CN111398587B - 一种检测宫颈癌的胶体金侧向层析试纸条及其制备方法 - Google Patents

一种检测宫颈癌的胶体金侧向层析试纸条及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测宫颈癌的胶体金侧向层析试纸条及其制备方法，属于免疫化学检测技术领域，所述胶体金侧向层析试纸条包括PVC底板、硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫和吸收垫；本发明所述胶体金侧向层析试纸能够能够克服背景信号的干扰(组分间杂交反应)，同时特异性检测宫颈癌miRNA标志物(miR‑21、miR‑196a)和蛋白类标志物(HPV E6、HPV E7)。本发明的宫颈癌检测胶体金侧向层析试纸条比目前市场上普遍采用的PCR技术、酶联免疫分析技术具有更好的检测效能。

Description

一种检测宫颈癌的胶体金侧向层析试纸条及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫化学检测技术领域，尤其涉及一种检测宫颈癌的胶体金侧向层析试纸条及其制备方法。
背景技术
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。目前，针对宫颈癌的筛查方法主要包括VIA/VILI(Visual inspecT1on with aceT1c acid and iodine，醋酸/碘染色肉眼观察法)、宫颈细胞学检查法、阴道镜法等，但这些方法不能识别感染HPV基因型的风险度，同时检测需要特定的仪器和专门的技术人员操作，不适于宫颈癌的早期快速筛查。美国ArborVita公司研发的OncoE6癌蛋白检测技术(AVC,Sunnyvale,CA,USA)是一种“试纸条检测”形式的捕获实验，可在2.5h内分别检出HPV 16和18型E6癌蛋白。ChrisT1na等通过一种新型ELISA方式，可同时检测HPV-16，18，45中的E7蛋白。但是上述现有技术仅对蛋白类肿瘤标志物进行检测，检测对象单一、检测的诊断效能不足。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测宫颈癌的胶体金侧向层析试纸条及其制备方法，本发明的胶体金侧向层析试纸条能够同时检测宫颈癌miRNA组和蛋白类两种不同类型的肿瘤标志物组，能够提高宫颈癌筛查的诊断效能。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种检测宫颈癌的胶体金侧向层析试纸条，所述胶体金侧向层析试纸条包括PVC底板、硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫和吸收垫；所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘附在所述PVC底板上并采用搭接的方式连接；
所述硝酸纤维素膜设有检测区T区和质控区C区；所述检测区T区包括T1线、T2线、T3线和T4线；所述质控区C区包括C1线和C2线；
以硝酸纤维素长边为行，所述T1线、T2线、T3线、T4线、C1线和C2线呈2行3列分布；所述C1线和C2线分列两行，分布于每行的靠近吸收垫的一端；
所述T1线上喷涂有T1线溶液；所述T1线溶液包括miR-21捕获探针；所述miR-21捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述miR-21捕获探针的3’端经生物素标记；
所述T2线上喷涂有T2线溶液；所述T2线溶液包括miR-196a捕获探针；所述miR-196a捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述miR-196a捕获探针的3’端经生物素标记；
所述T3线喷涂有T3线溶液；所述T3线溶液包括鼠抗HPV E6蛋白单克隆抗体；
所述T4线喷涂有T4线溶液；所述T4线溶液包括鼠抗HPV E7蛋白单克隆抗体；
所述C1线喷涂有C1线溶液；所述C1线溶液包括miR-21控制探针和miR-196a控制探针；所述miR-21控制探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述miR-196a控制探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述miR-21控制探针和miR-196a控制探针的3’端分别经生物素标记；
所述C2线喷涂有C2线溶液；所述C2线溶液包括二抗；
所述结合垫吸附有胶体金-检测探针偶联物；所述胶体金-检测探针偶联物包括胶体金-miR-21检测探针偶联物、胶体金-miR-196a检测探针偶联物、胶体金-HPV E6蛋白-牛血清蛋白偶联物和胶体金-HPV E7蛋白-牛血清蛋白偶联物；所述miR-21检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述miR-196a检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述miR-21检测探针和miR-196a检测探针的5’端分别经巯基修饰。
优选的，所述T3线溶液中鼠抗HPV E6蛋白单克隆抗体的浓度为0.8～1.2mg/mL；所述T4线溶液中鼠抗HPV E7蛋白单克隆抗体的浓度为0.8～1.2mg/mL。
优选的，所述搭接的重叠部分的长度分别为2～3mm。
优选的，从结合垫到吸收垫方向行依次分布有T1线、T3线和C1线，第二行依次分布有T2线、T4线和C2线；每个相邻位点间距为4～6mm。
优选的，所述吸收垫搭接于所述硝酸纤维膜之上；所述结合垫搭接于所述硝酸纤维素膜之上；所述样品垫搭接于所述结合垫之上。
优选的，胶体金-HPV E6蛋白-牛血清蛋白偶联物或胶体金-HPV E7蛋白-牛血清蛋白偶联物的制备方法，包括以下步骤：
将纳米金溶液、HPV蛋白溶液和牛血清蛋白溶液混合，进行偶联，得到胶体金-HPVE6蛋白-牛血清蛋白偶联物或胶体金-HPV E7蛋白-牛血清蛋白偶联物；所述HPV蛋白为HPVE6蛋白或HPV E7蛋白。
优选的，所述胶体金-miR-21互补序列探针偶联物或胶体金-miR-196a互补序列探针偶联物的制备方法，包括以下步骤：
将纳米金溶液、dATP溶液、十二烷基硫酸钠溶液、NaCl水溶液和miRNA互补序列探针混合，进行偶联，得到胶体金-miR-21互补序列探针偶联物或胶体金-miR-196a互补序列探针偶联物；所述miRNA互补序列探针为miR-21互补序列探针或miR-196a互补序列探针偶联物。
优选的，所述T1线溶液或T2线溶液的制备方法包括以下步骤：将生物素标记的miR-21部分互补序列或miR-196a部分互补序列与链霉亲和素溶液混合，进行培养，得到T1线溶液或T2线溶液。
本发明还提供了上述方案所述检测宫颈癌的胶体金侧流层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1)将硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上，依次固定结合垫、样品垫和吸收垫；
2)在结合垫吸附胶体金-检测探针偶联物，在硝酸纤维素膜的T1线、T2线、T3线、T4线、C1线和C2线处分别喷涂T1线溶液、T2线溶液、T3线溶液、T4线溶液、C1线溶液和C2线溶液，得到检测宫颈癌的胶体金侧流层析试纸条。
优选的，步骤2)中所述T1线溶液、T2线溶液、T3线溶液、T4线溶液、C1线溶液和C2线溶液的喷涂量分别为1μL。
本发明的有益效果：本发明提供一种检测宫颈癌的胶体金侧向层析试纸条，所述胶体金侧向层析试纸条包括PVC底板、硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫和吸收垫；本发明所述结合垫吸附有胶体金修饰的检测探针，所述胶体金-检测探针偶联物包括胶体金-miR-21互补序列探针偶联物、胶体金-miR-196a互补序列探针偶联物、胶体金-HPV E6蛋白-牛血清蛋白偶联物和胶体金-HPV E7蛋白-牛血清蛋白偶联物；所述硝酸纤维素膜设有检测区T区和质控区C区；所述检测区T区包括T1线、T2线、T3线和T4线；所述质控区C区包括C1线和C2线；所述T1线上喷涂有miR-21捕获探针；所述T2线上喷涂有miR-196a捕获探针；所述T3线喷涂有鼠抗HPV E6蛋白单克隆抗体；所述T4线喷涂有鼠抗HPV E7蛋白单克隆抗体。
本发明所述胶体金侧向层析试纸能够能够克服背景信号的干扰(组分间杂交反应)，同时特异性检测宫颈癌miRNA标志物(miR-21、miR-196a)和蛋白类标志物(HPV E6、HPVE7)，特异性达99.8％。当样品溶液中含有肿瘤标志物(miRNA或蛋白质)时，三明治式的键合反应{胶体金偶联的检测探针(抗体)-目标物-捕获探针(抗体)}将标志物和金纳米粒子捕获在侧流式传感器的测试区并呈现出红色，过量的金纳米粒子络合物被捕获在控制区域呈现红色区域。测试区域红色区域的灰度值与样品溶液中肿瘤标志物的浓度成正比例关系，能够用来定量检测样品中标志物的浓度。本发明的宫颈癌检测胶体金侧向层析试纸条比目前市场上普遍采用的PCR技术、酶联免疫分析技术具有更好的诊断效能。本发明的宫颈癌检测胶体金侧向层析试纸条是一种简便的、快速和简单的工具，对宫颈癌生物标志物具有高灵敏度和特异性，能够用于早期癌症的筛查，监测对治疗的反应，并提供在癌症患者的实时预后信息的技术。
附图说明
图1为本发明中用于检测宫颈癌的胶体金侧向层析试纸条的示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种检测宫颈癌的胶体金侧向层析试纸条，所述胶体金侧向层析试纸条包括PVC底板、硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫和吸收垫；所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘附在所述PVC底板上并采用搭接的方式连接；所述搭接的重叠部分的长度分别优选为2～3mm；所述检测宫颈癌的胶体金侧向层析试纸条的示意图参见图1。
本发明中，所述吸收垫优选的搭接于所述硝酸纤维膜之上；所述结合垫优选的搭接于所述硝酸纤维素膜之上；所述样品垫优选的搭接于所述结合垫之上。
本发明所述胶体金侧向层析试纸条的作用原理是：样品缓冲液作用下泳动至结合物垫，与结合垫上的纳米金颗粒DNA探针复合物(Au-NP-DNA)或纳米金-蛋白偶联物结合，一起移动至检测区时，即被该检测区上的探针杂交结合、显色。本发明的胶体金侧向层析试纸条能够同时检宫颈癌miRNA标志物(miR-21、miR-196a)和蛋白类标志物(HPV E6、HPV E7)。当样品溶液中含有肿瘤标志物(miRNA或蛋白质)时，三明治式的键合反应将标志物和金纳米粒子捕获在侧流式传感器的测试区并呈现出红色，过量的金纳米粒子络合物被捕获在控制区域呈现红色区域。测试区域红色区域的灰度值与样品溶液中肿瘤标志物的浓度成正比例关系，可以用来定量检测样品中标志物的浓度。
本发明中，所述样品优选的包括指尖血；每次检测样品的用量优选为10μL。
本发明中，所述硝酸纤维素膜设有检测区T区和质控区C区；所述检测区T区包括T1线、T2线、T3线和T4线；所述质控区C区包括C1线和C2线；以硝酸纤维素长边为行，所述T1线、T2线、T3线、T4线、C1线和C2线呈2行3列分布，从结合垫到吸收垫方向行依次分布有T1线、T3线和C1线，第二行依次分布有T2线、T4线和C2线；每个相邻位点间距为4～6mm，优选为5mm；DNA捕获探针的位置在蛋白抗体探针前面(靠近结合垫)能够减少非特异性吸附。
本发明中，所述T1线上喷涂有T1线溶液；所述T1线溶液包括miR-21捕获探针；所述miR-21捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：CTGATAAGCTA；所述miR-21捕获探针的3’端经生物素标记；所述miR-21捕获探针对应的miR-21目标物的核苷酸序列如SEQID NO：7所示，具体为：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA。
本发明中，所述T2线上喷涂有T2线溶液；所述T2线溶液包括miR-196a捕获探针；所述miR-196a捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：GAAACTACCTA；所述miR-196a捕获探针的3’端经生物素标记；所述miR-196a捕获探针对应的miR-196a目标物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，具体为：UAGGUAGUUUCAUGUUGUUGGG。
本发明所述T1线溶液或T2线溶液的制备方法包括以下步骤：将生物素标记的miR-21部分互补序列或miR-196a部分互补序列与链霉亲和素溶液混合，进行培养，得到T1线溶液或T2线溶液。
本发明具体实施过程中，将50nM生物素标记的T1/T2与200μL 2.5mg/ml的链霉亲和素(上海生工)在0.01MPBS中混合培养1h后，将混合液转移至透析管(截留分子量30000)中，在冷冻离心机中离心(6000rpm，20min，4℃)去除未结合的适配体探针。加入PBS重复以上步骤两次，最后收集离心后的溶液定容至600μL。最后将生物素标记的DNA和链霉亲和素结合的混合物溶液喷涂在试纸条上。
本发明中，所述T3线喷涂有T3线溶液；所述T3线溶液包括鼠抗HPV E6蛋白单克隆抗体；所述T3线溶液中鼠抗HPV E6蛋白单克隆抗体的浓度优选为0.8～1.2mg/mL，更优选1mg/mL。
本发明中，所述T4线喷涂有T4线溶液；所述T4线溶液包括鼠抗HPV E7蛋白单克隆抗体；所述T4线溶液中鼠抗HPV E7蛋白单克隆抗体的浓度优选为0.8～1.2mg/mL，更优选1mg/mL。
本发明中，所述C1线喷涂有C1线溶液；所述C1线溶液包括miR-21控制探针和miR-196a控制探针；所述miR-21控制探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，具体为：ACTGATGTTGA；所述miR-196a控制探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，具体为：ATGTTGTTGGG；所述miR-21控制探针和miR-196a控制探针的3’端分别经生物素标记。
本发明中，所述C2线喷涂有C2线溶液；所述C2线溶液包括二抗；所述二抗优选的包括羊抗鼠IgG。
本发明中，所述T1线溶液、T2线溶液、T3线溶液、T4线溶液、C1线溶液和C2线溶液的喷涂量分别优选为1μL；所述T1线溶液、T2线溶液、T3线溶液、T4线溶液、C1线溶液和C2线溶液的溶剂优选为PBS溶液。
本发明中，所述结合垫吸附有胶体金-检测探针偶联物；所述胶体金-检测探针偶联物包括胶体金-miR-21检测探针偶联物、胶体金-miR-196a检测探针偶联物、胶体金-HPVE6蛋白-牛血清蛋白偶联物和胶体金-HPV E7蛋白-牛血清蛋白偶联物；所述miR-21检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，具体为：TCAACATCAGT；所述miR-196a检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，具体为：CCCAACAACAT；所述miR-21检测探针和miR-196a检测探针的5’端分别经巯基修饰。
本发明中，所述硝酸纤维素膜包含检测区(T1～T4)、控制区(C1、C2)。侧流试纸条的检测中心区域主要集中在硝酸纤维素膜上。检测结果以T区和C区来衡量，T区上颜色可进行半定量或定量、定性分析。C区是为了能够验证试纸条检测的有效性。如果C区没有颜色，说明试纸条检测结果不可信。
本发明中，所述结合垫的材质优选的包括玻璃纤维膜。结合垫用于吸附胶体金修饰的检测探针(抗体和miRNA部分互补序列)，并在毛细吸附力作用下将样品待测液以一定速度均匀地输送到NC膜上；保持后续标记物颗粒的稳定性及完整性，有助于降低背景信号，提高检测的稳定性及重现性。
本发明中，所述胶体金-HPV E6蛋白-牛血清蛋白偶联物或胶体金-HPV E7蛋白-牛血清蛋白偶联物的制备方法，优选的包括以下步骤：将纳米金溶液、HPV蛋白溶液和牛血清蛋白溶液混合，进行偶联，得到胶体金-HPV E6蛋白-牛血清蛋白偶联物或胶体金-HPV E7蛋白-牛血清蛋白偶联物。
本发明所述HPV蛋白包括HPV E6蛋白或HPV E7蛋白；本发明对所述纳米金没有特殊限制，采用常规方法制备得到的纳米金即可；所述纳米金溶液优选为五倍浓缩的纳米金溶液；所述纳米金溶液中纳米金的粒径优选为15～20nm；所述纳米金溶液、HPV蛋白溶液和牛血清蛋白溶液的比例为1mL：10μL：100μL；所述HPV蛋白溶液中HPV蛋白的浓度优选为1mM；所述牛血清蛋白溶液中牛血清蛋白的质量百分比优选为10％；所述偶联的温度优选为20～30℃，更优选为25℃；所述偶联过程中优选的伴随震荡处理。
本发明具体实施过程中，先将所述纳米金溶液和HPV蛋白溶液混合进行第一偶联，得到胶体金-HPV蛋白偶联物，将胶体金-HPV蛋白偶联物和牛血清蛋白溶液混合进行第二偶联，得到胶体金-HPV蛋白-牛血清蛋白偶联物；所述第一偶联时间为60min；所述第二偶联的时间优选为30min；所述偶联后优选的包括对偶联物进行离心，用PBS缓冲液清洗沉淀，将沉淀溶于纳米粒子存储液中备用；所述离心的转速优选为12,000rpm，时间优选为10min；所述PBS缓冲液的pH值优选为7.2～7.4；所述清洗的次数优选为3次；所述纳米粒子存储液包括以下组分：20mmol/LNa3PO4·12H2O(12水磷酸钠)，5％BSA(牛血清蛋白)，0.25％Tween 20(吐温20)，10％sucrose(蔗糖)。
本发明中，所述胶体金-miR-21互补序列探针偶联物或胶体金-miR-196a互补序列探针偶联物的制备方法，包括以下步骤：将纳米金溶液、dATP溶液、十二烷基硫酸钠溶液、NaCl水溶液和miRNA互补序列探针混合，进行偶联，得到胶体金-miR-21互补序列探针偶联物或胶体金-miR-196a互补序列探针偶联物；所述miRNA互补序列探针包括miR-21互补序列探针或miR-196a互补序列探针偶联物。
本发明具体实施过程中，将1ml十倍浓缩的纳米金溶液和10μL浓度为1mM的dATP混合，于20～30℃条件下混合20min，得到第一混合物；将第一混合物和10μL浓度为1％SDS混合10min，得到第二混合物；将第二混合物和50μL浓度为0.2M的NaCl水溶液混合，混合过程中速度控制在每2～3min加入2μL，得到第三混合物；将第三混合物和1OD miRNA互补序列探针混合，于60℃下偶联3h，得到偶联物；对偶联物12,000rpm离心10min，用PBS缓冲液清洗沉淀，清洗后的沉淀溶于纳米粒子存储液中备用；所述PBS缓冲液的pH值优选为7.2～7.4；所述清洗的次数优选为3次。
本发明中，所述样品垫的材质优选的包括玻璃纤维膜；所述样品垫的作用是减缓待测样品迁移的速度，有利于待测液在样品垫均匀分布，为后面更好地流到结合垫创造前提条件。
本发明使用吸收效率高、容量大及稳定性好的吸收纸。吸收垫的目的是为了促进液体在横流试纸条上的迁移能够顺利并完整抵达吸收垫，确保待测物(液)能够通过最后一步的虹吸作用而跨过NC膜，提高检测信号输出值，降低信噪比。
本发明还提供了上述方案所述检测宫颈癌的胶体金侧流层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1)将硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上，依次固定结合垫、样品垫和吸收垫；
2)在结合垫吸附胶体金-检测探针偶联物，在硝酸纤维素膜的T1线、T2线、T3线、T4线、C1线和C2线处分别喷涂T1线溶液、T2线溶液、T3线溶液、T4线溶液、C1线溶液和C2线溶液，得到检测宫颈癌的胶体金侧流层析试纸条；所述T1线溶液、T2线溶液、T3线溶液、T4线溶液、C1线溶液和C2线溶液的喷涂量分别优选为1μL。
本发明所述宫颈癌检测胶体金侧流层析试纸条的使用方法优选的包括以下步骤：
取10μL血清与90μL样本缓冲液(PBS+1％BSA)混合均匀后，滴加于样品垫上，当样品溶液中含有肿瘤标志物(miRNA或蛋白质)时，三明治式的键合反应将标志物和金纳米粒子捕获在试纸条的测试区并呈现出红色，过量的金纳米粒子络合物被捕获在控制区域呈现红色区域。5min以后观察检验结果，超过20min检测结果无效。测试区域红色区域的灰度值与样品溶液中肿瘤标志物的浓度成正比例关系，能够用来定量检测样品中标志物的浓度；所述定量检测的设备优选为试纸条灰度检测仪。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中用到的试剂来源如下：
氯金酸，十二水合磷酸钠(Na3PO4·12H2O)，牛血清白蛋白(BSA)，蔗糖(sucrose)，吐温-20(Tween 20)，氯化钠(NaCl)，Tris-HCl，磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 7.4，0.01M)，均购于Sigma-Aldrich公司。
DNA探针购于上海生工。
纤维素纤维膜(CFSP001700)，玻璃纤维膜(GFCP000800)，硝酸纤维素膜(HFB18004)和层压板(HF000MCl00)均购自于Millipore公司。
其它试剂均为分析纯。实验所有用水均为超纯水(>18MΩcm)。
表1本发明的宫颈癌检测胶体金侧流层析试纸条涉及到的核苷酸序列
Figure BDA0002436952750000101
试纸制备流程：胶体金偶联抗体(或检测探针)后喷在结合垫上；抗体(或链霉亲和素偶联探针)喷在NC膜对应位置。然后进行组装：结合垫搭接于硝酸纤维素膜之上；样品垫搭接于结合垫之上；吸收垫搭接于硝酸纤维膜之上。
实施例1
1、抗体标记胶体金：取1ml五倍浓缩的纳米金(15～20nm)溶液，加入10μL1mM的抗体(鼠抗HPV E6蛋白单克隆抗体、鼠抗HPV E7蛋白单克隆抗体、二抗)，在室温下，用振荡器振荡60min，接着加入100μL10％BSA，震荡培养30min后，用离心机(转速12,000rpm，10min)离心，去除上清液，用PBS缓冲液(pH7.2～7.4)清洗3次，最后将沉淀溶于1mL纳米粒子存储液(20mmol/LNa3PO4·12H2O，5％BSA，0.25％Tween 20，10％sucrose)中，偶合物溶液放在4℃冰箱保存待用。
2、DNA检测探针标记胶体金：取1ml十倍浓缩的纳米金(15～20nm)溶液，加入10μL1mM的dATP，在室温下，用振荡器振荡20min，接着加入15μL1％SDS，震荡培养十min后，加入50μL0.2M的NaCl(速度控制在每2-3min加入2μL)，然后加入1OD miRNA互补序列探针，在60℃下反应3h，用离心机(转速12,000rpm，10min)离心，去除上清液，用PBS缓冲液(pH7.2～7.4)清洗3次，最后将沉淀溶于1mL纳米粒子存储液(20mmol/L Na3PO4·12H2O，5％BSA，0.25％Tween 20，10％sucrose)中，偶合物溶液放在4℃冰箱保存待用。
3、T3/T4蛋白单克隆抗体(1mg/mL)可直接喷涂在NC膜上；
4、T1/T2捕获探针处理步骤：将50nM生物素标记的T1/T2捕获探针与200μL 2.5mg/ml的链霉亲和素(上海生工)在0.01MPBS中混合培养1h后，将混合液转移至透析管(截留分子量30000)中，在冷冻离心机中离心(6000rpm，20min，4℃)去除未结合的适配体探针。加入PBS重复以上步骤两次，最后收集离心后的溶液定容至600μL。最后将生物素标记的DNA和链霉亲和素结合的混合物溶液喷涂在试纸条上。
5、胶体金标记的抗体(检测探针)喷在结合垫上；链霉亲和素偶联的T1/T2捕获探针、T3/T4E6/E7抗体、C1控制探针、C2二抗喷在NC膜对应位置.
6、将硝酸纤维素膜(NC膜)粘贴在PVC底板上，然后将结合垫固定在其位置上并保证与NC膜有2mm的重叠，接着将样品垫粘贴在其位置上并保证与结合垫有2mm的重叠，最后粘贴吸收垫并保证与NC膜有2mm的重叠以确保液体顺利流动。
检测步骤：取10μL血清与90μL样本缓冲液(PBS+1％BSA)混合均匀后，滴加于样品垫上，当样品溶液中含有肿瘤标志物(miRNA或蛋白质)时，三明治式的键合反应将标志物和金纳米粒子捕获在试纸条的测试区并呈现出红色，过量的金纳米粒子络合物被捕获在控制区域呈现红色区域。5min以后观察检验结果，超过20min检测结果无效。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 安徽科技学院
<120> 一种检测宫颈癌的胶体金侧向层析试纸条及其制备方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 1
ctgataagct a 11
<210> 2
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 2
gaaactacct a 11
<210> 3
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 3
actgatgttg a 11
<210> 4
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 4
atgttgttgg g 11
<210> 5
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 5
tcaacatcag t 11
<210> 6
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 6
cccaacaaca t 11
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 7
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 8
uagguaguuu cauguuguug gg 22

Claims (9)

1.一种检测宫颈癌的胶体金侧向层析试纸条，所述胶体金侧向层析试纸条包括PVC底板、硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫和吸收垫；所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘附在所述PVC底板上并采用搭接的方式连接；其特征在于，所述硝酸纤维素膜设有检测区T区和质控区C区；所述检测区T区包括T1线、T2线、T3线和T4线；所述质控区C区包括C1线和C2线；
以硝酸纤维素长边为行，所述T1线、T2线、T3线、T4线、C1线和C2线呈2行3列分布；所述T1线、T3线和C1线按照从结合垫到吸收垫的方向依次分布于第一行；所述T2线、T4线和C2线按照从结合垫到吸收垫的方向依次分布于第二行；
所述T1线上喷涂有T1线溶液；所述T1线溶液包括miR-21捕获探针；所述miR-21捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述miR-21捕获探针的3’端经生物素标记；
所述T2线上喷涂有T2线溶液；所述T2线溶液包括miR-196a捕获探针；所述miR-196a捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述miR-196a捕获探针的3’端经生物素标记；
所述T3线喷涂有T3线溶液；所述T3线溶液包括鼠抗HPV E6蛋白单克隆抗体；
所述T4线喷涂有T4线溶液；所述T4线溶液包括鼠抗HPV E7蛋白单克隆抗体；
所述C1线喷涂有C1线溶液；所述C1线溶液包括miR-21控制探针和miR-196a控制探针；所述miR-21控制探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述miR-196a控制探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述miR-21控制探针和miR-196a控制探针的3’端分别经生物素标记；
所述C2线喷涂有C2线溶液；所述C2线溶液包括二抗；
所述结合垫吸附有胶体金-检测探针偶联物；所述胶体金-检测探针偶联物包括胶体金-miR-21检测探针偶联物、胶体金-miR-196a检测探针偶联物、胶体金-HPV E6蛋白-牛血清蛋白偶联物和胶体金-HPV E7蛋白-牛血清蛋白偶联物；所述miR-21检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述miR-196a检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述miR-21检测探针和miR-196a检测探针的5’端分别经巯基修饰。
2.根据权利要求1所述的胶体金侧向层析试纸条，其特征在于，所述T3线溶液中鼠抗HPV E6蛋白单克隆抗体的浓度为0.8～1.2mg/mL；所述T4线溶液中鼠抗HPV E7蛋白单克隆抗体的浓度为0.8～1.2mg/mL。
3.根据权利要求1所述的胶体金侧向层析试纸条，其特征在于，所述搭接的重叠部分的长度分别为2～3mm。
4.根据权利要求1所述的胶体金侧向层析试纸条，其特征在于，所述结合垫到吸收垫方向行依次分布的T1线、T3线和C1线，所述第二行依次分布的T2线、T4线和C2线，每个相邻位点间距为4～6mm。
5.根据权利要求1所述的胶体金侧向层析试纸条，其特征在于，胶体金-HPV E6蛋白-牛血清蛋白偶联物或胶体金-HPV E7蛋白-牛血清蛋白偶联物的制备方法，包括以下步骤：
将纳米金溶液、HPV蛋白溶液和牛血清蛋白溶液混合，进行偶联，得到胶体金-HPV E6蛋白-牛血清蛋白偶联物或胶体金-HPV E7蛋白-牛血清蛋白偶联物；所述HPV蛋白为HPV E6蛋白或HPV E7蛋白。
6.根据权利要求1所述的胶体金侧向层析试纸条，其特征在于，所述胶体金-miR-21互补序列探针偶联物或胶体金-miR-196a互补序列探针偶联物的制备方法，包括以下步骤：
将纳米金溶液、dATP溶液、十二烷基硫酸钠溶液、NaCl水溶液和miRNA互补序列探针混合，进行偶联，得到胶体金-miR-21互补序列探针偶联物或胶体金-miR-196a互补序列探针偶联物；所述miRNA互补序列探针为miR-21互补序列探针或miR-196a互补序列探针偶联物。
7.根据权利要求1所述的胶体金侧向层析试纸条，其特征在于，所述T1线溶液或T2线溶液的制备方法包括以下步骤：将生物素标记的miR-21部分互补序列或miR-196a部分互补序列与链霉亲和素溶液混合，进行培养，得到T1线溶液或T2线溶液。
8.本发明还提供了权利要求1～7任意一项所述检测宫颈癌的胶体金侧流层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1)将硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上，依次固定结合垫、样品垫和吸收垫；
2)在结合垫吸附胶体金-检测探针偶联物，在硝酸纤维素膜的T1线、T2线、T3线、T4线、C1线和C2线处分别喷涂T1线溶液、T2线溶液、T3线溶液、T4线溶液、C1线溶液和C2线溶液，得到检测宫颈癌的胶体金侧流层析试纸条。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述T1线溶液、T2线溶液、T3线溶液、T4线溶液、C1线溶液和C2线溶液的喷涂量分别为1μL。
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