不会因试样液和第1扩增液41进行混合而产生扩增的不均，因此优选，若为30mm以下，则能够缩短检验时间，因此优选。
作为不溶性载体2，例如能够使用硝酸纤维素膜等。并且，固定不溶性载体2的背面粘接片7是粘附不溶性载体2的面为粘接面的片材状基材。
不溶性载体中的试样液的移动速度作为毛细管流动速度(毛细管流量)是由通过测定水在4cm的不溶性载体2中流动时所需时间而求出的移动1cm所需时间来定义的。在本实施方式中，优选使用毛细管流量为120～180秒/cm的不溶性载体。若为120秒/cm以上，则可以使检查区域上的第2物质与被检物质充分进行反应，以及使可以与修饰标记物质的第1物质结合的物质与第1物质充分进行反应，因此优选。另一方面，若毛细管流量为180秒/cm以下，则试样液可以在不溶性载体中迅速移动，可以进行检验时间在15分钟以内完成的迅速处理，因此优选。
不溶性载体2优选在长边方向上具有50mm以上且70mm以下左右的长度。
标记保持垫3被固定于不溶性载体2的长边方向中央部。标记物质例如可以使用直径50nm的金胶体(EM.GC50，BBI公司制造)。标记物质的表面被与被检物质结合的物质修饰，由此可以形成与被检物质的结合体。
标记物质并不限定于上述物质，而能够使用在通常的色谱法中使用的金属硫化物、用于免疫凝聚反应的着色粒子等，尤其优选金属胶体。作为金属胶体，可以举出金胶体、银胶体、铂胶体、铁胶体、氢氧化铝胶体及它们的复合胶体等，尤其，在适当的粒径下，金胶体在显示红色的方面是优选的，银胶体在显示黄色方面是优选的，其中，金胶体最优选。
如图2所示，标记保持垫3优选其上游侧和下游侧两边通过包括封入薄膜等的薄膜状固定部件6被固定于不溶性载体2。未被薄膜状固定部件6覆盖的部分相当于点加被检物质溶液(试样液)的区域。另外，固定标记保持垫3的两边并不限定于图2所示的上游侧和下游侧，也可以是不溶性载体在长度方向上平行的两边。并且，标记保持垫3的被薄膜状固定部件6覆盖而固定于不溶性载体的边不仅限于两边，也可以是3边或整个4边。
通过将标记保持垫3至少在两边固定于不溶性载体而提高在制作检验用试纸条1的阶段中的操作性，而且在输送时、使用时等，不会因在受到意外的冲击时偏移而导致测定精度变差。并且，由薄膜状固定部件6覆盖至少两边而固定于不溶性载体2，由此滴注标记保持垫3的试样液(被检物质溶液)不会从标记保持垫3溢出，而能够使所有试样液经由标记保持垫3转移到不溶性载体2，因此可以将试样液有效地提供到测定中。
另外，优选规定上部壳体20及检验用试纸条1的位置，以便检验用试纸条1的面向上部壳体20的试样液滴注用开孔21的区域的整个区域成为标记保持垫3。并且，如图3A所示，将标记保持垫3固定于不溶性载体2上的薄膜状固定部件6，尤其优选以从上部壳体20的试样液滴注用开孔21可辨识的标记保持垫3的区域不会被薄膜状固定部件6覆盖的方式来确定薄膜状固定部件6的粘附位置。如图3B所示，与从上部壳体20的试样液滴注用开孔21可辨识的标记保持垫3被一部分薄膜状固定部件6覆盖的情况相比，可以将从开孔21滴注的试样液全部滴注到标记保持垫3上，可以将试样液中的所有被检物质毫无浪费地进行标记。
另外，即使薄膜状固定部件6向流路形成部件65侧延伸配置，由于薄膜状固定部件为不溶性物质，因此试样液也不会通过薄膜状固定部件而进入到流路形成部件65与不溶性载体2的间隙60。
检查区域L1是包含与被检物质结合的第2物质且与被检物质结合的标记物质经由被检物质而被补充的标记物质补充区域。例如欲将流感A型病毒或其生物标记物作为被检物质来进行检测的情况下，优选例如由抗流感A型单克隆抗体(Anti-Influenza A SPTN-57307，Medix Biochemica公司制造)通过因物理吸附呈线状固定的抗体固定线而构成检查区域L1的方式。
若被检物质与经由第1物质而结合标记物质的复合体到达该检查区域L1，则第2物质与被检物质进行特异性结合，标记物质经由被检物质和第1物质而被补充。另一方面，未构成与被检物质的复合体的标记物质不会被补充到检查区域L1而通过。
确认区域L2为如下区域：包含可以与第1物质结合的物质，并从标记保持垫3与试样液一同在不溶性载体2中展开，在检查区域L1中通过的标记物质经由第1物质而被补充，用于确认试样液的展开结束。例如在欲将流感A型病毒或其生物标记物作为被检物质来进行检测的情况下，优选例如抗小鼠IgG抗体(抗小鼠IgG(H+L)，小兔F(ab')2，商品编号566-70621，Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造)因物理吸附而呈线状被固定的方式。
扩增指标区域L3为如下区域：包含与第1扩增液41进行反应的物质，与第1扩增液41进行反应而显色或者颜色发生变化，由此表示第1扩增液41展开至该区域，成为第2扩增液51的滴注定时的指标。例如作为第1扩增液41而使用硝酸铁水溶液和柠檬酸(Wako PureChemical Industries,Ltd.制造，038-06925)的混合水溶液的情况下，优选由溴甲酚绿(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造)呈线状固定的显色剂固定线构成扩增指标区域L3的方式。此时，若第1扩增液41到达扩增指标区域L3，则区域L3从绿色变色成橙色。该变色能够作为检查区域L1及确认区域L2通过第1扩增液41被充分填充的指标而获取。
与第1扩增液41进行反应的物质是用于检测第1扩增液41的显色剂，例如优选使用与离子进行反应而显色的化合物。关于第1扩增液41的详细内容，将进行后述，但例如在第1扩增液41包含2价铁离子(Fe2+)的情况下，作为该显色剂，能够使用与Fe2+离子进行反应而显色的化合物。作为与Fe2+离子进行反应而显色的化合物，能够使用通过与Fe2+离子进行络合而能够显色的化合物。作为与Fe2+离子进行反应而显色的化合物的具体例，能够使用具有菲咯啉骨架的化合物[例如1,10-菲咯啉、5-甲基菲咯啉、5-硝基菲咯啉、红菲咯啉(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)、或红菲咯啉二磺酸等]，或者具有联吡啶骨架的化合物[例如2,2'-联吡啶等]，能够优选使用具有菲咯啉骨架的化合物。并且，在包含被检物质的水溶液与第1扩增液41的pH不同的情况下，为了检测第1扩增液41，优选使用通过氢离子而产生结构变化而色调发生变化的试剂。尤其，在第1扩增液41为酸性(小于pH7，氢离子浓度高)的情况下，作为酸性区域用pH指示剂，优选将作为公知的显色剂的与H+离子进行反应而显色的化合物(例如甲基橙、甲基红、刚果红及甲基黄等重氮类显色剂，百里酚蓝、溴甲酚绿、溴甲酚紫及溴百里酚蓝等磺内酯类显色剂)等，配合包含扩增试剂的水溶液的pH适当地进行选择并使用。上述化合物中，更优选使用1,10-菲咯啉、红菲咯啉或溴甲酚绿。
另外，关于构成免疫层析试剂盒100的各组件的结构及组件被一体化的结构及其使用方式进行说明。
图4及图5是表示免疫层析试剂盒100的信号扩增前及扩增后的方式的概略剖视图，图6是面向中间部件30的上表面(上部壳体侧)的立体图，图7及图8是面向中间部件30的下表面(下部壳体侧)的概略立体图及概略仰视图。
封入有第1扩增液41的第1罐40如下构成：例如在由树脂材料构成的一面具有开口的容器42中被填充有扩增液41，并由可以破裂的片材部件43来覆盖该容器42的开口而进行封入。
封入有第2扩增液51的第2罐50也同样如下构成：例如在由树脂材料构成的一面具有开口的容器52中被填充有第2扩增液51，并由可以破裂的片材部件53来覆盖该容器52的开口而进行封入。
作为第1罐40中的片材部件43及第2罐50中的片材部件53，适合使用铝箔和铝层压片等。
作为使金属胶体等金属类标记物质的信号扩增的方法，优选使用如下方法：使银离子及银离子用还原剂与标记物质接触，并通过还原剂来还原银离子而生成银粒子，该银粒子将标记物质作为核而沉积在标记物质上，由此使基于标记物质的信号扩增(以下为银扩增)。
为了实现银扩增，作为第1扩增液41，只要使用包含银离子用还原剂的还原剂溶液即可，作为第2扩增液51，只要使用包含银离子的溶液即可。
作为第1扩增液41的优选方式的银离子用还原剂，只要能够将银离子还原成银，则即使是无机材料、有机材料等任何材料或混合物也能够使用。
作为无机还原剂，能够举出利用Fe2+、V2+、Ti3+等金属离子可以改变化合价的还原性金属盐、还原性金属络合物盐。在使用无机还原剂的情况下，需要通过将被氧化的离子进行络合或还原而去除或排除对还原性的影响。例如在使用Fe2+作为还原剂的情况下，使用柠檬酸和EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid：乙二胺四乙酸)来形成作为低氧化物的Fe3+的络合物，能够排除对还原性的影响。在本系统中，优选使用这种无机还原剂，尤其优选Fe2+的金属盐。
关于还原剂的另一例，能够参考日本特开2014-66674号公报等记载。
作为第2扩增液51而优选的包含银离子的溶液，在溶剂中溶解有含有银离子的化合物。作为含有银离子的化合物，能够使用有机银盐、无机银盐或银络合物。优选无机银盐或银络合物。作为无机银盐，可以使用相对于水等溶剂的溶解度较高的含有银离子的化合物，可以举出硝酸银、乙酸银、乳酸银、丁酸银及硫代硫酸银等。尤其优选为硝酸银。作为银络合物，优选在具有羟基和砜基等水溶性基团的配体上配位的银络合物，可以举出羟基硫醚银等。
如图1及图4所示，下部壳体10与中间部件30通过形成于中间部件30的卡合突起部36插入到卡合口16而被卡合，该卡合口16为形成于下部壳体10的卡合口且与卡合突起部36对应。而且，在下部壳体10与中间部件30卡合的状态下，下部壳体10与上部壳体20通过形成于上部壳体20的4角的嵌合突起部29插入到嵌合口19而被嵌合，该嵌合口19为形成于下部壳体10的嵌合口且分别与那些嵌合突起部29对应。
在下部壳体10中，作为配置检验用试纸条1的容纳部，设置有载置不溶性载体2的不溶性载体容纳部11及在其下游侧载置吸收垫5的吸收垫容纳部13。并且，在不溶性载体容纳部11的上游侧设置有容纳第1罐40的第1罐容纳部12。
检验用试纸条1载置于下部壳体10内的容纳部，在第1罐容纳部12中，第1罐40以具有其片材部件43的面成为上表面的方式配置，在其片材部件43的表面配置有检验用试纸条1的送液用垫4。
如图1～图8所示，中间部件30具有罐容纳部32，该罐容纳部32收容第2罐50，且在底面具备用于使第2扩增液51滴注不溶性载体2上的扩增液填充孔34。并且，罐容纳部32内的面向第2罐50的片材部件53的位置上，设置有使片材部件53破裂的突起部33。在本例中，在罐容纳部32的上方，第2罐50配置成具有其片材部件53的面成为下表面，在与其片材部件53对置的罐容纳部32的底面设置有突起部33。也可以如下构成：在将中间部件30安装于下部壳体10时，为了使第2罐50的片材部件53不被突起部33破裂，在第2罐50与中间部件30的罐容纳部32的底面之间插入例如弹簧部件，以使第2罐50向上部壳体20侧被施力。
并且，在与中间部件30的扩增液填充孔34相邻的部分设置有扩增液填充孔的肋35，在罐容纳部32的背面侧具备吸收垫按压突起37，该吸收垫按压突起37在与下部壳体10卡合时成为吸收垫5的压板。而且，与该肋35连续而形成有流路形成部件65的一面62作为中间部件30的一部分。另外，中间部件30配置成该一面62位于检查区域L1、确认区域L2及扩增指标区域L3的上方，该一面62由透明的材料形成，并兼作观察窗61的一面，以便可以从上方对检查区域L1、确认区域L2及扩增指标区域L3进行辨识。
在上部壳体20的上表面的中间部，如前述设置有试样液滴注用开孔21，从该开孔21将试样液滴注检验用试纸条1的标记保持垫3上。以开孔21与标记保持垫3的位置对齐的方式调整标记保持垫3的位置，由此可以将试样液可靠地点加到标记保持垫3上。
上部壳体20的与中间部件30的观察窗61对应的位置被设为开口28，以不妨碍从离子观察窗61的辨识性的方式构成。
并且，上部壳体20的与下部壳体10的罐容纳部12对应的位置，设置有包括较细的矩形开口的插口23，具有可插入于该插口23中的柱状部22a的第1可动部件22以该柱状部22a的前端插入到插口23的状态被保持。第1可动部件22构成为能够通过所施加的力而向下部进行压入，通过将可动部件22进行压入而按压送液用垫4以使其位移，从而使封入有第1扩增液的第1罐40的片材部件破裂以将送液用垫压入第1罐内部，能够使送液用垫浸渍于第1扩增液。该状态下，通过送液用垫而可以使第1扩增液在不溶性载体上展开。
在可动部件22的柱状部22a的前端插入到插口23的状态下且直至施加外力进行下压为止，作为不扎破罐片材部件而维持保持状态的机构，例如只要具有如下结构即可：在柱状部22a的前端设置有不容易从上部壳体20拔出的拉拔防止机构，且例如在上部壳体20的上表面与可动部件22的顶部22h之间具备弹簧部件。
另外，对第1可动部件22施加作用力的定时优选在不溶性载体2上的标记保持垫3上滴注试样液之后随即30秒内，进一步优选随即。通过以这种定时将第1扩增液41提供到不溶性载体2，能够利用吸收垫5的根据毛细管现象的吸引力使试样液向检查区域L1、确认区域L2、扩增指标区域L3的方向展开，同样地可以使第1扩增液41向检查区域L1、确认区域L2及扩增指标区域L3的方向展开。
如上所述，通过采用将第1罐40配置于送液用垫4的下方的结构，可以将第1扩增液41内置于免疫层析试剂盒，并且可以供给足够量的扩增液41，可以使扩增条件稳定。
在上部壳体20的与中间部件30的罐容纳部32对应的位置设置有包括十字形开口的插口25，柱状部24a具有与插口25大致相同形状的剖面，具有该柱状部24a的第2可动部件24的柱状部24a的前端以插入到插口25的状态而被保持。第2可动部件24以通过施加作用力而能够向下部压入的方式构成，通过将可动部件24进行压入而使第2罐50朝向突起部33移动，直至第2罐50的片材部件53因中间部件30的罐容纳部32内的突起部33而破裂的位置。由此，突起部33扎破第2罐50的片材部件53，可以将第2扩增液51供给到外部。从设置于中间部件30的罐容纳部32的底面的扩增液填充孔34，扩增液滴注到不溶性载体2的上部，从而可以将第2扩增液51供给到不溶性载体上的检查区域L1、确认区域L2及扩增指标区域L3。另外，此时，从扩增液填充孔34滴注到不溶性载体2的上部的第2扩增液51被填充到中间部件30与不溶性载体2的间隙，在间隙中通过之后被供给到检查区域L1、确认区域L2及扩增指标区域L3的上方，从而逐渐渗透于不溶性载体2。
在第2可动部件24的柱状部24a的前端插入到插口25的状态下且直至施加外力进行下压为止，作为以不下压第2罐50而维持保持状态的机构，与第1可动部件22的情况同样地，例如只要具有如下结构即可：在柱状部24a的前端设置有不容易从上部壳体20拔出的拉拔防止机构，且例如在上部壳体20的上表面与可动部件24的顶部之间具备弹簧部件。
另外，在本实施方式中，第2可动部件24使第2罐50向设置于中间部件30的突起部33移动，但第2可动部件只要使第2罐相对于突起部相对移动即可，也可以是如下结构：不使第2罐移动，而使突起部移动，由此使第2罐的片材部件因突起部而破裂；或者使第2罐及突起部这两者移动，从而使片材部件因突起部而破裂。例如可以考虑如下结构等：在中间部件的容纳部配置的突起部与第2可动部件连接，通过从外部按压第2可动部件而使突起部向片材部件移动。
第2罐的片材部件也可以未必一定位于朝向检验用试纸条的位置，只要是被破裂而能够使从罐流出的第2扩增液从容纳部32底面的扩增液填充孔34滴注到不溶性载体2上的结构，则容纳第2罐及第2罐的容纳部的结构也并不限定于本实施方式的结构。
如图4所示，在外壳9的各部件被一体化的状态下，以标记保持垫3位于下部壳体10的大致中央部的方式定位有不溶性载体2，在其上游侧的一端配置有送液用垫4，在下游侧配置有吸收垫5，它们分别与一部分不溶性载体2重叠，以上部壳体20的试样液滴注注入用开孔21位于面向标记保持垫3的位置的方式调整检验用试纸条1的配置。送液用垫4的一端与不溶性载体2重叠，而另一端不与不溶性载体2重叠而延伸，该延伸部分配置成位于罐容纳部12所具备的第1罐40的上表面。
在吸收垫5与不溶性载体重叠的区域及检查区域L1、确认区域L2、扩增指标区域L3的上部配置有中间部件30。中间部件30的吸收垫按压突起37以限制吸收垫5的方式位于与不溶性载体2重叠的区域，如上所述，区域L1～L3位于中间部件30的观察窗61的下方，其一面62与不溶性载体2之间构成间隙60。上部壳体20的开口28位于观察窗61的上方。并且，第1可动部件22及第1可动部件22被插入的插口23位于送液用垫4的上方，第2可动部件24及第2可动部件24被插入的十字形插口25位于第2罐50的上方。
中间部件30的罐容纳部32的形状优选为与封入有第2扩增液51的第2罐50嵌合的结构。通过设成这种结构而可以提高将第2扩增液51供给到不溶性载体2时的供给量和供给速度的重复再现性。并且，通过采用从扩增液填充孔34将第2扩增液51供给到不溶性载体2上的结构，能够防止第2扩增液51向外部溢出。
并且，从不溶性载体2的下游侧上方供给第2扩增液51的结构，即试样液的展开方向、第1扩增液41的展开方向及第2扩增液51的展开方向在同一条直线上，因此用一个吸收垫5便可以吸收包含被检物质的试样液、第1扩增液41、第2扩增液51这三种溶液，可以实现紧凑的试剂盒的设计。
＜免疫层析检验方法＞
关于使用上述免疫层析试剂盒100的免疫层析检验方法简单地进行说明。
从试样液滴注用开孔21，将试样液滴注到标记保持垫3上。在试样液中包含有被检物质的情况下，在标记保持垫3中，被检物质与第1物质进行结合，由此经由第1物质而形成被检物质与标记物质的复合体，该复合体与试样液一同通过吸收垫5的吸引力因毛细管现象而向吸收垫5侧展开。与滴注该试样液的同时或者之后下压第1可动部件22，使送液用垫4位移，从而使第1罐40的片材部件43破裂，将送液用垫4浸渍于第1扩增液41中，将第1扩增液41进行送液。另外，下压第1可动部件22的定时优选设为从滴注试样液时起30秒内，尤其优选滴注试样液后随即。
到达检查区域L1的复合体与检查区域L1的第2物质进行结合并被捕捉。并且，未与被检物质进行结合的第1物质通过检查区域L1之后到达确认区域L2，与确认区域L2的与第1物质进行结合的物质进行结合并被捕捉。
第1扩增液41经由检查区域L1、确认区域L2而到达扩增指标区域L3。此时，扩增指标区域L3变色，由此能够肉眼辨识第1扩增液41到达扩增指标区域L3。在确认扩增指标区域L3的变色之后，下压第2可动部件24，从而将第2扩增液51供给到不溶性载体2上。在本实施方式中，从扩增液填充孔34比不溶性载体2上的区域L1～L3更靠下游侧滴注的第2扩增液51，渗透到流路形成部件65的一面62与不溶性载体2的表面2S的间隙60，从而通过该间隙60而被引导至检查区域L1。
将第2扩增液51供给到不溶性载体2之后等待反应结束，从观察窗61确认检查区域L1及确认区域L2的显色。通过检查区域L1的显色而可以确认被检物质的有无及其浓度的高低，通过确认区域L2的显色而能够确认测定被检物质的检验是否成功。检查区域L1及确认区域L2中的显色是通过扩增标记的信号而得到的，能够实现高灵敏度的检验。
如上所述，若使用本免疫层析试剂盒100，则无需使用专用分析装置等，而能够由该试剂盒单体以高精度进行检验。
以下，关于在可动部件22的柱状部22a的前端插入到插口23的状态下不会容易拔出且直至施加外力进行下压为止，不扎破罐的片材部件而维持保持的状态的机构的优选的具体方式，参考图9及图10进行说明。
首先，参考图9对第1方式进行说明。图9是表示免疫层析试剂盒100的可动部件22的周边的概略剖视图，图9A表示第1可动部件22下压前，图9B表示第1可动部件22下压后。
在可动部件22的柱状部22a的前端设置有从上部壳体20不容易拔出的拉拔防止突起22b。并且，在柱状部22a的顶部侧设置有移动防止突起22c，该移动防止突起22c在柱状部22a插入到外壳内规定深度为止时，限制可动部件22向上方移动。
设置于柱状部22a的这些突起22b及22c是朝向前端侧变细的突起部，当从变细的一侧开始插入到插口23时，因弹性而稍微收缩而能够容易进行插入，但一旦插入到外壳内之后，突起部的发散侧挂在上部壳体20上而不易从插口23拉拔。
在可动部件22下压前，用于仅使柱状部22a的前端22d插入到插口23中以避免向下方下降的机构，能够通过利用如图9A、图9B所示的弹簧部件22e的弹力而实现。
图10是图9中已进行说明的方式的局部设计变更例。在图10中，图10A是表示可动部件22下压前的状态的概略俯视图，图10B是概略俯视图图10A中的B-B线上的概略剖视图，图10C是表示可动部件22下压后的状态的概略剖视图。
关于可动部件22的柱状部22a所具备的拉拔防止突起22b及移动防止突起22c，与图9的相同。
在该设计变更例中，在可动部件22下压前，用于仅使柱状部22a的前端22d插入到插口23中以避免向下方下降的机构不同。在此，具备可拆卸的用于防止下压的夹具部件22f。在下压前，夹具部件22f以夹持柱状部22b的方式被插入于可动部件22的顶部22h与上部壳体20的上表面之间，当下压可动部件22时，在拉拔夹具部件22f的状态下下压可动部件22。结构比弹簧部件简单，在具备夹具部件22f的状态下，即使对可动部22施加作用力，可动部22也不会移动，因此即使在搬运时等受到一点冲击，第1罐的片材部件也不会因可动部件22而产生破裂，因此优选。
另外，在第2可动部件24的柱状部24a的前端被插入到插口25的状态下不容易拔出且直至施加外力进行下压为止，作为不使第2罐移动而维持保持状态的机构，同样也可以使用上述结构。
另外，在本发明的免疫层析试剂盒中也可以包含：内置包含辅助提取被检体的辅药等的被检体提取液的罐和内含被检体稀释液的罐、辅助保存试剂盒的干燥剂和除氧剂、处理说明书等包装说明书、及棉棒等被检体采集器具等在检验中所需成套器材或者其一部分。
实施例
以下，关于本发明的免疫层析试剂盒的实施例及比较例进行说明。实施例及比较例的免疫层析试剂盒是用于检测流感病毒抗原作为被检物质的流感病毒抗原检测用免疫层析试剂盒。
(1)免疫层析试剂盒的制作
(1-1)作为修饰有可以与被检物质结合的第1物质的标记物质的抗流感A型抗体修饰金胶体的制作
通过在直径50nm的金胶体溶液(商品编号：EM.GC50，BBI公司制造)9mL中添加50mmol/L的KH2PO4缓冲液(pH7.5)1mL而调整pH的金胶体溶液中，添加160μg/mL的抗流感A型单克隆抗体(Anti-Influenza A SPTN-5 7307，Medix Biochemica公司制造)溶液1mL进行了搅拌。在静放10分钟之后，添加1％聚乙二醇(PEG(polyethylene glycol)；重均分子量(Mw.)：20000，商品编号：168-11285，Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造)水溶液550μL进行搅拌，接着，添加10％牛血清白蛋白(BSA(Bovine serum albumin)；FractionV，商品编号：A-7906，SIGMA Corporation制造)的水溶液1.1mL进行了搅拌。对该溶液以离心加速度8000×g、4℃经30分钟进行离心(himacCF16RX，Hitachi,Ltd.制造)之后，留下1mL左右并去除上清液，由超声波清洗机对金胶体进行了再分散。之后，在20mL的金胶体保存液(20mmol/L Tris-HCl(Tris-盐酸)缓冲液(pH8.2)，0.05％PEG(Mw.20000)，150mmol/LNaCl，1％BSA)中进行分散，再次以8000×g、4℃经30分钟进行离心之后，留下1mL左右并去除上清液，由超声波清洗机对金胶体进行再分散，得到抗体修饰金胶体(50nm)溶液。
(1-2)作为标记保持垫的抗流感A型抗体修饰金胶体保持垫的制作
用水稀释在(1-1)中制作的流感A型抗体修饰金胶体，以使Tris-HCl缓冲液(pH8.2)的浓度成为20mmol/L，PEG(Mw.20000)的浓度成为0.05质量％，蔗糖的浓度成为5质量％，而且光路长度设为10mm时的金胶体的520nm的光学浓度成为0.1，并设为金胶体涂布液。将该涂布液分别以0.8mL均匀地涂布于以12mm×300mm进行切割的每一片玻璃纤维垫(Glass Fiber Conjugate Pad，Millipore公司制造)，并减压干燥24小时，由此得到流感A型抗体修饰金胶体保持垫。
(1-3)色谱载体的制作
作为不溶性载体2而使用以60mm×300mm进行切断的硝酸纤维素膜(存在塑料内衬，HiFlow Plus HF120，Millipore公司制造)，在该膜上，通过如下方法而形成检查区域L1、确认区域L2及扩增指标区域L3而制作出色谱载体。
从60mm×300mm的矩形硝酸纤维素膜的300mm的两个长边中的一边向另一边侧在15mm的位置，将以成为1.5mg/mL的方式进行制备的抗流感A型单克隆抗体(Anti-InfluenzaA SPTN-5 7307，Medix Biochemica公司制造)溶液呈线状进行涂布并设为检查区域L1。另外，从相同的一边向另一边侧在11mm的位置，将以成为0.2mg/mL的方式进行制备的抗小鼠IgG抗体(抗小鼠IgG(H+L)，小兔F(ab')2，商品编号566-70621，Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.制造)溶液呈线状进行涂布并设为确认区域L2。另外，从相同的一边向另一边侧在9mm的位置，将以30mmol/L进行制备的溴甲酚绿(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.制造)呈线状进行涂布并设为扩增指标区域L3。在分别进行涂布之后，用暖风式干燥机在50℃下经30分钟对硝酸纤维素膜进行了干燥。将粘连液(含有0.5质量％酪蛋白(来源于乳液，商品编号030-01505，Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造)的50mmol/L的硼酸缓冲液(pH8.5))500mL放入槽中，使膜浸渍并保持原状静放30分钟。然后，将硝酸纤维素膜转移到放入另一槽中的清洗及稳定液(包含0.5质量％蔗糖及0.05质量％胆酸钠的50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)缓冲液500mL中进行浸渍并保持原状静放30分钟。然后，从溶液中取出硝酸纤维素膜，在25℃的环境下干燥了24小时。
在本实施例中，抗流感A型抗体相当于与被检物质结合的第2物质，抗小鼠IgG抗体相当于可以与第1物质结合的物质，溴甲酚绿相当于与第1扩增液进行反应的物质。
(1-4)检验用试纸条的制作
在背面粘接片(60mm×300mm(NIPPN TechnoCluster,Inc.制造))上粘附了在(1-3)中制作的色谱载体(形成有检查区域L1、确认区域L2及扩增指标区域L3的不溶性载体2)。接着，在不溶性载体2的中央附近的规定部位配置在(1-2)中制作的作为标记保持垫3的金胶体抗体保持垫，利用宽度4mm的密封薄膜，将金胶体保持垫的两端以薄膜与金胶体保持垫重叠1.5mm的方式进行粘附而固定于不溶性载体2。将送液用垫4(以25mm×300mm进行切割的玻璃纤维垫(Glass Fiber Conjugate Pad，Millipore公司制造))，以送液用垫4与不溶性载体2重叠7mm的方式粘附于不溶性载体2的上游侧。将如此制作的部件，以相对于与300mm的长边垂直的方向平行且宽度成为5mm的方式，利用铡刀式切割机(CM4000，NIPPNTechnoCluster,Inc.制造)来进行切断，制作出60条检验用试纸条(但不包含吸收垫。)。
(1-5)扩增液的制作
(1-5-1)第1扩增液(还原剂溶液)的制作
在水290g中溶解了通过将硝酸铁(III)九水合物(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.制造，095-00995)溶解于水中而制作的1mol/L硝酸铁水溶液23.6mL、柠檬酸(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造，038-06925)13.1g。在完全溶解之后，利用搅拌器一边搅拌，一边添加硝酸(10重量％)36mL，并添加硫酸铵铁(II)六水合物(WakoPure Chemical Industries,Ltd.制造，091-00855)60.8g，将其设为作为第1扩增液41的还原剂溶液。
(1-5-2)第2扩增液(银离子溶液)的制作
在水66g中添加硝酸银溶液8mL(包含10g硝酸银)和1mol/L硝酸铁水溶液24mL。进而，将该溶液和将硝酸(10重量％)5.9mL、十二烷胺(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造，123-00246)0.1g、表面活性剂C12H25-C6H4-O-(CH2CH2O)50H 0.1g预先溶解于47.6g水的溶液进行混合，将其设为作为第2扩增液51的银离子溶液。
(1-6)吸收垫的制作
准备以12mm×10mm进行切割的玻璃纤维垫(玻璃滤纸，Advantech Co.,Ltd.制造)60片，设为各检验用试纸条的吸收垫5。
(1-7)免疫层析试剂盒组件的制作
图1中示出的构成外壳9的下部壳体10、上部壳体20、中间部件30以及外壳9所具备的第1可动部件22、第2可动部件24、容纳第1扩增液41的第1罐40、容纳第2扩增液51的第2罐50，通过将聚丙烯作为材料进行注射成型而分别制作。
以下，首先，关于第1发明的实施例及比较例(设为实施例1、2及比较例1、2)进行说明。
(1-8-1)实施例1的免疫层析试剂盒的制作
将下部壳体10、在(1-4)中制作的检验用试纸条和在(1-6)中制作的吸收垫，如图4所示进行了固定。接着，在第1罐40、第2罐50中分别填充在(1-5-1)、(1-5-2)中制作的第1扩增液、第2扩增液，并利用作为片材部件的铝箔进行封入，如图4所示，分别安装于下部壳体10、中间部件30。将第1可动部件22、第2可动部件24在上部壳体20上分别安装于插口23、插口25，如图4组装下部壳体10、中间部件30及上部壳体20而制作出免疫层析试剂盒。另外，此时，固定金胶体抗体保持垫的密封薄膜配置成从试样液滴注用开孔无法看到(参考图3A)。即，实施例1的免疫层析试剂盒构成为面向试样液滴注用开孔的区域成为未被标记保持垫的密封薄膜覆盖的区域。
(1-8-2)实施例2的免疫层析试剂盒的制作
在实施例1的免疫层析试剂盒的制作中，固定金胶体抗体保持垫的薄膜状固定部件设置成从被检物质滴注用开孔部可以看到(参考图3B)，除此以外，以相同的方式制作出实施例2的免疫层析试剂盒。
(1-8-3)比较例1的免疫层析试剂盒的制作
在(1-3)的色谱载体的制作中，并未利用密封薄膜将金胶体抗体保持垫固定于不溶性载体，即金胶体抗体保持垫未固定于不溶性载体，除了该点以外，以与(1-3)的记载相同的方式制作色谱载体，除此以外，以与实施例1相同的方式制作出比较例1的免疫层析试剂盒。
(1-8-4)比较例2的免疫层析试剂盒的制作
在(1-3)的色谱载体的制作中，未设定扩增指标区域(显色剂固定线)，除此以外，以与(1-3)的记载相同的方式制作色谱载体，除此以外，以与实施例1相同的方式制作出比较例2的免疫层析试剂盒。
(2)评价
(2-1)点加
将模拟阳性被检体(BD Flu Examine Control A+B-(Becton,Dickinson andCompany制造))，使用提取液(含有1质量％BIGCHAP的1％BSA-PBS)制作出稀释成2560倍的溶液，将40μL点加于抗流感A型抗体修饰金胶体保持垫。
(2-2)第1扩增液(还原剂溶液)的展开
在点加(2-1)的试样液之后随即下压第1可动部件，以使送液用垫位移，从而使送液用垫压入第1罐，由此使封入有第1扩增液的铝箔破裂，将送液用垫浸渍于第1罐中，由此利用毛细管现象将第1扩增液供给到色谱载体。
(2-3)银扩增
扩增指标区域L3从绿色变色成橙色之后，下压第2可动部件24，以使第2罐向中间部件30的罐容纳部的突起部移动，由此通过突起部而压破第2罐的密封第2扩增液的铝箔，从中间部件30的银离子溶液填充孔，将银离子溶液供给到色谱载体，从而进行银扩增反应。
另外，关于比较例2，在第1扩增液开始送液5～10分钟之后，下压第2可动部件24，以使第2罐向中间部件30的罐容纳部的突起部移动，由此通过突起部压破第2罐的密封第2扩增液的铝箔，从中间部件30的银离子溶液填充孔，将银离子溶液供给到色谱载体，从而进行银扩增反应。
(2-4)扩增成功率的计算
准备各实施例及比较例的免疫层析试剂盒，尝试进行10次上述(2-1)、(2-2)及(2-3)中所记载的处理，算出扩增成功率。若在检查区域L1及确认区域L2中识别出黑线，则设为扩增成功。
(2-5)检查区域的浓度值的计算
为了确认重复再现性，从扩增处理结束的各实施例及比较例的免疫层析试剂盒中取出色谱载体，利用LAS4000(FUJIFILM Corporation制造)拍摄检查区域L1的浓度，算出浓度差(Δ＝(检查区域L1的浓度)-(背景部的浓度))。而且，关于各实施例及比较例求出10次分量(N＝10)的浓度差的偏差。
将各实施例及比较例的差异及评价结果综合表示于表1中。
[表1]
将标记保持垫固定于不溶性载体，并将扩增指标区域设置于不溶性载体，由此银扩增反应的成功率增加，并且重复10次相同的检验时的浓度的偏差(CV：coefficient ofvariation)良好，可知测定精度较高。而且，配置成从试样液滴注用开孔无法看到固定金胶体抗体保持垫的密封薄膜，并设为从试样液滴注用开孔只能看到标记保持垫的未被密封薄膜覆盖的区域，由此明确可知浓度偏差(CV)进一步降低且可提高再现性。
在将金胶体保持垫未固定于不溶性载体的情况下，因垫偏移而有时会产生在不溶性载体的宽度方向展开的金胶体的浓度不均，测定浓度产生偏差，观察到CV的降低。在未设定扩增指标区域(显色剂固定线)的情况下，供给银离子溶液的定时变得不稳定，不产生预期扩增的概率提高，且检测精度降低。由这些结果确认了本发明的效果。
接着，关于第2发明的实施例及比较例(设为实施例11～20及比较例1～4。)进行说明。
(21)免疫层析试剂盒的制作方法
与上述(1)免疫层析试剂盒的制作方法大致相同，仅对与(1)的制作方法不同点进行说明。
在(1-3)色谱载体的制作中，使用硝酸纤维素膜(存在塑料内衬，HiFlow PlusHF135(毛细管流量＝135秒/cm)、Millipore公司制造)来代替硝酸纤维素膜(存在塑料内衬，HiFlow Plus HF120，Millipore公司制造)。
在(1-4)检验用试纸条的制作中，不溶性载体2上的标记保持垫3的位置设为标记保持垫3的上游端3a与送液用垫4的下游端4b的距离B成为12mm。
(21-8-1)实施例11的免疫层析试剂盒的制作
将下部壳体10、在(1-4)中制作的检验用试纸条及在(1-6)中制作的吸收垫5，如图4所示进行了固定。接着，在第1罐40及第2罐50中分别填充在(1-5-1)、(1-5-2)中制作的第1扩增液41、第2扩增液51，利用作为片材部件的铝箔进行密封，如图4所示，分别安装于下部壳体10及中间部件30。将第1可动部件22及第2可动部件24在上部壳体20上分别安装于插口23、25，并将下部壳体10、中间部件30及上部壳体20如图4进行组装，从而制作出免疫层析试剂盒。
本实施例11将不溶性载体2的上游端2a与吸收垫5的上游端5a的距离A设为54mm，将标记保持垫3的下游端3b与流路形成部件65的一面62的上游端64的距离B设为3mm。
(21-8-2)实施例12～14及比较例11～13的免疫层析试剂盒的制作
在上述实施例11的免疫层析试剂盒中，如下述表1所示，将不溶性载体2的上游端2a与吸收垫5的上游端5a的距离A进行变更，变更为吸水力不同的吸收垫5，除此以外，以与实施例11相同的结构及顺序制作出实施例12～14及比较例11～13的免疫层析试剂盒。
(21-8-3)实施例15、16及比较例14的免疫层析试剂盒的制作
在上述实施例11的免疫层析试剂盒的制作方法的工序(1-4)中，调整不溶性载体2上的固定标记保持垫3的位置，如下述表1所示，将标记保持垫3的下游端3b与流路形成部件65的一面62的上游端64的距离B进行变更，除此以外，以与实施例11相同的结构及顺序制作出实施例15、16及比较例14的免疫层析试剂盒。
(21-8-4)实施例17的免疫层析试剂盒的制作
在上述实施例14的免疫层析试剂盒的制作方法的工序(1-4)中，调整不溶性载体2上的固定标记保持垫3的位置，如下述表1所示，将标记保持垫3的下游端3b与流路形成部件65的一面62的上游端64的距离B进行变更，除此以外，以与实施例14相同的结构及顺序制作出实施例17的免疫层析试剂盒。
(21-8-5)实施例18～20的免疫层析试剂盒的制作
在上述实施例11的免疫层析试剂盒的制作方法的工序(1-4)中，调整粘贴送液用垫4的位置，将标记保持垫3的上游端3a与送液用垫4的下游端4b的距离C进行变更，除此以外，以与实施例1相同的结构及顺序制作出实施例18～19的免疫层析试剂盒。关于距离C，分别将实施例18设为10mm，将实施例19设为18mm，实施例20设为30mm。
(22)评价
(22-1)点加
将模拟阳性被检体(BD Flu Examine Control A+B-(Becton,Dickinson andCompany制造))，使用提取液(含有1质量％BIGCHAP的1％BSA-PBS)制作出稀释成2560倍的溶液，将40μL点加于抗流感A型抗体修饰金胶体保持垫。
(22-2)第1扩增液(还原剂溶液)的展开
在点加(22-1)的试样液之后随即下压第1可动部件22，以使送液用垫4位移，从而将送液用垫4压入第1罐40，由此使封入有第1扩增液41的铝箔破裂，将送液用垫4浸渍于第1罐40中，由此利用毛细管现象将第1扩增液41供给到色谱载体。
(22-3)显色时间的测定
在(22-2)中将把第1扩增液41供给到色谱载体之后随即扩增指标区域L3从绿色变色成橙色为止的时间作为显色时间进行了测量。
(22-4)扩增方法
在扩增指标区域L3从绿色变色成橙色之后，下压第2可动部件24，使第2罐50向中间部件30的罐容纳部32的突起部33移动，由此使第2罐50的封入有第2扩增液51的铝箔因突起部33而压破，将作为第2扩增液51的银离子溶液从中间部件30的扩增液填充孔34供给到色谱载体，从而进行银扩增反应。从扩增液填充孔34滴注的第2扩增液51被填充到流路形成部件65的一面62与不溶性载体2的间隙60，并通过毛细管现象而引导至检查区域L1，银扩增反应在几十秒内完成。
(22-5)检查区域的浓度值的计算
从扩增处理结束的各实施例及比较例的免疫层析试剂盒中取出色谱载体，并利用LAS4000(FUJIFILM Corporation制造)来拍摄检查区域L1的浓度，算出浓度差(ΔOD＝(检查区域L1的浓度)-(背景部的浓度))。显色时间的标准鉴于适合于POCT的检验时间将15分钟以下设为优选范围。
(22-6)吸收垫的吸水力的测定方法
在本说明书中，吸收垫的吸水力是由每1分钟的吸水量来定义的，具体而言，设为如下求出的吸水力。
将HiFlow Plus HF135(毛细管流量135秒/cm，Millipore公司制造)的膜，以20mm×20mm的大小进行切出，并使其吸收饱和量的水。该膜上放置纵长15mm×横宽10mm×高度2mm大小的吸收垫，该吸收垫上放置具有20mm×20mm的底面积的630g砝码的状态下按压10秒钟。10秒钟后回收吸收垫并测定了重量。计算吸收垫放到膜上前后的重量的增加量，即水的吸收量，求出每1分钟的吸水量作为吸收垫的吸水量。
(22-7)浓度不均的评价
关于浓度不均进行了感官评价。评价基准为如下。
A未产生浓度不均。
B稍微产生浓度不均，但不构成问题。
C产生浓度不均，实际使用中不容许。
关于实施例11～17及比较例11～14的免疫层析试剂盒，将结构上的差异及上述测定结果综合表示于下述表2中。另外，关于任意的实施例及比较例，通过流路形成部件65的一面62与不溶性载体2的表面2S而形成的间隙60的距离D均设为0.3mm。
由表2的结果明确可知吸收垫5的吸水力为45μL/分钟以上，当不溶性载体2的上游端2a与吸收垫5的上游端5a的距离A为44mm～64mm时，显色时间被限制在15分钟以下，不存在浓度不均而能够进行良好的检验。如比较例11、12，当吸水力小于45μL/分钟时，显色时间超过20分钟，成为适合于POCT的结果。如比较例13，若距离A过大，则导致第1扩增液的扩散中途停止，未产生显色本身。并且，如比较例4，在流路形成部件65的一面62的上游端64与标记保持垫3的下游端3b的距离B小于1.0mm的情况下，在将试样液点加到标记保持垫3时，试样液通过毛管力而进入到流路形成部件65与不溶性载体2的间隙60，产生浓度不均。即，明确可知存在将标记保持垫3的下游端3b与流路形成部件65的一面62的上游端64的距离B设为1.0mm以上的必要性。
另外，表3中综合表示实施例11、实施例18～20的结构上的差异及上述测定结果。
[表3]
由表3的结果可知，标记保持垫3的上游端3a与送液用垫4的下游端4b的距离C优选为12mm以上。如实施例18，在距离C小于12mm的情况下，试样液和第1扩增液以溶液状进行混合的比例增加，从而有时产生扩增的不均(浓度不均)。
符号说明
1-检验用试纸条，2-不溶性载体，2a-不溶性载体的一端(上游端)，3-标记保持垫，3a-标记保持垫的上游端，3b-标记保持垫的下游端，4-送液用垫，4b-送液用垫的下游端，5-吸收垫，5a-吸收垫的上游端，6-密封薄膜(薄膜状固定部件)，7-背面粘接片，9-外壳，10-下部壳体，11、13-容纳部，12-第1罐的容纳部，20-上部壳体，21-试样液滴注用开孔，22-第1可动部件，23-第1可动部件的插口，24-第2可动部件，25-第2可动部件的插口，30-中间部件，32-第2罐的容纳部，33-突起部，34-扩增液填充孔，40-第1扩增液用第1罐，41-第1扩增液，50-第2扩增液用第2罐，51-第2扩增液，60-间隙，61-观察窗，62-流路形成部件的一面，64-流路形成部件的上游端，65-流路形成部件，100-免疫层析试剂盒，L1-检查区域，L2-确认区域，L3-扩增指标区域。

Claims (23)

1.一种免疫层析试剂盒，其检测试样液中的被检物质，所述免疫层析试剂盒具备：
检验用试纸条，其具备：不溶性载体，其使所述试样液展开；标记保持垫，其包含修饰有第1物质的标记物质，该第1物质能够与固定在该不溶性载体上的所述被检物质结合；送液用垫，其与所述不溶性载体的一端接触而配置，并将第1扩增液送至所述不溶性载体；及吸收垫，其与所述不溶性载体的另一端接触而配置，在所述不溶性载体的所述标记保持垫与所述吸收垫之间，从所述标记保持垫侧起依次具有：包含与所述被检物质结合的第2物质的检查区域、包含能够与所述第1物质结合的物质的确认区域及包含与所述第1扩增液进行反应的物质的扩增指标区域；
第1罐，其配置于所述送液用垫的下方，封入有所述第1扩增液；
第2罐，其配置于所述吸收垫的上方，封入有第2扩增液；及
外壳，其内含所述检验用试纸条、所述第1罐及所述第2罐，并具有面向所述标记保持垫的试样液滴注用开孔。
2.根据权利要求1所述的免疫层析试剂盒，其中，
所述外壳具备：上部壳体，其具有所述试样液滴注用开孔；下部壳体，其具有配置有所述检验用试纸条的容纳部；及中间部件，其配置于所述上部壳体及所述下部壳体之间，
该中间部件具有罐容纳部，该罐容纳部收容所述第2罐，在该罐容纳部的底面具备用于使所述第2扩增液流下来的孔。
3.根据权利要求1或2所述的免疫层析试剂盒，其中，
所述第1罐及所述第2罐分别具有具备片材部件的一面。
4.根据权利要求1所述的免疫层析试剂盒，其中，
所述外壳具备：上部壳体，其具有所述试样液滴注用开孔；下部壳体，其具有配置有所述检验用试纸条的容纳部；及中间部件，其配置于所述上部壳体及所述下部壳体之间，
该中间部件具有罐容纳部，该罐容纳部收容所述第2罐，在该罐容纳部的底面具备用于使所述第2扩增液流下来的孔，
所述第1罐及所述第2罐分别具有具备片材部件的一面，
在所述中间部件的所述罐容纳部内具备使所述第2罐的所述片材部件破裂的突起部，该突起部面向所述第2罐的所述片材部件，
该免疫层析试剂盒具备可动部件，该可动部件使所述第2罐相对于所述突起部相对移动，直至所述片材部件因所述突起部而破裂的位置。
5.根据权利要求3或4所述的免疫层析试剂盒，其中，
所述第1罐的具备所述片材部件的一面面向所述送液用垫而配置，
该免疫层析试剂盒具备可动部件，该可动部件隔着所述送液用垫而配置在与所述第1罐的所述片材部件对置的位置处，通过来自外部的按压力按压所述送液用垫而使其位移，从而使所述第1罐的所述片材部件破裂，由此将所述送液用垫压入所述第1罐的内部。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫层析试剂盒，其中，
所述标记保持垫的至少两边被薄膜状固定部件覆盖而固定于所述不溶性载体，
所述标记保持垫的面向所述外壳的所述试样液滴注用开孔的区域未被所述薄膜状固定部件覆盖。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫层析试剂盒，其中，
所述第1扩增液为银离子用还原剂溶液，
所述第2扩增液为含有银离子的溶液。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的免疫层析试剂盒，其中，
所述第1扩增液为含有2价铁离子的溶液。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的免疫层析试剂盒，其中，
与所述第1扩增液进行反应的物质是经由氢离子进行反应的物质。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的免疫层析试剂盒，其中，
所述标记物质为金属胶体。
11.一种免疫层析试剂盒，其检测试样液中的被检物质，所述免疫层析试剂盒具备：
检验用试纸条，其具备：不溶性载体，其使所述试样液展开；标记保持垫，其包含修饰有第1物质的标记物质，该第1物质能够与固定在该不溶性载体上的所述被检物质结合；送液用垫，其与所述不溶性载体的一端接触而配置，并将第1扩增液送至所述不溶性载体；及吸收垫，其与所述不溶性载体的另一端接触而配置，在所述不溶性载体上的所述标记保持垫与所述吸收垫之间具有包含与所述被检物质结合的检查区域；
第1罐，其配置于所述送液用垫的下方，封入有所述第1扩增液；
第2罐，其配置于所述吸收垫的上方，封入有第2扩增液；及
外壳，其内含所述检验用试纸条、所述第1罐及所述第2罐，
所述外壳具备：下部壳体，其具备配置有所述检验用试纸条的容纳部；上部壳体，其与所述下部壳体嵌合；及流路形成部件，其配置于所述上部壳体及所述下部壳体之间，
所述流路形成部件具有在与所述不溶性载体的表面之间形成将滴注在该不溶性载体上的所述第2扩增液引导至所述检查区域上的间隙的一面，
所述吸收垫的吸水力为45μL/分钟以上且90μL/分钟以下，
在所述检验用试纸条中，将所述送液用垫侧设为上游，将所述吸收垫侧设为下游时，所述不溶性载体的所述一端与所述吸收垫的上游侧的端部之间的距离为44mm以上且64mm以下，
所述流路形成部件的所述一面的上游侧的端部与所述标记保持垫的下游侧的端部之间的距离为1mm以上且19mm以下。
12.根据权利要求11所述的免疫层析试剂盒，其中，
所述间隙为0.01mm以上且1.00mm以下。
13.根据权利要求11或12所述的免疫层析试剂盒，其中，
所述标记保持垫的上游侧的端部与所述送液用垫的下游侧的端部之间的距离为12mm以上且30mm以下。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的免疫层析试剂盒，其中，
所述不溶性载体的所述一端与所述吸收垫的上游侧的端部之间的距离为49mm以上且59mm以下。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的免疫层析试剂盒，其中，
所述吸收垫的吸水力为65μL/分钟以上且75μL/分钟以下。
16.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫层析试剂盒，其中，
在所述不溶性载体上的所述检查区域与所述吸收垫之间，从所述检查区域侧起依次具有包含能够与所述第1物质结合的物质的确认区域、及包含与所述第1扩增液进行反应的物质的扩增指标区域。
17.根据权利要求16所述的免疫层析试剂盒，其中，
与所述第1扩增液进行反应的物质为经由氢离子进行反应的物质。
18.根据权利要求11至17中任一项所述的免疫层析试剂盒，其中，
具备配置于所述上部壳体与所述下部壳体之间的中间部件，
该中间部件具有罐容纳部，该罐容纳部收容所述第2罐，在该罐容纳部的底面具备用于将所述第2扩增液滴注在所述不溶性载体上的孔。
19.根据权利要求18所述的免疫层析试剂盒，其中，
所述中间部件与所述流路形成部件形成为一体。
20.根据权利要求1至9中任一项所述的免疫层析试剂盒，其中，
所述第2扩增液滴注在比所述不溶性载体的所述检查区域更靠下游侧的位置处。
21.根据权利要求11至20中任一项所述的免疫层析试剂盒，其中，
所述第1扩增液为银离子用还原剂溶液，
所述第2扩增液为含有银离子的溶液。
22.根据权利要求11至21中任一项所述的免疫层析试剂盒，其中，
所述第1扩增液为含有2价铁离子的溶液。
23.根据权利要求11至22中任一项所述的免疫层析试剂盒，其中，
所述标记物质为金属胶体。
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