CN104849443A - 基于pH计的酶联免疫吸附测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于pH计的酶联免疫吸附测定方法。该方法通过在酶标板中进行抗原-抗体特异性免疫反应，捕获样本中的分析物抗原或抗体，随后引入葡萄糖氧化酶-葡萄糖生物催化反应，并使用pH计量测含有萄糖酸的混合产物溶液的pH值，pH值的大小与样本中分析物的浓度呈负相关，即完成基于pH计的酶联免疫吸附测定。本发明使用廉价的pH计进行信号读取，降低了定量分析的成本，它通过利用微米或纳米颗粒固定葡萄糖氧化酶来放大单个抗原-抗体结合反应的响应信号，在保持传统ELISA法良好特异性的同时，通过使用微米或纳米颗粒增加葡萄糖氧化酶的固定化量，放大单个抗原-抗体特异性结合反应的响应信号，提高了检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immune-Sorbent Assay，简写为ELISA）技术领域，具体涉及一种基于pH计的酶联免疫吸附测定方法。
背景技术
酶联免疫吸附测定（ELISA）方法是以免疫学反应为基础，将抗体、抗原的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种具有高特异性和高灵敏度的实验技术。根据样本中待测物质的种类及性质不同，可以设计出各种不同类型的ELISA方法，包括抗体夹心法、抗原夹心法、竞争法、间接法及捕获包被法等。自1971瑞典斯德哥尔摩大学的Engvall和Perlmann首次建立酶联免疫吸附测定方法，经过40余年的不断发展和完善，ELISA方法已经被广泛应用于临床诊断、医学研究、食品安全、环境监测等诸多领域。目前传统的ELISA方法主要借助酶标仪、荧光仪等光学分析仪器实现目标分析物的定量检测。但是，这些光学仪器价格较为昂贵且体积庞大，导致传统ELISA方法的分析成本较高，同时不能用于现场分析和即时检验（Point-of-Care Testing）。此外，在一些重要的应用方面，例如，疾病的早期诊断，还需要进一步提高ELISA方法的检测灵敏度。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种基于pH计的酶联免疫吸附测定方法。
本发明的思路：使用廉价的pH计（即酸度计）代替酶标仪、荧光仪等传统的光学分析仪器进行信号读取，降低定量分析的成本；同时，使用具有较大比表面积的微米或纳米颗粒固定葡萄糖氧化酶，放大在酶标板上进行的单个抗原-抗体结合反应的响应信号，从而获得高灵敏度的吸附测定方法。
具体步骤为：
步骤一，在酶标板中包被单克隆抗体或抗原。
步骤二，以牛血清白蛋白为封闭剂进行封闭；利用抗原-抗体特异性免疫反应，捕获样本中的分析物抗原或抗体，并进一步结合生物素标记的抗体或二抗。
步骤三，利用生物素-亲和素特异性反应，将链霉亲和素与葡萄糖氧化酶同时标记的微米或纳米颗粒捕获到酶标板表面。
步骤四，加入葡萄糖与葡萄糖氧化酶进行催化反应。
步骤五，最后使用pH计量测含有萄糖酸的混合产物溶液的pH值，pH值的大小与样本中分析物抗原或抗体的浓度呈负相关，即完成基于pH计的酶联免疫吸附测定。
所述的将链霉亲和素与葡萄糖氧化酶同时标记的微米或纳米颗粒捕获到酶标板表面，是根据不同的目标分析物对象，采用的抗原-抗体特异性免疫反应模式为双抗体夹心法、双抗原夹心法、间接法、竞争法和捕获包被法中的一种。
所述pH计为台式pH计、便携式pH计和便携式pH笔中的一种。
与现有的ELISA法相比，本发明的突出优点在于：1）使用价格低廉的pH计进行信号读取，降低了分析成本，若使用便携式pH计或pH笔还可实现样本的现场分析和即时检测；2）在保持传统ELISA法良好特异性的同时，通过使用微米或纳米颗粒增加葡萄糖氧化酶的固定化量，放大单个抗原-抗体特异性结合反应的响应信号，提高了检测灵敏度；3）与现有ELISA方法完全兼容，可直接推广应用于尿液、血液、血清、唾液、水等各种液体样本中分析物的定量检测，在临床诊断、医学研究、食品安全、环境监测等领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明基于pH计的酶联免疫吸附测定方法的原理示意图。采用的是双抗体夹心法检测分析物抗原。图中标记：1—酶标板上的单个酶标孔；2—单克隆抗体；3—封闭剂牛血清白蛋白；4—分析物抗原；5—生物素标记的多克隆抗体；5-1—多克隆抗体；5-2—生物素；6—链霉亲和素与葡萄糖氧化酶同时标记的微米或纳米颗粒；6-1—葡萄糖氧化酶；6-2—链霉亲和素；6-3—微米或纳米颗粒；7—葡萄糖；8—便携式pH计。
图2为本发明实施例1中使用基于pH计的ELISA方法检测10 pg/mL人癌基因蛋白质（Human Oncogene Protein，HOP）p190/bcr-abl抗原时所得pH值与空白样品所得pH值的比较。
图3为本发明实施例2中使用基于pH计的ELISA方法检测一系列不同浓度的人癌基因蛋白质（HOP）p190/bcr-abl抗原时所得pH值与HOP浓度的Log值之间的工作曲线。
具体实施方式
下面以基于双抗体夹心法免疫反应模式检测人癌基因蛋白质（Human Oncogene Protein，HOP）p190/bcr-abl抗原（模型分析物）的ELISA方法为例，在该方法中利用便携式pH计进行信号读取，并通过使用微米或纳米颗粒固定葡萄糖氧化酶来提高检测灵敏度。以下实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1:
使用基于pH计的ELISA方法检测40 pg/mL人癌基因蛋白质（HOP）p190/bcr-abl抗原。
具体实施过程如下：
如图1所示，本实施例的具体步骤为：步骤一，往酶标板上的单个酶标孔加入50 μL 0.25 mg/mL人癌基因蛋白质（HOP）p190/bcr-abl单克隆抗体（10 mM碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液配制，pH 9.6），冰箱4℃下静置过夜，弃去液体，甩干，将每个孔加满洗涤液（10 mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液，pH 7.4），静置30 s后弃去，如此重复5次，将孔倒置在平铺的卷筒纸上拍干；步骤二，往单个酶标孔加入50 μL 10 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）（10 mM碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液配制，pH 9.6），室温下静置5 h，弃去液体，甩干，随后加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，将孔倒置在平铺的卷筒纸上拍干；步骤三，往单个酶标孔依次加入40 μL 40 pg/mL人癌基因蛋白质（HOP）p190/bcr-abl抗原样本（10 mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液配制，pH 7.4）、10 μL 1 mg/mL 生物素标记的HOP多克隆抗体（10 mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液配制，pH 7.4）以及50 μL 1 mg/mL 链霉亲和素与葡萄糖氧化酶同时标记的超顺磁性Fe3O4SiO2核壳纳米颗粒（粒径约为100 nm）悬浊液（10 mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液配制，pH 7.4），轻微震荡混匀后置于37℃反应1 h，弃去液体，甩干，将每个孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，将孔倒置在平铺的卷筒纸上拍干；步骤四，往单个酶标孔加入100 μL 30 mM葡萄糖溶液（含0.1 M氯化钾的超纯水配制），37℃反应1 h；步骤五，将溶液移入含有3 mL 0.1 M氯化钾电解质溶液（超纯水配制）的10 mL离心管中，使用便携式pH计（酸度计）量测混合溶液的pH值，即信号pH值，即完成基于pH计的酶联免疫吸附测定。
根据相同的步骤，将方法用于分析空白样本，即10 mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液（pH 7.4），并使用pH计量测最终混合溶液的pH值，即空白pH值。从图2可以看出，与检测空白样本所得的pH值相比，检测40 pg/mL HOP抗原所得的pH值有了显著降低。这是因为通过抗原-抗体、生物素-亲和素之间的特异性反应，链霉亲和素与葡萄糖氧化酶同时标记的超顺磁性Fe3O4SiO2核壳纳米颗粒被捕获到酶标板表面，葡萄糖氧化酶随后催化葡萄糖生成大量的葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖酸在溶液中电离后将产生的大量H+离子，从而导致混合产物溶液的pH值显著降低。图2中的对比实验结果表明，基于廉价的便携式pH计的ELISA方法切实可行。
实施例2:
使用基于pH计的ELISA方法检测浓度范围为0.62 ~ 40 pg/mL的人癌基因蛋白质（HOP）p190/bcr-abl抗原。
具体实施过程如下：
如图1所示，本实施例的具体步骤为：步骤一，往酶标板上的单个酶标孔加入50 μL 0.25 mg/mL人癌基因蛋白质（HOP）p190/bcr-abl单克隆抗体（10 mM碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液配制，pH 9.6），冰箱4℃下静置过夜，弃去液体，甩干，将每个孔加满洗涤液（10 mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液，pH 7.4），静置30 s后弃去，如此重复5次，将孔倒置在平铺的卷筒纸上拍干；步骤二，往单个酶标孔加入50 μL 10 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）（10 mM碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液配制，pH 9.6），室温下静置5 h，弃去液体，甩干，随后加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，将孔倒置在平铺的卷筒纸上拍干；步骤三，往单个酶标孔依次加入40 μL含有某一浓度的人癌基因蛋白质（HOP）p190/bcr-abl抗原（10 mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液配制，pH 7.4）的样本、10 μL 1 mg/mL生物素标记的HOP多克隆抗体（10 mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液配制，pH 7.4）以及50 μL 1 mg/mL 链霉亲和素与葡萄糖氧化酶同时标记的超顺磁性Fe3O4SiO2核壳纳米颗粒（粒径约为100 nm）悬浊液（10 mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液配制，pH 7.4），轻微震荡混匀后置于37℃反应1 h，弃去液体，甩干，将每个孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，将孔倒置在平铺的卷筒纸上拍干；步骤四，往单个酶标孔加入100 μL 30 mM葡萄糖溶液（含0.1 M氯化钾的超纯水配制），37℃反应1 h；步骤五，分别将每个酶标孔中的溶液移入含有3 mL 0.1 M氯化钾电解质溶液（超纯水配制）的10 mL离心管中，使用便携式pH计（酸度计）量测混合溶液的pH值，并将所有得到的pH值对HOP浓度的Log值作图（图3），即完成基于pH计的酶联免疫吸附测定。
由图3可知，随着HOP浓度的增加，相应的pH值逐渐降低。这是因为，当样本中HOP浓度较大时，通过抗原-抗体、生物素-亲和素之间的特异性反应，被捕获到酶标板表面的链霉亲和素与葡萄糖氧化酶同时标记的超顺磁性Fe3O4SiO2核壳纳米颗粒的数量也会越多。此时，被葡萄糖氧化酶催化葡萄糖生成的葡萄糖酸的数量也越多，其电离后产生的H+离子的数量随之增多，从而使得混合产物溶液的pH值降低更多。此外，图3显示，利用廉价的便携式pH计量测所得的pH值与HOP浓度的Log值在0.62 ~ 40 pg/mL范围内呈现良好的线性关系。而传统的基于价格昂贵且体积庞大的酶标仪的ELISA方法分析HOP样本时的线性检测范围是10 ~ 160 pg/mL。基于pH计的ELISA方法表现出更好的检测灵敏度主要归因于使用微米或纳米颗粒增加了葡萄糖氧化酶的固定化量，从而放大了单个抗原-抗体特异性结合反应的响应信号。
Claims (1)
1.一种基于pH计的酶联免疫吸附测定方法，其特征在于具体步骤为：
步骤一，在酶标板中包被单克隆抗体或抗原；
步骤二，以牛血清白蛋白为封闭剂进行封闭；利用抗原-抗体特异性免疫反应，捕获样本中的分析物抗原或抗体，并进一步结合生物素标记的抗体或二抗；
步骤三，利用生物素-亲和素特异性反应，将链霉亲和素与葡萄糖氧化酶同时标记的微米或纳米颗粒捕获到酶标板表面；
步骤四，加入葡萄糖与葡萄糖氧化酶进行催化反应；
步骤五，最后使用pH计量测含有萄糖酸的混合产物溶液的pH值，pH值的大小与样本中分析物抗原或抗体的浓度呈负相关，即完成基于pH计的酶联免疫吸附测定；
所述的将链霉亲和素与葡萄糖氧化酶同时标记的微米或纳米颗粒捕获到酶标板表面，是根据不同的目标分析物对象，采用的抗原-抗体特异性免疫反应模式为双抗体夹心法、双抗原夹心法、间接法、竞争法和捕获包被法中的一种；
所述pH计为台式pH计、便携式pH计和便携式pH笔中的一种。
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Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN105353116A (zh) * | 2015-11-09 | 2016-02-24 | 国家纳米科学中心 | 一种基于过氧化氢试纸条进行免疫分析的方法及其应用 |
| CN106770565A (zh) * | 2016-11-24 | 2017-05-31 | 桂林理工大学 | 基于pH计的银离子检测方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN103513027A (zh) * | 2013-09-29 | 2014-01-15 | 长春百克生物科技股份公司 | 新型超灵敏性elisa方法的建立 |
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- 2015-05-17 CN CN201510248482.7A patent/CN104849443B/zh active Active
Patent Citations (1)
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