CN101566626A - 一种抗原检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗原检测方法及其应用，该方法将抗原信号的检测转化为对核酸条码标识的检测，其操作步骤为：(1)用待测抗原的抗体I标记经过修饰的纳米磁性微球制备免疫磁性微球；用待测抗原的抗体II和核酸条码片段同时标记纳米金溶胶制备双标记纳米金探针；(2)使免疫磁性微球和纳米金探针与待测抗原充分结合，除去结合聚集物，留下上清液待检；(3)对上清液中的核酸条码标识进行检测。该抗原检测方法可以应用与临床的PSA抗原的检测。该方法操作简单，灵敏度高，特异性好，易于自动化，有广泛的应用前景。

Description

一种抗原检测方法及其应用

【技术领域】

本发明属于诊断技术领域，具体涉及超微量抗原检测技术及其在超微量肿瘤抗原-前列腺特异性抗原(PSA)检测中的应用。

【背景技术】

随着医学诊断技术迅速发展，抗原检测手段也日新月异变化。发展至今，放射性免疫分析法、酶联免疫分析法和荧光免疫分析法这三大技术是免疫化学、免疫学以及分子生物学中应用最广的常规抗原分子检测手段。

1959年，美国学者Berson和Yalow建立放射免疫分析(RadioImmunoassay，RIA)法，由于RIA具有灵敏度高、特异性强、简便等优点，RIA具有一定的生命力，但因为它必须使用放射性核素，需要防护，防止污染；标记物有效使用时间短，难以实现操作和测量的自动化等，它的进一步发展受到一些局限，因此不少学者进行了新检测方法探索。

1971年，Engvall、Perlaman和Weeman、Schuur两组学者用酶代替同位素制备酶标记试剂，创立了酶免疫分析技术(Enzyme Immune sorbentAssay，EIA)。至今有二十多种酶已被应用于EIA，其中以辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)为主，EIA除了避免放射性同位素的危害外，更重要的优点是酶标记物有效期更长，但普通的EIA灵敏度不高，而后来发展的荧光免疫分析(Immune fluorescence Assay，FIA)和化学发光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay，CLIA)提高灵敏度和检测法范围。

1992年，Sano等人将免疫测定技术与PCR结合，创建了一种全新的极其敏感的抗原分子检测技术，即免疫-PCR(Immune-PCR)。它的出现解决了上述三种抗体标记技术的不足之处，然而，由于此法操作复杂，步骤烦琐，难以推广开来。

在早期癌抗原及某些神经肽等极微量抗原检测上，荧光标记及酶标记技术还缺乏足够的灵敏性。放射性同位素标记技术的灵敏度虽然能达到μg/ml的数量级，在实际操作中由于需特殊设备和安全防护，因此限制了它在实际过程中的广泛应用。

纳米技术的介入为抗原检测技术的研究发展提供了无穷的想象空间。纳米粒子(英文名称为nano particles)是指粒径在1nm-100nm范围内的粒子，也称超微粒子(英文名称为ultrafine particles)，其处在原子和宏观物体交界的过渡区域内，具有特殊的性能。

纳米金粒子本身具有小尺寸效应，表面效应，化学反应活性等独特的物化特性，而日益收到人们的关注，在生物医学领域，特别是检测技术领域具有广泛的应用前景，纳米金溶胶具有特殊的颜色，可以通过弱的相互作用与生物大分子结合，也可以通过化学键与生物大分子偶联，而不改变生物大分子的生物活性，目前常被制备成免疫纳米金探针广泛应用于快速免疫诊断。

纳米免疫磁性微球是表面结合有单克隆抗体的磁性微球。磁性微球大小和抗体大小相接近，化学性能稳定，不产生凝聚；不与细胞发生非特异性的结合；磁性微球与抗体的结合牢固；磁性微球的大小均匀，磁响应性好，磁性纳米材料的含量均匀一致；磁性微球大小适当，不易被细胞所吞噬，所以免疫磁性微球主要用于细胞分离等方面。

目前，纳米金为代表的诊断技术中，以斑点免疫金银染色(Dot-immune goldsilver staining，Dot-IGSS)，斑点免疫金渗滤法(Dot-immune gold filtrationassay，DIGFA)和免疫金层析法(immune chromatography，GICA)，三种为主。1989年，Spielberg等最先发展了以纳米金为标记物的渗滤试验，用于检测艾滋病病毒抗体，确立斑点免疫金渗滤法(Dot-immune gold filtration assay，DIGFA)。Beggs等最先将金胶用于人绒毛膜促性腺激素(HCG)的测定(Beggs M，NovotnyM，Sampedro S，et al.A self-performing chromatography immunoassay for thequantitative determination of HCG in urine and serum.Clin.Chem.，1990，36(6)：1084-1085.)由于纳米金为代表的诊断试剂盒与放免、酶标试剂盒相比，具有操作使用安全、简便、快速等优点，因此近些年来金标诊断试剂盒日益流行，在某些项目上已逐渐替代了放免、酶标试剂盒，如早孕试剂条等。

生物探针是具有放射性或非放射性标记的寡核苷酸，用于从大量核酸样品中找出互补的目标序列，然后用放射自显影或其他显色法(如连接的酶作用于可显色底物)显示目标序列所在位置。纳米金可通过Au-S共价键与核酸分子作用，在DNA的识别和检验方面展示出极具应用价值的成果，纳米金可通过Au-S共价键与硫醇修饰的寡核苷酸结合，二硫苏糖醇(DTT)或巯基乙醇(MCE)作为还原剂可将寡核苷酸替换下来，形成的纳米金生物核酸探针可应用于核酸或蛋白芯片检测诊断技术(Hil HD，Mirkin CA.The bio-barcode assay for the detection ofprotein and nucleic acid targets using DTT-induced ligand exchange.NATUREPROTOCOLS，2006，1(1)：324-337.)。发明专利申请公开说明书(公开号：CN1339609A；国别：中国；公开日：2002年3月13日)就公开了一种纳米金标记基因探针，其中采用采用纳米金与烷硫醇修饰的核酸结合形成探针，其一般用于诊断型芯片领域。

纳米金标记抗体，并可通过银显影放大信号。Duan L等利用纳米金标记作为报告分子，建立一种同时快速检测乙型，丙型肝炎病毒的蛋白芯片(抗体芯片)检测法，与常规酶联免疫分析(ELISA)检测法相比，无明显差异(Duan L，WangY，Li SS，et al.Rapid and simultaneous detection of human hepatitis B virusand hepatitis C virus antibodies based on a protein chip assay using nano-goldimmunological amplification and silver staining method.BMC Infect Dis.2005；5：53)。

而在免疫磁性微球方面，其是近年来发展迅速的新技术，主要用于分离浓缩等试验，磁性粒子能与蛋白质以共价方式结合而不影响其活性，所以常用来俘获特定蛋白或分离蛋白。原理如下：将某抗体标记磁性微粒，放入含目的抗原的溶液中，经充分混合反应后，形成抗原抗体磁性微粒混合物，使溶液通过磁场，由于磁性微粒被吸附而使目的抗原截留下来，也可根据磁性强弱确定抗体或抗原量的多少。

基于纳米金和免疫磁性微球特性的结合，美国西北大学纳米技术研究所Chad A.Mirkin教授领导的研究小组在2003年建立了以DNA标记免疫检测为基础的“生物条码核酸芯片检测法”(Nam JM，Thaxton CS，Mirkin CA.Nanoparticle-Based Bio-Bar Codes for the Ultrasensitive Detection of Proteins.SCIENCE，2003，301：1884-1886)。其做法具体：采用双抗体夹心法检测血清中超微量前列腺癌特异性抗原，利用纳米金生物探针上的寡核苷酸片段进行放大检测信号，从而获知超微量抗原水平，检测下限比传统ELISA法低至6个数量级，不仅适用于DNA还适用于蛋白抗原。2006年，研究小组成功应用此法同时检测PSA，HCG，AFP(Stoeva SI，Lee JS，Smith JE，et al.Multiplexed Detection ofProtein Cancer Markers with Biobarcoded Nano particle Probes.J.AM.CHEM.SOC.2006，128：8378-8379.)，另外，他们还用此法检测脑脊液中微量ADDL蛋白，而普通检测方法难以检测到ADDL，阐明了死后被诊断为老年痴呆患者的脑脊液中高于健康个体的ADDL蛋白浓度，有利于老年痴呆症的早期诊断。(Georganopoulou DG，Lei Chang，Nam JM，et al.Nano particle-baseddetection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic biomarker forAlzheimer’s disease.PNAS，2005，102(7)：2273-2276)该方法目前还只存在与实验研究阶段，所用的抗原样本为标准样本，而临床检测时需要用到血清样本，所以需要对血清的稀释度进行研究，另外该方法操作复杂，需要用计算机芯片技术进行检测，检测成本较高。

【发明内容】

为了解决上述的技术问题，本发明基于纳米技术和免疫学检测技术的结合，将纳米金和免疫磁性微球同时运用到检测技术中，即提供一种简单的采用核酸条码(nucleic acid codes)标识的抗原诊断检测方法，将抗原分子的检测转换为对核酸条码标识的检测，无需特殊的仪器设备，操作简单快捷，灵敏度高，特异性好，易于自动化，有广泛的应用前景。

本发明的目的是这样实现的，即建立基于制备免疫磁性微球和纳米金探针的双抗体夹心法检测前列腺特异性抗原，通过检测核酸条码的量而放大检测蛋白抗原的信号，从而获知超微量蛋白质检测水平。要求检测反应中抗原抗体的能特异性结合，而通用核酸条码片段又可以达到非酶促信号放大，提高检测灵敏度的效果。

本发明包括二方面的内容：核酸条码标识的检测方法和核酸条码标识检测的应用，其创新点在于核酸片段可标记抗原抗体反应，将超微量抗原的检测转化为对核酸片段的检测，双抗体夹心和核酸条码信号的放大，大大提高检测灵敏度。本发明适用于各类抗原物质的检测，包括早期癌抗原及某些神经肽等极微量抗原的检测。

本发明的具体技术方案如下：

一种微量抗原检测方法，所述的抗原包括所有的抗原，不局限于PSA抗原。

其操作步骤如下：

1、免疫磁性微球的制备

所述免疫磁性微球是由海藻酸钠磁性微球表面修饰相应抗体而构成，该抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，每毫克磁性微球连接的抗体含量为70μg～150μg，其中以含有羧基的生物可降解的高分子材料海藻酸钠交联形成高分子包裹层，包裹层内还包含纳米磁性材料，用反相微乳法在高速搅拌和超声的条件下制备磁性微球，然后在化学交联剂的作用下，将高分层上再连接单克隆抗体，形成免疫磁性微球，制得的免疫磁性微球的粒径范围在300nm～1μm左右。

其具体制备方法如下：

(1)磁性微球的制备

取一定量的海藻酸钠和Fe₃O₄溶于蒸馏水中，微热使之充分溶解后，超声15分钟后形成磁流体混合液，调节混合液的pH为10左右，升温至60℃。超声和高速搅拌的条件下，将一定量混合液逐滴加入到温度为60℃的AOT/正庚烷油相中，形成透明的灰黑色反相微乳体系。在超声和搅拌的条件下将30％的CaCl₂溶液加入到微乳体系中，再逐滴加入一定量的环氧氯丙烷，继续搅拌3～5小时，进行磁分离后，依次用丙酮、乙醇和蒸馏水洗涤，然后离心分选，真空冷冻干燥后保存。

(2)免疫磁性微球的制备

取1mg制备好的磁性微球，PBS定容到4ml，加入水溶性3mg～6mg的EDC和6mg～10mg的sufl-NHS，充分混匀，室温反应15min，加入0.1-0.2mg/ml的6-氨基己酸，轻摇3h，加入600μl，20μg/ml～30μg/ml测试抗原的抗体，轻轻搅拌5h～10h，加入0.2 M含0.2％BSA的甘氨酸溶液封闭，磁分离洗涤，加入储存液4℃保存待用。

以下操作步骤是对免疫磁性微球的分析：

A.用透射电子显微镜(TEM)和光镜进行形貌的定性检测。

B.采用流式细胞仪检测抗体活性情况：取1mg磁性微球冻干品稀释并按上述方法连接包被150μg小鼠IgG，定容为5mg/ml免疫磁性微球。取5试管，分别加入0.01M，pH7.4的PBS 1ml，5mg/ml免疫磁性微球80μl(磁性微球包被小鼠IgG)，充分混匀，加入一定量FITC标记的羊抗小鼠IgG，37℃避光分别轻摇0.5h、1h、2h，3h，磁场分离，浓度为0.01M，pH为7.4的PBS重复洗涤三次，用流式细胞仪检测免疫磁性微球抗体活性情况。

2、纳米金生物探针的制备

所述的纳米金探针是由大小粒径为10nm～50nm纳米金微粒表面静电吸附抗体，共价结合核酸条码(nucleic acid codes)片段而构成。所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

所述的核酸条码片段为单链DNA或RNA分子，其长度为10～50bp，其一端被巯基修饰，另一端被生物素、荧光基团标记。

所述的核酸条码片段靠近巯基的一端包含有烷氢和多个单一碱基形成的基团。

制备纳米金探针时，纳米微粒表层覆盖有通过Au-S共价键牢固结合的核酸条码片段，二硫苏糖醇(DTT)或巯基乙醇(MCE)作为还原剂将核酸条码片段替换下来。

纳米金微粒表面静电吸附抗体，并易于交连结合的活性基团-巯基(-SH)，对核酸条码分子进行硫醇修饰。为了克服寡核苷酸单链分子连接时候的空间位阻问题，核酸条码片段-SH端增加了烷氢基团，并连接了10个腺嘌呤(A)作为“手臂”以有活动空间，另外所连接的寡核苷酸片段为10bp-50bp，过长的片段容易缠绕在金纳米粒子表面。

其具体操作步骤如下：

(1)胶体金的制备

将100ml 0.01％的HAuCl4溶液加热至沸腾；高速搅拌条件下(1200rpm)快速加入5ml浓度为1％的柠檬酸三钠(上海国药，Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)，继续加热搅拌30min，自然冷却，用超纯水恢复至原体积。用0.22μm滤膜过滤，4℃避光保存备用。

用透射电子显微镜(TEM)观察纳米金粒子的形貌，用激光散射仪测定其大小和粒径分布，用紫外-可见光分光光度计扫描观察吸收峰值，并根据朗伯-比尔定律估算纳米金的浓度。

(2)纳米金生物探针的制备

取上述5ml纳米金溶胶(约3.5nM)，用Na₂CO₃调pH值至9左右。按比例加入与待测抗原的抗体(7μg/ml)和一定量的硫醇(3’-端硫醇、烷硫醇)修饰的寡核苷酸(ssDNA)(稀释至13.2μg/ml)，随即旋涡混匀，轻摇3h，低温避光静置过夜，使溶液中纳米金粒子和抗体、寡核苷酸(ssDNA)能够充分作用。加入0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)，10％(W/V)的十二烷基硫酸钠(SDS)使其终浓度为0.01％，旋涡混匀，置于摇床中30min，逐渐加入1.2M的NaCl溶液，使浓度至0.15M，边加边旋涡混匀，静置平衡3h以上，稳定ssDNA的连接。最后，加入5％(W/V)的牛血清白蛋白(BSA)使最终浓度为1％，混匀平衡。

取上述制备好的纳米金探针，12000r/min，40min，4℃，倾去上清液除去未结合的抗体和寡核苷酸，0.01M PBS(pH7.4)和0.15M NaCl溶液(含0.1％BSA，0.01％SDS)重复洗涤红色油状沉淀，磷钨酸负染，透射电镜(TEM)对探针进行形貌大小定性观察，紫外-可见光分光光度计波长扫描分析。

用免疫金银染色光镜观察分析纳米金探针的形貌，用斑点免疫金渗滤测定纳米金探针上抗体的活性。

3、核酸条码标识的建立

所述的核酸条码标识法，采用了免疫磁性微球和纳米金探针，所述的纳米金探针的核酸条码为抗原检测标识信号。

所述的核酸条码标识法的建立包括如下步骤：

(1)免疫磁性微球与含目的抗原的物质混合，轻摇孵育，磁分离洗涤；

(2)重新悬浮，加入纳米金探针，轻摇孵育，磁分离洗涤，留聚集物；

(3)加入还原剂还原出核酸条码片段；

(4)低温超速离心，作用获取核酸条码片段。

更具体的步骤为：

(1)免疫磁性微球、待测抗原混合，混合，37℃轻摇孵育；

(2)磁场分离，重复洗涤，稀释液悬浮；

(3)加入纳米金探针，混合，37℃轻摇孵育；

(4)磁场分离，重复洗涤；

(5)加入DTT，混匀，纯化，去结合聚集物，检测上清液；

所述核酸条码标识法，DTT的加入终浓度不超过0.01M；

所述的抗原为PSA抗原时，其更进一步具体的操作步骤为：

将标准PSA抗原稀释至10～1000倍，取10μl～80μl，5～10mg/ml的免疫磁性微球，加入稀释的PSA标准抗原1ng～500ng，超纯水定容至1ml，37℃轻摇1h，磁场分离，0.01M，pH7.4 PBS(含0.2％BSA)重复洗涤三次，分别加入核酸条码法稀释液和体积比为1∶2～1∶16(免疫磁性微球和纳米金探针的体积比)的纳米金探针，37℃，200～500r/min轻摇1h～3h，磁场分离，核酸条码法洗涤液重复洗涤，最后定容至50μl，加入DTT至终浓度为0.01M，作用3h～10h，12000r/min，0.5h～1h，4℃条件下离心获取上清液。

免疫磁性微球结合抗原的最适作用条件为37℃，垂直轻摇混匀1h。

纳米金探针结合抗原的最适作用时间为37℃孵育1h，200～400r/min轻摇。

采用方阵滴定法确定免疫磁性微球和纳米金探针反应最适比例。

采用流式细胞仪梯度摸索法检测纳米金探针结合抗原最适反应时间。

4、核酸条码标识的检测

所述的核酸条码标识的检测方法包括酶放大检测法、荧光定量法、核酸芯片检测法。

所述核酸条码的检测，通过生物素-链酶亲和素放大系统检测信号的强弱(相对灰度值)获知标识分子(抗原)检测情况。所述生物素-链酶亲和素放大系统检测步骤可以为：

(1)尼龙膜点样，80℃烘烤2～4h；

(2)按照试剂盒要求配置相应的洗涤液体，封闭液，平衡液等，洗涤液轻摇5min去液，加入封闭液，室温轻摇30min，去液；

(3)加入碱性磷酸酶标记的链霉亲合素的稀释液体，37℃轻摇30min，去液；

(4)洗涤液重复洗涤2～3次，每次室温轻摇10min再去液体；

(5)加入平衡液，室温轻摇10min，去液体；

(6)加入反应液显色10～15min，蒸馏水终止反应，观察结果；

制作核酸条码标识法标准曲线来评估其核酸条码标识法的准确性，并确定其相应的PSA浓度范围。

制作核酸条码标识法标准曲线来评估核酸条码标识法灵敏度，并确定其相应的PSA浓度范围。

做临床核酸条码标识法检测抗原时的最适血清稀释度。

做核酸条码标识法准确性实验检测和重复性检测。

本发明还提供一种通过核酸条玛法在临床血清标本检测PSA抗原检测的应用，根据核酸条码标识法检测本底值与标准条带对照，以PSA＞4ng/ml为阳性检测标准，PSA≤4ng/ml为阴性标准。

通过核酸条码标识法与ELISA和RIA对比验证该方法的准确性步骤。

本发明的有如下使用效果：

(1)将检测效率检测灵敏度提高至2～3个数量级，达到普通免疫学检测技术(ELISA)无法比拟的灵敏度，能对临床微量肿瘤标志物、微量激素、心脏疾病等微量蛋白质准确快捷检测的目的。并且，由于检测中不需要生物活性大分子的参与，试剂的运输保存相对容易；

(2)由于纳米金和磁性微球制备技术成熟，整个操作过程简单，容易实现高通量检测自动化操作。

(3)本发明初步应用于前列腺特异性抗原(PSA)的检测，对不同的检测物只需变换对应的抗体或寡核苷酸便是一种新试剂盒。

【图表说明】

图1是本发明的免疫磁性微球透射电镜图；

图2是本发明的流式细胞仪检测免疫磁性微球抗体活性示意图；

图3是本发明的纳米金微粒透射电镜图；

图4是本发明的纳米金探针透射电镜图；

图5是本发明的纳米金溶胶和纳米金探针紫外-可见分光光度计扫描曲线图；

图6是本发明的免疫金银染色法透射电镜图；

图7是本发明的核酸条码标识法过程示意图；

图8是本发明的免疫磁性微球和纳米金探针不同反应比例的示意图；

图9是本发明的纳米金探针结合抗原不同反应时间的示意图；

图10是本发明的是核酸条码标识法标准曲线的相关性示意图；

图11是本发明的核酸条码标识法灵敏度的示意图；

图12是本发明的核酸条码标识法血清稀释的检测结果示意图；

图13.核酸条码标识法临床血清标本检测示意图

图14是本发明的核酸条码标识法、ELISA、RIA对比验证相关性分析结果示意图；

表1是本发明的核酸条码标识法回收性实验检测结果；

表2是本发明的核酸条码标识法重复性检测结果；

表3是本发明的核酸条码标识法临床血清标本检测结果；

表4是本发明的核酸条码标识法、ELISA、RIA三种方法检测结果；

表5是本发明的核酸条码标识法与ELISA对比验证吻合度分析结果；

表6是本发明的核酸条码标识法与RIA对比验证吻合度分析结果。

【具体实施方式】

本发明结合纳米技术和免疫学检测技术，将免疫磁性微球和纳米金探针巧妙组合，利用核酸条玛法检测抗原，将微量蛋白抗原的检测转化为对核酸条码的检测。

可用于本发明的核酸条码片段的检测没有特别限制，代表性例子包括(但并不限于)：酶放大检测法(生物素链酶亲合素)、荧光定量法、核酸芯片检测法等。

可用于本发明的识别分子没有特别限制，代表性例子包括(但并不限于)：抗体(识别抗原)、抗原(被抗体识别)、受体(识别配体)、配体(识别受体)等。

本发明提供一种微量抗原检测方法，所述的抗原包括所有的抗原，不局限于PSA抗原。下面以PSA抗原为例，给出其优选的检测步骤：

步骤1、免疫磁性微球的制备

海藻酸钠：Fe₃O₄∶60℃的AOT/正庚烷油相∶30％的CaCl₂溶液∶环氧氯丙烷的配比？

取一定量的海藻酸钠和Fe₃O₄溶于蒸馏水中，微热使之充分溶解后，超声15分钟后形成磁流体混合液，调节混合液的pH为10，升温至60℃。超声和高速搅拌的条件下，将一定量混合液逐滴加入到温度为60℃的AOT/正庚烷油相中，形成透明的灰黑色反相微乳体系。在超声和搅拌的条件下将30％的CaCl₂溶液加入到微乳体系中，再逐滴加入一定量的环氧氯丙烷，继续搅拌5小时，进行磁分离后，分别用丙酮、乙醇和蒸馏水洗涤，然后离心分选，真空冷冻干燥后保存。

磁球：EDC∶sufl-NHS∶PSA单克隆抗体的配比？

取1mg制备好的磁球，PBS定容到4ml，加入水溶性EDC和sufl-NHS，充分混匀，室温反应15min，加入6-氨基己酸，轻摇3h，加入600μl，20～30μg/mlPSA单克隆抗体，轻轻搅拌5h～10h，以0.2M甘氨酸溶液(含0.2％BSA)封闭，磁分离洗涤，加入储存液4℃保存待用。

用透射电子显微镜(TEM)和光镜进行形貌的定性检测，观察到的免疫磁性微球透射电镜图如图1所示。

采用流式细胞仪检测抗体活性情况，如图2所示，实验结果所得磁性微球有较好分散性，粒径均匀，磁响应性好，，交联抗体后流式细胞术检测98.3％的磁性微球具免疫活性。

步骤2、纳米金探针的制备

(1)纳米金胶的制备

柠檬酸三钠：HAuCl₄量的配比？

用柠檬酸三钠(上海国药)还原HAuCl₄法制备胶体金。将100ml 0.01％的HAuCl4溶液加热至沸腾；高速搅拌条件下(1200rpm)快速加入5ml 1％柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)，继续加热搅拌30min，自然冷却，用超纯水恢复至原体积。0.22μm滤膜过滤，4℃避光保存备用。

用透射电子显微镜(TEM)观察纳米金粒子的形貌，观察到的纳米金在透射电镜下的图像如图3所示，用激光散射仪测定其大小和粒径分布，用紫外-可见光分光光度计扫描观察吸收峰值，如图5中a曲线所示，测得纳米金在518nm有最大的吸收峰，粒度均匀，分散性良好，主要分布范围在10±3nm。并根据朗伯-比尔定律估算纳米金的浓度，金胶大概的浓度为3.7nM。

(3)纳米金探针的制备

量的配比？

将连接有3’-端硫醇的ssDNA片段0.5OD溶解在超纯水中，备用。取5ml纳米金溶胶(约3.7nM)，用Na₂CO₃调pH值至9左右。按比例加入适量PSA抗体和一定量3-端硫醇修饰的ssDNA(稀释至13.2μg/ml)，随即旋涡混匀，轻摇3h，低温避光静置过夜，使溶液中纳米金粒子和抗体、ssDNA能够充分作用。加入0.01M PBS(pH7.4)，10％(W/N)的SDS使其终浓度为0.01％，旋涡混匀，置于摇床中30min，逐渐加入1.2M的NaCl溶液使终浓度至0.15M，边加边旋涡混匀，静置平衡3h以上，稳定ssDNA的连接。最后，加入5％(W/V)的牛血清白蛋白(BSA)使最终浓度为1％，混匀平衡。

下面是对纳米金探针的分析和表征：

取上述制备好的纳米金探针，12000r/min，40min，4℃，倾去上清液除去未结合的抗体和寡核苷酸，0.01M PBS(pH7.4)和0.15M NaCl溶液(含0.1％BSA，0.01％SDS)重复洗涤红色油状沉淀，磷钨酸负染，透射电镜(TEM)对探针进行形貌大小定性观察，观察到的结果如图4所示。紫外-可见光分光光度计波长扫描分析，如图5中曲线b所示，结果所得的纳米金探针溶液大概浓度在3nM，稳定性良好，连接抗体和核酸条码片段后最高吸收峰发生6nm漂移。

用免疫金银染色光镜观察分析纳米金探针的形貌，观察到的结果如图6所示，用斑点免疫金渗滤测定纳米金探针上抗体的活性，结果显示纳米金探针上抗体的活性良好。

步骤3：核酸条码标识的建立

将标准PSA抗原稀释至50倍，取40μl，5mg/ml的免疫磁性微球，加入稀释的PSA标准抗原500ng，超纯水定容至1ml，37℃轻摇1h，磁场分离，0.01M，pH7.4PBS(含0.2％BSA)重复洗涤三次，分别加入核酸条码法稀释液(量的多少？)和体积比为1∶2(免疫磁性微球和纳米金探针的体积比)的纳米金探针，37℃，400r/min轻摇1h，磁场分离，核酸条码法洗涤液重复洗涤，最后定容至50μl，加入DTT至终浓度为0.01M，作用3h，12000r/min，30min，4℃条件下离心获取上清液。

如图7所示，采用方阵滴定法确定二者反应最适比例：将免疫磁性微球定至5～10mg/ml，纳米金生物探针的定至10～15nM，二者以1∶2、1∶4、1∶8、1∶16的体积比，双抗夹心法检测500ng，100ng，1ng系列稀释的PSA抗原：取10μl，20μl，40μl，80μl，5mg/ml的免疫磁性微球，分别加入稀释的PSA标准抗原(1ng，100ng，500ng)，超纯水定容至1ml，37℃轻摇1h，磁场分离，0.01M，pH7.4 PBS(含0.2％BSA)重复洗涤三次，分别加入核酸条码法稀释液和相应体积比例纳米金探针，37℃轻摇1h，磁场分离，核酸条码法洗涤液重复洗涤，最后定容至50μl，加入DTT至终浓度为0.01M，作用5h或低温过夜。

取上述作用管，12000r/min，30min，轻取含Bio-ssDNA的上清液，重复纯化得到Bio-ssDNA。利用碱性磷酸酶标记的链霉亲合素检测试剂盒检测Bio-ssDNA，根据相同PSA浓度检测信号的强弱(相对灰度值)和不同PSA浓度的信号比较确定二者反应的最适工作比例。

如图8所示，40μl免疫磁性微球与80μl的纳米金探针反应比例信号强度最好，即二者1∶2的反应体积下，背景色最弱。

取4支小试管，分别加入一定量的PSA标准抗原，0.01M，pH7.4 PBS稀释至1ml，加入5mg/ml的免疫磁球40μl，37℃轻摇1h，磁场分离，0.01M，pH7.4PBS(含0.2％BSA)重复洗涤，分别加入核酸条码法稀释液和80μl纳米金探针，37℃分别轻摇0.5h，1h，2h，3h，磁场分离，条码核酸标识法洗涤液重复洗涤，最后定容至50μl，加入DTT至终浓度为0.01M，作用5h或低温过夜。低温超速离心获取Bio-ssDNA。按上述方法利用碱性磷酸酶标记的链霉亲合素检测Bio-ssDNA，同时做好阴性对照，用成像系统检测信号的强弱(相对灰度值)，以阳性/阴性值最大时的反应时间作为纳米金探针结合抗原的最适作用时间。

如图9显示，在37℃轻摇孵育的条件下，不同的反应时间，结果检测有差异，而纳米金探针结合抗原的最适时间也为1h。

4、核酸条码标识的检测

(1)尼龙膜点样，80℃烘烤3h；

(2)按照试剂盒要求配置相应的洗涤液体，封闭液，平衡液等，洗涤液轻摇5min去液，加入封闭液，室温轻摇30min，去液；

(3)加入碱性磷酸酶标记的链霉亲合素的稀释液体，37℃轻摇30min，去液；

(4)洗涤液重复洗涤3次，每次室温轻摇10min再去液体；

(5)加入平衡液，室温轻摇10min，去液体；

(6)加入反应液显色15min，蒸馏水终止反应，观察结果；

依据上述的核酸条码标识建立和检测的步骤，取13μgPSA标准品，加以PBS缓冲液稀释配置成10μg/ml，1μg/ml，100ng/ml，1ng/ml，10pg/ml，100fg/ml 6份浓度成系列梯度的PSA标准品，按照核酸条码标识法检测，整个操作过程具体如下：取5mg/ml免疫磁性微球40μl，与系列PSA标准品混合定容至1ml，37℃轻摇1h，磁场分离，0.01M，pH7.4 PBS(含0.2％BSA)重复洗涤，再加入10nM纳米金探针80μl，37℃轻摇1h，磁场分离，核酸条码法洗涤液重复洗涤，最后定容至50μl，加入DTT至终浓度为0.1M，作用3h，低温超速离心获取上清液。

剪取5×8cm尼龙膜，吸取上清液点样，80℃烘烤3～4h，按上述方法利用碱性磷酸酶标记的链霉亲合素检测Bio-ssDNA，直接裸眼判定检测结果，并用成像系统进行灰度值统计分析，灰度分析软件进行数据对比分析，以PSA标准品浓度为横坐标，以相对应的灰度值为纵坐标绘制标准曲线，观察曲线线形及检出限，每一次试验每一个数据结果都来自4个重复方阵的平均值，重复四次检测。每次测定标本均应带一标准曲线。

如图10所示，标准曲线在PSA浓度为100fg/ml～1μg/ml之间线形关系良好，R＝0.9759，相关系数较好。

采用上述步骤作灵敏度的初步评估。0.01M，pH7.2 PBS中系列稀释的已知浓度为100ng/ml的PSA阳性血清标本：浓度分别为100ng/ml、1ng/ml、100pg/ml、10pg/ml、1pg/ml、100fg/ml、10fg/ml、1fg/ml、100ag/ml、10ag/ml、1ag/ml、0；按照上述核酸条码法操作流程，检测PSA抗原，直接裸眼判定该法的检测灵敏度，并进行灰度值的比较测定和分析。

如图11所示，稀释至100fg/ml以下后，检测点的信号强度大大减少，当稀释至1fg/ml时候，几乎看不到检测点的存在。

依上述核酸条码标识建立和检测步骤作最适血清稀释度的检测：取已知PSA浓度为90ng/ml的阳性血清，依次取：1μl、10μl、20μl、40μl、80μl、100μl，分别用含1％BSA的PBS稀释至1ml，系列稀释比例分别为1∶1000、1∶100、1∶50、1∶25、1∶12.5、1∶10，重复三次作血清稀释度测定。按照上述核酸条码标识法操作加入免疫磁性微球和纳米金探针，检测血清，根据标准曲线比对相对灰度值获得剂量反应曲线。

如图12所示，血清作1∶100～1∶50稀释时，目测检测结果比较好，与标准曲线对比，灰度值较高。为使用方便，采用1∶50稀释作为试验用血清工作浓度。

依上述的核酸条码标识建立和检测步骤作准确性检测：取4份已知的不同PSA浓度的血清样品(P)分别加入一定量的PSA标准品(A)，充分混匀，测定各份样品PSA的浓度，每个浓度测定4次获得平均测定值(M)，根据回收率％＝(M-P)/A×100％，计算结果。

如表1所示，回收率为96.3％～107.8％。

依上述的核酸条码标识建立和检测步骤作重复性检测：取常规检测PSA血清标本低、中、高值各3份，分别为：4.0μg/L、10μg/L、100μg/L的样品进行多点多次测定，计算重复测定值的平均值和标准差，观察批内变异，结果之间的变异系数。

如表2所示，平均批内变异系数(CV％)为6.24％，重复性良好。

本发明还公开了一种该抗原检测方法在临床上的应用：

如图13所示，依上述抗原检测方法的步骤分别检测45例前列腺癌患者，45例前列腺良性增生患者，15例其它肿瘤患者，30例正常人群血清标本，重复三次试验，以核酸条码标识法检测本底值与标准条带对照，以PSA＞4ng/ml为阳性检测标准，PSA≤4ng/ml为阴性标准。确定核酸条码标识法的临床检测血清特异性和灵敏度等指标。

如表3所示，灵敏度和特异性分别为92％和68％。假阳性率及假阴性率则是，分别为32％和8％。

通过核酸条码标识法与ELISA和RIA对比验证该方法的准确性步骤如下：

如图14，采用上述抗原检测方法检测45例前列腺癌患者，45例前列腺良性增生患者，15例其它肿瘤患者，30例正常人群血清标本，用核酸条码法标识法检测，并用PSA-ELISA试剂盒(购于瑞典CanAg Diagnostics.AB GothenburgSweden)和PSA放射免疫试剂盒(法国CIS BIO，Inc.)进行对比验证，严格按试剂盒说明书操作，检测结果做配对卡方检验、相关性分析及吻合度测量系数检测，如表4所示为三种方法的检测结果。

如表5和表6所示，三法的检测结果差异无显著性意义(P＞0.05)。相关性比较显示相关系数r分别为0.950和0.967，相关性良好，且K系数为0.918～0.960，吻合度强，说明了临床结果与公司进口试剂盒基本一致。

表1.核酸条码法回收实验结果

表2.核酸条码标识法批内重复性检测结果

表3.核酸条码法临床血清标本试验结果

(1)灵敏度(真阳性率)＝(42+20)/(42+3+20+2)×100％＝92.5％

(2)特异度(真阴性率)＝(16+8+22)/(7+16+7+8+22+8)×100％＝68％

(3)假阳性率＝(7+7+8)/(7+16+15+30)×100％＝32％

(4)假阴性率＝3/(15+22)×100％＝8％

表4.三种方法PSA检测结果

表5.核酸条码标识法和ELISA吻合性比较

P＞0.05，K系数＝0.918

表6.核酸条码标识法和RIA吻合性比较

P＞0.05，K系数＝0.960

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，因此，在与本发明权利要求书相当的含义和范围内的各种改动或修改，都应认为是包括在本发明的范围之内。

Claims (20)

1.一种抗原检测方法，该方法将抗原信号的检测转化为对核酸条码标识的检测，其特征在于，该方法的操作步骤如下：

(1)用待测抗原的抗体I标记经过修饰的纳米磁性微球制备免疫磁性微球；用待测抗原的抗体II和核酸条码片段同时标记纳米金溶胶制备双标记纳米金探针；

(2)使免疫磁性微球和纳米金探针与待测抗原充分结合，除去结合聚集物，留下上清液待检；

(3)对上清液中的核酸条码标识进行检测。

2.根据权利要求1所述的抗原检测方法，其特征在于，所述纳米磁性微球为Fe₃O₄/海藻酸纳包裹的磁性微球，磁性颗粒大小为是0.3μm～1μm。

3.根据权利要求1所述的抗原检测方法，其特征在于，所述免疫磁性微球中每毫克磁性微球含70μg-150μg抗体。

4.根据权利要求1所述的抗原检测方法，其特征在于，所述纳米金是通过柠檬酸三钠还原四氯金酸制备而成，纳米金平均粒径约为10nm～50nm。

5.根据权利要求1所述的抗原检测方法，其特征在于，所述标记抗体I包括单克隆抗体和多克隆抗体，标记抗体II包括单克隆抗体和多克隆抗体。

6.根据权利要求1所述的抗原检测方法，其特征在于，所述的核酸条码片段为单链DNA或RNA分子，其长度为10～50bp，其一端被硫醇修饰，另一端被生物素、荧光基团标记。

7.根据权利要求6所述的抗原检测方法，其特征在于，所述的硫醇包含有巯基，所述的硫醇与核酸条码片段通过巯基交联，所述的核酸条码片段靠近巯基的一端包含有烷氢和多个单一碱基形成的基团。

8.根据权利要求7所述的抗原检测方法，其特征在于，所述的硫醇包括3’-端硫醇和烷硫醇。

9.根据权利要求1所述的抗原检测方法，其特征在于，步骤(2)的详细步骤如下：

(1)免疫磁性微球与含目的抗原的物质混合，轻摇孵育，磁分离洗涤；

(2)重新悬浮，加入纳米金探针，轻摇孵育，磁分离洗涤，留聚集物；

(3)加入还原剂还原出核酸条码片段；

(4)低温超速离心，作用获取核酸条码片段。

10.根据权利要求9所述的抗原检测方法，其特征在于，所述的待检测的抗原为PSA抗原时，步骤(2)的更进一步详细的步骤如下：

(1)将标准PSA抗原稀释至10～1000倍，取10μl～80μl，5～10mg/ml的免疫磁性微球，加入稀释的PSA标准抗原1ng～500ng，超纯水定容至1ml，37℃轻摇1h，磁场分离，0.01M，pH7.4PBS(含0.2％BSA)重复洗涤三次

(2)依次加入核酸条码法稀释液和体积比为1∶2～1∶16的纳米金探针，37℃，200～500r/min轻摇1h～3h，磁场分离，核酸条码法洗涤液重复洗涤，最后定容至50μl

(3)加入DTT至终浓度为0.01M，作用3h～10h

(4)12000r/min，0.5h～1h，4℃条件下离心获取上清液。

11.根据权利要求9所述的抗原检测方法，其特征在于，所述的还原剂包括二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇(MCE)。

12.根据权利要求11所述的抗原检测方法，其特征在于，DTT的加入终浓度小于或等于0.01M，室温下摇匀3～10h。

13.根据权利要求9所述的抗原检测方法，其特征在于，所述抗原和抗体结合方式为轻摇200～500rpm，孵育温度为37℃，作用时间为0.5h～3h。

14.根据权利要求9所述的抗原检测方法，其特征在于，所述核酸条码片段采用12000rpm，4℃低温超速离心的方法提取，作用时间0.5h～1h。

15.根据权利要求9所述的抗原检测方法，其特征在于，所述加入的纳米金探针的量为免疫磁性微球的两倍。

16.根据权利要求9所述的抗原检测方法，其特征在于，所述的抗原和抗体结合的时间为1h。

17.根据权利要求1所述的抗原检测方法，其特征在于，步骤(3)所述的核酸条码标识的检测方法包括酶放大检测法、荧光定量法、核酸芯片检测法。

18.根据权利要求17所述的抗原检测方法，其特征在于，所述的步骤(3)采用酶放大检测法包括生物素-链酶亲和素系统放大检测法，其步骤包括如下：

(1)尼龙膜点样，80℃烘烤2～4h；

(2)按照试剂盒要求配置相应的洗涤液体，封闭液，平衡液等，洗涤液轻摇5min去液，加入封闭液，室温轻摇30min，去液；

(3)加入碱性磷酸酶标记的链霉亲合素的稀释液体，37℃轻摇30min，去液；

(4)洗涤液重复洗涤2～3次，每次室温轻摇10min再去液体；

(5)加入平衡液，室温轻摇10min，去液体；

(6)加入反应液显色10～15min，蒸馏水终止反应，观察结果。

19.如权利要求1-18任一所述的抗原检测方法，应用于检测微量PSA抗原，其特征在于，在检测时，以PSA＞4ng/ml为阳性检测标准，PSA≤4ng/ml为阴性标准。

20.根据权利要求19所述的一种抗原检测方法，其特征在于，该方法应用于微量PSA抗原检测时，PSA浓度范围为100fg/ml～1μg/ml，采用标准血清检测时，血清稀释范围为1∶50。

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