CN102023151B - 用拉曼光谱在金纳米棒端面自组装介导下检测微囊藻毒素的方法 - Google Patents

用拉曼光谱在金纳米棒端面自组装介导下检测微囊藻毒素的方法 Download PDF

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Abstract

一种基于拉曼光谱在金纳米棒端面自组装介导下的检测微囊藻毒素(MC-LR)的方法,属于免疫分析化学技术领域。本发明以金纳米棒的端面与微囊藻毒素的包被原及抗微囊藻毒素的抗体分别偶联形成金纳米棒的探针,利用合成的金纳米棒探针进行免疫反应从而由于金纳米棒端面的抗原抗体反应形成纳米链,组装形成的纳米链长度的不同使拉曼信号强度不同,通过拉曼信号的变化达到检测MC-LR含量的目的。本发明是在液体环境中反应,不需要清洗的步骤,只需要一步反应,简化了反应的条件,减轻劳动强度,提高了检测的灵敏度。

Description

用拉曼光谱在金纳米棒端面自组装介导下检测微囊藻毒素的方法
技术领域
一种基于拉曼光谱在金纳米棒端面自组装介导下的检测微囊藻毒素(MC-LR)的方法,属于免疫分析化学技术领域。
背景技术
随着经济的发展,含有大量的氮、磷营养物质的污水进入湖泊、水库,使水体富营养化,致使藻类异常增殖,释放次级代谢物藻毒素(Algae Toxins),威胁人类的饮用水的安全和水体中其它生物的安全。其中微囊藻毒素(Microcystins,MCs)分布最广、危害最大,其结构如下:
Figure BSA00000273967100011
其含有五个固定成分的氨基酸,两个可变的氨基酸X、Y。即在上述的结构式中其中X和Y分别为Leu和Arg的即为MC-LR。MC-LR是最为常见且毒性又最大的一种微囊藻毒素,世界卫生组织(WHO)推荐的饮用水中的MC-LR的最大残留限量为1.0μg/L,我国现颁布执行的生活饮用水水质卫生规范(2001,0.001mg/L)和地表水环境质量标准(GB3838-2002,微囊藻毒素-LR,0.001mg/L),因此急需建立针对MC-LR检测的一种快速、简单、灵敏、省力的检测方法。
常用的检测藻毒素的方法主要有仪器分析方法、生物化学法及免疫检测法等几大类。仪器分析方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)、质谱、液质联用等,这些方法虽然灵敏但其需要昂贵的仪器设备,专业的操作人员,对检材的要求也比较高,并且需要进一步的样本前处理才能进行,这已经不能达到现代检测对快速、方便、准确的要求。生物化学法主要是蛋白磷酸酶抑制试验法,优点是快速,数小时即可实现对大量样品的检测,但其最大的不足之处在于特异性蛋白磷酸酶等没有商品供应、特异性差。免疫分析化学方法具有快速,灵敏度高,操作简单,专一性好等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于拉曼光谱在金纳米棒端面自组装介导下的检测微囊藻毒素(MC-LR)的方法,灵敏度高,操作方便,线性范围宽。
本发明的技术方案:一种基于拉曼光谱在金纳米棒端面自组装介导下的检测微囊藻毒素(MC-LR)的方法,包括包被原和抗体的修饰,抗体和金纳米棒的偶联,包被原和金纳米棒的偶联,信号分子4-氨基苯硫酚和GNR-Ab金纳米捧的侧面偶联,标准曲线的测定。步骤为:
(1)包被原的修饰:
将微囊藻毒素MC-LR的包被原与硫辛酸相偶联得到修饰的藻毒素包被原;
(2)抗体的修饰:
将抗微囊藻毒素MC-LR的抗体与硫辛酸相偶联得到修饰的抗微囊藻毒素MC-LR的抗体;
(3)用步骤(1)得到的修饰的藻毒素包被原与金纳米棒的端面偶联得到金纳米棒-包被原探针GNR-Ag;
(4)用步骤(2)得到的修饰的抗微囊藻毒素MC-LR的抗体与金纳米棒的端面偶联得到金纳米棒-抗体探针GNR-Ab;
(5)信号分子4-氨基苯硫酚和GNR-Ab金纳米捧的侧面偶联;
(6)微囊藻毒素MC-LR含量检测:利用间接竞争免疫检测原理,将微囊藻毒素MC-LR和步骤(3)得到的金纳米棒-包被原探针同时加入到一个离心管中,而后向离心管中加入步骤(4)得到的金纳米棒-抗体探针,混匀,通过微囊藻毒素MC-LR和金纳米棒-包被原探针与金纳米棒-抗体探针进行竞争偶联,通过微囊藻毒素MC-LR浓度的不同使形成的金纳米粒子形成不同的粒径分布,不同程度组装形成的纳米链对于拉曼信号的增强作用不同,通过拉曼仪器测定液体环境中的纳米链对于信号分子所产生的信号强度来间接测定微囊藻毒素的含量。
所述包被原的修饰:
①含硫辛酸1.625mg的0.3mL的硫辛酸的乙醇溶液与含2mg的0.2mL的藻毒素包被原溶液混合;
②将75μL的碳二亚胺在磁力搅拌的条件下逐滴滴入上述溶液中后室温反应4h;
③用pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析三天,每天换三次透析液;
④将修饰后的藻毒素包被原放在4℃备用。
所述抗体的修饰:
①含硫辛酸1.625mg的0.3mL的硫辛酸的乙醇溶液与含4mg的0.4mL的藻毒素抗体混合;
②将75μL的碳二亚胺在磁力搅拌的条件下逐滴滴入上述溶液中后室温反应4h;
③用pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析三天,每天换三次透析液;
④将修饰后的藻毒素抗体放在4℃备用。
所述金纳米棒-抗体探针的制备:采用晶种生长法合成金纳米棒,合成的金纳米棒利用pH 3.8、含有0.1%聚乙二醇PEG的0.005M十六烷基三甲基溴化铵CTAB稀释溶液进行重悬,重悬液采用1M HCl调整pH值3.1,0.5mL浓度为2nmol重分散的金纳米棒(GNRs)逐滴滴加到由50μL经修饰后的藻毒素抗体中,最终分散到1mL的稀释溶液中。采用硫辛酸修饰的藻毒素抗体会修饰到金棒的端面而非侧面上,室温搅拌反应4h,反应结束后6000rpm离心10min,用1mL的pH 3.8、含有0.1%PEG的0.005M CTAB溶液进行重分散,洗涤两遍;最后用50μL的pH 3.8、含有0.1%PEG的0.005M CTAB溶液进行重分散;此金纳米棒-抗体探针,即金纳米棒-藻毒素抗体偶联物GNR-Ab置于4℃保存。
所述金纳米棒-包被原探针的制备:藻毒素包被原和金纳米棒的偶联与上述藻毒素抗体和金纳米棒的偶联相似,只是在包被原的量上有区别,即加入的藻毒素包被原60μL后用940μL的pH3.8、含有0.1%PEG的0.005M CTAB溶液进行稀释;此金纳米棒-包被原探针,即金纳米棒-藻毒素包被原偶联物GNR-Ag置于4℃保存。
所述信号分子4-氨基苯硫酚和GNR-Ab金纳米捧的侧面偶联:在495μL偶联上藻毒素抗体的金纳米棒分散液中,加入5μL浓度为100mM的4-氨基苯硫酚的乙醇溶液,至金纳米棒-藻毒素抗体偶联物分散液中4-氨基苯硫酚的最终浓度为1mM,室温震荡避光反应12h,反应结束后6000rpm离心10min,运用1mL的pH3.8、含有0.1%PEG的0.005M CTAB溶液进行重分散,洗涤两遍,最后用50μL的pH 3.8、含有0.1%PEG的0.005M CTAB溶液进行重分散,此信号分子4-氨基苯硫酚偶联在GNR-Ab金纳米捧的侧面,4-氨基苯硫酚与GNR-Ab偶联物置于4℃保存。
所述标准曲线的建立:通过测定拉曼信号大小进行MC-LR的检测,步骤为:
①免疫反应:向各个离心管中各加入20μL的GNR-Ag后,再向各离心管加入用pH3.8、含有0.1%PEG的0.005M CTAB溶液稀释的0.01,0.05,0.1,1,10,50,100ng/mL的微囊藻毒素后混匀,按照GNR-Ag与GNR-Ab的体积比为1∶1加入GNR-Ab混匀,放入37℃反应30min;
②仪器检测:反应结束,反应液中加入等量的pH3.8、含有0.1%PEG的0.005M CTAB溶液稀释,混匀,静置2min,用拉曼仪测定该反应液中的信号分子的强度-峰面积,重复三次;
运用MC-LR的浓度作为横坐标,拉曼信号强度为纵坐标建立标准曲线,检测限LOD通过公式LOD=3.3SD/S计算得出,SD为变异系数,S为标准曲线的斜率。
本发明的有益效果:与传统的ELISA方法相比,本发明利用晶种生长法合成的金纳米棒分别与微囊藻毒素的包被原和抗微囊藻毒素的抗体相连,在液体的环境下金纳米棒偶联抗体和金纳米棒偶联包被原反应形成纳米链,微囊藻毒素可以和金纳米棒偶联的包被原进行竞争结合金纳米棒偶联抗体的结合位点,因此微囊藻毒素的含量会影响纳米链的长度。不同程度组装形成的纳米链,对于拉曼信号的增强作用不同,故通过拉曼仪器测定液体环境中的纳米链对于信号分子所产生的信号强度来间接测定微囊藻毒素的含量。本发明只在液体环境中反应,不破坏样品,不需要清洗的步骤,只需要一步反应,简化了反应的条件,减轻劳动强度,提高了检测的灵敏度。
附图说明
图1加入不同浓度微囊藻毒素标准品后拉曼检测金纳米棒的结果图(自上到下添加浓度为100ng/mL,10ng/mL,1ng/mL,0ng/mL)。
图2微囊藻毒素检测的标准曲线。
具体实施方式
实施例1
(1)藻毒素包被原的修饰:
藻毒素包被原为藻毒素小分子和卵清蛋白通过碳二亚胺法进行偶联获得。
藻毒素包被原的修饰采用碳二亚胺法将藻毒素包被原与硫辛酸相偶联得到修饰的藻毒素包被原,操作步骤如下:
①0.3mL的硫辛酸的乙醇溶液(含硫辛酸1.625mg)与0.2mL(含藻毒素包被原2mg)的藻毒素包被原溶液混合。
②将75μL的碳二亚胺在磁力搅拌的条件下逐滴滴入上述溶液中后室温反应4h。
③用pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析三天,每天换三次透析液。
④将修饰后的藻毒素包被原放在4℃备用。
(2)藻毒素抗体修饰:
①0.3mL的硫辛酸的乙醇溶液(含硫辛酸1.625mg)与0.4mL的藻毒素抗体溶液(含藻毒素抗体4mg)混合。
②将75μL的碳二亚胺在磁力搅拌的条件下逐滴滴入上述溶液中后室温反应4h。
③用pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析三天,每天换三次透析液。
④将修饰后的藻毒素抗体放在4℃备用。
(3)藻毒素抗体和金纳米棒端面偶联:
采用晶种生长法合成金纳米棒,首先要经过7500rpm离心15min去除溶液中多余的Vc,AgNO3和小的球形粒子金纳米棒后利用pH3.8、含有0.1%聚乙二醇(PEG)的0.005M十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)稀释溶液进行重悬。采用1MHCl调整重悬液的pH值至3.1。在金纳米棒的制备过程中CTAB起着非常关键的作用。CTAB主要是分布在金纳米棒的侧面,从而金纳米棒的侧面带有正电荷,而CTAB在金纳米棒的端面分布很少,因此采用硫辛酸修饰的藻毒素抗体会修饰到金纳米棒的端面而非侧面上。0.5mL浓度为2nmol重分散的金纳米棒(GNRs)逐滴滴加到由50μL经修饰后的藻毒素抗体中,最终分散到1mL的稀释溶液中。室温搅拌反应4h。反应结束后6000rpm离心10min,运用1mL的0.005M CTAB(pH3.8)含有0.1%PEG的溶液进行重分散。洗涤两遍。最后用50μL的0.005M CTAB(pH 3.8)含有0.1%PEG的溶液进行重分散。此金纳米棒-藻毒素抗体偶联物(GNR-Ab)置于4℃保存。
(4)藻毒素包被原和金纳米棒端面偶联
藻毒素包被原和金纳米棒的偶联与(3)藻毒素抗体和金纳米棒的偶联相似,只是在藻毒素包被原的量上有区别,即加入的包被原60μL后用940μL的0.005MCTAB(pH3.8)含有0.1%PEG的溶液进行稀释。此金纳米棒-藻毒素包被原偶联物(GNR-Ag)置于4℃保存。
(5)信号分子4-氨基苯硫酚和GNR-Ab金纳米捧的侧面偶联
在495μL偶联上藻毒素抗体的金纳米棒分散液中,加入5μL、100mM的4-氨基苯硫酚的乙醇溶液,至金纳米棒-藻毒素抗体偶联物分散液中4-氨基苯硫酚的最终浓度为1mM,室温震荡避光反应12h。反应结束后6000rpm离心10min,运用1mL的0.005M CTAB(pH 3.8)含有0.1%PEG的溶液进行重分散。洗涤两遍。最后用50μL的0.005M CTAB(pH3.8)含有0.1%PEG的溶液进行重分散。此信号分子4-氨基苯硫酚偶联在GNR-Ab金纳米捧的侧面,4-氨基苯硫酚与GNR-Ab偶联物置于4℃保存。
(6)标准曲线的建立:
微囊藻毒素MC-LR(995.2Da)作为一个小分子不可能被两个抗体分子进行识别。当金纳米棒-藻毒素抗体偶联物(GNR-Ab)和金纳米棒-藻毒素包被原偶联物(GNR-Ag)混合时,由于抗体抗原反应导致金纳米棒发生自组装形成长的纳米链。当加入微囊藻毒素MC-LR时,MC-LR就会与藻毒素包被原竞争藻毒素抗体的结合位点导致GNR-Ab不能两端同时与GNR-Ag发生免疫反应,因此MC-LR的浓度会影响纳米链的长度,不同程度组装形成的纳米链,对于拉曼信号的增强作用不同,故通过拉曼仪器测定液体环境中的纳米链对于信号分子所产生的信号强度来间接测定微囊藻毒素的含量。通过测定拉曼信号可以建立基于金纳米棒探针的端面与端面相互连接的针对MC-LR的检测方法,具体步骤为:
①免疫反应:向各个离心管中各加入50μL的GNR-Ag,再向各管中分别加入用0.005M CTAB(pH 3.8)含有0.1%PEG的溶液稀释的0.01,0.05,0.1,1,10,50,100ng/mL的微囊藻毒素之一种,后混匀,按照GNR-Ag与GNR-Ab的体积比为1∶1加入GNR-Ab混匀,于37℃反应30min。
②仪器检测:反应结束,反应液中加入等量的0.005M CTAB(pH 3.8)含有0.1%PEG的溶液稀释,混匀。静置2min,用拉曼仪测定该反应液中的信号分子的强度,重复三次。
运用MC-LR的浓度作为横坐标,拉曼信号强度(峰面积)作为纵坐标建立标准曲线。检测限(LOD)通过公式LOD=3.3SD/S计算得出,式中SD为变异系数,S为标准曲线的斜率。
(7)实际样本的检测。
实际样本是来自于无锡不同区域的太湖水。我们通过对实际样本的添加回收率实验来验证我们方法的可靠性。太湖水中的含有的原始的微囊藻毒素通过传统的ELISA进行测定。在搅拌的条件下添加微囊藻毒素MC-LR至预先采集的实际样本太湖水中,添加的浓度为0.05,0.1,0.5,2.5,5ng/mL。添加后将太湖水在4℃静置两小时。而后通过本专利建立的检测方法测定MC-LR的浓度,计算回收率。通过对数据分析得到回收率在92.21%和109.38%之间。两组平行试验的变异系数均小于3.73%。检测结果如表1。
表1
Figure BSA00000273967100061
通过这个结果可以得出本专利建立的检测方法是可行的,并且是简单、快速和省力的一种方法。

Claims (3)

1.一种基于拉曼光谱在金纳米棒端面自组装介导下检测微囊藻毒素的方法,其特征在于步骤为:
(1)包被原的修饰:
将微囊藻毒素MC-LR的包被原与硫辛酸相偶联得到修饰的藻毒素包被原;
(2)抗体的修饰:
将抗微囊藻毒素MC-LR的抗体与硫辛酸相偶联得到修饰的抗微囊藻毒素MC-LR的抗体;
(3)用步骤(1)得到的修饰的藻毒素包被原与金纳米棒的端面偶联得到金纳米棒-包被原探针GNR-Ag;
(4)用步骤(2)得到的修饰的抗微囊藻毒素MC-LR的抗体与金纳米棒的端面偶联得到金纳米棒-抗体探针GNR-Ab;
(5)信号分子4-氨基苯硫酚和GNR-Ab金纳米捧的侧面偶联;
(6)微囊藻毒素MC-LR含量检测:利用间接竞争免疫检测原理,将微囊藻毒素MC-LR和步骤(3)得到的金纳米棒-包被原探针同时加入到一个离心管中,而后向离心管中加入步骤(4)得到的金纳米棒-抗体探针,混匀,通过微囊藻毒素MC-LR和金纳米棒-包被原探针与金纳米棒-抗体探针进行竞争偶联,通过微囊藻毒素MC-LR浓度的不同使形成的金纳米粒子形成不同的粒径分布,不同程度组装形成的纳米链对于拉曼信号的增强作用不同,通过拉曼仪器测定液体环境中的纳米链对于信号分子所产生的信号强度来间接测定微囊藻毒素的含量。
2.根据权利要求1所述的基于拉曼光谱在金纳米棒端面自组装介导下检测微囊藻毒素的方法,其特征在于信号分子4-氨基苯硫酚和GNR-Ab金纳米捧的侧面偶联:在495μL偶联上藻毒素抗体的金纳米棒分散液中,加入5μL浓度为100mM的4-氨基苯硫酚的乙醇溶液,至金纳米棒-藻毒素抗体偶联物分散液中4-氨基苯硫酚的最终浓度为1mM,室温震荡避光反应12h,反应结束后6000rpm离心10min,运用1mL的pH 3.8、含有0.1%PEG的0.005M CTAB溶液进行重分散,洗涤两遍,最后用50μL的pH 3.8、含有0.1%PEG的0.005M CTAB溶液进行重分散,此信号分子4-氨基苯硫酚偶联在GNR-Ab金纳米捧的侧面,4-氨基苯硫酚与GNR-Ab偶联物置于4℃保存。
3.根据权利要求1所述的基于拉曼光谱在金纳米棒端面自组装介导下检测微囊藻毒素的方法,其特征在于标准曲线的建立:通过测定拉曼信号大小进行MC-LR的检测,步骤为:
①免疫反应:向各个离心管中各加入20μL的GNR-Ag后,再向各离心管加入用pH3.8、含有0.1%PEG的0.005M CTAB溶液稀释的0.01,0.05,0.1,1,10,50,100ng/mL的微囊藻毒素后混匀,按照GNR-Ag与GNR-Ab的体积比为1∶1加入GNR-Ab混匀,放入37℃反应30min;
②仪器检测:反应结束,反应液中加入等量的pH3.8、含有0.1%PEG的0.005M CTAB溶液稀释,混匀,静置2min,用拉曼仪测定该反应液中的信号分子的强度-峰面积,重复三次;
运用MC-LR的浓度作为横坐标,拉曼信号强度为纵坐标建立标准曲线,检测限LOD通过公式LOD=3.3SD/S计算得出,SD为变异系数,S为标准曲线的斜率。
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