CN102608321B - 多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒及制备方法 - Google Patents

Abstract

多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒及制备方法，涉及一种多房棘球绦虫循环抗原检测试剂。试剂盒设有检测板、金标记抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体和洗涤液，所述检测板设有载体介质、微孔滤膜、吸水介质、多房棘球绦虫循环抗原检测点和对照点。制备多房棘球绦虫循环抗原；制备抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体；制备胶体金；胶体金与抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体的标记；制备斑点金免疫渗滤试剂盒。可用于全血、血清、血浆等标本中多房棘球绦虫循环抗原的检测。检测时，所需的标本量极小，不需要特殊仪器，肉眼直接判读结果，且检测简便快速，特异性强，灵敏度高，准确可靠，成本低，应用广泛。

Description

多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒及制备方法

技术领域

本发明涉及一种多房棘球绦虫循环抗原检测试剂，尤其是涉及一种采用胶体金免疫渗滤技术(immunofiltration)进行的多房棘球绦虫循环抗原免疫渗滤检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

泡状棘球蚴病(Alveolar echinococcosis，AE)是由棘球绦虫属的多房棘球绦虫(Echinococcus multicularia，Em)幼虫寄生所致的人畜共患寄生虫病，在我国主要分布于内蒙、新疆、西藏、甘肃、宁夏、青海和四川西部等广大牧区，是我国目前主要防治的寄生虫病之一。该病被认为是最致命的蠕虫感染病，是世界性最危险的“人畜共患病”之一。人因摄入棘球绦虫虫卵而被感染，继而幼虫在患者肝部呈多泡状、肿瘤样浸润迁移生长，迅速破坏肝实质细胞，最终导致肝机能不全或丧失，并伴有肺、脑等重要器官转移，确诊后10年内患者的死亡率高达90％以上([1]Filippou D.，Tselepis D.，Filippou G.and Papadopoulos V.Advances in Liver Echinococcosis：Diagnosis and Treatment.Clinical Gastroenterology andHepatology.2007，5(2)：152-159.)。该病的有效治疗目前仍然主要为外科手术，而术后复发率高是AE防治的一大难题。因而，在注重早期诊断和治疗的同时，加强对泡状棘球蚴病患者疗效的监测、病情转归消长的监测以及控制疾病的复发同样具有重要意义。

目前主要使用影像学检查，以及酶联免疫吸附实验(ELISA)和蛋白质印迹(Westernblotting)等免疫学试验对AE患者进行诊断和病情监测([2]Brunetti E，Kern P，Vuitton D A.Expert consensus for the diagnosis and treatment of cystic and alveolar echinococcosis inhumans[J].Acta tropica，2010，114(1)：1-16)。影像学检查常使一些非典型和体积较小的病灶与肝癌和肝脓肿等相混淆([3]张宽，王会苹，黄山，等.肝泡状棘球蚴病的CT诊断[J].实用放射学杂志，2011，27(7)：1117-1119)，而免疫学诊断具有快速、敏感、特异和价廉等优点，因此目前被广泛应用于该病的临床诊断和流行病学调查。但由于免疫学诊断所用抗原种类和质量等因素的影响，往往缺乏敏感性和特异性，与细粒棘球绦虫、猪囊尾蚴及其他寄生虫的抗原存在交叉反应，因此寻找高度敏感、特异的检测方法一直是AE诊断及防治的研究热点。目前运用于诊断的重组抗原多以检测多抗为主，然而基于多抗的免疫学检测方法的特异性和敏感性均有待提高([4]Carmena D，Benito A，Eraso E.The immunodiagnosis of Echinococcusmultilocularis infection.Clin.Microbiol.Infect，2007，13：460-475)。

寄生虫循环抗原(circulating antigen，CAg)是指生活虫体排放到宿主体液内的大分子微粒，主要是排泄分泌物或脱落物中具有抗原特性，并且能被血清免疫学试验所检出的物质。由于循环抗体在患者治疗后仍能长期存在，故不能区别现症感染和既往感染，不宜作疗效考核之用。一般认为检测CAg能提示有活动性感染存在，可用于判断现症患者及评价疗效等，因此CAg成为一种诊断靶抗原。随着对寄生虫CAg研究的不断深入，认识到它在寄生虫病发生发展和病理生理中的作用和地位，对CAg的研究内容已扩展到消长、转归等规律性探索，从而对其在免疫病理和免疫调节机制中的作用有所认识。早期的血清学方法使用多房棘球绦虫粗提物作为抗原，与其他病原体(如细粒棘球蚴)存在交叉反应，因此假阳性也时有发生。随着分子生物学技术的普及，将重组抗原应用于多房棘球绦虫实验已经越来越多，目前研究比较多的多房棘球绦虫抗原有EM2、EM4、EM10、EM13、EM16等，采用重组DNA技术制备的重组抗原可以克服多房棘球绦虫粗提物的缺点，能快速、经济地制备无限量特异重组多房棘球绦虫抗原([5]李文桂，陈雅棠.多房棘球绦虫em18研究进展[J].中国人兽共患病学报ISTIC，2009，25(1)：56-57)。建立一种简便快捷的试剂来筛查，对AE患者CAg的检测不仅可以辅助循环抗原检测对疾病进行诊断，而且对疾病治疗的疗效考核和病情监测具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒及制备方法。

所述多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒设有检测板、金标记抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体和洗涤液，所述检测板设有载体介质、微孔滤膜、吸水介质、多房棘球绦虫循环抗原检测点和对照点；所述多房棘球绦虫循环抗原检测点和对照点依次设在微孔滤膜上；在多房棘球绦虫循环抗原检测点处包被抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体，在对照点处包被多房棘球绦虫抗原EM2和EM18，将点样的微孔滤膜固定于吸水介质上，然后放入载体介质内，所述载体介质的一侧开有与微孔滤膜相对的通孔；所述载体介质包括底板和扣于底板上的盖板，盖板上开设有正对微孔滤膜的通孔，以便于加样。

所述载体介质可采用PVC板等。

所述微孔滤膜可采用硝酸纤维膜等，所述微孔滤膜的孔径可为0.1～0.5μm。

所述吸水介质可采用以纤维素为主要成分的纸等。

所述多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒的制备方法包括以下步骤：

1)制备多房棘球绦虫抗原EM2和EM18；

2)制备多房棘球绦虫重组抗原EM2和EM18的单克隆抗体，具体方法如下：

(1)制备多房棘球绦虫重组抗原EM2的单克隆抗体；

(2)制备多房棘球绦虫重组抗原EM18的单克隆抗体；

(3)将抗多房棘球绦虫循环抗原EM2单克隆抗体和抗多房棘球绦虫循环抗原EM18单克隆抗体混合；

3)硝酸纤维素膜的点样

在多房棘球绦虫循环抗原检测点处包被抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体，在对照点处包被多房棘球绦虫抗原EM2和EM18，烘干；

4)制备胶体金

采用柠檬酸三钠还原方法制备25nm胶体金，具体方法为：取1％氯金酸1mL加入到100mL去离子双蒸水中，得到的氯金酸浓度为0.01％，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热搅拌下加入1％柠檬酸三钠水溶液2.0mL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于棕色瓶中4℃冰箱保存备用；

5)胶体金与抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体的标记；

6)制备含0.5％ Tween20的10mmol/L pH7.4磷酸缓冲盐溶液作为洗涤液；

7)制备多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒，具体方法如下：

多房棘球绦虫循环抗原检测点和对照点依次设在微孔滤膜上；在检测点处包被抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体，在对照点处包被多房棘球绦虫抗原EM2和EM18；将点样的微孔滤膜膜固定于吸水介质上、然后放入载体介质内，所述载体介质的一侧开有与微孔滤膜相对的通孔；装有微孔滤膜的载体介质为检测板；检测板、金标记的抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体和洗涤液共同组成多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒。

在步骤1)中，所述制备多房棘球绦虫抗原EM2和EM18的具体方法可为：采用基因克隆技术，PCR扩增编码多房棘球绦虫抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得多房棘球绦虫重组抗原EM2和EM18。

在步骤2)第(1)部分中，所述制备多房棘球绦虫重组抗原EM2的单克隆抗体的具体方法是：将重组抗原EM2与等体积弗氏完全佐剂混合免疫小鼠，免疫小鼠的脾细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞经细胞融合，筛选分泌高滴度抗体的杂交瘤细胞进行扩大培养、冻存；采用有限稀释法克隆杂交瘤细胞，小鼠腹腔注射阳性杂交瘤细胞；待小鼠腹部明显隆起时，采集腹水，离心取上清，无菌过滤，亲和层析纯化腹水获EM2单克隆抗体；

在步骤2)第(2)部分中，所述制备多房棘球绦虫重组抗原EM18的单克隆抗体的具体方法是：将重组抗原EM18与等体积弗氏完全佐剂混合免疫小鼠，免疫小鼠的脾细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞经细胞融合，筛选分泌高滴度抗体的杂交瘤细胞进行扩大培养、冻存；采用有限稀释法克隆杂交瘤细胞，小鼠腹腔注射阳性杂交瘤细胞；待小鼠腹部明显隆起时，采集腹水，离心取上清，无菌过滤，亲和层析纯化腹水获EM18单克隆抗体；

在步骤2)第(3)部分中，所述抗多房棘球绦虫循环抗原EM2单克隆抗体和抗多房棘球绦虫循环抗原EM18单克隆抗体可按体积比1∶(0.2～5)混合；所述羊抗鼠IgG多克隆抗体的终浓度为1～4mg/mL；两者点样量为1μL/mm³；所述抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体浓度可为1～4mg/mL。

在步骤3)中，所述烘干的温度可为37℃。

在步骤4)中，所述柠檬酸三钠的浓度可为2％。

在步骤5)中，所述胶体金与抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体的标记的具体方法如下：

(1)取胶体金10mL，用0.1mol/L NaOH调至pH5.4，加100μg抗多房棘球绦虫循环抗原EM2单克隆抗体，混匀，放置5min，加入5％ BSA 1mL混匀，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10mL，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，沉淀用PBS稀释至1mL，得胶体金标记的抗多房棘球绦虫循环抗原EM2单克隆抗体；

(2)取胶体金10mL，用0.1mol/L NaOH调至pH5.4，加100μg抗多房棘球绦虫循环抗原EM18单克隆抗体，混匀，放置5min，加入5％ BSA 1mL混匀，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10mL，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，沉淀用PBS稀释至1mL，得胶体金标记的抗多房棘球绦虫循环抗原EM18单克隆抗体；

(3)将胶体金标记的抗多房棘球绦虫循环抗原EM2单克隆抗体和抗多房棘球绦虫循环抗原EM18单克隆抗体混合，所述抗多房棘球绦虫循环抗原EM2单克隆抗体和抗多房棘球绦虫循环抗原EM18单克隆抗体混合以体积比1∶(0.2～5)混合。

本发明采用胶体金免疫渗滤技术建立多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒，可用于全血、血清和血浆等标本中多房棘球绦虫循环抗原的检测。检测时，所需的标本量极小，不需要特殊仪器，肉眼直接判读结果，且检测简便快速，特异性强，灵敏度高，准确可靠，成本低，应用广泛。

附图说明

图1为本发明所述多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒中检测板的组装示意图。

图2为本发明所述多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒实施例的结构组成示意图。

图3为实验结果模式示意图。在图3中，(1)为使用前的示意图，(2)为无效试验(产品质量问题)，(3)多房棘球绦虫循环抗原阴性，(4)多房棘球绦虫循环抗原阳性。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

本发明所述多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒设有载体介质、微孔滤膜、吸水介质、检测点、对照点、金标记抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体和洗涤液。

参见图1和2，所述多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒实施例设有检测板8、金标记抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体9和洗涤液10，所述检测板8设有载体介质(包括底板1和扣于底板上的盖板2)、微孔滤膜5、吸水介质6、多房棘球绦虫循环抗原检测点3和对照点4；所述多房棘球绦虫循环抗原检测点3和对照点4依次设在微孔滤膜5上；在多房棘球绦虫循环抗原检测点3处包被抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体，在对照点4处包被多房棘球绦虫抗原EM2和EM18，将点样的微孔滤膜5固定于吸水介质6上，然后放入载体介质内，所述载体介质的一侧开有与微孔滤膜5相对的通孔；所述载体介质包括底板1和扣于底板上的盖板2，盖板2上开设有正对微孔滤膜5的通孔，以便于加样。检测板8、金标记抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体9和洗涤液10共同构成多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒。

所述载体介质可采用PVC板等。

所述微孔滤膜可采用硝酸纤维膜等，所述微孔滤膜的孔径可为0.1～0.5μm。

所述吸水介质可采用以纤维素为主要成分的纸等。

所述多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒的制备方法包括以下步骤：

1)制备多房棘球绦虫抗原EM2和EM18

采用基因克隆技术，PCR扩增编码多房棘球绦虫抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得多房棘球绦虫重组抗原EM2和EM18。

2)制备多房棘球绦虫重组抗原EM2和EM18的单克隆抗体

将重组抗原EM2与等体积弗氏完全佐剂混合免疫小鼠，免疫小鼠的脾细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞经细胞融合，筛选分泌高滴度抗体的杂交瘤细胞进行扩大培养、冻存。采用有限稀释法克隆杂交瘤细胞。小鼠腹腔注射阳性杂交瘤细胞。待小鼠腹部明显隆起时，采集腹水，离心取上清，无菌过滤，亲和层析纯化腹水获EM2单克隆抗体。

多房棘球绦虫重组抗原EM18的单克隆抗体的制备同以上方法。

3)硝酸纤维素膜的点样

在检测点处包被抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体，在对照点处包被多房棘球绦虫抗原EM2和EM18，晾干；

4)制备胶体金

采用柠檬酸三钠还原方法制备25nm胶体金，取1％氯金酸1mL加入到100mL去离子双蒸水中，得到的氯金酸浓度为0.01％，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热搅拌下加入1％柠檬酸三钠水溶液2.0mL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于棕色瓶中4℃冰箱保存备用；

5)胶体金与抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体的标记

取胶体金10mL，用0.1mol/L NaOH调至pH5.4，加100μg抗多房棘球绦虫循环抗原EM2单克隆抗体，混匀，放置5min，加入5％ BSA 1mL混匀，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10mL，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，沉淀用PBS稀释至1mL，得胶体金标记的抗多房棘球绦虫循环抗原EM2单克隆抗体；

抗多房棘球绦虫循环抗原EM18的单克隆抗体的制备同以上方法；

6)洗涤液制备

制备含0.5％ Tween20的10mmol/L pH7.4磷酸缓冲盐溶液作为洗涤液；

7)制备多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒

多房棘球绦虫循环抗原检测点和对照点依次设在微孔滤膜上；在检测点处包被抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体，在对照点处包被多房棘球绦虫抗原EM2和EM18。将点样的微孔滤膜膜固定于吸水介质上、然后放入载体介质内，所述载体介质的一侧开有与微孔滤膜相对的通孔；装有微孔滤膜的载体介质为检测板；检测板、金标记的抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体和洗涤液共同组成多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒。

以下给出斑点金免疫渗滤法检测患者的临床标本：

1)平衡：向反应孔中滴加1滴洗涤液以平衡检测膜；

2)加样：取待测样本加入反应孔，以使待测样本中的抗原与抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体结合，并等待液体向下渗滤并被吸水纸吸收；

3)洗涤：向反应孔中滴加4滴洗涤液，以清晰薄膜，并等待液体向下渗滤并被吸水纸吸收；

4)加金标抗体：向反应孔中滴加1滴金标记的抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体，使其上的标记物识别抗原，并等待液体向下渗滤并被吸水纸吸收；

5)洗涤：向反应孔中滴加4滴洗涤液，以清晰薄膜，并等待液体向下渗滤并被吸水纸吸收；

结果判断：参见图3，通过目测读取试验结果，只在多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒检测板对照区有一紫红色条带出现，则判为阴性；在检测区及对照区均有一紫红色条带出现，则判为阳性；加样检测后，检测区和对照区均不出现紫红色条带，为无效结果。

以下给出多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒的性能检定：

1)外观检查：试剂盒无破损，包被反应膜平整、干净无污染斑点、无裂缝，胶带无开胶，无切斜现象。

2)阳性标本符合率：用多房棘球绦虫阳性的不同滴度的阳性参比血清各50份采用多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒检定，计算阳性符合率。阳性参比血清的确定采用ELISA(进口试剂)法确定的临床标本。

3)阴性标本符合率：用50份阴性参比血清检定，计算阴性符合率。阴性参比血清的确定采用ELISA(进口试剂)法确定的临床标本。

4)批内差异：同一批次多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒，用特征性血清检测，要求阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。

5)批间差异：不同批次多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒，用特征性血清检测，要求阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。

6)干扰试验：检测结果不受标本溶血(n＝50)、脂血(n＝50)和黄疸(n＝50)的干扰。

7)交叉反应：采用本多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒，进行系统性红斑狼疮(n＝30)、类风湿病(n＝30)、免疫性肝炎(n＝30)等自身免疫系统疾病的检测，未发现交叉反应。

8)稳定性检测：应用Arrhenius法则，将多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒放置37℃ 20天后检测，以上各项指标无显著变化，确保成品在室温干燥条件下保存，有效期为18个月。

以下给出具体实施例。

实施例1

在硝酸纤维膜检测点处包被抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体，在检测点处包被抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体，将点样的微孔滤膜膜固定于吸水介质上、然后放入载体介质内组装成检测板，所述载体介质的一侧开有与微孔滤膜相对的通孔，制备成的胶体金免疫渗滤检测板，密封室温保存备用。其中，抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体浓度为1mg/mL，是将抗多房棘球绦虫循环抗原EM2单克隆抗体和抗多房棘球绦虫循环抗原EM18单克隆抗体以体积比1∶1混合；羊抗鼠IgG多克隆抗体的终浓度为1mg/mL；两者点样量为1μL/mm³；

将胶体金标记的抗多房棘球绦虫循环抗原EM2单克隆抗体和抗多房棘球绦虫循环抗原EM18单克隆抗体浓度为1mg/mL，以体积比1∶1混合后，制备成金金标记的抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体，装瓶备用。

制备含0.5％ Tween20的10mmol/L pH7.4磷酸缓冲盐溶液作为洗涤液，装瓶备用。

胶体金免疫渗滤检测板、金标记的抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体和洗涤液共合组成多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒。

向反应孔中滴加1滴洗涤液以平衡检测膜；取待检标本血清50μL加样于多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤检测板加样区；待液体吸收后，滴加4滴洗涤液；待液体吸收后，向反应孔中滴加1滴金标记的抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体；最后再滴加4滴洗涤液后观察结果。只在多房棘球绦虫循环抗原检测板对照区有一紫红色条带出现，则判为阴性；在检测区及对照区均有一紫红色条带出现，则判为阳性；加样检测后，检测区和对照区均不出现紫红色条带，为无效结果。

实施例2

与实施例1相似，区别在于硝酸纤维膜检测点处包被抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体仅由抗多房棘球绦虫循环抗原EM2单克隆抗体组成，不含有抗多房棘球绦虫循环抗原EM18单克隆抗体。结果判断与实施例1相同。

实施例3

与实施例1相似，区别在于硝酸纤维膜检测点处包被抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体仅由抗多房棘球绦虫循环抗原EM18单克隆抗体组成，不含有抗多房棘球绦虫循环抗原EM2单克隆抗体。结果判断与实施例1相同。

实施例4

性能验证试验：按实施例1的方案制备多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒，然后进行性能验证。

1)外观检查：试剂盒无破损，包被反应膜平整、干净无污染斑点、无裂缝，胶带无开胶，无切斜现象。

2)阳性标本符合率：用多房棘球绦虫阳性的不同滴度的阳性参比血清各50份采用多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒检定，计算阳性符合率。阳性参比血清的确定采用ELISA(进口试剂)法确定的临床标本。

3)阴性标本符合率：用50份阴性参比血清检定，计算阴性符合率。阴性参比血清的确定采用ELISA(进口试剂)法确定的临床标本。

4)批内差异：同一批次多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒，用特征性血清检测，要求阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。

5)批间差异：不同批次多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒，用特征性血清检测，要求阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。

6)干扰试验：检测结果不受标本溶血(n＝50)、脂血(n＝50)和黄疸(n＝50)的干扰。

7)交叉反应：采用本多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒，进行系统性红斑狼疮(n＝30)、类风湿病(n＝30)、免疫性肝炎(n＝30)等自身免疫系统疾病的检测，未发现交叉反应。

8)稳定性检测：应用Arrhenius法则，将多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒放置37℃ 20天后检测，以上各项指标无显著变化，确保成品在室温干燥条件下保存，有效期为18个月。

本发明所制备的多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒，均可用于全血、血清和血浆等标本中多房棘球绦虫循环抗原的检测，标本用量微小，不需要特殊仪器，肉眼直接判读结果。且检测简便快速，特异性强，灵敏度高，准确可靠，成本低，应用广泛。

Claims (10)

1.多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒，其特征在于设有检测板、金标记抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体和洗涤液，所述检测板设有载体介质、微孔滤膜、吸水介质、多房棘球绦虫循环抗原检测点和对照点；所述多房棘球绦虫循环抗原检测点和对照点依次设在微孔滤膜上；在多房棘球绦虫循环抗原检测点处包被抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体，在对照点处包被多房棘球绦虫抗原EM2和EM18，将点样的微孔滤膜固定于吸水介质上，然后放入载体介质内，所述载体介质的一侧开有与微孔滤膜相对的通孔；所述载体介质包括底板和扣于底板上的盖板，盖板上开设有正对微孔滤膜的通孔。

2.如权利要求1所述的多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒，其特征在于所述载体介质采用PVC板；所述微孔滤膜采用硝酸纤维膜，所述微孔滤膜的孔径为0.1～0.5μm；所述吸水介质采用以纤维素为主要成分的纸。

3.如权利要求1所述的多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）制备多房棘球绦虫抗原EM2和EM18；

2）制备多房棘球绦虫重组抗原EM2和EM18的单克隆抗体，具体方法如下：

（1）制备多房棘球绦虫重组抗原EM2的单克隆抗体；

（2）制备多房棘球绦虫重组抗原EM18的单克隆抗体；

（3）将抗多房棘球绦虫循环抗原EM2单克隆抗体和抗多房棘球绦虫循环抗原EM18单克隆抗体混合；

3）硝酸纤维素膜的点样

在多房棘球绦虫循环抗原检测点处包被抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体，在对照点处包被多房棘球绦虫抗原EM2和EM18，烘干；

4）制备胶体金

采用柠檬酸三钠还原方法制备25nm胶体金，具体方法为：取1%氯金酸1mL加入到100mL去离子双蒸水中，得到的氯金酸浓度为0.01%，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热搅拌下加入1%柠檬酸三钠水溶液2.0mL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于棕色瓶中4℃冰箱保存备用；

5）胶体金与抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体的标记；

6）制备含0.5%Tween20的10mmol/L pH7.4磷酸缓冲盐溶液作为洗涤液；

7）制备多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒，具体方法如下：

多房棘球绦虫循环抗原检测点和对照点依次设在微孔滤膜上；在检测点处包被抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体，在对照点处包被多房棘球绦虫抗原EM2和EM18；将点样的微孔滤膜膜固定于吸水介质上、然后放入载体介质内，所述载体介质的一侧开有与微孔滤膜相对的通孔；装有微孔滤膜的载体介质为检测板；检测板、金标记的抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体和洗涤液共同组成多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒。

4.如权利要求3所述的多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤1）中，所述制备多房棘球绦虫抗原EM2和EM18的具体方法为：采用基因克隆技术，PCR扩增编码多房棘球绦虫抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得多房棘球绦虫重组抗原EM2和EM18。

5.如权利要求3所述的多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤2）第（1）部分中，所述制备多房棘球绦虫重组抗原EM2的单克隆抗体的具体方法是：将重组抗原EM2与等体积弗氏完全佐剂混合免疫小鼠，免疫小鼠的脾细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞经细胞融合，筛选分泌高滴度抗体的杂交瘤细胞进行扩大培养、冻存；采用有限稀释法克隆杂交瘤细胞，小鼠腹腔注射阳性杂交瘤细胞；待小鼠腹部明显隆起时，采集腹水，离心取上清，无菌过滤，亲和层析纯化腹水获EM2单克隆抗体。

6.如权利要求3所述的多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤2）第（2）部分中，所述制备多房棘球绦虫重组抗原EM18的单克隆抗体的具体方法是：将重组抗原EM18与等体积弗氏完全佐剂混合免疫小鼠，免疫小鼠的脾细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞经细胞融合，筛选分泌高滴度抗体的杂交瘤细胞进行扩大培养、冻存；采用有限稀释法克隆杂交瘤细胞，小鼠腹腔注射阳性杂交瘤细胞；待小鼠腹部明显隆起时，采集腹水，离心取上清，无菌过滤，亲和层析纯化腹水获EM18单克隆抗体。

7.如权利要求3所述的多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤2）第（3）部分中，所述抗多房棘球绦虫循环抗原EM2单克隆抗体和抗多房棘球绦虫循环抗原EM18单克隆抗体按体积比1∶（0.2～5）混合。

8.如权利要求7所述的多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒的制备方法，其特征在于所述抗多房棘球绦虫循环抗原EM2单克隆抗体和抗多房棘球绦虫循环抗原EM18单克隆抗体的点样量为1μL/mm3；所述抗多房棘球绦虫循环抗原EM2单克隆抗体和抗多房棘球绦虫循环抗原EM18单克隆抗体的浓度为1～4mg/mL。

9.如权利要求3所述的多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤3）中，所述烘干的温度为37℃；在步骤4）中，所述柠檬酸三钠的浓度为2%。

10.如权利要求3所述的多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤5）中，所述胶体金与抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体的标记的具体方法如下：

（1）取胶体金10mL，用0.1mol/L NaOH调至pH5.4，加100μg抗多房棘球绦虫循环抗原EM2单克隆抗体，混匀，放置5min，加入5%BSA1mL混匀，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10mL，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，沉淀用PBS稀释至1mL，得胶体金标记的抗多房棘球绦虫循环抗原EM2单克隆抗体；

（2）取胶体金10mL，用0.1mol/L NaOH调至pH5.4，加100μg抗多房棘球绦虫循环抗原EM18单克隆抗体，混匀，放置5min，加入5%BSA1mL混匀，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10mL，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，沉淀用PBS稀释至1mL，得胶体金标记的抗多房棘球绦虫循环抗原EM18单克隆抗体；

（3）将胶体金标记的抗多房棘球绦虫循环抗原EM2单克隆抗体和抗多房棘球绦虫循环抗原EM18单克隆抗体混合，所述抗多房棘球绦虫循环抗原EM2单克隆抗体和抗多房棘球绦虫循环抗原EM18单克隆抗体混合以体积比1∶（0.2～5）混合。

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