CN101315371A - 一种3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫荧光猝灭检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种3－甲基－喹啉－2－羧酸的免疫荧光猝灭检测方法，属于免疫分析化学技术领域。本发明包括免疫源、包被原、和抗体的制备，包被原的固定，磁性纳米粒子的修饰，磁性纳米粒子与包被原的偶联，金纳米粒子的制备，金纳米探针的制备，流动注射系统中的免疫反应，荧光酶标板的包被和流动注射荧光猝灭的检测。本发明大大提高了3－甲基－喹啉－2－羧酸检测的灵敏度，且操作更加简便，达到了高通量的目的，而且以磁性粒子作为固相载体，具有清洗和分离方便，操作简单的优点，用DNA修饰的金纳米粒子作为探针代替传统的HRP进行免疫反应，简化了反应的条件，提高了检测的灵敏度，达到国际领先水平。
Description
技术领域
一种3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫荧光猝灭检测方法，属于免疫分析化学技术领域。
背景技术
3-甲基-喹啉-2-羧酸，英文名称：3-methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid(MQCA)，是喹啉类饲料添加剂在动物体内的代谢产物，以喹诺酮和喹乙醇为主要代表。当鸡、猪、鱼等食用此类饲料添加剂后，会在体内，主要是肌肉，肠道，肾脏中代谢生成3-甲基-喹啉-2-羧酸，这种代谢物对人体毒性极大。由于国内对喹啉类添加剂的大量滥用，造成了添加剂在动物体内的含量严重超标，国内的检测技术尚停留在对原药的检测，随着国际标准的提高，我国贸易的国际化，这种检测技术已经不能满足要求。近年来，国外开始逐渐加大了对代谢物3-甲基-喹啉-2-羧酸的研究和检测。为了与国际接轨，减少我国的肉类制品在出口时不必要的损失，我国有必要加大对代谢物的研究力度，由于对其研究较少，检测限仍然较高，为了弥补这一空白，有必要研究一种灵敏度高，检测限低，操作简单的，针对3-甲基-喹啉-2-羧酸的检测方法。
HPLC和LC-MS/MS的方法虽然灵敏，但是所需仪器价格昂贵，对操作人员的要求较高，较难推广。免疫分析化学方法具有快速，灵敏度高，操作简单，专一性好等优点。与传统的ELISA方法相比，本发明利用纳米磁性粒子作为固相载体，在流动注射系统中进行免疫反应，用DNA修饰的金纳米粒子作为探针，免疫反应后，收集DNA，并将其固定于金纳米粒子表面，加入异硫氰酸荧光素，检测荧光信号从而达到检测3-甲基-喹啉-2-羧酸的目的，本发明方法大大提高了检测的灵敏度，且操作更加简便，达到了高通量的目的，而且以磁性粒子作为固相载体，具有清洗和分离方便，操作简单的优点，用DNA修饰的金纳米粒子作为探针代替传统的HRP进行免疫反应，简化了反应的条件，提高了检测的灵敏度。
发明内容
本发明的目的是提供一种3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫荧光猝灭检测方法，灵敏度高，操作方便，线性范围宽。
本发明的技术方案：一种3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫荧光猝灭检测方法，包括免疫源、包被原、和抗体的制备，包被原的固定，磁性纳米粒子的修饰，磁性纳米粒子与包被原的偶联，金纳米粒子的制备，金纳米探针的制备，流动注射系统中的免疫反应，荧光酶标板的包被和流动注射荧光猝灭的检测；工艺步骤为：
(1)包被原的制备：将3-甲基-喹啉-2-羧酸与间氨基苯甲酸相连，再与卵清蛋白相偶联得到包被原；
(2)免疫原的制备：将3-甲基-喹啉-2-羧酸与牛血清蛋白相偶联得到免疫原；
(3)抗体的制备：用所得免疫原免疫兔子得到特异性多克隆抗体；
(4)包被原的固定：用所得包被原与磁性微粒偶联，并固定于玻璃微通道内；
(5)磁性纳米粒子的修饰；将制备的Fe3O4种子用3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰；
(6)磁性纳米粒子与包被原的偶联；
(7)两种粒径的金纳米粒子的制备；
(8)两种金纳米探针的制备；
(9)流动注射系统中的免疫反应；
(10)荧光酶标板的包被；
(11)流动注射荧光猝灭的检测：利用间接竞争免疫检测将3-甲基-喹啉-2-羧酸和多克隆抗体通过玻璃微通道内，竞争结合后的多克隆抗体与经羊抗兔抗体及双链DNA共同修饰的金纳米探针反应，变性得到单链DNA并将其收集，收集得到的单链DNA一端与互补DNA修饰的金纳米探针反应，另一端与生物素修饰的互补DNA反应，并用亲和素固定于酶标板上，加入异硫氰酸荧光素，用荧光酶标仪检测荧光信号从而检测3-甲基-喹啉-2-羧酸含量。
包被原的制备：取3-甲基-喹啉-2-羧酸102mg，溶解在6mL N，N-二羟基甲酰胺中，加入120μL三正丁胺，反应0.5小时；再加入75μL氯甲酸异丁酯，反应1小时；再与含有100mg间氨基苯甲酸、6mL pH9.6的碳酸钠缓冲溶液混合，在4℃下搅拌反应2小时；过程中有沉淀产生，离心，取沉淀物，干燥，得到3-甲基-喹啉-2-羧酸半抗原；取3-甲基-喹啉-2-羧酸半抗原9.9mg，N-羟基琥珀酰亚胺11.5mg，N，N-二环己基二亚胺20.63mg，加入到3mL N，N-二羟基甲酰胺中，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL含60mg卵清蛋白的溶液在4℃下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，冻干，-20℃保存备用。
免疫原的制备：取3-甲基-喹啉-2-羧酸102mg，N-羟基琥珀酰亚胺11.5mg，N，N-二环己基二亚胺20.63mg，加入到3mL N，N-二羟基甲酰胺中，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL含130mg卵清蛋白的溶液在4℃下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，冻干，-20℃保存备用。
磁性纳米粒子的修饰：用二次蒸馏水分别配制FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O的溶液及NaOH溶液，将所配两种铁盐溶液混合，在铁盐的混合溶液中Fe2+离子的浓度为0.12mol/L，Fe3+离子的浓度为0.2mol/L；NaOH溶液的浓度为2.5mol/L；在剧烈搅拌下将一定体积的NaOH溶液缓慢滴加到混合铁盐溶液中，将所得的沉淀在60℃陈化2小时，用二次蒸馏水将沉淀物清洗数次，过滤后再在60℃干燥24小时，在玛瑙研钵中研磨后所得产物为Fe3O4种子；将Fe3O4种子0.125g用100mL乙醇和1mL二次蒸馏水分散，超声30min，滴加0.4mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES，室温搅拌7小时，以8000r/min离心30min，将APTES修饰的Fe3O4纳米颗粒从反应介质中分离，并用乙醇溶液对其清洗5次，过滤后再在60℃干燥24小时，备用。
磁性纳米粒子与包被原的偶联：取所得的APTES修饰的Fe3O4纳米颗粒10mg，N-羟基琥珀酰亚胺11.5mg，N，N-二环己基二亚胺20.63mg，加入到3mL N，N-二羟基甲酰胺中，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL含60mg卵清蛋白的溶液在4℃下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，对透析袋中溶液进行磁性分离，弃上清，加入含2％明胶的pH9.6碳酸钠缓冲溶液封闭，再加入PBST洗涤液，洗涤后磁分离，去上清，最后向磁性分离过的离心管中加入1mL 0.02mol/L pH7.6的Tris缓冲液，4℃保存备用。
两种粒径的金纳米粒子的制备：所用的玻璃仪器都强酸浸泡，双蒸水清洗，晾干备用；制备时，向洁净的三角烧瓶中加入100mL质量浓度为0.01％的氯金酸，加热，煮沸，紧接着加入1％的柠檬酸三钠溶液3.5mL或1mL，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色变成红色，反应持续6-8分钟以使柠檬酸三钠完全沉降，最后，溶液分别冷却至室温，稀释到100mL，4℃保藏；加入3.5mL柠檬酸三钠溶液制得的金纳米粒子平均粒径为13nm，加入1mL柠檬酸三钠溶液制得的金纳米粒子平均粒径为30nm。
两种金纳米探针的制备：
30nm金纳米探针的制备：首先，30nm金纳米粒子与1.5μg的羊抗兔在pH9.1碱性水溶液中搅拌反应，紧接着，向溶液中加入巯基修饰的寡核苷酸5’-TACGAGTTGAGACCGTTAAGACGAGGCAATCATGCAATCCTGAATGCGt(10)-SH-3’，室温反应20小时，再用含0.1M NaCl的10mM磷酸盐缓冲溶液调节pH值至7.0，盐陈40小时后于-4℃下2000r.p.m离心30分钟，弃上清；红色沉淀物用含0.1M NaCl的10mM磷酸盐缓冲溶液溶解，加入1.5μM的寡核苷酸5’-CGCATTCAGGATTGCATGAATGCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTA-3’37℃杂交4小时，再次离心去上清，杂交过程重复4次，沉淀最后溶解于含0.3MNaCl的10mM磷酸盐缓冲溶液中，得到羊抗兔抗体及双链DNA共同修饰的30nm金纳米探针，作为储备液4℃保藏；
13nm金纳米探针的制备：直接向13nm金纳米溶液中加入巯基寡核苷酸5’-GGCAATCATGCAATCCTGAATGCGa(10)-SH-3’，室温反应20小时，再用含0.1M NaCl的10mM磷酸盐缓冲溶液调节pH值至7.0，盐陈40小时后于-4℃下2000r.p.m离心30分钟，弃上清；红色沉淀物用含0.1M NaCl的10mM磷酸盐缓冲液溶解，4℃保藏。
流动注射系统中的免疫反应：先用pH 7.0、含0.1M NaCl的0.01M磷酸盐缓冲液作洗液清洗微管和免疫反应池，然后将40μL 0.5mg/mL抗原修饰的超顺磁纳米粒子溶液吸入螺线管中，再以5μL/s的速率注入免疫反应池内，电磁铁通电，吸附磁珠，将其固定在反应池内；将预孵育的50μL抗体和50μL 3-甲基-喹啉-2-羧酸混合溶液吸入螺线管中，其中，3-甲基-喹啉-2-羧酸溶解于pH7.4、含0.05％Tween-20的0.01M PBST中，浓度从1pg/mL～100pg/mL；然后，将混合溶液注入免疫反应池中室温反应10分钟，再以20μL/s的速度注入400μL pH7.0、0.1M NaCl的0.01M PBS洗液；之后，将100μL的羊抗兔抗体及双链DNA共同修饰的30nm金纳米探针的溶液以1μL/s的速度注入反应池，反应6分钟，冲洗；以2μL/s的速度注入100μL的双蒸水，60℃反应6分钟，最后再注入100μL的双蒸水，收集所需单链DNA，撤去磁场，洗涤柱子以备再用。
荧光酶标板的包被：用亲和素包被荧光酶标板，向酶标板每孔中加入100μL亲和素的pH9.6碳酸钠缓冲溶液，4℃孵育过夜，用PBS清洗后，备用。
荧光猝灭检测：将收集的单链DNA与10μL的生物素标记的捕获探针25μM，5’-生物素-a(10)TACGAGTTGAGACCGTTAAGACGA-3’混合，再加入20μL的含0.3M NaCl、0.02％SDS的pH7.4 0.01M PBS溶液，37℃孵育10分钟后，再加入20nM 13nm金纳米探针进一步杂交10分钟后，将杂交液转移到亲和素包被的荧光酶标板上，室温孵育30分钟，最后，用100μL PBS缓冲液洗涤，加入100μL异硫氰酸荧光素(FITC)，震荡，荧光检测，荧光强度通过Wallac1420工作站在线观测。
本发明的有益效果：本发明大大提高了3-甲基-喹啉-2-羧酸检测的灵敏度，且操作更加简便，达到了高通量的目的，而且以磁性粒子作为固相载体，具有清洗和分离方便，操作简单的优点，用DNA修饰的金纳米粒子作为探针代替传统的HRP进行免疫反应，简化了反应的条件，提高了检测的灵敏度，达到国际领先水平。
附图说明
图13-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫荧光猝灭检测结果。
具体实施方式
实施例1
(1)包被原的制备：
取3-甲基-喹啉-2-羧酸102mg，溶解在6mL N，N-二羟基甲酰胺(DMF)中，加入120μL三正丁胺，反应0.5小时，再加入75μL氯甲酸异丁酯，反应1小时，再与含有100mg间氨基苯甲酸的碳酸钠缓冲溶液(pH9.6)的溶液混合，在4℃下搅拌反应2小时，过程中有沉淀产生，离心，取沉淀物，干燥，得到半抗原；
取半抗原9.9mg，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)11.5mg，N，N-二环己基二亚胺(DCC)20.63mg，加入到3mL N，N-二羟基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL卵清蛋白(OVA)(60mg)溶液在4℃下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，冻干，-20℃保存备用；
(2)免疫源的制备：
取3-甲基-喹啉-2-羧酸102mg，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)11.5mg，N，N-二环己基二亚胺(DCC)20.63mg，加入到3mL N，N-二羟基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL卵清蛋白(OVA)(130mg)溶液在4℃下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，冻干，-20℃保存备用；
(3)多克隆抗体制备：
采用新西兰大白兔作为被免疫的动物，首次免疫时将免疫源与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，在大白兔背部皮下多点注射，免疫剂量为1mg/只，间隔2-4周后，用相同剂量免疫源加等量弗氏不完全佐剂混合制成乳化剂，加强免疫，免疫期间监测抗体效价及特异性，最后一次免疫不加佐剂。最后一次免疫7天后，心脏放血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的MQCA多克隆抗体。
(4)抗体效价的测定：
采用间接ELISA方法对免疫后不同时期的抗体进行效价的监测，以OD值达到1.0左右时判断为阳性，结果最后抗体的效价为3.2×105。
(5)磁性纳米粒子的修饰：
用二次蒸馏水分别配制FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O的溶液及NaOH溶液，将所配两种铁盐溶液混合。在铁盐的混合溶液中Fe2+离子的浓度为0.12mol/L，Fe3+离子的浓度为0.2mol/L；NaOH溶液的浓度为2.5mol/L。在剧烈搅拌下将一定体积的NaOH溶液缓慢滴加到混合铁盐溶液中，将所得的沉淀在60℃陈化2小时，用二次蒸馏水将沉淀物清洗数次，过滤后再在60℃干燥24小时，在玛瑙研钵中研磨后所得产物为Fe3O4种子。
将上步产物Fe3O4种子0.125g用100mL乙醇和1mL水溶解，超声30min，滴加0.4mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室温搅拌7小时，以8000r/min离心30min，将APTES修饰的Fe3O4纳米颗粒从反应介质中分离，并用乙醇溶液对其清洗5次，过滤后再在60℃干燥24小时，备用。
(6)磁性纳米粒子与包被原的偶联：
取步骤(5)所得最终产物10mg，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)11.5mg，N，N-二环己基二亚胺(DCC)20.63mg，加入到3mL N，N-二羟基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL卵清蛋白(OVA)(60mg)溶液在4℃下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，对透析袋中溶液进行磁性分离，弃上清，加入含2％明胶的封闭液封闭，再加入PBST洗涤液，洗涤后磁分离，去上清，最后向磁性分离过的离心管中加入1mL 0.02mol/L pH7.6的Tris缓冲液，4℃保存备用。
(7)金纳米粒子的制备：
所有的玻璃仪器都用强酸浸泡，双蒸水清洗，晾干备用。制备时，向洁净的三角烧瓶中加入100mL质量浓度为0.01％的氯金酸，加热，煮沸，紧接着加入1％的柠檬酸三钠溶液(13nm粒子需3.5mL；30nm粒子需1mL)，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色变成红色，反应持续6-8分钟以使柠檬酸三钠完全沉降。最后，溶液分别冷却至室温，稀释到100mL，4℃保藏。
(8)金纳米探针的制备：
首先，30nm金纳米粒子与1.5μg的羊抗兔在碱性水溶液中搅拌反应(pH9.1)，紧接着，向溶液中加入巯基修饰的寡核苷酸5’-tacgagttgagaccgttaagacgaggcaatcatgcaatcctgaatgcgt(10)-SH-3’，室温反应20小时，再用10mM的磷酸盐缓冲溶液(0.1M NaCl)调节pH值至7.0，盐陈40小时后于-4℃下2000r.p.m离心30分钟，弃上清。红色沉淀物用10mM的磷酸盐缓冲溶液(0.1M NaCl)溶解，加入1.5μM的目标探针5’-cgcattcaggattgcatgaatgcctcgtcttaacggtctcaactcgta-3’37℃杂交4小时，再次离心去上清，杂交过程重复4次，沉淀最后溶解于10mM的磷酸盐缓冲溶液(0.3MNaCl)，作为储备液4℃保藏；
13nm金纳米探针的制备直接向金纳米溶液中加入巯基寡核苷酸5’-GGCAATCATGCAATCCTGAATGCGa(10)-SH-3’，室温反应20小时，再用10mM的磷酸盐缓冲溶液(0.1M NaCl)调节pH值至7.0，盐陈40小时后于-4℃下2000r.p.m离心30分钟，弃上清。红色沉淀物用10mM的磷酸盐缓冲溶液(0.1MNaCl)溶解，4℃保藏。
(9)流动注射系统中的免疫反应：
先用0.01M PBS(pH7.0，0.1M NaCl)的洗液清洗微管和免疫反应池，然后将40μL抗原修饰的超顺磁纳米粒子溶液(0.5mg/ml)吸入螺线管中，再以5μL/s的速率注入免疫反应池内，电磁铁通电，吸附磁珠，将其固定在反应池内。将预孵育的混合溶液(50μL抗体；50μLMQCA)吸入螺线管中，其中，MQCA溶解于0.01MPBST(pH7.4，0.05％Tween-20)中，浓度从从1pg/mL～100pg/mL。然后，将混合溶液注入免疫反应池中室温反应10分钟，再以20μL/s的速度注入400μL 0.01MPBS(pH7.0，0.1M NaCl)的洗液。之后，将100μL的30nm金探针(含有二抗和DNA)的溶液以1μL/s的速度注入反应池，反应6分钟，冲洗。以2μL/s的速度注入100μL的双蒸水，60℃反应6分钟，最后再注入100μL的双蒸水，收集所需单链DNA，撤去磁场，洗涤柱子以备再用。
(10)荧光酶标板的包被：
用亲和素包被荧光酶标板，向酶标板每孔中加入100μL亲和素的碳酸钠缓冲溶液(pH9.6)，4℃孵育过夜，用PBS清洗后，备用。
(11)荧光猝灭检测：
步骤(9)收集的单链DNA与10μL的生物素标记的捕获探针(25μM，5’-生物素-a(10)TACGAGTTGAGACCGTTAAGACGA-3’)混合，再加入20μL(0.3MNaCl，0.02％SDS，0.01M PBS，pH7.4)，37℃孵育10分钟后，再加入13nm金纳米探针(20nM)进一步杂交10分钟后，将杂交液转移到亲和素包被的荧光酶标板上，室温孵育30分钟。最后，用100μL PBS缓冲液洗涤，加入100μL FITC，震荡，荧光检测，荧光强度可以通过Wallac1420工作站在线观测。
Claims (10)
1、一种3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫荧光猝灭检测方法，其特征是包括免疫源、包被原、和抗体的制备，包被原的固定，磁性纳米粒子的修饰，磁性纳米粒子与包被原的偶联，金纳米粒子的制备，金纳米探针的制备，流动注射系统中的免疫反应，荧光酶标板的包被和流动注射荧光猝灭的检测；工艺步骤为：
(1)包被原的制备：将3-甲基-喹啉-2-羧酸与间氨基苯甲酸相连，再与卵清蛋白相偶联得到包被原；
(2)免疫原的制备：将3-甲基-喹啉-2-羧酸与牛血清蛋白相偶联得到免疫原；
(3)抗体的制备：用所得免疫原免疫兔子得到特异性多克隆抗体；
(4)包被原的固定：用所得包被原与磁性微粒偶联，并固定于玻璃微通道内；
(5)磁性纳米粒子的修饰：将制备的Fe3O4种子用3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰；
(6)磁性纳米粒子与包被原的偶联；
(7)两种粒径的金纳米粒子的制备；
(8)两种金纳米探针的制备；
(9)流动注射系统中的免疫反应；
(10)荧光酶标板的包被；
(11)流动注射荧光猝灭的检测：利用间接竞争免疫检测将3-甲基-喹啉-2-羧酸和多克隆抗体通过玻璃微通道内，竞争结合后的多克隆抗体与经羊抗兔抗体及双链DNA共同修饰的金纳米探针反应，变性得到单链DNA并将其收集，收集得到的单链DNA一端与互补DNA修饰的金纳米探针反应，另一端与生物素修饰的互补DNA反应，并用亲和素固定于酶标板上，加入异硫氰酸荧光素，用荧光酶标仪检测荧光信号从而检测3-甲基-喹啉-2-羧酸含量。
2、根据权利要求1所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫荧光猝灭检测方法，其特征是包被原的制备：取3-甲基-喹啉-2-羧酸102mg，溶解在6mL N，N-二羟基甲酰胺中，加入120μL三正丁胺，反应0.5小时；再加入75μL氯甲酸异丁酯，反应1小时；再与含有100mg间氨基苯甲酸、6mL pH9.6的碳酸钠缓冲溶液混合，在4℃下搅拌反应2小时；过程中有沉淀产生，离心，取沉淀物，干燥，得到3-甲基-喹啉-2-羧酸半抗原；取3-甲基-喹啉-2-羧酸半抗原9.9mg，N-羟基琥珀酰亚胺11.5mg，N，N-二环己基二亚胺20.63mg，加入到3mLN，N-二羟基甲酰胺中，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL含60mg卵清蛋白的溶液在4℃下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，冻干，-20℃保存备用。
3、根据权利要求1所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫荧光猝灭检测方法，其特征是免疫原的制备：取3-甲基-喹啉-2-羧酸102mg，N-羟基琥珀酰亚胺11.5mg，N，N-二环己基二亚胺20.63mg，加入到3mL N，N-二羟基甲酰胺中，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL含130mg卵清蛋白的溶液在4℃下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，冻干，-20℃保存备用。
4、根据权利要求1所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫荧光猝灭检测方法，其特征是磁性纳米粒子的修饰：用二次蒸馏水分别配制FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O的溶液及NaOH溶液，将所配两种铁盐溶液混合，在铁盐的混合溶液中Fe2+离子的浓度为0.12mol/L，Fe3+离子的浓度为0.2mol/L；NaOH溶液的浓度为2.5mol/L；在剧烈搅拌下将一定体积的NaOH溶液缓慢滴加到混合铁盐溶液中，将所得的沉淀在60℃陈化2小时，用二次蒸馏水将沉淀物清洗数次，过滤后再在60℃干燥24小时，在玛瑙研钵中研磨后所得产物为Fe3O4种子；将Fe3O4种子0.125g用100mL乙醇和1mL二次蒸馏水分散，超声30min，滴加0.4mL3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES，室温搅拌7小时，以8000r/min离心30min，将APTES修饰的Fe3O4纳米颗粒从反应介质中分离，并用乙醇溶液对其清洗5次，过滤后再在60℃干燥24小时，备用。
5、根据权利要求1所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫荧光猝灭检测方法，其特征是磁性纳米粒子与包被原的偶联：取所得的APTES修饰的Fe3O4纳米颗粒10mg，N-羟基琥珀酰亚胺11.5mg，N，N-二环己基二亚胺20.63mg，加入到3mLN，N-二羟基甲酰胺中，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL含60mg卵清蛋白的溶液在4℃下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，对透析袋中溶液进行磁性分离，弃上清，加入含2％明胶的pH9.6碳酸钠缓冲溶液封闭，再加入PBST洗涤液，洗涤后磁分离，去上清，最后向磁性分离过的离心管中加入1mL 0.02mol/L pH7.6的Tris缓冲液，4℃保存备用。
6、根据权利要求1所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫荧光猝灭检测方法，其特征是金纳米粒子的制备：所用的玻璃仪器都强酸浸泡，双蒸水清洗，晾干备用；制备时，向洁净的三角烧瓶中加入100mL质量浓度为0.01％的氯金酸，加热，煮沸，紧接着加入1％的柠檬酸三钠溶液3.5mL或1mL，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色变成红色，反应持续6-8分钟以使柠檬酸三钠完全沉降，最后，溶液分别冷却至室温，稀释到100mL，4℃保藏；加入3.5mL柠檬酸三钠溶液制得的金纳米粒子平均粒径为13nm，加入1mL柠檬酸三钠溶液制得的金纳米粒子平均粒径为30nm。
7、根据权利要求1所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫荧光猝灭检测方法，其特征是金纳米探针的制备：
30nm金纳米探针的制备：首先，30nm金纳米粒子与1.5μg的羊抗兔在pH9.1碱性水溶液中搅拌反应，紧接着，向溶液中加入巯基修饰的寡核苷酸5’-TACGAGTTGAGACCGTTAAGACGAGGCAATCATGCAATCCTGAATGCGt(10)-SH-3’，室温反应20小时，再用含0.1M NaCl的10mM磷酸盐缓冲溶液调节pH值至7.0，盐陈40小时后于-4℃下2000r.p.m离心30分钟，弃上清；红色沉淀物用含0.1M NaCl的10mM磷酸盐缓冲溶液溶解，加入1.5μM的寡核苷酸5-CGCATTCAGGATTGCATGAATGCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTA-3’37℃杂交4小时，再次离心去上清，杂交过程重复4次，沉淀最后溶解于含0.3MNaCl的10mM磷酸盐缓冲溶液中，得到羊抗兔抗体及双链DNA共同修饰的30nm金纳米探针，作为储备液4℃保藏；
13nm金纳米探针的制备：直接向13nm金纳米溶液中加入巯基寡核苷酸5’-GGCAATCATGCAATCCTGAATGCGa(10)-SH-3’，室温反应20小时，再用含0.1M NaCl的10mM磷酸盐缓冲溶液调节pH值至7.0，盐陈40小时后于-4℃下2000r.p.m离心30分钟，弃上清；红色沉淀物用含0.1M NaCl的10mM磷酸盐缓冲液溶解，4℃保藏。
8、根据权利要求1所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫荧光猝灭检测方法，其特征是流动注射系统中的免疫反应：先用pH 7.0、含0.1M NaCl的0.01M磷酸盐缓冲液作洗液清洗微管和免疫反应池，然后将40μL 0.5mg/mL抗原修饰的超顺磁纳米粒子溶液吸入螺线管中，再以5μL/s的速率注入免疫反应池内，电磁铁通电，吸附磁珠，将其固定在反应池内；将预孵育的50μL抗体和50μL 3-甲基-喹啉-2-羧酸混合溶液吸入螺线管中，其中，3-甲基-喹啉-2-羧酸溶解于pH7.4、含0.05％Tween-20的0.01M PBST中，浓度从1pg/mL～100pg/mL；然后，将混合溶液注入免疫反应池中室温反应10分钟，再以20μL/s的速度注入400μL pH7.0、0.1M NaCl的0.01M PBS洗液；之后，将100μL的羊抗兔抗体及双链DNA共同修饰的30nm金纳米探针的溶液以1μL/s的速度注入反应池，反应6分钟，冲洗；以2μL/s的速度注入100μL的双蒸水，60℃反应6分钟，最后再注入100μL的双蒸水，收集所需单链DNA，撤去磁场，洗涤柱子以备再用。
9、根据权利要求1所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫荧光猝灭检测方法，其特征是荧光酶标板的包被：用亲和素包被荧光酶标板，向酶标板每孔中加入100μL亲和素的pH9.6碳酸钠缓冲溶液，4℃孵育过夜，用PBS清洗后，备用。
10、根据权利要求1所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫荧光猝灭检测方法，其特征是荧光猝灭检测：将收集的单链DNA与10μL的生物素标记的捕获探针25μM，5’-生物素-a(10)TACGAGTTGAGACCGTTAAGACGA-3’混合，再加入20μL的含0.3M NaCl、0.02％SDS的pH7.40.01M PBS溶液，37℃孵育10分钟后，再加入20nM 13nm金纳米探针进一步杂交10分钟后，将杂交液转移到亲和素包被的荧光酶标板上，室温孵育30分钟，最后，用100μL PBS缓冲液洗涤，加入100μL异硫氰酸荧光素，震荡，荧光检测，荧光强度通过Wallac1420工作站在线观测。
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