CN106855573A - 检测人前列腺特异性抗原斑点金渗滤试剂盒及其检测方法 - Google Patents

检测人前列腺特异性抗原斑点金渗滤试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供检测人前列腺特异性抗原斑点金渗滤试剂盒及其检测方法，包括：pH值为6.5的预封闭液、pH值为6.3的洗涤液、胶体金标记人前列腺特异性抗原抗体、人前列腺特异性抗原层析器和定标卡；所述预封闭液包括Triton‑100和Tris缓冲液溶液；所述洗涤液包括牛血清白蛋白和Tris缓冲液溶液。本发明采用硝酸纤维素膜为固相载体，以吸附在硝酸纤维素上的抗体为固相，当被金颗粒标记的抗体与相应的抗原配体结合，金颗粒在抗体配体位点大量聚集时，便形成肉眼可见的红色斑点。本发明的斑点免疫金渗滤试剂盒结构简单，测试方便，结果准确；检测时间短，重复性和精密度较高，因此适合各级医院使用。

Description

检测人前列腺特异性抗原斑点金渗滤试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于医学检验领域，尤其涉及一种检测人前列腺特异性抗原(PSA)斑点免疫金渗滤试剂盒及其定量检测方法。
背景技术
PSA是一种含有237个氨基酸的单链多肽，属于具有组织特异性的有糜蛋白酶样作用的丝氨酸蛋白酶家族，其可以分解精液中的主要胶状蛋白，所以具有稀释精液的作用。PSA在正常和癌样上皮细胞中都可合成。
PSA在大多数有临床意义的前列腺癌中都会升高，也是其最重要的早期检测指标。正常的前列腺导管系统周围有一种血—上皮之间的屏障，从而避免了前列腺上皮产生的PSA直接进入血液之中，从而维持了血液中PSA的低浓度。一般认为，血清PSA小于4.0ng/ml为正常，PSA大于10ng/ml则患前腺癌的危险性增加。当前列腺发生癌变时就破坏了血—上皮之间的屏障，同时癌分泌的PSA也增加了，致使PSA直接进入血内，癌的恶性程度越高，对于正常前列腺组织破坏性越大，血清中PSA越高。此外，前列腺炎症、前列腺增生、急性尿潴留、前列腺按摩等可使PSA增高，但当致病因素消除后，大约一个月可恢复正常。因此PSA也可作为前列腺功能正常与否和前列腺疾病预后判断的指标。
人前列腺特异性抗原检测技术主要有免疫层析法、免疫荧光法、酶联免疫法等。免疫层析法检测时间相对较长，易受环境温湿度的影响，且精密度较差。免疫荧光法则成本较为昂贵，不适合基层医院开展使用。酶联免疫法操作较为繁琐，耗时较长，且对操作者要求较高，一般配套全自动酶联免疫仪使用，且只适用于大批量样本的检测，因此其单人检测成本高，且耗时长，限制了其在医院的推广使用。
发明内容
现有的金标免疫检测在定性检测应用较为广泛，本发明提供一种检测人前列腺特异性抗原(PSA)斑点免疫金渗滤试剂盒及其定量检测方法，斑点免疫金渗滤法是让待测样本垂直渗滤过微孔膜，被膜上包被的捕获探针捕获，再以同样方式让胶体金标探针渗滤过微孔膜，与被捕获的配体结合后聚集形成肉眼可见的红色斑点。
本发明提供一种检测人前列腺特异性抗原(PSA)斑点免疫金渗滤试剂盒，包括：pH值为6.5的预封闭液、pH值为6.3的洗涤液、胶体金标记人前列腺特异性抗原抗体、人前列腺特异性抗原层析器和定标卡；所述预封闭液包括Triton-100和Tris缓冲液溶液；所述洗涤液包括牛血清白蛋白(BSA)和Tris缓冲液溶液。
优选的，所述预封闭液中Triton-100的浓度为1～3％，Tris缓冲液溶液的浓度为1～3mol/L；所述洗涤液中牛血清白蛋白的浓度为1～3％，Tris缓冲液溶液的浓度为1～3mol/L。
优选的，所述Tris缓冲液溶液由由三羟甲基氨基甲烷4.6-5.5重量份、NaCl 8重量份、KCl 0.3重量份、蒸馏水1200重量份、牛血清白蛋白9重量份配制而成。
优选的，所述胶体金标记人前列腺特异性抗原抗体按以下方法制备而成：
先将质量份数为0.3％氯金酸与双蒸水按体积1∶56配成A液；将质量份数分别为0.5％的柠檬酸三钠、0.3％的鞣酸、15mM K2CO3与双蒸水按体积3.6∶0.01～0.03∶0.01～0.03∶14.37～15.78配成B液；再将所述A液加热到50～58℃，B液加热到62～68℃，搅拌B液，快速加入A液，继续搅拌0.5分钟，在14～19分钟内加热至沸腾，制成胶体金液；所述胶体金颗粒直径为8～12nm，该胶体金液颜色由黑→蓝→紫→红色；
利用0.15M K2CO3调整所述胶体金液的pH值为6.5～6.7；
将人前列腺特异性抗原抗体原液在10℃下6000～8000r/min离心80分钟，吸取上清液；将该抗体原液装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，得到人前列腺特异性抗原抗体；
将得到的人前列腺特异性抗原抗体缓慢加入所述胶体金液中进行包被，所述人前列腺特异性抗原抗体与胶体金液的质量体积比为0.1～0.26mg：90ml，搅拌10分钟后，依次加入1～9％迭氮钠和0.1～0.49％牛血清白蛋白，所述迭氮钠、牛血清白蛋白与所述胶体金液的体积比为500μl：100μl：100ml，搅匀后在1.5～2.4℃，以5000r/min速度离心45分钟，去除上清液，沉淀物即为胶体金标记人前列腺特异性抗原抗体。
优选的，所述柠檬酸三钠、鞣酸、K2C03与双蒸水的体积比为2:0.05:0.05:13.65，所述胶体金液中形成直径为12＜D＜15nm的胶体金颗粒。
优选的，所述人前列腺特异性抗原层析器内设有直径为2.5cm的反应盒，所述反应盒包括盒底和盒盖两部分，盒盖顶面中央设有一个上表面直径为0.4cm，下表面直径为0.2cm的小圆孔；所述反应盒内垫满吸水材料；在所述小圆孔下方和吸水材料上方之间放置一张1.1×1.1cm的包被人前列腺特异性抗原抗体的硝酸纤维素膜。
优选的，所述人前列腺特异性抗原抗体的硝酸纤维素膜按以下步骤制备而成：
将人前列腺特异性抗原包被抗体的原液在10℃下6000～8000r/min离心80分钟，吸取上清液；将吸收上清液的抗体装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻；
用Tris缓冲液溶液稀释上述抗体，得到0.6mg/ml为包被液；
将包被液滴加至裁切好的硝酸纤维素膜上，每张膜片0.17ml，将膜片置于烘箱中干燥后即制成包被有人前列腺特异性抗原抗体的硝酸纤维素膜。
优选的，所述定标卡为人前列腺特异性抗原梯度质量浓度溶液所检测颜色相对应的检测信号值。根据检测试纸显示的信号值，与定标卡信号值比对，即可定量判定其质量浓度。
优选的，所述梯度质量浓度分别为1、2、4、10、20、50、100ng/mL，并且该梯度质量浓度检测的信号值与定标卡相对应。
一种检测人前列腺特异性抗原斑点免疫金渗滤试剂盒的定量检测方法，包括以下步骤：
用无抗凝或EDTA抗凝的真空采血管采集血样1～5ml混匀，置室温放置15min-2h，2000r/min离心40min，吸取上清液即为待测样本；
用移液器准确吸取预封闭液，点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上；
待预封闭液渗入后，用移液器准确吸取检测样本，点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上；
待检测样本渗入后，再往反应盒膜面滴加Tris缓冲液溶液稀释的人前列腺特异性抗原抗体标记胶体金；
待人前列腺特异性抗原抗体标记胶体金渗入后，再往反应盒膜面上滴加洗涤液；
观察反应盒膜面，待洗涤液完全渗入膜面后，检测人前列腺特异性抗原层析器信号值，通过仪器结合定标卡信息计算检测样本人前列腺特异性抗原浓度，即可定量判定其质量浓度。
本发明斑点金标免疫渗滤法以亲和层析原理为基础，采用硝酸纤维素膜为固相载体，以吸附在硝酸纤维素上的抗体为固相，以人血中抗原以及抗体标记胶体金为液相，并同时以抗体标记胶体金作为探针和指示剂，而建立起来的一种新型的免疫检测方法。其中胶体金颗粒的表面带负电荷与人前列腺特异性抗原抗体蛋白分子的正电荷基团因静电作用形成牢固的结合，同时金颗粒又有高电子密度的特性，当被金颗粒标记的抗体与相应的抗原配体结合，金颗粒在抗体配体位点大量聚集时，便形成肉眼可见的红色斑点。本发明具有以下优点：本发明上所述的斑点免疫金渗滤试剂盒结构简单，测试方便，结果准确；本发明的检测方法检测时间短，重复性和精密度较高，因此适合各级医院使用。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明公开了一种检测人前列腺特异性抗原(PSA)斑点免疫金渗滤试剂盒，包括pH值为6.5的预封闭液、pH值为6.3的洗涤液、胶体金标记人前列腺特异性抗原抗体、人前列腺特异性抗原层析器和定标卡；其中，所述预封闭液中Triton-100的浓度为1～3％，Tris缓冲液溶液的浓度为1～3mol/L；所述洗涤液中牛血清白蛋白的浓度为1～3％，Tris缓冲液溶液的浓度为1～3mol/L。
作为优选方案，所述Tris缓冲液溶液由三羟甲基氨基甲烷4.6-5.5重量份、NaCl 8重量份、KCl 0.3重量份、蒸馏水1200重量份、牛血清白蛋白9重量份配制而成。
作为优选方案，所述定标卡为人前列腺特异性抗原梯度质量浓度溶液所检测信号值相对应。根据检测试剂显示的信号值，与定标卡信号值比对，即可定量判定其质量浓度。
作为优选方案，所述梯度浓度分别为1、2、4、10、20、50、100ng/mL，并且该梯度质量浓度检测的信号与定标卡相对应。
作为优选方案，所述人前列腺特异性抗原层析器设置有反应盒，直径为2.5cm的塑料小盒，分盒底和盒盖两部分，盒盖顶面中央有一个上部直径为0.4cm、下部直径为0.2cm的小圆孔，盒内垫满吸水材料，在小圆孔下方和吸水材料上方之间放置一张1.1×1.1cm的包被有人前列腺特异性抗原抗体的硝酸纤维素膜，合紧盒盖即组成反应盒。可避免大部分待测样本和标记探针从斑点以外的非相关区域流失，影响检测灵敏度，可以使得该技术在临床检验中广泛使用。
作为优选方案，所述的包被人前列腺特异性抗原抗体的硝酸纤维素膜按以下步骤制备而成：
(1)抗体的纯化，人前列腺特异性抗原包被抗体的纯化与透析，将抗体原液在10℃下6000～8000r/min离心80分钟，吸取上清液；将该抗体装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻，备用；
(2)用Tris缓冲液溶液稀释上述抗体至0.6mg/ml的包被液；
(3)将包被液滴加至裁切好的硝酸纤维素膜上，每张膜片0.17ml，将膜片置于烘箱中干燥后即制成包被有人前列腺特异性抗原抗体的硝酸纤维素膜。
作为优选方案，所述人前列腺特异性抗原抗体标记胶体金按以下步骤制备而成：
(1)胶体金的制备以质量分数分别为0.3％氯金酸、0.5％柠檬酸三钠、0.3％鞣酸、15mM K2CO3及双蒸水为原料，先将0.3％氯金酸与双蒸水按体积1∶56配成A液；将0.5％柠檬酸三钠、0.3％鞣酸、15mM K2CO3与双蒸水按体积比3.6∶0.01～0.03∶0.01～0.03∶14.37～15.78配成B液；再将所述A液加热到50～58℃，B液加热到62～68℃，搅拌B液，快速加入A液，继续搅拌0.5分钟，在14～19分钟内加热至沸腾，制成胶体金液；所述胶体金颗粒直径为8～12nm，该胶体金液颜色由黑→蓝→紫→红色；
(2)利用0.15M K2CO3调整胶体金液的pH值为6.5～6.7后备用；
(3)人前列腺特异性抗原抗体的制备与透析，将抗体在10℃下6000～8000r/min离心80分钟，吸取上清液即为人前列腺特异性抗原抗体；将该抗体装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，备用；
(4)胶体金标记人前列腺特异性抗原抗体，将步骤(3)中人前列腺特异性抗原抗体0.1～0.26mg，缓慢加入步骤(2)制备的90ml胶体金液中进行包被，搅拌10分钟后，依次加入1～9％的迭氮钠500μl、0.1～0.49％的牛血清白蛋白100μl，搅匀后在1.5～2.4℃，以5000r/min速度离心45分钟，去除上清液，即成人前列腺特异性抗原抗体标记胶体金。
进一步的，用Tris缓冲液溶液将胶体金标记人前列腺特异性抗原抗体稀释30倍，瓶装备用。
作为优选方案，配制胶体金A液配方同上，所述配制胶体金B液的组分与含量为1％柠檬酸三钠4.0ml、1％鞣酸0.08ml、25mM K2C030.08ml与双蒸水15.84ml；制成的胶体金颗粒直径为10＜D＜11nm；胶体金液pH值调为7.1；胶体金液与人前列腺特异性抗原抗体的体积重量比为100ml∶0.30mg。
更进一步的，一种检测人前列腺特异性抗原(PSA)斑点金渗滤试剂盒的定量检测方法，按以下步骤操作：
(1)待检人血清/血浆的采集：用无抗凝/EDTA抗凝的真空采血管采集血样1～5ml混匀，置室温放置15min-2h，2000r/min离心40min，吸取上清液，冷冻备用；
(2)预封闭液加样：用移液器准确吸取预封闭液，点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上；
(3)检测样本加样：待预封闭液完全渗入后，用移液器准确吸取检测样本，点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上；
(4)滴加胶体金标记人前列腺特异性抗原抗体：待检测样本渗入后，再往反应盒膜面滴加胶体金标记人前列腺特异性抗原抗体；
(5)待人前列腺特异性抗原抗体标记胶体金渗入后，再往反应盒膜面上滴加洗涤液；
(6)检测并记录结果：观察反应盒膜面，待洗涤液完全渗入膜面后，检测人前列腺特异性抗原层析器信号值，通过仪器结合定标卡信息计算检测样本人前列腺特异性抗原浓度，即可定量判定其质量浓度。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
本发明实施例采用的原料和化学试剂均为市购。
实施例1
一种检测人前列腺特异性抗原(PSA)斑点免疫金渗滤试剂盒，包括pH值为6.5的预封闭液、pH值为6.3的洗涤液、胶体金标记人前列腺特异性抗原抗体、人前列腺特异性抗原层析器和定标卡；其中，所述预封闭液中Triton-100的浓度为2％，Tris缓冲液溶液的浓度为2mol/L；所述洗涤液中牛血清白蛋白的浓度为2％，Tris缓冲液溶液的浓度为2mol/L。所述Tris缓冲液溶液由三羟甲基氨基甲烷5.0重量份、NaCl 8重量份、KCl 0.3重量份、蒸馏水1200重量份、牛血清白蛋白9重量份配制而成。所述人前列腺特异性抗原层析器设置有反应盒，直径为2.5cm的塑料小盒，分盒底和盒盖两部分，盒盖顶面中央有一个上部直径为0.4cm、下部直径为0.2cm的小圆孔，盒内垫满吸水材料，在小圆孔下方和吸水材料上方之间放置一张1.1×1.1cm的包被有人前列腺特异性抗原抗体的硝酸纤维素膜。
所述包被有人前列腺特异性抗原抗体的硝酸纤维素膜按以下步骤制备而成：
(1)抗体的纯化，人前列腺特异性抗原包被抗体的纯化与透析，将抗体原液在10℃下7000r/min离心80分钟，吸取上清液；将该抗体装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻，备用；
(2)用Tris缓冲液溶液稀释上述抗体至0.6mg/ml的包被液；
(3)将包被液滴加至裁切好的硝酸纤维素膜上，每张膜片0.17ml，将膜片置于烘箱中干燥后即制成包被有人前列腺特异性抗原抗体的硝酸纤维素膜。
作为优选方案，所述人前列腺特异性抗原抗体标记胶体金按以下步骤制备而成：
(1)胶体金的制备以质量分数分别为0.3％氯金酸、0.5％柠檬酸三钠、0.3％鞣酸、15mM K2CO3及双蒸水为原料，先将0.3％氯金酸与双蒸水按体积1∶56配成A液；将0.5％柠檬酸三钠、0.3％鞣酸、15mM K2CO3与双蒸水按体积比3.6∶0.01～0.03∶0.01～0.03∶14.37～15.78配成B液；再将所述A液加热到55℃，B液加热到65℃，搅拌B液，快速加入A液，继续搅拌0.5分钟，在16分钟内加热至沸腾，制成胶体金液；所述胶体金颗粒直径为10nm，该胶体金液颜色由黑→蓝→紫→红色；
(2)利用0.15M K2CO3调整胶体金液的pH值为6.6后备用；
(3)人前列腺特异性抗原抗体的制备与透析，将抗体在10℃下7000r/min离心80分钟，吸取上清液即为人前列腺特异性抗原抗体；将该抗体装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，备用；
(4)胶体金标记人前列腺特异性抗原抗体，将步骤(3)中人前列腺特异性抗原抗体0.2mg，缓慢加入步骤(2)制备的90ml胶体金液中进行包被，搅拌10分钟后，依次加入5％的迭氮钠500μl、0.3％的牛血清白蛋白100μl，搅匀后在2.0℃，以5000r/min速度离心45分钟，去除上清液，即成人前列腺特异性抗原抗体标记胶体金。
一种检测人前列腺特异性抗原(PSA)斑点金渗滤试剂盒定量检测方法，按以下步骤操作：用无抗凝/EDTA抗凝的真空采血管采集血样3mL，混匀，置室温放置1h，2000r/min离心40min，吸取上清液，冷冻备用；用移液器准确吸取25μL预封闭液，点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上；待预封闭液完全渗入后，用移液器准确吸取25μL检测样本，点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上；待检测样本渗入后，再往反应盒膜面滴加25μL Tris缓冲液溶液稀释的人前列腺特异性抗原抗体标记胶体金；待人前列腺特异性抗原抗体标记胶体金渗入后，再往反应盒膜面上滴加25μL洗涤液；观察反应盒膜面，待洗涤液完全渗入膜面后，检测人前列腺特异性抗原层析器信号值，通过仪器结合定标卡信息计算检测样本人前列腺特异性抗原浓度，即可定量判定其质量浓度。
实施例2
一种检测人前列腺特异性抗原(PSA)斑点免疫金渗滤试剂盒，包括pH值为6.5的预封闭液、pH值为6.3的洗涤液、胶体金标记人前列腺特异性抗原抗体、人前列腺特异性抗原层析器和定标卡；其中，所述预封闭液中Triton-100的浓度为3％，Tris缓冲液溶液的浓度为1mol/L；所述洗涤液中牛血清白蛋白的浓度为3％，Tris缓冲液溶液的浓度为1mol/L。所述Tris缓冲液溶液由三羟甲基氨基甲烷4.6重量份、NaCl 8重量份、KCl 0.3重量份、蒸馏水1200重量份、牛血清白蛋白9重量份配制而成。所述人前列腺特异性抗原层析器设置有反应盒，直径为2.5cm的塑料小盒，分盒底和盒盖两部分，盒盖顶面中央有一个上部直径为0.4cm、下部直径为0.2cm的小圆孔，盒内垫满吸水材料，在小圆孔下方和吸水材料上方之间放置一张1.1×1.1cm的包被有人前列腺特异性抗原抗体的硝酸纤维素膜。
所述包被有人前列腺特异性抗原抗体的硝酸纤维素膜按以下步骤制备而成：
(1)抗体的纯化，人前列腺特异性抗原包被抗体的纯化与透析，将抗体原液在10℃下8000r/min离心80分钟，吸取上清液；将该抗体装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻，备用；
(2)用Tris缓冲液溶液稀释上述抗体至0.6mg/ml的包被液；
(3)将包被液滴加至裁切好的硝酸纤维素膜上，每张膜片0.17ml，将膜片置于烘箱中干燥后即制成包被有人前列腺特异性抗原抗体的硝酸纤维素膜。
作为优选方案，所述人前列腺特异性抗原抗体标记胶体金按以下步骤制备而成：
(1)胶体金的制备以质量分数分别为0.3％氯金酸、0.5％柠檬酸三钠、0.3％鞣酸、15mM K2CO3及双蒸水为原料，先将0.3％氯金酸与双蒸水按体积1∶56配成A液；将0.5％柠檬酸三钠、0.3％鞣酸、15mM K2CO3与双蒸水按体积比3.6∶0.01～0.03∶0.01～0.03∶14.37～15.78配成B液；再将所述A液加热到50℃，B液加热到62℃，搅拌B液，快速加入A液，继续搅拌0.5分钟，在14分钟内加热至沸腾，制成胶体金液；所述胶体金颗粒直径为8nm，该胶体金液颜色由黑→蓝→紫→红色；
(2)利用0.15M K2CO3调整胶体金液的pH值为6.5后备用；
(3)人前列腺特异性抗原抗体的制备与透析，将抗体在10℃下8000r/min离心80分钟，吸取上清液即为人前列腺特异性抗原抗体；将该抗体装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，备用；
(4)胶体金标记人前列腺特异性抗原抗体，将步骤(3)中人前列腺特异性抗原抗体0.1mg，缓慢加入步骤(2)制备的90ml胶体金液中进行包被，搅拌10分钟后，依次加入1％的迭氮钠500μl、0.1％的牛血清白蛋白100μl，搅匀后在1.5℃，以5000r/min速度离心45分钟，去除上清液，即成人前列腺特异性抗原抗体标记胶体金。
一种检测人前列腺特异性抗原(PSA)斑点金渗滤试剂盒定量检测方法，按以下步骤操作：用无抗凝/EDTA抗凝的真空采血管采集血样1mL，混匀，置室温放置15min，2000r/min离心40min，吸取上清液，冷冻备用；用移液器准确吸取25μL预封闭液，点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上；待预封闭液完全渗入后，用移液器准确吸取25μL检测样本，点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上；待检测样本渗入后，再往反应盒膜面滴加25μL Tris缓冲液溶液稀释的人前列腺特异性抗原抗体标记胶体金；待人前列腺特异性抗原抗体标记胶体金渗入后，再往反应盒膜面上滴加25μL洗涤液；观察反应盒膜面，待洗涤液完全渗入膜面后，检测人前列腺特异性抗原层析器信号值，通过仪器结合定标卡信息计算检测样本人前列腺特异性抗原浓度，即可定量判定其质量浓度。
实施例3
一种检测人前列腺特异性抗原(PSA)斑点免疫金渗滤试剂盒，包括pH值为6.5的预封闭液、pH值为6.3的洗涤液、胶体金标记人前列腺特异性抗原抗体、人前列腺特异性抗原层析器和定标卡；其中，所述预封闭液中Triton-100的浓度为3％，Tris缓冲液溶液的浓度为3mol/L；所述洗涤液中牛血清白蛋白的浓度为3％，Tris缓冲液溶液的浓度为3mol/L。所述Tris缓冲液溶液由三羟甲基氨基甲烷5.5重量份、NaCl 8重量份、KCl 0.3重量份、蒸馏水1200重量份、牛血清白蛋白9重量份配制而成。所述人前列腺特异性抗原层析器设置有反应盒，直径为2.5cm的塑料小盒，分盒底和盒盖两部分，盒盖顶面中央有一个上部直径为0.4cm、下部直径为0.2cm的小圆孔，盒内垫满吸水材料，在小圆孔下方和吸水材料上方之间放置一张1.1×1.1cm的包被有人前列腺特异性抗原抗体的硝酸纤维素膜。
所述包被有人前列腺特异性抗原抗体的硝酸纤维素膜按以下步骤制备而成：
(1)抗体的纯化，人前列腺特异性抗原包被抗体的纯化与透析，将抗体原液在10℃下6000r/min离心80分钟，吸取上清液；将该抗体装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻，备用；
(2)用Tris缓冲液溶液稀释上述抗体至0.6mg/ml的包被液；
(3)将包被液滴加至裁切好的硝酸纤维素膜上，每张膜片0.17ml，将膜片置于烘箱中干燥后即制成包被有人前列腺特异性抗原抗体的硝酸纤维素膜。
作为优选方案，所述人前列腺特异性抗原抗体标记胶体金按以下步骤制备而成：
(1)胶体金的制备以质量分数分别为0.3％氯金酸、0.5％柠檬酸三钠、0.3％鞣酸、15mM K2CO3及双蒸水为原料，先将0.3％氯金酸与双蒸水按体积1∶56配成A液；将0.5％柠檬酸三钠、0.3％鞣酸、15mM K2CO3与双蒸水按体积比3.6∶0.01～0.03∶0.01～0.03∶14.37～15.78配成B液；再将所述A液加热到58℃，B液加热到68℃，搅拌B液，快速加入A液，继续搅拌0.5分钟，在19分钟内加热至沸腾，制成胶体金液；所述胶体金颗粒直径为12nm，该胶体金液颜色由黑→蓝→紫→红色；
(2)利用0.15M K2CO3调整胶体金液的pH值为6.7后备用；
(3)人前列腺特异性抗原抗体的制备与透析，将抗体在10℃下6000r/min离心80分钟，吸取上清液即为人前列腺特异性抗原抗体；将该抗体装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，备用；
(4)胶体金标记人前列腺特异性抗原抗体，将步骤(3)中人前列腺特异性抗原抗体0.26mg，缓慢加入步骤(2)制备的90ml胶体金液中进行包被，搅拌10分钟后，依次加入9％的迭氮钠500μl、0.49％的牛血清白蛋白100μl，搅匀后在2.4℃，以5000r/min速度离心45分钟，去除上清液，即成人前列腺特异性抗原抗体标记胶体金。
一种检测人前列腺特异性抗原(PSA)斑点金渗滤试剂盒定量检测方法，按以下步骤操作：用无抗凝/EDTA抗凝的真空采血管采集血样5mL，混匀，置室温放置2h，2000r/min离心40min，吸取上清液，冷冻备用；用移液器准确吸取25μL预封闭液，点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上；待预封闭液完全渗入后，用移液器准确吸取25μL检测样本，点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上；待检测样本渗入后，再往反应盒膜面滴加25μL Tris缓冲液溶液稀释的人前列腺特异性抗原抗体标记胶体金；待人前列腺特异性抗原抗体标记胶体金渗入后，再往反应盒膜面上滴加25μL洗涤液；观察反应盒膜面，待洗涤液完全渗入膜面后，检测人前列腺特异性抗原层析器信号值，通过仪器结合定标卡信息计算检测样本人前列腺特异性抗原浓度，即可定量判定其质量浓度。
实施例4
实施例4与实施例1、实施例2和实施例3的区别是在制备胶体金标记人前列腺特异性抗原抗体时，配制胶体金A液不变，所述配制胶体金B液的组分与含量为0.5％柠檬酸三钠3.6ml、0.3％鞣酸0.01ml、15mM K2C030.08ml与双蒸水14.37ml；制成的胶体金颗粒直径为11＜D＜13nm；胶体金液pH值调为7.0；胶体金液与人前列腺特异性抗原抗体的体积重量比为100ml∶0.30mg。
以上实施方式和实施例均需根据具体情况适度调节温度和蒸馏水的使用量，本说明只是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.检测人前列腺特异性抗原斑点金渗滤试剂盒，其特征在于，包括:
pH值为6.5的预封闭液、pH值为6.3的洗涤液、胶体金标记人前列腺特异性抗原抗体、人前列腺特异性抗原层析器和定标卡；
所述预封闭液包括Triton-100和Tris缓冲液溶液；
所述洗涤液包括牛血清白蛋白和Tris缓冲液溶液。
2.根据权利要求1所述的斑点金渗滤试剂盒，其特征在于，所述预封闭液中Triton-100的浓度为1～3％，Tris缓冲液溶液的浓度为1～3mol/L；所述洗涤液中牛血清白蛋白的浓度为1～3％，Tris缓冲液溶液的浓度为1～3mol/L。
3.根据权利要求1所述的斑点金渗滤试剂盒，其特征在于，所述Tris缓冲液溶液由三羟甲基氨基甲烷4.6-5.5重量份、KH2PO4 3.0-2.1重量份、NaCl 8重量份、KCl 0.3重量份、蒸馏水1200重量份、牛血清白蛋白9重量份配制而成。
4.根据权利要求1所述的斑点金渗滤试剂盒，其特征在于，所述胶体金标记人前列腺特异性抗原抗体按以下方法制备而成：
先将质量份数为0.3％氯金酸与双蒸水按体积1∶56配成A液；将质量份数分别为0.5％的柠檬酸三钠、0.3％的鞣酸、15mM K2CO3与双蒸水按体积3.6∶0.01～0.03∶0.01～0.03∶14.37～15.78配成B液；再将所述A液加热到50～58℃，B液加热到62～68℃，搅拌B液，快速加入A液，继续搅拌0.5分钟，在14～19分钟内加热至沸腾，制成胶体金液；
利用0.15M K2CO3调整所述胶体金液的pH值为6.5～6.7；
将人前列腺特异性抗原抗体原液在10℃下6000～8000r/min离心80分钟，吸取上清液；将该抗体原液装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，得到人前列腺特异性抗原抗体；
将得到的人前列腺特异性抗原抗体缓慢加入所述胶体金液中进行包被，所述人前列腺特异性抗原抗体与胶体金液的质量体积比为0.1～0.26mg：90ml，搅拌10分钟后，依次加入1～9％迭氮钠和0.1～0.49％牛血清白蛋白，所述迭氮钠、牛血清白蛋白与所述胶体金液的体积比为500μl：100μl：100ml，搅匀后在1.5～2.4℃，以5000r/min速度离心45分钟，去除上清液，沉淀物即为胶体金标记人前列腺特异性抗原抗体。
5.根据权利要求4所述的斑点金渗滤试剂盒，其特征在于，所述柠檬酸三钠、鞣酸、K2C03与双蒸水的体积比为2:0.05:0.05:13.65，所述胶体金液中形成直径为12＜D＜15nm的胶体金颗粒。
6.根据权利要求1所述的斑点金渗滤试剂盒，其特征在于，所述人前列腺特异性抗原层析器内设有直径为2.5cm的反应盒，所述反应盒包括盒底和盒盖两部分，盒盖顶面中央设有一个上表面直径为0.4cm，下表面直径为0.2cm的小圆孔；所述反应盒内垫满吸水材料；在所述小圆孔下方和吸水材料上方之间放置一张1.1×1.1cm的包被人前列腺特异性抗原抗体的硝酸纤维素膜。
7.根据权利要求6所述的斑点金渗滤试剂盒，其特征在于，所述人前列腺特异性抗原抗体的硝酸纤维素膜按以下步骤制备而成：
将人前列腺特异性抗原包被抗体的原液在10℃下6000～8000r/min离心80分钟，吸取上清液；将吸收上清液的抗体装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻；
用Tris缓冲液溶液稀释上述抗体，得到0.6mg/ml为包被液；
将包被液滴加至裁切好的硝酸纤维素膜上，每张膜片0.17ml，将膜片置于烘箱中干燥后即制成包被有人前列腺特异性抗原抗体的硝酸纤维素膜。
8.根据权利要求1所述的斑点金渗滤试剂盒，其特征在于，所述定标卡为人前列腺特异性抗原梯度质量浓度溶液所检测颜色相对应的检测信号值。
9.根据权利要求8所述的斑点金渗滤试剂盒，其特征在于，所述梯度质量浓度分别为1、2、4、10、20、50、100ng/mL，并且该梯度质量浓度检测的信号值与定标卡相对应。
10.检测人前列腺特异性抗原斑点金渗滤试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
用无抗凝或EDTA抗凝的真空采血管采集血样1～5ml混匀，置室温放置15min-2h，2000r/min离心40min，吸取上清液即为待测样本；
用移液器准确吸取预封闭液，点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上；
待预封闭液渗入后，用移液器准确吸取检测样本，点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上；
待检测样本渗入后，再往反应盒膜面滴加Tris缓冲液溶液稀释的人前列腺特异性抗原抗体标记胶体金，所述胶体金标记人前列腺特异性抗原抗体与所述检测样本的体积比为1.5：1；
待人前列腺特异性抗原抗体标记胶体金渗入后，再往反应盒膜面上滴加洗涤液，所述洗涤液与所述检测样本的体积比为1.5：1；
观察反应盒膜面，待洗涤液完全渗入膜面后，检测人前列腺特异性抗原层析器信号值，通过仪器结合定标卡信息计算检测样本人前列腺特异性抗原浓度，即可定量判定其质量浓度。
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