JP5104622B2

JP5104622B2 - 磁性粒子を用いた測定対象物質の濃度測定法

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Publication number: JP5104622B2
Application number: JP2008194754A
Authority: JP
Inventors: 由貴高橋; 小毛謝; 景明松井
Original assignee: JNC Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 2008-07-29
Filing date: 2008-07-29
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2028-07-29
Also published as: JP2010032360A

Description

本発明は、磁性粒子を使用した、試料中の測定対象物質の濃度を安価に、高精度且つ高感度に測定する免疫測定法に関する。

タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質、糖鎖、核酸、脂質等の測定は、臨床分野、産業分野において一般的に行われている。

これらの測定方法のうち、汎用な方法の一つとして、２種類の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法が挙げられる。この方法では、同一の測定対象物質に対して特異的な結合能を有する２種類の抗体を用意し、一方の抗体を固相に結合させ、他方の抗体を標識させておく。これらを用いて、固相に結合させた一方の抗体に測定対象物質をトラップし、次いで標識された他方の抗体を測定対象物質に結合させることで固相抗体−測定対象物質−標識抗体からなる抗原抗体複合体を形成させる。その後、該標識を検出することで、測定対象物質の濃度を測定することができる。

上記サンドイッチ免疫測定法においては、抗原抗体複合体中の標識を特異的に検出するために、抗原と結合していない標識抗体を取り除く操作（Ｂ／Ｆ分離）が必要となる。そのため一方の抗体を固相に結合させておくのであるが、通常は抗体が反応容器表面等の固相に結合されているため、抗原抗体反応が反応溶液中の一部の限られた領域でしか起こらず、そのため、液相中での反応に比べて反応効率が大幅に低下してしまい、十分な感度を得るためには一定の反応時間を確保する必要があった。

上記問題点を改善するために、液相中に分散させることが可能な固相に抗体を結合し、液相中で固相抗体−測定対象物質−標識抗体を形成させ、その後、固相を一定の場所に集めてＢ／Ｆ分離を行う方法が開発されている。例えば、磁性粒子は液相中に分散することができ、これを固相として使用することで、液相中で抗原抗体複合体を形成させることができる。その後、該複合体を磁石で集め（磁集し）、Ｂ／Ｆ分離を行った後に標識を検出することができる。

磁性ナノ粒子は、その粒子径が２００ｎｍ以下である場合には、微小であることから水によく分散するが、分散状態が維持されてしまい磁集できない。しかしながら、例えば、下限臨界溶液温度を持つ温度応答性高分子で表面修飾した磁性粒子を利用して、その水溶液の温度を下限臨界溶液温度以上とした場合には、該下限臨界溶液温度を持つ温度応答性高分子で表面修飾した磁性粒子が析出、凝集する。この凝集物は磁力で容易に回収できることから、該下限臨界溶液温度を持つ温度応答性高分子で表面修飾し、抗体または抗原を固定化した温度応答性高分子表面修飾磁性粒子を用いる方法も開発されてきている（特許文献１）。

臨床検査においては、近年、ポイントオブケアテスティング（ＰＯＣＴ）と呼ばれるベッドサイドや診療現場で行われる迅速且つ高感度な検査の重要性が高まっている。患者検体を採取し、その場で測定を行って迅速に結果を出すことが求められるＰＯＣＴの検査項目として、手術前の感染症の各種マーカーや、胸痛患者の脳性ナトリウム利尿ペプチド（以下、「ＢＮＰ」と略すことがある）等の心不全マーカー等が挙げられる。ＢＮＰは、慢性及び急性心不全の重症度が上昇するのと比例して、著しく血中濃度が上昇することが知られており、この濃度を測定することで心不全の診断を行うことができる。ＢＮＰの検査方法として、特許文献２には、哺乳類のα−ＢＮＰに反応する第１の抗体とプレプ
ロＢＮＰもしくはγ−ＢＮＰ誘導体に反応するがα−ＢＮＰには反応しない第２の抗体とを用いることを特徴とする哺乳類のγ−ＢＮＰ誘導体に特異的な免疫測定方法が開示されている。

また、臨床現場においては、ＢＮＰの測定方法として、ＭＩ０２シオノギＢＮＰ（商品名：塩野義製薬製）を試薬に使用した免疫測定法が用いられている。この方法は、ビオチン標識した抗ＢＮＰ抗体とアルカリフォスファターゼ標識した抗ＢＮＰ抗体の２種類のモノクローナル抗体により、検体中のＢＮＰをサンドイッチ様に挟んで反応させ、反応終了後、表面に抗ビオチン抗体を固定化した反応カップに移し、サンドイッチ様のＢＮＰ抗原抗体複合体を反応カップの表面に結合させる。未反応の標識抗体を洗浄、除去し、発光基質を添加して発光強度を測定し、標準曲線を用いて検体中のＢＮＰ量を測定する方法である。この方法は、検体と２種類の抗体試薬を同時に反応させる方法であり、全自動化学発光免疫装置により測定の自動化が行え、比較的短時間に、比較的高い精度で測定できるものの、２段階インキュベーションが必要であり（第１段階が５分、第２段階が４分）、３種類の抗体が必要であり、また、器材、抗体の固相化した反応カップ、酵素等が高価であるなど改良の余地が大いにある。

現在、ＢＮＰのみならず、様々な測定対象物質の濃度を、より高精度に、安価で、短時間に測定結果が出せる測定方法が求められている。
特開２００５−０８２５３８号公報国際公開ＷＯ９９／１３３３１号パンフレット

本発明の課題は、測定対象物質の濃度を、より短時間で測定することができ、従来よりも安価に、高精度且つ高感度に測定できる測定方法を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した。その結果、磁性粒子を固相として使用するサンドイッチ免疫測定法において、検体及び抗体を含む試薬の添加を特定の順序で行うことにより、検体と全ての抗体試薬を同時に反応させる従来法と比較して、反応時間を増加させることなく、従来法よりも安価に、高精度且つ高感度に測定結果が得られることを見出し、これをもとに本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）検体と、標識物質で標識された第１抗体とを混合して混合液を調製する工程、
互いに親和性を有する２種類の結合材の一方が結合した第２抗体と、該２種類の結合材の他方が結合した磁性粒子を、前記混合液に添加する工程、
前記磁性粒子を回収する工程、及び
前記標識を検出する工程
を含み、
前記第１抗体と前記第２抗体は測定対象物質に対する結合能を有し、その結合に際して互いに競合しないことを特徴とする、
検体中の測定対象物質の濃度を測定する方法。
（２）前記第２抗体と前記磁性粒子とを、前記混合液に同時に添加することを特徴とする、（１）に記載の方法。
（３）前記第２抗体を前記混合液に添加した後に、前記磁性粒子を添加することを特徴とする、（１）に記載の方法。
（４）前記磁性粒子を前記混合液に添加した後に、前記第２抗体を添加することを特徴とする、（１）に記載の方法。
（５）前記磁性粒子が、１〜１０００ｎｍの平均粒径であることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記磁性粒子が、５０〜２００ｎｍの平均粒径であることを特徴とする、（５）に記載の測定方法。
（７）前記第１抗体及び前記第２抗体の少なくとも一方がモノクローナル抗体である、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記測定対象物質がペプチドである、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記ペプチドが脳性ナトリウム利尿ペプチドである、（８）に記載の方法。

本発明の測定方法を用いることで、少ない試薬量で、反応のためのインキュベーションが短時間で処理でき、高精度且つ高感度に測定結果を出すことができる。これにより、例えば臨床現場では、受診頻度を高くしても安価に短時間で感度よく検査項目を測定できることから、経済的な負担を抑えながら病気を早期発見することができる。また、患者の予後の経過観察においても、本発明の方法を用いることにより、経済的な負担が軽減できる。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明において検体とは、測定対象物の濃度を測定するための検査に必要な試料であり、臨床検体、食品検体、環境サンプリング検体に大別することができる。

臨床検体としては、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、膵液、胃液、喀痰、鼻や咽等の粘膜から採取したぬぐい液等の体液や便等が挙げられるがこれらに限定されず、目的とする測定対象物質が含まれ得る検体であれば検体に含まれる。
本発明により測定できる臨床検体中の測定対象物質としては、微生物、細菌、ウィルス、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質、脂質、糖脂質、核酸、毒素等またはこれらの複合体等が挙げられ、低分子物質がこれらと結合したものも含まれる。測定対象物質としては、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、遊離ＰＳＡ等の腫瘍マーカー、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｅ抗原、ＨＢｅ抗体、ＨＢｃ抗体、ＨＣＶ抗体、ｐ２４抗原等の感染症マーカー、ＦＤＰ、Ｄダイマー、ＰＩＣ、ＡＴIII、ＦＭ等の凝固線溶マーカー、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロビン、トロポニン、ＣＲＰ、ＢＮＰ等の心不全マーカー、ＴＳＨ、ＨＣＧ等のホルモン類、インスリン等が例示できるが、これらに限定されるものではなく、サンドイッチ免疫測定法で測定できるものは全て本発明の方法の測定対象物質に含まれる。

食品検体としては、液体飲料、半固形食品、固形食品等が挙げられる。
本発明により測定できる食品検体中の測定対象物質としては、微生物、細菌、ウィルス、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質、脂質、糖脂質、核酸、毒素、アレルゲン等またはこれらの複合体等が挙げられ、低分子物質がこれらと結合したものも含まれるが、これらに限定されるものではなく、サンドイッチ免疫測定法又はこれに準じる方法で測定できるものは全て本発明の方法の測定対象物質に含まれる。

環境サンプリング検体としては、土壌、河川、海水等の自然界のサンプルの他、工場内の生産ラインやクリーンルームに設置されたエアーサンプラーによるサンプリング検体や、ふき取り検体等も挙げられる。
本発明により測定できる環境サンプリング検体中の測定対象物質としては、微生物、細菌、ウィルス、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質、脂質、糖脂質、核
酸、毒素等またはこれらの複合体等が挙げられ、低分子物質がこれらと結合したものも含まれるが、これらに限定されるものではなく、サンドイッチ免疫測定法又はこれに準じる方法で測定できるものは全て本発明の方法の測定対象物質に含まれる。

検体はそのまま本発明の方法に用いることもできるし、希釈や抽出等の処理を施した後に本発明に用いることもできる。

サンドイッチ免疫測定法とは、測定対象物質に対して結合能を有する第２の抗体を固相に結合させたものと、測定対象物質に対して結合能を有するが、その結合に際して第２の抗体と競合しない第１の抗体を標識物質で標識したものを準備し、これらと測定対象物質を含む検体を反応させて、測定対象物質が前記２種類の抗体によりサンドイッチ様に挟み込まれた免疫複合体を固相表面上に形成させた後、標識物質を検出することを含む方法をいう。また、測定対象物質に結合する抗体がポリクローナル抗体である場合には、該ポリクローナル抗体は測定対象物質の複数の部位に結合することができ得るので、測定対象物質のサンドイッチ様の挟み込みは３つ以上の抗体分子によりなされることもある。

本発明において、第１抗体及び第２抗体が測定対象物質に対する結合に際して互いに競合しない関係とは、第１抗体及び第２抗体がそれぞれ測定対象物質の異なるエピトープに結合する関係、第１抗体がモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体で第２抗体がポリクローナル抗体であって、第２抗体は第１抗体と同一のエピトープに結合する抗体を含むが、異なるエピトープに結合する抗体も含む関係をいう。

本発明における抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよいが、安定した品質の抗体を安定して供給するためには、モノクローナル抗体であることが好ましい。また、本発明における抗体には、抗体をペプシンやパパインのようなタンパク質分解酵素で分解し、測定対象物質である抗原に対する結合性を維持した、Ｆ（ａｂ'）₂フラグメント、Ｆａｂ'フラグメント、Ｆａｂフラグメントや、２本のＨ鎖同士を結びつけているジスルフィド結合を還元して解離させて、１本のＨ鎖と１本のＬ鎖からなるフラグメントとしたものも含まれる。また、本発明における抗体には、単鎖抗体やその２量体（ダイアボディー）もしくは３量体（トリアボディー）、又はミニボディーも含まれる。本発明に使用する抗体として、一般的に用いられているマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、トリ由来のもの等が使用できるがこれらに限定されず、測定対象物質に特異的に結合する抗体であれば何れも使用できる。

本発明に用いられる標識物質としては、酵素、放射線同位元素、蛍光物質、発光物質、金コロイド等が挙げられる。標識物質のなかでも、西洋わさび過酸化酵素（ＨＲＰ）や、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識がより好ましい。標識にアルカリフォスファターゼを用いる場合は、酵素の基質としてＡＭＰＰＤ（３−（２'−スピロアダマンタン）−
４−メトキシ−４−（３''−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・２ナトリウム塩）、９−（４−クロロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン二ナトリウム塩等の発光基質を使用することができる。また、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ローダミン等の蛍光色素等を使用することができる。

互いに親和性を有する２種類の結合材の組み合わせは、アビジンとビオチン、ストレプトアビジンとビオチン、プロテインＡとＩｇＧ、プロテインＧとＩｇＧ、カルボキシル基＋縮合剤と蛋白質、受容体とこれに結合するリガンド、核酸とこれに結合する相補的な核酸、レクチンとこれに結合する特異的な糖鎖等が挙げられる。親和性の高さや反応速度等から、アビジンとビオチン、ストレプトアビジンとビオチンの組み合わせがより好ましい。

本発明において、磁性粒子は固相として用いられる。該磁性粒子は、例えば、特表２００２−５１７０８５号公報等に開示された方法によって製造することができる。すなわち、鉄（II）化合物、または鉄（II）化合物及び金属（II）化合物を含有する水溶液を、磁性酸化物の形成のために必要な酸化状態下に置き、溶液のｐＨを７以上に維持して、酸化鉄、またはフェライト磁性体ナノ粒子を形成する方法である。また、金属（II）化合物含有の水溶液と鉄（III）化合物含有の水溶液をアルカリ性条件下で混合することによっても製造することができる。

あるいは、磁性粒子は、多価アルコールとマグネタイトから製造することもできる。この多価アルコールは、構成単位に水酸基を少なくとも２個有し、鉄イオンと結合可能なアルコール構造体であれば、特に制限なく使用することができる。例えば、デキストラン、ポリビニルアルコール、マンニトール、ソルビトール、シクロデキストリン等が挙げられる。例えば、特開２００５−０８２５３８号公報に、デキストランを用いた磁性粒子の製造方法が開示されており、この方法によって製造することもできる。また、グリシジルメタクリレート重合体のように、エポキシ基を有し、開環後多価アルコール構造体を形成する化合物も使用できる。

磁性粒子は、良好な分散性を有するように、その平均粒径が、１〜１０００ｎｍであることが好ましい。特に、磁性粒子表面の第２抗体と検出対象物質との反応速度を高めるためには、平均粒径が５０〜２００ｎｍであることが好ましい。粒子径測定は光散乱で行うことができ、このような粒子径測定を行える機器としては、ＥＬＳ−８０００（大塚電子株式会社製）が挙げられる。

磁性粒子は、その平均粒径が１０００ｎｍ以下であると、磁集に時間を要する。そこで、磁集速度を速めるために、刺激応答性高分子による表面修飾磁性粒子を使用することが好ましい。刺激としては、温度変化、ｐＨ変化等が挙げられる。例えば、温度応答性高分子で表面修飾した磁性粒子は、加熱または冷却により温度応答性高分子が凝集するために、磁性粒子が凝集塊を生成し、短時間で磁集が可能になる（特開２００５−０８２５３８号公報）。このような温度応答性高分子表面修飾磁性粒子として、マグナビート社の「ＴｈｅｒｍａＭａｘ（登録商標）」等が挙げられる。温度応答性高分子表面修飾磁性粒子の温度応答範囲は免疫反応に差し支えなければ特に限定しないが、例えば、下限臨界溶液温度を持つ該磁性粒子を用いる場合は２５℃から４０℃、より好ましくは３０℃から３７℃のものが好適に用いられる。
また、温度変化だけでなく、凝集剤を用いることで、凝集塊を生成させることもできる。凝集剤としては、例えば、硫酸リチウム、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム等の硫酸金属塩等や、酢酸ナトリウムやクエン酸ナトリウム等のカルボン酸金属塩等が利用できる。凝集剤を使用して生成した凝集塊は、加熱または冷却により生成した凝集塊と同様に短時間で磁集が可能になる。

また、特開２００６−２４２５９７号公報には、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸で表面修飾した粒径１ｎｍ以上５０ｎｍ以下の磁性粒子が開示されている。このようなポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸で表面修飾した磁性粒子は、クエン酸−リン酸緩衝液により凝集塊を生成し、磁集が可能になる。以上のように平均粒径が１０００ｎｍ以下で良好な分散性を有し、かつ短時間で磁集可能な磁性粒子が好ましい。

磁性粒子は、互いに親和性を有する２種類の結合材の組み合わせのうち一方を結合させて用いる。例えば、第２抗体にビオチンが結合されている場合は、アビジンまたはストレプトアビジンを結合した磁性粒子を使用し、第２抗体にアビジンが結合されている場合は、ビオチンを結合した磁性粒子を使用し、第２抗体にストレプトアビジンが結合されている場合は、ビオチンを結合した磁性粒子を使用する。

以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。

本発明の第１の測定方法では、まず、測定対象物質を含む検体と、標識物質で標識された第１抗体とを混合して、検体中の測定対象物質と第１抗体とを反応させる。その際の反応時間は、好ましくは３０秒以上、より好ましくは１分以上である。次に互いに親和性を有する２種類の結合材の一方が結合した第２抗体と他方が結合した磁性粒子との混合液を添加して、測定対象物質と標識された第１抗体からなる複合体と第２抗体とを反応させる。その際の反応時間に特に制限はないが、好ましくは１０分以下、より好ましくは５分以下であり、３分以下、１分以下、３０秒以下、１０秒以下であってもよい。その後、磁性粒子を回収し、後述する方法で標識物質を利用して、測定対象物質を定量する。

本発明の第２の測定方法では、まず、測定対象物質を含む検体と、標識物質で標識された第１抗体とを混合して、検体中の測定対象物質と第１抗体とを反応させる。その際の反応時間は、好ましくは３０秒以上、より好ましくは１分以上である。次に互いに親和性を有する２種類の結合材の一方が結合した第２抗体を添加して、測定対象物質と標識された第１抗体からなる複合体と、第２抗体を反応させる。その際の反応時間に特に制限はないが、好ましくは１０分以下、より好ましくは５分以下であり、３分以下、１分以下、３０秒以下、１０秒以下であってもよい。続いて該結合材の他方が結合した磁性粒子を添加して、２種類の結合材を反応させる。その際の反応時間に特に制限はないが、好ましくは１０分以下、より好ましくは５分以下、好ましくは３分以下であり、１分以下、３０秒以下、１０秒以下であってもよい。その後、磁性粒子を回収し、後述する方法で標識物質を利用して、測定対象物質を定量する。

本発明の第３の測定方法では、まず、測定対象物質を含む検体と、標識物質で標識された第１抗体とを混合して、検体中の測定対象物質と第１抗体とを反応させる。その際の反応時間は、好ましくは３０秒以上、より好ましくは１分以上である。次に互いに親和性を有する２種類の結合材の一方が結合した磁性粒子を添加する。続いて該結合材の他方が結合した第２抗体を添加して、測定対象物質と標識された第１抗体からなる複合体と第２抗体の反応と、２種類の結合材の反応を同時に進行させる。その際の反応時間に特に制限はないが、好ましくは１０分以下、より好ましくは５分以下であり、３分以下、１分以下、３０秒以下、１０秒以下であってもよい。その後、磁性粒子を回収し、後述する方法で標識物質を利用して、測定対象物質を定量する。

上述した３つの測定方法のうち第１の測定方法では、あらかじめ、互いに親和性を有する２種類の結合材の一方が結合した第２抗体と他方が結合した磁性粒子とを混合した混合液を使用するため、試薬を添加するステップを少なくでき、測定時間がより短縮でき得るので好ましい。この場合において、第２抗体と磁性粒子が、２種類の結合材を介して結合したものだけを分離精製して保存しておき、結合していない遊離の第２抗体及び遊離の磁性粒子を実質的に含まない溶液を添加することも本発明に含まれる。

上記した本発明の第１〜第３のいずれの測定方法でも、標識物質で標識された第１抗体と、磁性粒子の結合した第２抗体とで検体中の測定対象物質をサンドイッチ様に挟み込んだ複合体を得ることができる。この複合体を磁集し、洗浄して共雑物を除去し、複合体中の標識を利用して測定対象物質の濃度を定量する。磁性粒子として温度応答性高分子表面修飾磁性粒子を用いる場合には、反応混合物の温度を上昇させた後、又は凝集剤を添加した後に、磁集を行うことができる。標識物質の検出は、磁集した複合体を再度水やバッファー等に分散させて、溶液中の標識物質濃度を均一にしてから行うこともできるし、複合体を磁集したままの状態、又は別の位置に磁集して、局所的に標識物質の濃度を高めて検出することもできる。

測定対象物質の定量方法は、標識の方法によって異なり、例えば、標識物質として蛍光物質を用いた場合、その蛍光強度を測定することで測定対象物質を定量することができるし、標識物質としてアルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ、グルコースオキシダーゼ等を用いた場合には、発色基質や発光基質を添加することで、吸光度や発光強度の変化を測定して測定対象物質を定量することができる。また、標識物質として放射性同位元素を用いた場合には放射能を測定することで測定対象物質を定量することができるし、標識物質として金コロイドを用いた場合には、吸光度を測定することで測定対象物質を定量することができる。これらの標識物質の測定方法は当業者に周知の方法で行うことができる。本発明に好適な標識物質としては、アルカリフォスファターゼが挙げられ、ＡＭＰＰＤ（３−（２'−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３''−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・２ナトリウム塩）、９−（４−クロロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン二ナトリウム塩等の発光基質を添加して発光強度を測定することで測定対象物質を定量することができる。

反応を行う温度、反応混合物、洗浄液等の組成、ｐＨ等は、一般的に行われるサンドイッチ免疫測定法に使用する条件でよい。反応温度としては、２５〜４０℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。また、温度応答性高分子表面修飾磁性粒子を用いる場合は、温度応答性高分子が凝集しない温度で反応を行うことが好ましい。反応混合物、洗浄液としては、使用する標識物質に影響を与えないことが好ましく、例えば標識物質が酵素の場合には、酵素活性を阻害しないものを選択する必要がある。検出にアルカリフォスファターゼを使用するのであれば、一般的な、Ｔｒｉｓバッファー、ＰＩＰＥＳバッファー等を使用することができるし、これらのバッファーに塩や、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ等の非イオン性の界面活性剤を加えたもの、アルブミンやカゼイン等を添加したものを用いることもできる。測定に適した反応混合物や洗浄液の組成は、測定対象物質や使用する試薬の性質により変化し得るが、当業者が通常行う手段によって最適化することができる。

本発明の方法は、用手法で行うこともできるし、専用の自動分析機で行うこともできる。

以下ＢＮＰの測定に関する実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

ＢＮＰは、心臓（主に心室）から分泌されるホルモンであり、健常者の血中ＢＮＰ濃度は２０ｐｇ/ｍL以下であるが、心疾患または心不全の患者では重篤度によって濃度が上昇することが知られている。自覚症状のない軽度の患者の血中のＢＮＰ濃度も上昇することが知られている。

〔実施例１〕
標識物質で標識された第１抗体として、アルカリフォスファターゼ標識抗ＢＮＰ抗体（以下「Ｒ２抗体」と略すことがある）、互いに親和性を有する２種類の結合材の一方が結合した第２抗体としてビオチン標識抗ＢＮＰ抗体（以下「Ｒ１抗体」と略すことがある）、及び互いに親和性を有する２種類の結合材の他方が結合した磁性粒子としてアビジンを固定した磁性粒子を用い、サンドイッチ免疫測定法によりＢＮＰを定量した。

検体である標準ＢＮＰ試薬（塩野義製薬株式会社製、ＭＩ０２シオノギＢＮＰ（商品名）、標準ＢＮＰ試薬）をマイクロチューブに６５μL分注した。ここに、Ｒ２抗体（塩野義製薬株式会社、ＭＩ０２シオノギＢＮＰ（商品名）、ＢＮＰ第二抗体試薬）０．２μLと標準試薬Ｏ（塩野義製薬株式会社製、ＭＩ０２シオノギＢＮＰ（商品名）、標準ＢＮＰ試薬、ＢＮＰ不含）１２．８μLの混合液１３μLを加えてピペッティングにて攪拌し、３０℃で５分間、反応させた。

反応が終了した検体とＲ２抗体との反応混合物に、Ｒ１抗体（塩野義製薬株式会社、ＭＩ０２シオノギＢＮＰ（商品名）、ＢＮＰ第一抗体試薬）０．２μLと標準試薬Ｏ１．８μLと磁性粒子（マグナビート株式会社製、Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ（登録商標）ＬＡＡｖｉｄｉｎ、商品コードＴＭＬ００１、濃度４ｍｇ／ｍL、平均粒径１１０ｎｍ）２０μLを混合液として用意し、２２μL添加した。ここで、３０℃で５分間、反応させる工程を設けてもよいが、今回は、この工程を省略した。

続いて、反応混合物に凝集剤３０μLを加え、ピペッティングにて攪拌し、３０℃で３
０秒反応後、Ｍａｇｎａ−Ｓｔａｎｄ６（（商品名）、マグナビート株式会社、商品コードＴＭＭ００１）にセットし、３０℃で１分間、磁気分離し、その後、上清を除去した。洗浄液（塩野義製薬株式会社製、ＭＩ０２シオノギＢＮＰ（商品名）、ブロック液）１００μLにて沈殿物を再分散し、凝集剤３０μLを加えピペッティングにて攪拌し、３０℃で３０秒反応後、３０℃で１分間、磁気分離し、洗浄を行なった。洗浄は同様の手順で２回繰り返した。最後に洗浄液１００μLにて沈殿物を再分散し、全量をマイクロプレートに移し、ＡＰＳ−５（Ｌｕｍｉｇｅｎ社製、商品コードＡＰ５−１０１）１００μLを混合し、５秒間攪拌した後、１０秒反応させ、マルチラベルプレートリーダー（ベルトールドジャパン株式会社製、ＭｉｔｈｒａｓＬＢ９４０（商品名））にて０．１秒間発光強度を測定した。測定結果を表１に示した。ここでは、凝集剤として、１ＭＮａ₂ＳＯ₄水溶液を用いた。

最小検出濃度（ＭＤＣ値）０．４４ｐｇ／ｍL
最小検出濃度は以下の方法で算出した。
（最小濃度×２ＳＤ／最小濃度時の平均値−濃度０時の平均値）

〔比較例１〕
比較例として、検体に磁性粒子とＲ１抗体及び、Ｒ２抗体の混合物を添加して、従来のサンドイッチ法によりＢＮＰを定量した例を示す。

磁性粒子、Ｒ１抗体、Ｒ２抗体同時混合サンドイッチ法
測定方法は、以下の通りである。検体として標準ＢＮＰ試薬（塩野義製薬株式会社製、ＭＩ０２シオノギＢＮＰ（商品名）、標準ＢＮＰ試薬）をマイクロチューブに６５μL分
注した。ここに、Ｒ１抗体（塩野義製薬株式会社製、ＭＩ０２シオノギＢＮＰ（商品名）、ＢＮＰ第一抗体試薬）２μL、Ｒ２抗体（塩野義製薬株式会社製、ＭＩ０２シオノギＢＮＰ（商品名）、ＢＮＰ第二抗体試薬）０．５μLと標準試薬Ｏ（塩野義製薬株式会社製、ＭＩ０２シオノギＢＮＰ（商品名）、標準ＢＮＰ試薬）１２．５μLと磁性粒子（マグナビート株式会社製、Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ（登録商標）ＬＡＡｖｉｄｉｎ、商品コードＴＭＬ００１、濃度４ｍｇ／ｍL、平均粒径１１０ｎｍ）２０μLの混合液を３５μL加えてピペッティングにて攪拌し、３０℃で５分間反応させた。反応終了後、反応混合物に凝集剤３０μLを加えてピペッティングにて攪拌し、３０℃で３０秒反応後、Ｍａｇｎａ−Ｓｔａｎｄ６（（商品名）、マグナビート株式会社製、商品コードＴＭＭ００１）にセットし、３０℃で１分間磁気分離し、その後、上清を除去した。洗浄液（塩野義製薬株式会社製、ＭＩ０２シオノギＢＮＰ（商品名）、ブロック液）１００μLにて沈殿物を再分散し、凝集剤３０μLを加えピペッティングにて攪拌し、３０℃で３０秒反応後、３０℃で１分間磁気分離し、洗浄を行なった。洗浄は同様の手順で２回繰り返した。最後に洗浄液１００μLにて沈殿物を再分散し、全量をマイクロプレートに移し、ＡＰＳ−５（Ｌｕｍｉｇｅｎ社製、商品コードＡＰ５−１０１）１００μLを混合し、５秒間攪拌した後、１０秒反応させ、マルチラベルプレートリーダー（ベルトールドジャパン株式会社製、ＭｉｔｈｒａｓＬＢ９４０（商品名））にて０．１秒間発光強度を測定した。測定結果を表２に示した。ここでは、凝集剤として、１ＭＮａ₂ＳＯ₄水溶液を用いた。

最小検出濃度(ＭＤＣ値)０．９８ｐｇ／ｍL

実施例１では、Ｒ２抗体０．２μL及びＲ１抗体０．２μLを用いた。これに対して比較例１ではＲ２抗体０．５μL及びＲ１抗体２μLを用いた。これらを同じ測定時間で比較すると、表１及び表２の結果からわかるように、実施例１の測定方法は比較例１の測定方法よりも低い最小検出濃度を示していることがわかる。つまり測定時間を一定に設定した場合、本発明の測定方法は高感度にＢＮＰを測定可能であるのに加えて、抗体の使用量が少なく、安価に測定することができた方法である。

本発明の方法は、少ない試薬量で、短時間に、高精度且つ高感度に測定結果を出すことができるため、臨床分野、産業分野での利用が考えられる。本発明は、特にＰＯＣＴ分野
に適した測定方法であり、例えばＢＮＰの検査に利用することができる。

Claims

検体と、標識物質で標識された第１抗体とを混合して混合液を調製する工程、
互いに親和性を有する２種類の結合材の一方が結合した第２抗体と、該２種類の結合材の他方が結合した磁性粒子を、前記混合液に添加する工程、
前記磁性粒子を回収する工程、及び
前記標識を検出する工程
を含み、
前記第１抗体と前記第２抗体は測定対象物質に対する結合能を有し、その結合に際して互いに競合しないことを特徴とし、
前記磁性粒子の平均粒径が５０〜２００ｎｍであることを特徴とする、
検体中の測定対象物質の濃度を測定する方法。
前記第２抗体と前記磁性粒子とを、前記混合液に同時に添加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記第２抗体を前記混合液に添加した後に、前記磁性粒子を添加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記磁性粒子を前記混合液に添加した後に、前記第２抗体を添加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記第１抗体及び前記第２抗体の少なくとも一方がモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
前記測定対象物質がペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
前記ペプチドが脳性ナトリウム利尿ペプチドである、請求項６に記載の方法。