CN101382541B - 一种微囊藻毒素-lr的免疫荧光猝灭检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种微囊藻毒素-LR的免疫荧光猝灭检测方法，属于免疫分析化学技术领域。本发明包括免疫原、包被原、和抗体的制备，磁性纳米粒子的修饰，磁性纳米粒子与包被原的偶联，金纳米粒子的制备，金纳米探针的制备，包被原的固定，流动注射系统中的免疫反应，荧光酶标板的包被和流动注射荧光猝灭的检测；本发明大大提高了微囊藻毒素-LR检测的灵敏度，且操作更加简便，达到了高通量的目的，而且以磁性粒子作为固相载体，具有清洗和分离方便，操作简单的优点，用DNA修饰的金纳米粒子作为探针代替传统的HRP进行免疫反应，简化了反应的条件。
Description
技术领域
一种微囊藻毒素-LR的免疫荧光猝灭检测方法，属于免疫分析化学技术领域。
背景技术
随着经济的发展，含有大量的氮、磷营养物质的污水进入湖泊、水库，使水体富营养化，致使藻类异常增殖，释放次级代谢物藻毒素(Algae Toxins)，威胁人类的饮用水的安全和水体中其它生物的安全。其中微囊藻毒素(Microcystins，MCs)的分布广、危害大更应引起重视，其是由某些种属的淡水蓝藻，主要是铜绿微囊藻产生的一个结构相似的环七肽家族，已知有60余种异构体。其结构如下：
其含有五个固定成分的氨基酸，两个可变的氨基酸X、Y。其中X和Y分别为Leu和Arg的最为常见、毒性也最大。基于此，世界卫生组织(WHO)推荐的饮水中的藻毒素标准为1.0μg/L，我国现颁布执行的生活饮用水水质卫生规范(2001，微囊藻毒素-LR，0.001mg/L)和地表水环境质量标准(GB3838-2002，微囊藻毒素-LR，0.001mg/L)。故对藻毒素准确有效监测尤为重要。
常用的检测藻毒素的方法主要有仪器分析方法、生物化学法及免疫检测法等几大类。仪器分析方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)、质谱、液质联用等，这些方法虽然灵敏但其需要昂贵的仪器设备，专业的操作人员，对检材的要求也比较高，并且需要进一步的样本前处理才能进行，这已经不能达到现代检测对快速、方便、准确的要求。生物化学法主要是蛋白磷酸酶抑制试验法，优点是快速，数小时即可实现对大量样品的检测，但其最大的不足之处在于特异性蛋白磷酸酶等没有商品供应、特异性差。免疫分析化学方法具有快速，灵敏度高，操作简单，专一性好等优点。与传统的ELISA方法相比，本发明利用纳米磁性粒子作为固相载体，在流动注射系统中进行免疫反应，用DNA修饰的金纳米粒子作为探针，免疫反应后，收集DNA，并将其固定于金纳米粒子表面，加入异硫氰酸荧光素，检测荧光信号从而达到检测微囊藻毒素-LR的目的，该方法大大提高了检测的灵敏度，且操作更加简便，达到了高通量的目的，而且以磁性粒子作为固相载体，具有清洗和分离方便，操作简单的优点，用DNA修饰的金纳米粒子作为探针代替传统的HRP进行免疫反应，简化了反应的条件，提高了检测的灵敏度。
发明内容
本发明的目的是提供一种微囊藻毒素-LR的免疫荧光猝灭检测方法，灵敏度高，操作方便，线性范围宽。
本发明的技术方案：一种微囊藻毒素-LR的免疫荧光猝灭检测方法，包括免疫原、包被原、和抗体的制备，磁性纳米粒子的修饰，磁性纳米粒子与包被原的偶联，金纳米粒子的制备，金纳米探针的制备，包被原的固定，流动注射系统中的免疫反应，荧光酶标板的包被和流动注射荧光猝灭的检测；工艺步骤为：
(1)包被原的制备：将微囊藻毒素-LR与卵清蛋白相偶联得到包被原；
(2)免疫原的制备：将微囊藻毒素-LR与牛血清蛋白相偶联得到免疫原；
(3)抗体的制备：用所得免疫原按常规方法免疫得到特异性多克隆抗体；
(4)磁性纳米粒子的修饰：将制备的Fe3O4种子用3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰；
(5)磁性纳米粒子与包被原的偶联；
(6)两种粒径的金纳米粒子的制备；
(7)两种金纳米探针的制备；
(8)包被原的固定：用所得包被原与磁性微粒偶联，并固定于玻璃微通道内；
(9)流动注射系统中的免疫反应；
(10)荧光酶标板的包被；
(11)流动注射荧光猝灭的检测：利用间接竞争免疫检测将微囊藻毒素-LR和多克隆抗体通过玻璃微通道内，竞争结合后的多克隆抗体与经羊抗兔抗体及双链DNA共同修饰的金纳米探针反应，变性得到单链DNA并将其收集，收集得到的单链DNA一端与互补DNA修饰的金纳米探针反应，另一端与生物素修饰的互补DNA反应，并用亲和素固定于酶标板上，加入异硫氰酸荧光素，用荧光酶标仪检测荧光信号从而检测微囊藻毒素-LR含量。
免疫原的制备：
①取0.25mL溶解有微囊藻毒素-LR的乙醇溶液，加入0.75mL去离子水，加入150μL的碳二亚胺，得A液；
②用1mL25％的乙醇溶液溶解2mg的牛血清蛋白BSA，得B液；
③将A液逐滴加入到B液中，再加入150μL的碳二亚胺，混匀，4℃反应12h，得到微囊藻毒素-LR-BSA偶联物的混合液；
④将微囊藻毒素-LR-BSA偶联物的混合液移入透析袋中，用6×1L的去离子水透析4-6天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：微囊藻毒素-LR-BSA，用作免疫原。
包被原的制备：
①取微囊藻毒素-LR 0.5mg溶于250μL的N，N-二甲基甲酰胺中，得C液；
②取三正丁胺15μL溶于250μL的N，N-二甲基甲酰胺中，得D液；
③将D液加入到C液中；
④取氯甲酸异丁酯12μL，溶于500μL N，N-二甲基甲酰胺中，4℃搅拌下逐滴加入到C液中，反应1h；
⑤取牛血清蛋白6mg溶于3mL pH 9.0、50mmol/L的碳酸钠溶液，将上述反应液于18℃搅拌下逐滴加入到牛血清蛋白质溶液中，室温反应12h，即得到微囊藻毒素-LR-OVA偶联物的混合液；
⑥将微囊藻毒素-LR-OVA偶联物的混合液移入透析袋中，用6×1L的去离子水透析4-6天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：微囊藻毒素-LR-OVA，用作包被原。
磁性纳米粒子的修饰：用二次蒸馏水分别配制FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O的溶液及NaOH溶液，将所配两种铁盐溶液混合，在铁盐的混合溶液中Fe2+离子的浓度为0.12mol/L，Fe3+的浓度为0.2mol/L；NaOH溶液的浓度为2.5mol/L，在剧烈搅拌下将一定体积的NaOH溶液缓慢滴加到混合铁盐溶液中，将所得的沉淀在60℃陈化2小时，用二次蒸馏水将沉淀物清洗数次，过滤后再在60℃干燥24小时，在玛瑙研钵中研磨后所得产物为Fe3O4种子；将微囊藻毒素-LR-OVA0.125g用100mL乙醇和1mL水溶解，超声30min，滴加0.4mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES，室温搅拌7小时，以8000r/min离心30min，将APTES修饰的Fe3O4纳米颗粒从反应介质中分离，并用乙醇溶液对其清洗5次，过滤后再在60℃干燥24小时，备用。
磁性纳米粒子与包被原的偶联：取修饰的磁性纳米粒子10mg，N-羟基琥珀酰亚胺NHS 11.5mg，N，N-二环己基二亚胺DCC 20.63mg，加入到3mL N，N-二羟基甲酰胺中，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL含60mg卵清蛋白OVA的溶液在4℃下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，对透析袋中溶液进行磁性分离，弃上清，加入含2％明胶的封闭液封闭，再加入PBST洗涤液，洗涤后磁分离，去上清，最后向磁性分离过的离心管中加入1mL 0.02mol/LpH7.6的Tris缓冲液，4℃保存备用。
金纳米粒子的制备：所有的玻璃仪器都强酸浸泡，双蒸水清洗，晾干备用；制备时，向洁净的三角烧瓶中加入100mL浓度为0.01％的氯金酸，加热，煮沸，紧接着加入1％的柠檬酸三钠溶液3.5mL或1mL，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色变成红色，反应持续6-8分钟柠檬酸三钠使金纳米粒子完全沉降，所得金纳米粒子粒径对应分别为13nm或30nm，最后，溶液分别冷却至室温，稀释到100mL，4℃保藏。
金纳米探针的制备：
30nm金纳米探针的制备：首先，30nm金纳米粒子与1.5μg的羊抗兔在pH9.1碱性水溶液中搅拌反应，紧接着，向溶液中加入巯基修饰的寡核苷酸5’-tacgagttgagaccgttaagacgaggcaatcatgcaatcctgaatgcgt(10)-SH-3’，室温反应20小时，再用含0.1M NaCl的10mM磷酸盐缓冲溶液调节pH值至7.0，盐陈40小时后于-4℃下2000r.p.m离心30分钟，弃上清，红色沉淀物用含0.1M NaCl的10mM磷酸盐缓冲溶液溶解，加入1.5μM的目标探针5’-cgcattcaggattgcatgaatgcctcgtcttaacggtctcaactcgta-3’37℃杂交4小时，再次离心去上清，杂交过程重复4次，沉淀最后溶解于含0.3M NaCl的10mM磷酸盐缓冲溶液，作为储备液4℃保藏；
13nm金纳米探针的制备：直接向金纳米溶液中加入巯基寡核苷酸5’-GGCAATCATGCAATCCTGAATGCGa(10)-SH-3’，室温反应20小时，再用含0.1M NaCl的10mM磷酸盐缓冲溶液调节pH值至7.0，盐陈40小时后于-4℃下2000r.p.m离心30分钟，弃上清，红色沉淀物用含0.1M NaCl的10mM磷酸盐缓冲溶液溶解，4℃保藏。
包被原固定及流动注射系统中的免疫反应：先用含0.1MNaCl、pH 7.0的0.01M磷酸盐缓冲液作为洗液清洗微管和免疫反应池，然后将40μL 0.5mg/mL抗原修饰的超顺磁纳米粒子溶液吸入螺线管中，再以5μL/s的速率注入免疫反应池内，电磁铁通电，吸附磁珠，将其固定在反应池内；将预孵育的50μL抗体和50μL微囊藻毒素-LR混合溶液吸入螺线管中，其中，微囊藻毒素-LR溶解于含0.05％Tween-20pH7.40.01M PBST中，浓度从从1pg/ml到100pg/ml。然后，将混合溶液注入免疫反应池中室温反应10分钟，再以20μL/s的速度注入400μL含0.1M NaCl的pH7.0、0.01M磷酸盐缓冲液洗液，之后，将100μL的羊抗兔抗体及双链DNA共同修饰的30nm金探针的溶液以1μL/s的速度注入反应池，反应6分钟，冲洗；以2μL/s的速度注入100μL的双蒸水，60℃反应6分钟，最后再注入100μL的双蒸水，收集所需单链DNA，撤去磁场，洗涤柱子以备再用。
荧光酶标板的包被：用亲和素包被荧光酶标板，向酶标板每孔中加入100μLpH9.6的亲和素碳酸钠缓冲溶液，4℃孵育过夜，用PBS清洗后，备用。
荧光猝灭检测：将收集的单链DNA与10μL的生物素标记的捕获探针25μM，5’-生物素-a(10)TACGAGTTGAGACCGTTAAGACGA-3’混合，再加入含0.3M NaCl，0.02％SDS pH7.420μL、0.01M PBS，37℃孵育10分钟后，再加入13nm金纳米探针20nM进一步杂交10分钟后，将杂交液转移到亲和素包被的荧光酶标板上，室温孵育30分钟，最后，用100μL PBS缓冲液洗涤，加入100μL异硫氰酸荧光素FITC，震荡，荧光检测，荧光强度可以通过Wallac1420工作站在线观测。
本发明的有益效果：本发明大大提高了微囊藻毒素-LR检测的灵敏度，且操作更加简便，达到了高通量的目的，而且以磁性粒子作为固相载体，具有清洗和分离方便，操作简单的优点，用DNA修饰的金纳米粒子作为探针代替传统的HRP进行免疫反应，简化了反应的条件。
附图说明
图1免疫原的紫外扫描图。
图2微囊藻毒素-LR的免疫荧光猝灭检测结果。
具体实施方式
实施例1
(1)免疫原的制备：
①取0.25mL溶解有微囊藻毒素-LR(MC-LR)的乙醇溶液，加入0.75mL去离子水，加入150μL的碳二亚胺(EDC)，得A液。
②用1mL 25％的乙醇溶液溶解2mg的牛血清蛋白(BSA)，得B液。
③将A液逐滴加入到B液中，再加入150μL的碳二亚胺(EDC)，混匀，4℃反应12h。得到微囊藻毒素-LR-BSA偶联物的混合液。
④将微囊藻毒素-LR-BSA偶联物的混合液移入透析袋中，用6×1L的去离子水透析4-6天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：微囊藻毒素-LR-BSA，作为免疫原。
透析袋前处理：取10cm的透析袋，煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。
(2)包被原的制备：
①取微囊藻毒素-LR(MC-LR)0.5mg溶于250μL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得C液。
②取三正丁胺15μL溶于250μL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得D液。
③将D液加入到C液中。
④取氯甲酸异丁酯12μL，溶于500μL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，4℃搅拌下逐滴加入到C液中，反应1h。
⑤取牛血清蛋白(BSA)6mg溶于3mL pH＝9.0、50mmol/L的碳酸钠溶液，将上述反应液与18℃搅拌下逐滴加入到蛋白质溶液中，室温反应12h。即得到微囊藻毒素-LR-OVA偶联物的混合液。
⑥将微囊藻毒素-LR-OVA偶联物的混合液移入透析袋中，用6×1L的去离子水透析4-6天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：微囊藻毒素-LR-OVA，作为包被原。
透析袋前处理：取10cm的透析袋，煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。
(3)磁性纳米粒子的修饰：
用二次蒸馏水分别配制FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O的溶液及NaOH溶液，将所配两种铁盐溶液混合。在铁盐的混合溶液中Fe2+离子的浓度为0.12mol/L，Fe3+的浓度为0.2mol/L；NaOH溶液的浓度为2.5mol/L。在剧烈搅拌下将一定体积的NaOH溶液缓慢滴加到混合铁盐溶液中，将所得的沉淀在60℃陈化2小时，用二次蒸馏水将沉淀物清洗数次，过滤后再在60℃干燥24小时，在玛瑙研钵中研磨后所得产物为Fe3O4种子。
将上步产物0.125g用100mL乙醇和1mL水溶解，超声30min，滴加0.4mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室温搅拌7小时，以8000r/min离心30min，将APTES修饰的Fe3O4纳米颗粒从反应介质中分离，并用乙醇溶液对其清洗5次，过滤后再在60℃干燥24小时，备用。
(4)磁性纳米粒子与包被原的偶联：
取步骤(3)所得最终产物10mg，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)11.5mg，N，N-二环己基二亚胺(DCC)20.63mg，加入到3mL N，N-二羟基甲酰胺(DMF)，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL卵清蛋白(OVA)(60mg)溶液在4℃下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，对透析袋中溶液进行磁性分离，弃上清，加入含2％明胶的封闭液封闭，再加入PBST洗涤液，洗涤后磁分离，去上清，最后向磁性分离过的离心管中加入1mL0.02mol/L pH7.6的Tris缓冲液，4℃保存备用。
(5)金纳米粒子的制备：
所有的玻璃仪器都强酸浸泡，双蒸水清洗，晾干备用。制备时，向洁净的三角烧瓶中加入100mL浓度为0.01％的氯金酸，加热，煮沸，紧接着加入1％的柠檬酸三钠溶液(13nm粒子需3.5mL；30nm粒子需1mL)，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色变成红色，反应持续6-8分钟以使柠檬酸三钠完全沉降。最后，溶液分别冷却至室温，稀释到100mL，4℃保藏。
(6)金纳米探针的制备：
首先，30nm金纳米粒子与1.5μg的羊抗兔在碱性水溶液中搅拌反应(pH9.1)，紧接着，向溶液中加入巯基修饰的寡核苷酸(5’-tacgagttgagaccgttaagacgaggcaatcatgcaatcctgaatgcgt(10)-SH-3’)，室温反应20小时，再用10mM的磷酸盐缓冲溶液(0.1M NaCl)调节pH值至7.0，盐沉40小时后于-4℃下2000r.p.m离心30分钟，弃上清。红色沉淀物用10mM的磷酸盐缓冲溶液(0.1M NaCl)溶解，加入1.5μM的目标探针(5’-cgcattcaggattgcatgaatgcctcgtcttaacggtctcaactcgta-3’)37℃杂交4小时，再次离心去上清，杂交过程重复4次，沉淀最后溶解于10mM的磷酸盐缓冲溶液(0.3MNaCl)，作为储备液4℃保藏；13nm金纳米探针的制备直接向金纳米溶液中加入巯基寡核苷酸(5’-GGCAATCATGCAATCCTGAATGCGa(10)-SH-3’)，室温反应20个小时，再用10mM的磷酸盐缓冲溶液(0.1M NaCl)调节pH值至7.0，盐陈40小时后于-4℃下2000r.p.m离心30分钟，弃上清。红色沉淀物用10mM的磷酸盐缓冲溶液(0.1M NaCl)溶解，4℃保藏。
(7)流动注射系统中的免疫反应：
先用0.01M PBS(pH7.0，0.1M NaCl)的洗液清洗微管和免疫反应池，然后将40μL抗原修饰的超顺磁纳米粒子溶液(0.5mg/ml)吸入螺线管中，再以5μL/s的速率注入免疫反应池内，电磁铁通电，吸附磁珠，将其固定在反应池内。将预孵育的混合溶液(50μL抗体；50μLMC-LR)吸入螺线管中，其中，MC-LR溶解于0.01M PBST(pH7.4，0.05％Tween-20)中，浓度从从1pg/ml到100pg/ml。然后，将混合溶液注入免疫反应池中室温反应10分钟，再以20μL/s的速度注入400μL0.01M PBS(pH7.0，0.1M NaCl)的洗液。之后，将100μL的30nm金探针(含有二抗和DNA)的溶液以1μL/s的速度注入反应池，反应6分钟，冲洗。以2μL/s的速度注入100μL的双蒸水，60℃反应6分钟，最后再注入100μL的双蒸水，收集所需单链DNA，撤去磁场，洗涤柱子以备再用。
(8)荧光酶标板的包被：
用亲和素包被荧光酶标板，向酶标板每孔中加入100μL亲和素的碳酸钠缓冲溶液(pH9.6)，4℃孵育过夜，用PBS清洗后，备用。
(9)荧光猝灭检测：
步骤(9)收集的单链DNA与10μL的生物素标记的捕获探针(25μM，5’-生物素-a(10)TACGAGTTGAGACCGTTAAGACGA-3’)混合，再加入20μL(0.3M NaCl，0.02％SDS，0.01M PBS，pH7.4)，37℃孵育10分钟后，再加入13nm金纳米探针(20nM)进一步杂交10分钟后，将杂交液转移到亲和素包被的荧光板上，室温孵育30分钟。最后，用100μL PBS缓冲液洗涤，加入100μL FITC，震荡，荧光检测，荧光强度可以通过Wallac1420工作站在线观测。
Claims (1)
1.一种微囊藻毒素-LR的免疫荧光猝灭检测方法，其特征是包括免疫原、包被原、和抗体的制备，磁性纳米粒子的修饰，磁性纳米粒子与包被原的偶联，金纳米粒子的制备，金纳米探针的制备，包被原的固定，流动注射系统中的免疫反应，荧光酶标板的包被和流动注射荧光猝灭的检测；工艺步骤为：
(1)包被原的制备：将微囊藻毒素-LR与卵清蛋白相偶联得到包被原；
①取微囊藻毒素-LR 0.5mg溶于250μL的N，N-二甲基甲酰胺中，得C液；
②取三正丁胺15μL溶于250μL的N，N-二甲基甲酰胺中，得D液；
③将D液加入到C液中；
④取氯甲酸异丁酯12μL，溶于500μL N，N-二甲基甲酰胺中，4℃搅拌下逐滴加入到C液中，反应1h；
⑤取牛血清蛋白6mg溶于3mL pH 9.0、50mmol/L的碳酸钠溶液，将上述反应液于18℃搅拌下逐滴加入到牛血清蛋白质溶液中，室温反应12h，即得到微囊藻毒素-LR-OVA偶联物的混合液；
⑥将微囊藻毒素-LR-OVA偶联物的混合液移入透析袋中，用6×1L的去离子水透析4-6天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：微囊藻毒素-LR-OVA，用作包被原；
(2)免疫原的制备：将微囊藻毒素-LR与牛血清蛋白相偶联得到免疫原；
①取0.25mL溶解有微囊藻毒素-LR的乙醇溶液，加入0.75mL去离子水，加入150μL的碳二亚胺，得A液；
②用1mL25％的乙醇溶液溶解2mg的牛血清蛋白BSA，得B液；
③将A液逐滴加入到B液中，再加入150μL的碳二亚胺，混匀，4℃反应12h，得到微囊藻毒素-LR-BSA偶联物的混合液；
④将微囊藻毒素-LR-BSA偶联物的混合液移入透析袋中，用6×1L的去离子水透析4-6天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：微囊藻毒素-LR-BSA，用作免疫原；
(3)抗体的制备：用所得免疫原按常规方法免疫得到特异性多克隆抗体；
(4)磁性纳米粒子的修饰：将制备的Fe3O4种子用3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰；用二次蒸馏水分别配制FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O的溶液及NaOH溶液，将所配两种铁盐溶液混合，在铁盐的混合溶液中Fe2+离子的浓度为0.12mol/L，Fe3+的浓度为0.2mol/L；NaOH溶液的浓度为2.5mol/L，在剧烈搅拌下将一定体积的NaOH溶液缓慢滴加到混合铁盐溶液中，将所得的沉淀在60℃陈化2小时，用二次蒸馏水将沉淀物清洗数次，过滤后再在60℃干燥24小时，在玛瑙研钵中研磨后所得产物为Fe3O4种子；将微囊藻毒素-LR-OVA 0.125g用100mL乙醇和1mL水溶解，超声30min，滴加0.4mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES，室温搅拌7小时，以8000r/min离心30min，将APTES修饰的Fe3O4纳米颗粒从反应介质中分离，并用乙醇溶液对其清洗5次，过滤后再在60℃干燥24小时，备用；
(5)磁性纳米粒子与包被原的偶联：取修饰的磁性纳米粒子10mg，N-羟基琥珀酰亚胺NHS 11.5mg，N，N-二环己基二亚胺DCC 20.63mg，加入到3mL N，N-二羟基甲酰胺中，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL含60mg卵清蛋白OVA的溶液在4℃下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，对透析袋中溶液进行磁性分离，弃上清，加入含2％明胶的封闭液封闭，再加入PBST洗涤液，洗涤后磁分离，去上清，最后向磁性分离过的离心管中加入1mL0.02mol/L pH7.6的Tris缓冲液，4℃保存备用；
(6)两种粒径的金纳米粒子的制备：所有的玻璃仪器都强酸浸泡，双蒸水清洗，晾干备用；制备时，向洁净的三角烧瓶中加入100mL浓度为0.01％的氯金酸，加热，煮沸，紧接着加入1％的柠檬酸三钠溶液3.5mL或1mL，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色变成红色，反应持续6-8分钟柠檬酸三钠使金纳米粒子完全沉降，所得金纳米粒子粒径对应分别为13nm或30nm，最后，溶液分别冷却至室温，稀释到100mL，4℃保藏；
(7)两种金纳米探针的制备：
30nm金纳米探针的制备：首先，30nm金纳米粒子与1.5μg的羊抗兔在pH9.1碱性水溶液中搅拌反应，紧接着，向溶液中加入巯基修饰的寡核苷酸5’-tacgagttgagaccgttaagacgaggcaatcatgcaatcctgaatgcgt(10)-SH-3’，室温反应20小时，再用含0.1M NaCl的10mM磷酸盐缓冲溶液调节pH值至7.0，盐陈40小时后于-4℃下2000r.p.m离心30分钟，弃上清，红色沉淀物用含0.1M NaCl的10mM磷酸盐缓冲溶液溶解，加入1.5μM的目标探针5’-cgcattcaggattgcatgaatgcctcgtcttaacggtctcaactcgta-3’37℃杂交4小时，再次离心去上清，杂交过程重复4次，沉淀最后溶解于含0.3M NaCl的10mM磷酸盐缓冲溶液，作为储备液4℃保藏；
13nm金纳米探针的制备：直接向金纳米溶液中加入巯基寡核苷酸5’-GGCAATCATGCAATCCTGAATGCGa(10)-SH-3’，室温反应20小时，再用含0.1M NaCl的10mM磷酸盐缓冲溶液调节pH值至7.0，盐陈40小时后于-4℃下2000r.p.m离心30分钟，弃上清，红色沉淀物用含0.1M NaCl的10mM磷酸盐缓冲溶液溶解，4℃保藏；
(8)包被原的固定：用所得包被原与磁性微粒偶联，并固定于玻璃微通道内；
先用含0.1M NaCl、pH 7.0的0.01M磷酸盐缓冲液作为洗液清洗微管和免疫反应池，然后将40μL 0.5mg/mL抗原修饰的超顺磁纳米粒子溶液吸入螺线管中，再以5μL/s的速率注入免疫反应池内，电磁铁通电，吸附磁珠，将其固定在反应池内；
(9)流动注射系统中的免疫反应：将预孵育的50μL抗体和50μL微囊藻毒素-LR混合溶液吸入螺线管中，其中，微囊藻毒素-LR容解于含0.05％Tween-20pH7.40.01M PBST中，浓度从1pg/ml到100pg/ml；然后，将混合溶液注入免疫反应池中室温反应10分钟，再以20μL/s的速度注入400μL含0.1M NaCl的pH7.0、0.01M磷酸盐缓冲液洗液，之后，将100μL的羊抗兔抗体及双链DNA共同修饰的30nm金探针的溶液以1μL/s的速度注入反应池，反应6分钟，冲洗；以2μL/s的速度注入100μL的双蒸水，60℃反应6分钟，最后再注入100μL的双蒸水，收集所需单链DNA，撤去磁场，洗涤柱子以备再用；
(10)荧光酶标板的包被：用亲和素包被荧光酶标板，向酶标板每孔中加入100μL pH9.6的亲和素碳酸钠缓冲溶液，4℃孵育过夜，用PBS清洗后，备用；
(11)流动注射荧光猝灭的检测：利用间接竞争免疫检测将微囊藻毒素-LR和多克隆抗体通过玻璃微通道内，竞争结合后的多克隆抗体与经羊抗兔抗体及双链DNA共同修饰的金纳米探针反应，变性得到单链DNA并将其收集，收集得到的单链DNA一端与互补DNA修饰的金纳米探针反应，另一端与生物素修饰的互补DNA反应，并用亲和素固定于酶标板上，加入异硫氰酸荧光素，用荧光酶标仪检测荧光信号从而检测微囊藻毒素-LR含量；
将收集的单链DNA与10μL的生物素标记的捕获探针25μM，5’-生物素-a(10)TACGAGTTGAGACCGTTAAGACGA-3’混合，再加入含0.3M NaCl，0.02％SDS pH7.420μL、0.01M PBS，37℃孵育10分钟后，再加入13nm金纳米探针20nM进一步杂交10分钟后，将杂交液转移到亲和素包被的荧光酶标板上，室温孵育30分钟，最后，用100μL PBS缓冲液洗涤，加入100μL异硫氰酸荧光素FITC，震荡，荧光检测，荧光强度可以通过Wallac1420工作站在线观测。
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