CN109655617A - 一种多指标联合检测标志性蛋白纸芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多指标联合检测标志性蛋白纸芯片，属于疾病检测技术领域。纸芯片分为两部分：检测通道区和吸水区。检测通道区通过在硝酸纤维素膜上喷蜡打印矩形蜡区分隔出相邻蜡区之间的亲水性检测通道。检测通道分样品区、反应区及显色区，为检测反应的场所。吸水区通过吸水滤纸与检测区部分重叠，提供层析动力并吸收多余反应物。样品中的标志性蛋白通过层析至反应区，与胶体金包被的特异抗体结合；显色区将检测结果以肉眼可见的红色条带方式呈现，使得纸芯片能适用于日常家庭诊断。本发明具有较高准确率，为疾病相关标志性蛋白的联合检测提供了一种简单快速的工具。

Description

一种多指标联合检测标志性蛋白纸芯片
技术领域
本发明属于疾病检测领域，是基于胶体金技术及喷蜡打印制备微流控纸芯片技术，设计用于联合检测两种以上标志性蛋白的家庭用诊断装置。
背景技术
对于肿瘤标志物等标志性蛋白指标的检测，传统方法如酶联免疫吸附试验，存在检测步骤繁琐且耗时较长；每次仅能检测一种指标，导致特异性不强，假阳性率较高；最终显示检测结果需要借助一定的分析设备，从而限制了其适用场所。针对这些缺点，本发明提出一种结合喷蜡打印制备微流控纸芯片通道及胶体金标记特异性抗体的多指标联合检测纸质微流控芯片(简称纸芯片)，具有以下优点：1、使用纸质基材有效降低成本；2、通过设计合理的通道整合两个及以上检测指标，提高检测效率并降低假阳性；3、利用纸质的毛细作用驱动液体流动并发生反应，操作简单。4，使用免疫胶体金技术作为示踪物，可以实现检测结果的肉眼可见，无需专用分析设备。
发明内容
本发明提供了一种多指标联合检测标志性蛋白纸芯片。以硝酸纤维素膜和滤纸作为基材构建纸质微流控芯片，结合胶体金免疫示踪法实现肉眼检测，用于两种及以上标志性蛋白指标的联合检测，适用于日常家庭诊断。
本发明的技术方案：
一种多指标联合检测标志性蛋白纸芯片，所述的多指标联合检测标志性蛋白纸芯片包括两部分：检测通道区1和吸水区2；其中检测通道区1的基材为硝酸纤维素膜，吸水区2基材为吸水性滤纸；
检测通道区1包括N条矩形的蜡区3以及由蜡区3形成的亲水性的检测通道4；每个检测通道4分为样品区I、反应区II、显色区III三部分；样品区I用来施加样品液体；反应区II包被有针对标志性蛋白的胶体金标记A抗体；显色区III含检测线6和对照线7，二者的宽度与检测通道4一致，其中检测线6包被针对标志性蛋白的B抗体，对照线7靠近吸水区2一侧，且包被针对A抗体的二抗；
检测通道区1的显色区III与吸水区2滤纸相连，滤纸置于硝酸纤维素膜上层，两者重叠2mm，且共同粘附在聚氯乙烯底板5上。
所述的样品区I需要使用喷涂预处理液a进行喷涂处理，之后干燥15分钟，防止由于样品过酸或过碱的pH对实验结果造成影响；其中预处理液a为含2％牛血清白蛋白、0.5％Tween-20，pH为7.8的Tris-HCL缓冲液。
所述的反应区II包被前需要使用喷涂预处理液b进行喷涂处理，之后干燥 15分钟，以提高胶体金标记A抗体的释放效率；预处理液b为含有3％蔗糖、2％牛血清白蛋白、0.5％Tween-20，pH为7.6的Tris-HCL缓冲液。
所述的蜡区3由喷蜡打印机打印而成，打印蜡区3后的硝酸纤维素膜需要置于加热板上120℃下加热3分钟，至蜡融化后形成疏水屏障。
本发明的有益效果：(1)本发明将喷蜡打印法与胶体金技术相结合，能够联合多种标志性蛋白检测提高准确率，同时实现检测结果的肉眼可见，适用于家庭诊断。(2)与传统胶体金试纸相比，将样品垫、金标垫也集中到硝酸纤维素膜上，从而简化了装置的生产组装过程。(3)依照不同的标志性蛋白种类数，可以扩展相应的检测通道数。
附图说明
图1是纸芯片组装结构示意图。
图2是纸芯片内部结构示意图。
图3是检测结果示意图。
图中：1检测通道区；2吸水区；3蜡区；4检测通道；5聚氯乙烯底板；6 检测线；7对照线；I样品区；II反应区；III显色区。A为阳性结果，B为阴性结果，C为无效结果。
具体实施方式
以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。
一种多指标联合检测标志性蛋白纸芯片，如图1，图2所示，多指标联合检测标志性蛋白的纸芯片由两部分组成：检测通道区1与吸水区2。检测通道区由硝酸纤维素膜为基材，长46mm，宽9mm，使用喷蜡打印机打印长36mm宽1 mm的三条蜡区3，打印蜡区后的硝酸纤维素膜置于加热板上120℃加热3分钟，至蜡融化后形成疏水屏障，蜡区3之间的区域即为两条独立的亲水性检测通道4，长36mm宽2-3mm，构成反应发生的场所并避免联合检测过程中的互相干扰；吸水区由滤纸构成，用来吸收多余的反应物并提供层析动力。滤纸尺寸长30 mm，宽9mm，能够完全吸收多余反应物。检测通道区1与吸水区2相连，两者共同粘附在聚氯乙烯底板5上，长74mm宽9mm。其中吸水区2的吸水纸置于检测通道区1的硝酸纤维素膜上层，重叠2mm。
其中每一个检测通道分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三部分。第Ⅰ部分为样品区，用来施加样品液体。长度12mm，可以插入临床液体样品中或者滴加40-60μl样品。需要对样品区使用预处理液a进行喷涂预处理，以避免样品pH值对检测效果的影响，所用预处理液a为含2％牛血清白蛋白、0.5％Tween-20pH为7.8的 Tris-HCL缓冲液。其中牛血清白蛋白是常用的封闭剂，能够有效封闭膜上的孔隙防止非特异性结合；所用Tween 20为表面活性剂的一种，有利于提高材料的表面活性，加快层析速率。两条检测通道的样品区相互融合，以避免样品分布及层析不均匀。第Ⅱ部分反应区长度10mm，包被有针对标志性蛋白的胶体金标记A抗体。包被前需要对反应区使用预处理液b进行喷涂预处理，以提高反应复合物释放效率。预处理液b为含有3％蔗糖、2％牛血清白蛋白、 0.5％Tween-20，pH为7.6的Tris-HCL缓冲液。第Ⅲ部分为显色区，含有检测线6与对照线7，宽度与检测通道一致，长度均为1mm。其中检测线6距离第Ⅱ部分15mm，包被了针对标志性蛋白上未被胶体金标记A抗体结合的位点的 B抗体；对照线7与检测线相距约5mm，靠近吸水区2一侧，包被针对A抗体的二抗。所用B抗体及二抗依靠静电作用力吸附在显色区III的硝酸纤维素膜上，浓度均为1mg/ml。
所述多指标联合检测标志性蛋白纸芯片的制备过程为：
1.使用Phaser 8560DN喷蜡打印机在硝酸纤维素膜中间打印2-3mm蜡区3，置于加热板上120℃加热3分钟，至蜡融化后形成疏水屏障。
2.分别将预处理液a、b喷涂在膜的Ⅰ、Ⅱ区域的检测通道4上，37℃干燥 15分钟。
3.将制备好的胶体金标记A抗体喷涂在第Ⅱ部分上，浓度为10μg/ml；同时在检测线6和对照线7分别包被检测B抗体和二抗，4℃干燥。
4.干燥后的硝酸纤维素膜粘附在聚氯乙烯底板5上，吸水纸置于第Ⅲ部分之后，与硝酸纤维素膜重叠2mm。
所述多指标联合检测标志性蛋白纸芯片的使用操作过程为：
将纸芯片第I部分样品区插入样品液体中，或者滴加少量样品在样品区，反应时间为5-10分钟。样品会在毛细作用下发生层析，依次经过检测通道的反应区Ⅱ、显色区III的检测线6与对照线7，多余的反应物被吸水区2的滤纸吸收。在流经第Ⅱ部分的反应区时，与反应区II上包被的胶体金标记A抗体结合形成免疫复合物并继续向吸水区3方向层析；在流经第Ⅲ部分的显色区时，检测线6 上包被的针对标志性蛋白的B抗体能够识别抗原上未被胶体金标记A抗体结合的其他位点，从而将抗原-胶体金标记A抗体复合物捕获，而未与抗原结合的胶体金标记A抗体则继续流动至对照线7，与对照线7上包被的针对A抗体的二抗结合。当被捕获的胶体金标记A抗体达到一定浓度时便会聚集显示红色。因此，如图3所示，A阳性结果为检测线6与对照线7均有显色，B阴性结果中样本由于没有抗原作为中介导致检测线6的B抗体无法结合胶体金标记A抗体，所以不显示检测线6而只显示对照线7。而当胶体金标记A抗体失败时，对照线6与检测线7均无着色，检测为无效结果C。
本发明可以依据需求平行于所述检测区添加通道结构，用以实现对三种及以上标志物蛋白的联合检测。

Claims (5)

1.一种多指标联合检测标志性蛋白纸芯片，其特征在于，所述的多指标联合检测标志性蛋白纸芯片包括两部分：检测通道区(1)和吸水区(2)；其中检测通道区(1)的基材为硝酸纤维素膜，吸水区(2)基材为吸水性滤纸；
检测通道区(1)包括N条矩形的蜡区(3)以及由蜡区(3)形成的亲水性的检测通道(4)；每个检测通道(4)分为样品区(I)、反应区(II)、显色区(III)三部分；样品区(I)用来施加样品液体；反应区(II)包被有针对标志性蛋白的胶体金标记A抗体；显色区(III)含检测线(6)和对照线(7)，二者的宽度与检测通道(4)一致，其中检测线(6)包被针对标志性蛋白的B抗体，对照线(7)靠近吸水区(2)一侧，且包被针对A抗体的二抗；
检测通道区(1)的显色区(III)与吸水区(2)滤纸相连，滤纸置于硝酸纤维素膜上层，两者重叠2mm，且共同粘附在聚氯乙烯底板(5)上。
2.根据权利要求1所述的一种多指标联合检测标志性蛋白纸芯片，其特征在于，所述的样品区(I)需要使用喷涂预处理液a进行喷涂处理，之后干燥15分钟，防止由于样品过酸或过碱的pH对实验结果造成影响；其中预处理液a为含2％牛血清白蛋白、0.5％Tween-20，pH为7.8的Tris-HCL缓冲液。
3.根据权利要求1或2所述的一种多指标联合检测标志性蛋白纸芯片，其特征在于，所述的反应区(II)包被前需要使用喷涂预处理液b进行喷涂处理，之后干燥15分钟，以提高胶体金标记A抗体的释放效率；预处理液b为含有3％蔗糖、2％牛血清白蛋白、0.5％Tween-20，pH为7.6的Tris-HCL缓冲液。
4.根据权利要求1或2所述的一种多指标联合检测标志性蛋白纸芯片，其特征在于，所述的蜡区(3)由喷蜡打印机打印而成，打印蜡区(3)后的硝酸纤维素膜需要置于加热板上120℃下加热3分钟，至蜡融化后形成疏水屏障。
5.根据权利要求3所述的一种多指标联合检测标志性蛋白纸芯片，其特征在于，所述的蜡区(3)由喷蜡打印机打印而成，打印蜡区(3)后的硝酸纤维素膜需要置于加热板上120℃下加热3分钟，至蜡融化后形成疏水屏障。
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