CN102879580A - 微量蛋白检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微量蛋白检测方法，包括以下步骤：制备抗体标记的磁珠；制备抗体与DNA通过纳米金颗粒相连接的纳米金探针；将抗体标记的磁珠与待测蛋白样品混合，用磁铁吸附磁珠，使待测蛋白得到分离和富集；加入纳米金探针，该探针与所述分离和富集的待测蛋白结合；加入环形DNA模板、滚环扩增反应组分及荧光标记探针，进行滚环扩增反应；检测荧光信号。本发明的微量蛋白检测方法，显著提高了灵敏度，降低了蛋白与DNA连接的难度，适用于医学检测。

Description

微量蛋白检测方法
技术领域
本发明涉及一种蛋白检测方法，尤其涉及一种基于磁珠、纳米金探针和滚环扩增的微量蛋白检测方法。
背景技术
免疫学技术是用以检测特定蛋白(抗原)的最有效的方法，比如在实验室最常用的Westernblot、免疫荧光和在临床广泛使用的酶联免疫吸附试验(ELISA)，都是利用抗体的特异性实现的。由于所有的结合反应都通过自由扩散进行，结合效率比较低。因此，磁珠就被引入到反应体系中，磁珠是可以作为固相载体，对抗原进行分离和富集，又因为其尺寸较小，可以与待测的液体样品充分接触，有利于提高抗原结合效率。但是，蛋白检测的灵敏度始终低于核酸检测，其原因在于核酸可以扩增而蛋白无法扩增。于是有人想到了将DNA与抗体相连接，通过扩增与抗体相连的DNA以放大信号，借此弥补蛋白无法扩增的劣势。DNA扩增的方法有聚合酶链式反应(PCR)以及各种等温扩增的方法，PCR是一种变温扩增的方法，需要特定的仪器，且与之前的抗原抗体反应不在同一种管子内进行，在操作上造成不便，也容易造成交叉污染。等温扩增对仪器的要求较低，其中滚环扩增(RCA)因其技术的成熟性，是等温扩增中最为广泛使用的一种，将其与抗原抗体反应相结合，就形成了免疫RCA(Immuno-RCA)的方法。在免疫RCA方法中，寡核苷酸引物的5’端标记有抗体，抗原抗体反应后，加入RCA反应组分与环状DNA模板进行RCA，然后标记有荧光素的探针与RCA产物原位杂交，最后对荧光信号进行检测。免疫RCA方法使蛋白检测的灵敏度得到了改善，但是，对于微量蛋白的检测，现有免疫RCA方法的灵敏度仍然偏低。
随着纳米技术的发展，纳米材料在其它学科的应用也逐渐增加，这也为生物医学的发展提供了新的契机。作为标记材料的纳米金颗粒，对生物分子具有很强的吸附已经在免疫检测和免疫电镜中被使用，是纳米材料中最成熟的一种。将纳米材料与生物医学相结合，将推动生物医学的发展。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种微量蛋白检测方法，该方法比传统的免疫RCA方法具有更高的灵敏度。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
在本发明的一个方面，提供了一种微量蛋白检测方法，包括以下步骤：
将抗待测蛋白的抗体标记到磁珠表面，制成抗体标记的磁珠；
将纳米金颗粒与抗待测蛋白的抗体、DNA连接，制成抗体与DNA通过纳米金颗粒相连接的纳米金探针；
将抗体标记的磁珠与待测蛋白样品混合，用磁铁吸附该抗体标记的磁珠，使待测蛋白得到分离和富集；
加入纳米金探针，该探针与所述分离和富集的待测蛋白结合；
加入环形DNA模板、滚环扩增反应组分及荧光标记探针，进行滚环扩增反应；
检测荧光信号，得待测蛋白的检测结果。
所述连接抗体与DNA的纳米金颗粒的直径为10～30纳米。
所述纳米金探针的抗体与DNA的分子数之比为1∶5～1∶20。优选的，所述抗体与DNA的分子数之比为1∶8～1∶16。
所述纳米金颗粒由还原剂还原氯金酸制得。
所述纳米金探针的DNA通过金硫键与纳米金颗粒连接。
在本发明的另一方面，还提供了一种纳米金探针，包含抗体、DNA、纳米金颗粒，所述抗体和DNA通过纳米金颗粒相连接。
所述抗体与DNA的分子数之比为1∶5～1∶20。优选的，所述抗体与DNA的分子数之比为1∶8～1∶16。
在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述纳米金探针的微量蛋白检测试剂盒。
本发明的微量蛋白检测方法，是基于磁珠、纳米金探针和滚环扩增的蛋白检测方法，该方法使DNA分子与抗原的比例从原先的1∶1提高到50∶1至100∶1，多了一级信号放大，提高了灵敏度；也使DNA与抗体的连接更简便，无须化学试剂处理，减少对环境的污染。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明纳米金探针的制备流程示意图；
图2是本发明蛋白检测流程示意图；
图3是本发明实施例1的流式细胞仪检测结果图。
具体实施方式
为了提高微量蛋白检测的灵敏度，本发明方法将抗体标记的磁珠、纳米金探针和滚环扩增相结合，其中使用的纳米金探针是抗体与DNA通过纳米金颗粒连接的探针，且连接在纳米金颗粒上的抗体与DNA的分子数之比为1∶5～1∶20，该纳米金探针取代了现有免疫RCA中抗体与DNA直接1∶1连接的方法，使检测信号明显放大，显著提高了微量蛋白检测的灵敏度。
本发明微量蛋白检测方法，包括以下步骤：
将抗待测蛋白的抗体标记到磁珠表面，制成抗体标记的磁珠；
将纳米金颗粒与抗待测蛋白的抗体、DNA连接，制成抗体与DNA通过纳米金颗粒相连接的纳米金探针(见图1)，其中，纳米金颗粒的直径为10～30纳米，抗体与DNA的分子数之比为1∶5～1∶20，DNA通过金硫键与纳米金颗粒连接；
将抗体标记的磁珠与待测蛋白样品混合，用磁铁吸附该抗体标记的磁珠，使待测蛋白得到分离和富集；
加入纳米金探针，该探针与所述分离和富集的待测蛋白结合；
加入环形DNA模板、滚环扩增反应组分及荧光标记探针，进行滚环扩增反应；
检测荧光信号，得待测蛋白的检测结果(见图2)。
本发明微量蛋白检测方法的具体步骤如下：
1.磁珠标记
按照所购买磁珠的说明书，将针对待测蛋白的抗体标记到磁珠表面。
2.纳米金探针制备
用柠檬酸钠还原四氯金酸法制备直径为10～20纳米的纳米金颗粒，将纳米金的pH调至9～9.5，再加入能使纳米金稳定的最少量抗体，室温孵育30分钟后加入一定量的巯基修饰的DNA，10度孵育4分钟，加入100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)至磷酸盐终浓度9mM，室温振荡30分钟，然后放置3小时以上；加入高盐缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)，2M氯化钠)至氯化钠终浓度150mM，室温放置1小时，4度10000×g离心15分钟，用洗液(10mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)，150mM氯化钠)洗3次；最后加200微升洗液，4度保存。
3.微量蛋白检测
取一定量的抗体标记的磁珠用100微升洗液重悬，加入100微升待测血清样品，室温振荡1.5小时，用磁铁吸附磁珠，弃上清，用洗液洗两次，加入49微升洗液和1微升纳米金探针，室温振荡1小时，用洗液洗两次，加入环形模板孵育30分钟，用洗液洗两次，加入
Figure BDA0000075064940000031
DNA聚合酶、配套的缓冲液、dNTP，30度反应1.5小时，最后进行检测。
实施例1
1.磁珠标记
取100微升Dynabeads M-280 Tosylactivated(Invitrogen公司)，按照说明书，加入60微克抗乙肝表面抗原单抗进行标记，最后重悬到1毫升说明书推荐的缓冲液，4度保存。
2.纳米金颗粒的制备
在一个回流装置中加热250毫升1mM四氯金酸至110度以上，然后加入25毫升38.8mM柠檬酸钠，再加热15分钟，冷却至室温，4度保存，制备的纳米金颗粒平均直径为13纳米。
3.纳米金探针制备
取1毫升纳米金，用氢氧化钠调节pH至9.2，加入8微克抗乙肝表面抗原多抗，室温孵育30分钟后加入1nmol的巯基修饰的DNA，10度孵育4分钟，加入110毫升100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)，室温每分钟1000转振荡30分钟，然后放置3小时；加入99微升高盐缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)，2M氯化钠)，室温放置1小时，4度10000×g离心15分钟，用1毫升洗液(10mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)，150mM氯化钠)洗3次；最后加200微升洗液，4度保存。
4.微量乙肝表面抗原检测
乙肝表面抗原用血清稀释成10ng/mL、1ng/mL、100pg/mL、10pg/mL和1pg/mL。取5微升抗体标记的磁珠，用100微升洗液重悬，加入100微升待测血清标准样品，室温每分钟1000转振荡1.5小时，用磁铁吸附磁珠，弃上清，用200微升洗液洗两次，加入49微升洗液和1微升纳米金探针，室温振荡每分钟1000转1小时，用200微升洗液洗两次，加入10pmol环形模板(溶于50微升洗液)，孵育30分钟，用200微升洗液洗两次，加入50微升反应体系，包括10单位
Figure BDA0000075064940000041
聚合酶(Fermentas公司)、1×缓冲液、0.2mM dNTP、0.2μM Cy3标记的探针，30度反应1.5小时；经重悬后用流式细胞仪进行检测，结果见错误！未找到引用源。。检测极限可以达到10pg/mL，是常规ELISA灵敏度的100倍，且线性关系较好。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种微量蛋白检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
将抗待测蛋白的抗体标记到磁珠表面，制成抗体标记的磁珠；
将纳米金颗粒与抗待测蛋白的抗体、DNA连接，制成抗体与DNA通过纳米金颗粒相连接的纳米金探针；
将抗体标记的磁珠与待测蛋白样品混合，用磁铁吸附该抗体标记的磁珠，使待测蛋白得到分离和富集；
加入纳米金探针，该探针与所述分离和富集的待测蛋白结合；
加入环形DNA模板、滚环扩增反应组分及荧光标记探针，进行滚环扩增反应；
检测荧光信号，得待测蛋白的检测结果。
2.根据权利要求1所述的微量蛋白检测方法，其特征在于，所述连接抗体与DNA的纳米金颗粒的直径为10～30纳米。
3.根据权利要求1所述的微量蛋白检测方法，其特征在于，所述纳米金探针的抗体与DNA的分子数之比为1∶5～1∶20。
4.根据权利要求1所述的微量蛋白检测方法，其特征在于，所述纳米金颗粒由还原剂还原氯金酸制得。
5.根据权利要求1所述的微量蛋白检测方法，其特征在于，所述纳米金探针的DNA通过金硫键与纳米金颗粒连接。
6.一种纳米金探针，其特征在于，包含抗体、DNA、纳米金颗粒，所述抗体和DNA通过纳米金颗粒相连接。
7.根据权利要求6所述的纳米金探针，其特征在于，所述抗体与DNA的分子数之比为1∶5～1∶20。
8.根据权利要求7所述的纳米金探针，其特征在于，所述抗体与DNA的分子数之比为1∶8～1∶16。
9.一种微量蛋白检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求6所述的纳米金探针。
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