CN113588610B - 用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液及其制备方法与应用 - Google Patents
用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113588610B CN113588610B CN202110826363.0A CN202110826363A CN113588610B CN 113588610 B CN113588610 B CN 113588610B CN 202110826363 A CN202110826363 A CN 202110826363A CN 113588610 B CN113588610 B CN 113588610B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- detection sensitivity
- pretreatment liquid
- antibody
- immunofluorescence detection
- filtering membrane
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 64
- 238000001914 filtration Methods 0.000 title claims abstract description 58
- 239000012528 membrane Substances 0.000 title claims abstract description 58
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 title claims abstract description 39
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 6
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 claims abstract description 25
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 claims abstract description 25
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 18
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims abstract description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000002886 autophagic effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 23
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 23
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 15
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 8
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 8
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 7
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 6
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 claims description 6
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 5
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 5
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 4
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 4
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 claims description 4
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 4
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 claims description 3
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 15
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 101100537532 Rattus norvegicus Tnni3 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000011056 performance test Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000647 trehalose group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液及其制备方法与应用，用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液包括溶剂和溶质，所述溶剂为缓冲液Tris‑HCL，所述Tris‑HCL的浓度为50Mm/L‑100Mm/L，所述溶质包括2g/L‑6g/L的表面活性剂，1g/L‑5g/L的PVP，3g/L‑6g/L的PEG6000，20g/L‑60g/L的糖类，30g/L‑60g/L的惰性蛋白，1mg/L‑5mg/L的异噬性抗体，1mg/L‑5mg/L抗红细胞抗体，0.5g/L‑1g/L的防腐剂。过滤膜前处理液具有提高微流控芯片检测的灵敏度的优点。
Description
技术领域
本发明涉及属于微流控免疫荧光检测技术领域，更具体地说，它涉及一种用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液及其制备方法与应用。
背景技术
微流控技术是一种在微米尺度空间对流体进行操控为主要特征的科学技术，其技术核心是微流控芯片。微流控芯片具有检测速度快、高通量、灵敏度高、试剂消耗少等优势，近年来迅速发展。20世纪90年代，A.Mans等采用芯片提出了微全分析系统(微流控芯片)的概念，在该系统中，分析样品的进样、预处理、化学反应、分离和检测等功能实现了装备的微型化、自动化和一体化。
微流控免疫荧光检测芯片的检测原理为：全血通过检测卡上的过滤膜，将血细胞与血浆分离后，血浆流入检测卡中的混合区，其中血浆中的抗原或抗体通过与混合区中荧光标记抗体发生免疫反应，随后荧光抗体与血浆中的抗原或抗体随反应液流入微结构的流道中被固定在流道中的另一抗体捕获，通过测定其荧光强度计算待测物质的浓度。进样和对过滤膜前处理是微流控芯片工作的前两个环节。
高灵敏度是微流控芯片的主要优势之一，但也是最大的挑战之一。市面上对许多项目的检测都有极高的灵敏度需求，如BNP检测下限为5pg，cTnI检测下限为50pg等，这对微流控芯片工作的每个环节都有极高要求。为提高检测微流控检测的灵敏度，研究者们主要从改变抗体交联体系和荧光材料等方面入手。过滤膜承担着对样本前处理这一重要环节，目前普遍所用过滤膜仅发挥着从过滤红细胞和促进血浆流动两个作用。实验室前期的研究表明，过滤膜前处理的配方对项目的检测灵敏度起关键影响，对于检测阈值较高的项目如MYO的检测，通过优化交联体系等方法使用普通过滤膜仅能达到要求，但对于检测灵敏度较高的项目使用普通过滤膜则稍显不佳，因此，研制其处理配方至关重要。
发明内容
为了提高微流控芯片检测的灵敏度，本发明提供一种用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液。
一种用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液，包括溶剂和溶质，所述溶剂为缓冲液Tris-HCL，所述Tris-HCL的浓度为50Mm/L-100Mm/L，所述溶质包括2g/L-6g/L的表面活性剂，1g/L-5g/L的PVP，3g/L-6g/L的PEG6000，20g/L-60g/L的糖类，30g/L-60g/L的惰性蛋白，1mg/L-5mg/L的异噬性抗体，1mg/L-5mg/L抗红细胞抗体，0.5g/L-1g/L的防腐剂。
通过采用上述技术方案，缓冲液Tris-HCL提供血浆中的抗原抗体与芯片底板上包被的抗体抗原抗体免疫反应最佳的PH,离子强度；表面活性剂和PVP促进血浆流动，有利于荧光物质分散；PEG6000和糖类物质均能增强抗原抗体反应灵敏度；惰性蛋白能够对过滤膜起到封闭作用，减少非特异性吸附，增强抗原抗体反应灵敏度；异噬性抗体减少对非特异性抗原产生的反应；抗红细胞抗体提高红细胞过滤效率，减少红细胞破裂后物质对检测产生的干扰；防腐剂可提高前处理液各种成分的保存时间。
优选的，所述表面活性剂为Triton X-100、Tween20、S10、S11中的一种或者多种。
通过采用上述技术方案，Triton X-100、Tween20、S10、S11中的一种或者多种都能控制血浆流动速度，但是Triton X-100的效果最佳。
优选的，所述糖类物质为葡萄糖、蔗糖、果糖、海藻糖的一种或多种。
通过采用上述技术方案，葡萄糖、蔗糖、果糖、海藻糖的一种或多种都能增强抗原抗体反应灵敏度，但是葡萄糖的使用效果最佳。
优选的，所述惰性蛋白为BSA、酪蛋白、脱脂奶粉等的一种或多种。
通过采用上述技术方案，BSA、酪蛋白、脱脂奶粉等的一种或多种都能对过滤膜起到封闭作用，减少非特异性吸附，增强抗原抗体反应灵敏度，但是BSA的使用效果最佳。
优选的，所述防腐剂为PC300、叠氮化钠中的一种或者多种。
通过采用上述技术方案，PC300、叠氮化钠中的一种或者多种都能起到防腐剂的作用，但是PC300的使用效果最佳。
优选的，所述糖类为葡萄糖，所述惰性蛋白为BSA，所述葡萄糖：PEG6000：BSA的比值为10：1：10。
通过采用上述技术方案，BSA、PEG6000和葡萄糖三种物质的组合能够显著提高对血浆中的抗原抗体检测灵敏度，当海藻糖：PEG6000：BSA的比值为10：1：10时，效果最佳。
优选的，所述溶质包括：6g/L的Triton X-100，5g/L的PVP,6g/L的PEG6000，60g/L的葡萄糖糖，60g/L的BSA，5mg/L的异噬性抗体,5mg/L抗红细胞抗体,1g/L的PC300。
通过采用上述技术方案，当各种溶质的浓度是上述浓度时，此时对血浆中的抗原抗体的检测结果最佳。
一种用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液的制备方法，包括以下步骤：调节Tris的PH使得PH值为7.8-8.2，将溶质表面活性剂PVP,PEG6000，糖类，惰性蛋白，异噬性抗体,抗红细胞抗体与Tris混合搅拌，直至溶解。
通过采用上述技术方案，先将Tris的PH值进行调节，PH过高或过低都会降低检测信号，然后通过混合搅拌制备出前处理液。
一种用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液的应用，包括以下步骤：在前处理液中放入过滤膜，浸泡5min-10min，取出平置干燥，20-40℃烘干12h-24h后取出，密封保存备用。
通过采用上述技术方案，过滤膜在前处理液中进行浸泡，浸泡时间小于5min，过滤膜未完全均匀吸收溶液，导致同批次过滤膜间差异较大，影响检测重复性；浸泡时间大于10min过滤膜过分吸收溶液膨胀，部分溶解于溶液中，影响过滤膜形状，使其形状不适用于底板；烘干后进行保存，经过前处理液的过滤膜的增强了微流控芯片检测的灵敏度，使得血浆中的抗原抗体的检测更加精准。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1.本发明通过采用Tris-HCL为溶剂，溶质包括：表面活性剂，PVP，PEG6000，糖类，惰性蛋白，异噬性抗体，抗红细胞抗体防腐剂；缓冲液Tris-HCL提供抗血浆中的待测抗原抗体与芯片底板上包被的抗原抗体反应最佳的PH,离子强度；表面活性剂和PVP促进血浆流动，有利于荧光物质分散；PEG6000和糖类物质均能增强抗原抗体反应灵敏度；惰性蛋白能够对过滤膜起到封闭作用，减少非特异性吸附，增强抗原抗体反应灵敏度；异噬性抗体减少对非特异性抗原产生的反应；抗红细胞抗体提高红细胞过滤效率，减少红细胞破裂后物质对检测产生的干扰；防腐剂可提高前处理液各种成分的保存时间。
2.本发明中葡萄糖：PEG6000：BSA的比值为10：1：10，BSA、PEG6000和葡萄糖三种物质起协同作用能够显著提高检测灵敏度，当葡萄糖：PEG6000：BSA的比值为10：1：10时，效果最佳；
3.本发明中的前处理液应用时，将过滤膜放入前处理液中，浸泡5min-10min，取出平置干燥，20-40℃烘干12h-24h后取出，密封保存备用，经过浸泡后的过滤膜提高了过滤膜检测的稳定性。
具体实施方式
现免疫荧光检测常用过滤膜仅发挥着促进样本流动的作用，忽视了其前处理环节对检测可发挥的潜在价值。本发明旨在对市面上免疫荧光检测产品所用以玻璃纤维为原材料的过滤膜研制了一种过滤膜前处理液配方，经所述处理液处理的过滤膜使用在微流控芯片上能够提高靶标物的检测灵敏度；降低玻璃纤维对靶标物的吸附，减少非特异性吸附，降低检测CV；促进血浆流动速度缩短检测时长；高效过滤红细胞减少其对检测的影响。
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明原料来源均为市售。
实施例
实施例1-7
以下实施例1为例进行说明，用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液的制备方法，包括以下步骤：
(1)配制浓度为50Mm/L的缓冲液Tris-HCL，用4M/L的盐酸调节PH值；
(2)称取表面活性剂PVP，PEG6000，糖类，惰性蛋白，异噬性抗体,抗红细胞抗体于干净的烧杯中；
(3)然后将缓冲液Tris-HCL加入步骤(2)的烧杯中，在磁力搅拌器上以300-500rpm搅拌速度搅拌20min至物质全部溶解，定容至100ml后继续搅拌10min。
实施例1-6的溶剂浓度、溶剂PH值以及各溶质浓度的取值参见表1、表2以及表3。
表1为实施例1-5的溶剂浓度、溶剂PH值以及各溶质浓度表
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | |
| 缓冲液PH | 7.8 | 7.9 | 8 | 8.1 | 8.2 |
| Tris-HCL(mM/L) | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 |
| Triton X-100(g/L) | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| PVP(g/L) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| PEG6000(g/L) | 3 | 3.5 | 4 | 5 | 6 |
| 葡萄糖(g/L) | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 |
| BSA(g/L) | 30 | 40 | 45 | 50 | 60 |
| 异噬性抗体(g/L) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 抗红细胞抗体(g/L) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| PC300(g/L) | 0.5 | 0.6 | 0.8 | 0.9 | 1 |
表2为实施例6的溶剂浓度、溶剂PH值以及溶质浓度表
表3为实施例7的溶剂浓度、溶剂PH值以及溶质浓度表
| 实施例6 | |
| 缓冲液PH | 8.2 |
| Tris-HCL(mM/L) | 100 |
| Triton X-100(g/L) | 6 |
| PVP(g/L) | 5 |
| PEG6000(g/L) | 6 |
| 葡萄糖(g/L) | 60 |
| 脱脂奶粉(g/L) | 60 |
| 异噬性抗体(mg/L) | 5 |
| 抗红细胞抗体(mg/L) | 5 |
| PC300(g/L) | 1 |
实施例1-6中的表面活性剂可以替换成Triton X-100、Tween20、S10、S11中的一种或者多种；糖类物质可替换成葡萄糖、蔗糖、果糖、海藻糖的一种或多种；惰性蛋白可替换成BSA、酪蛋白、脱脂奶粉等的一种或多种。
对比例
对比例1-2
与实施例1的不同之处在于：溶剂浓度、溶剂PH值以及溶质浓度取值不同。对比例1-2的溶剂浓度、溶剂PH值以及溶质浓度的取值参见表4。
表4为对比例1-2的溶剂浓度、溶剂PH值以及溶质浓度表
| 对比例1 | 对比例2 | |
| 缓冲液PH | 7 | 9 |
| Tris-HCL(mM/L) | 20 | 200 |
| Triton X-100(g/L) | 1 | 10 |
| PVP(g/L) | 0.5 | 10 |
| PEG6000(g/L) | 1 | 10 |
| 葡萄糖(g/L) | 10 | 100 |
| BSA(g/L) | 10 | 100 |
| 异噬性抗体(mg/L) | 0.5 | 10 |
| 抗红细胞抗体(mg/L) | 0.5 | 10 |
| PC300(g/L) | 0.1 | 5 |
对比例3
常规的前置液的配方为0.1％-2％的表面活性剂，该对比例中采用的配比为1％的表面活性剂。
用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液的应用，包括以下步骤：将实施例1-7以及对比例1-3制备得到的前处理液中放入过滤膜，浸泡5-10min；然后将过滤膜取出平置干燥，在20-40℃烘干12h-24h后取出，密封保存备用。实施例1-7以及对比例1-3的浸泡时长、烘干温度以及时长见表5。
表5实施例1-7以及对比1-3的浸泡时长、烘干温度以及时长表
性能检测试验
将在实施例1-7以及对比例1-3的前制备液中放入过滤膜，浸泡5min-10min，取出平置干燥，20-40℃烘干12h-24h后取出，然后将过滤膜放置在微流控芯片上进行检验，检验结果见表6。
表6多个过滤膜检验结构表
根据表6，可以看出经过实施例1-7与对比例3的前处理液处理的过滤膜的检测结果：荧光信号增强，背景信号减弱，荧光物质也没有团聚，流动时长也相对较短，经过本发明处理过的过滤膜不仅能提高血浆的流动速度，还能提高微流控芯片检测的灵敏度。
根据表6，经过对比例1-2与实施例1-7的前处理液处理的过滤膜的检测结果相比，当前处理液的PH大于8.2或小于7.8，缓冲液的浓度小于50mM/L或者大于100mM/L，PVP的浓度小于1g/L或者大于5g/L，PEG6000的浓度小于3g/L或者大于6g/L，糖类的浓度小于20g/L或者60g/L，惰性蛋白的浓度小于30g/L或者大于60g/L，异噬性抗体的浓度小于1ng/L或者大于5ng/L，抗红细胞抗体的浓度小于1ng/L或者大于5ng/L，防腐剂的浓度小于0.5g/L或者大于1g/L时，检测结果显示荧光信号减弱，背景信号增强，荧光物质团聚，流动时长增加。
根据表1和表2可知，实施例5与实施例6相比，除了将葡萄糖替换成海藻糖以外，其他条件相同，根据表6可知，经过实施例6与实施例5的前处理液处理的过滤膜的检测结果相比，荧光信号减弱，背景信号增加。
根据表1和表3可知，实施例5与实施例7相比，除了将BSA替换成脱脂奶粉以外，其他条件相同，根据表6可知，经过实施例7与实施例5的前处理液处理的过滤膜的检测结果相比，荧光信号减弱，背景信号增加。
所以当前处理液中的糖类为葡萄糖，惰性蛋白为BSA时，检测结果最佳，主要原理是因为葡萄糖与BSA以及PEG6000发生协同作用，共同提高了过滤膜的检测效果。
根据表6可知，实施例1-3与实施例4-5的检测结果相比，葡萄糖：PEG6000：BSA的浓度比值为10：1：10时，荧光信号最佳。
根据表6可知，实施例1-5各溶质的原料相同，但当溶质是以下配比：6g/L的TritonX-100，5g/L的PVP,6g/L的PEG6000，60g/L的葡萄糖糖，60g/L的BSA，5mg/L的异噬性抗体,5mg/L抗红细胞抗体,1g/L的PC300时，检测结果显示荧光信号最强，背景信号最低，荧光物质未团聚，流动时长较低，此时的配比是本发明的最佳配比。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (9)
1.一种用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液，其特征在于：包括溶剂和溶质，所述溶剂为缓冲液Tris-HCL，所述Tris-HCL的浓度为50Mm/L-100Mm/L，所述溶质包括2g/L-6g/L的表面活性剂，1g/L-5g/L的PVP，3g/L-6g/L的PEG6000，20g/L-60g/L的糖类，30g/L-60g/L的惰性蛋白，1mg/L-5mg/L的异噬性抗体，1mg/L-5mg/L抗红细胞抗体，0.5g/L-1g/L的防腐剂。
2.根据权利要求1所述的用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液，其特征在于：所述表面活性剂为Triton X-100、Tween20、S10、S11中的一种或者多种。
3.根据权利要求2所述的用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液，其特征在于：所述糖类为葡萄糖、蔗糖、果糖、海藻糖中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液，其特征在于：所述惰性蛋白为BSA、酪蛋白、脱脂奶粉中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液，其特征在于：所述防腐剂为PC300、叠氮化钠中的一种或者多种。
6.根据权利要求4所述的用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液，其特征在于：所述糖类为葡萄糖，所述惰性蛋白为BSA，所述葡萄糖：PEG6000：BSA的比值为10：1：10。
7.根据权利要求6所述的用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液，其特征在于：所述溶质包括：6g/L的Triton X-100，5g/L的PVP,6g/L的PEG6000，60g/L的葡萄糖，60g/L的BSA，5mg/L的异噬性抗体,5mg/L抗红细胞抗体,1g/L的PC300。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：调节缓冲液Tris-HCL的pH使得pH值为7.8-8.2，将表面活性剂、PVP、PEG6000、糖类、惰性蛋白、异噬性抗体、抗红细胞抗体与缓冲液Tris-HCL混合搅拌，直至溶解。
9.一种如权利要求1-7任一项所述的用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液的应用，其特征在于：在前处理液中放入过滤膜，浸泡5min-10min，取出平置干燥，20-40℃烘干12h-24h后取出，密封保存备用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110826363.0A CN113588610B (zh) | 2021-07-21 | 2021-07-21 | 用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110826363.0A CN113588610B (zh) | 2021-07-21 | 2021-07-21 | 用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液及其制备方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113588610A CN113588610A (zh) | 2021-11-02 |
| CN113588610B true CN113588610B (zh) | 2024-02-02 |
Family
ID=78248856
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110826363.0A Active CN113588610B (zh) | 2021-07-21 | 2021-07-21 | 用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113588610B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000088854A (ja) * | 1998-09-11 | 2000-03-31 | Uma:Kk | 微生物（細菌，眞菌，ウイルス，産生物質）の高感度な免疫 学的検出測定法および定量方法 |
| CN1354258A (zh) * | 2000-11-17 | 2002-06-19 | 缪金明 | 可快速检测的层析生物芯片技术 |
| CN103308683A (zh) * | 2012-03-14 | 2013-09-18 | 上海新波生物技术有限公司 | 糖类抗原19-9时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒 |
| JP2016099131A (ja) * | 2014-11-18 | 2016-05-30 | 古河電気工業株式会社 | 免疫アッセイによる微生物の検出方法、免疫アッセイに付す検体の処理方法、免疫アッセイ用検体前処理液、及びイムノクロマトグラフィー用試験キット |
| CN106855573A (zh) * | 2016-08-23 | 2017-06-16 | 广东优尼德生物科技有限公司 | 检测人前列腺特异性抗原斑点金渗滤试剂盒及其检测方法 |
| CN109655617A (zh) * | 2019-01-18 | 2019-04-19 | 大连理工大学 | 一种多指标联合检测标志性蛋白纸芯片 |
-
2021
- 2021-07-21 CN CN202110826363.0A patent/CN113588610B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000088854A (ja) * | 1998-09-11 | 2000-03-31 | Uma:Kk | 微生物（細菌，眞菌，ウイルス，産生物質）の高感度な免疫 学的検出測定法および定量方法 |
| CN1354258A (zh) * | 2000-11-17 | 2002-06-19 | 缪金明 | 可快速检测的层析生物芯片技术 |
| CN103308683A (zh) * | 2012-03-14 | 2013-09-18 | 上海新波生物技术有限公司 | 糖类抗原19-9时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒 |
| JP2016099131A (ja) * | 2014-11-18 | 2016-05-30 | 古河電気工業株式会社 | 免疫アッセイによる微生物の検出方法、免疫アッセイに付す検体の処理方法、免疫アッセイ用検体前処理液、及びイムノクロマトグラフィー用試験キット |
| CN106855573A (zh) * | 2016-08-23 | 2017-06-16 | 广东优尼德生物科技有限公司 | 检测人前列腺特异性抗原斑点金渗滤试剂盒及其检测方法 |
| CN109655617A (zh) * | 2019-01-18 | 2019-04-19 | 大连理工大学 | 一种多指标联合检测标志性蛋白纸芯片 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 斑点酶免疫渗滤法定量检测雌三醇的实验研究;薛添 等;细胞与分子免疫学杂志;29(08);874-876, 881 * |
| 检测3种侵袭性真菌感染相关抗体的蛋白质芯片法;马春芳 等;临床检验杂志;31(11);825-828 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113588610A (zh) | 2021-11-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5136095A (en) | Reversible agglutination mediators | |
| US3551555A (en) | Coated immunochemical reagent particles and process of preparation | |
| EP2479268A1 (en) | Dissociation method and dissociation agent for avidin and biotin | |
| CN110244036B (zh) | 一种用于免疫检测的微流控检测芯片及方法 | |
| EP0849595A1 (de) | Synthetische Partikel als Agglutinationsreagenzien | |
| US20230393042A1 (en) | Pretreatment method, preservation method, automatic treatment system and detection method for urine sample | |
| KR101451733B1 (ko) | 아플라톡신 ｂ1 검출용 표지물질 및 이를 포함한 아플라톡신 ｂ1 검출용 키트 | |
| CN111830146B (zh) | 一种干血片中25-羟基维d的lc-ms/ms高通量检测方法及试剂盒 | |
| CA2004773A1 (en) | Enzyme-linked immunoassay for measurement of cyclosporin a levels in whole blood samples | |
| CN106841603B (zh) | 一种利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素b1的方法 | |
| CN113588610B (zh) | 用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液及其制备方法与应用 | |
| CN114487420A (zh) | 一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒 | |
| CN114720684A (zh) | 一种白介素细胞因子多重流式荧光检测试剂盒、检测方法及应用 | |
| US4812401A (en) | Reversible agglutination mediators for separating cells from whole blood | |
| Sokoloff et al. | Rapid spectrophotometric assay of dodecyl sulfate using acridine orange | |
| CN108359642B (zh) | 一种虾原肌球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用 | |
| CN112143484B (zh) | 一种荧光微球活化剂复溶液及其应用 | |
| CN114113287A (zh) | 一种血清蛋白制备方法及血清蛋白质组质谱检测方法 | |
| JPH02503599A (ja) | 固相タンパク質アッセイ | |
| Bari et al. | Development of a microparticle‐enhanced nephelometric immunoassay for the quantification of beta‐casein in milk | |
| Kanaya et al. | Determination of low concentrations of protein by the biuret method using the “stopped-flow time difference analysis” technique | |
| CN110672834A (zh) | 一种快速检测样品中铅含量的试剂盒 | |
| CN110632294A (zh) | 一种快速检测样品中镉含量的试剂盒 | |
| CN109439654A (zh) | 一种免前处理自动化提取大体积全血dna的方法 | |
| WO2013180657A1 (en) | Rapid high-sensitivity affinity ligand-based constrained cohydration chromatography assays |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |