CN109834291A - 基于金纳米棒头尾自组装表面增强拉曼探针制备方法和检测汞离子中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于金纳米棒头尾自组装表面增强拉曼探针制备方法和检测Hg2+中的应用,其技术方案包括有金纳米棒的制备,并根据金纳米棒修饰DNA,并通过本发明利用金纳米棒的EE(end to end)自组装构建“表面增强拉曼探针”,利用SERS灵敏度高,甚至可以检测单分子,非常适合用于微量检测,同时无需繁琐的制样与前处理等特点。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域,具体设计一种基于金纳米棒头尾自组装的表面增强拉曼散射(SERS)探针,并进一步其应用于Hg2+的检测。
背景技术
汞是环境中最危险的污染物之一。它渗入土壤,流入海洋,最终通过食物链积累在人体内,损害人类的心血管,泌尿,肠胃和神经系统。特别是水溶性汞(Hg2+),由于其对人类健康造成严重损害而一直备受关注。美国环境保护署 (EPA)现定饮用水中Hg2+的限值为2μg/L(10nmol/L),如此微量的浓度对检测方法的敏感度要求很大。目前已有多种传统的Hg2+检测方法,包括原子荧光光谱法 (AFS),冷原子吸收光谱法(CVAAS),电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)。这些检测方法大部分都需要高度精确的样品制备,昂贵的实验设备和较长的时间,这使得它们不适合远程或现场检测。因此,迫切需要开发一种简便可靠、快速、灵敏测定Hg2+的方法。
表面增强拉曼散射(SERS)光谱可用于检测目标分子而不需要任何标记或样品预处理,特别适合用于现场分析,为Hg2+的快速筛选提供了另一种方法。
近来SERS已被广泛应用于汞离子的检测。比如,Li和他的同事(Kayeong,S., Jun-Haeng,C.,Moon-Young,Y.,Hoeil,C.,2016,Anal.Chem.,88:3465-3470.Li S., Xu L.G.,Ma W,Kuang H.,Wang L.,Xu C.,Small,2015,11:3435–3439.)报道了拉曼标记金纳米颗粒三聚体同时检测汞离子和银离子的工作。Fu课题组(Fu S.Y.,Guo X.Y.,Wang H.,YangT.X.,Wen Y.,Yang H.F.,Sensor Actuat B-Chem, 2014,199:108–114.)以AuNPs为基底构建了一种超灵敏的汞离子传感器, LOD为0.5pmol/L,到达了历史最低。Kandjani等人(Kandjani A.E.,Sabri Y.M., Mohammad-Taheri M.,Bansal V.,Bhargava S.K.,EnvironSci Technol,2015,49: 1578–1584.)通过SERS固体活性基底ZnO/Ag纳米阵列薄膜提高了Hg 2+在液相中的检测灵敏度,由于HgO与AgNPs反应形成汞齐包裹在金属表面,导致罗丹明B(RB)拉曼信号衰减,Hg 2+的检出限约为2.25nmol/L。
一般认为,电磁增强和化学增强对拉曼信号增强都有贡献。电磁增强主要取决于金属表面的纳米结构以及分子与热点之间的距离,而化学增强是通过改变拉曼散射截面或通过分析物在基底上的化学附着来实现。由此可知,纳米颗粒的自组装可以有效增加间隙之间的电磁场作用进而提高SERS信号。例如,Wu等人(L.Tang,S.Li,F.Han,L.Liu,L.Xu,W.Ma,H.Kuang,A.Li,L.Wang and C.Xu,Biosens.Bioelectron.,2015,71,7.)用Au@AgNRs二聚物检测多巴胺,Xu 等人Liguang Xu,Honghong Yin,Wei Ma,Hua Kuang,Libing Wang,Chuanlai Xu, Biosens.Bioelectron.,2015,67,472–476.)用金纳米颗粒自组装成金链用于Hg2+检测。曲兆珠等人(曲兆珠;周骏;罗海清;吴冠毅;姜丹;吴莎,一种自组装金纳米棒SERS免疫基底及其制备方法[P].中国专利:CN106940310A,2017-07-11.)在硅片上自组装金纳米棒用于SERS免疫检测。徐霞等人(徐霞;徐程楠;应义斌,基于纳米组装结构的SERS适体传感器的构建方法及应用[P].中国专利: CN107290519A,2017-10-24.)将赭曲霉素A适体片段部分互补的两种DNA分别修饰到金纳米棒和金纳米粒子的表面,在DNA适体的互补配对连接下自组装形成纳米组装结构用于待测物浓度检测。上述工作中DNA无选择地修饰在纳米颗粒表面,自组装可能是头碰头,也可能是肩并肩,也可能两种形式都有,有可能存在多个纳米颗粒自组装团聚的情况造成信号不均匀。因此有必要对此进一步进行改进。王利兵等人(王立兵;胥传来;马伟;朱颍越;陈伟;徐丽广;刘丽强;赵媛,一种基于金纳米棒聚合酶链反应自组装的拉曼传感器的制备[P].中国专利:CN102146338A,2011-08-11.)只是提供了一种PCR扩增DNA方法自组装金纳米棒的方法,在AuNRs表面修饰前端引物(F)与后端引物(R)中既未说明定向修饰端面的原因,也无表征定向修饰端面的效果图,并且未牵涉汞离子的检测。
本发明利用,通过调节CTAB和pH值来避免静电吸附,从而实现大部分以巯基结合金纳米棒的方法,从而获得T-T错配的巯基DNA修饰在金纳米棒两端金纳米棒。有汞离子存在下,T-T错配的DNA发生杂交,实现金纳米棒头碰头自组装,拉曼信号进行放大。拉曼信号与汞离子的浓度成一定的比例关系。
基于此,提出本发明申请。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足,而提供一种基于金纳米棒头尾自组装表面增强拉曼探针制备方法和检测Hg2+中的应用,本发明将 DNA选择性修饰在金纳米棒的两端,形成头尾自组装金纳米棒,操作简单,在液体环境中反应均匀。
为实现上述目的,本发明的第一个技术方案是提供了一种基于金纳米棒头尾自组装表面增强拉曼探针。
S1:在容器中加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液,高速搅拌下加入HAuCl4水溶液,待溶液混合均匀,快速加入NaBH4水溶液,继续搅拌,随后水浴静置,本步骤S1中十六烷基三甲基溴化铵:HAuCl4:NaBH4的加入量的摩尔比为:0.2: 0.0001:(0.0012-0.0025);
S2:在容器中加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液、超纯水和HAuCl4水溶液,待搅拌均匀,再加入AgNO3水溶液,用蠕动泵将抗坏血酸水溶液缓慢加入,再加入步骤S1中制备的种子溶液,水浴;本步骤S2中十六烷基三甲基溴化铵: HAuCl4:AgNO3和抗坏血酸的加入量的摩尔比:1:0.025:0.0125:0.029;
S3:将所述步骤S2制备的溶液离心,除去多余的十六烷基三甲基溴化铵溶液,得到金纳米棒,将金纳米棒重新分散在十六烷基三甲基溴化铵水溶液中,得到金纳米棒溶液。
进一步设置是步骤S1中,十六烷基三甲基溴化铵水溶液的浓度为0.5 mmol/L,HAuCl4水溶液的浓度为0.25mmol/L,NaBH4水溶液的浓度为0.01 mol/L,水浴静置时间为2-4h。
进一步设置是步骤S2中,十六烷基三甲基溴化铵水溶液的浓度为0.5 mmol/L,HAuCl4水溶液的浓度为0.25mmol/L,AgNO3水溶液的浓度为0.01 mol/L,抗坏血酸水溶液的浓度为0.1mol/L。
进一步设置是抗坏血酸的加入量正好使得反应溶液从金黄色变为无色。
进一步设置是在步骤S2中加入如上述步骤S1中制备的种子溶液50-70μL。
本发明还提供一种基于金纳米棒头尾自组装表面增强拉曼探针的制备方法,包括以下步骤:
(1)将DNA加入至如所述的金纳米棒溶液中,用HCl水溶液调节pH=3-4,水浴下,慢搅,溶液离心,除去多余的DNA,获得金纳米棒两端修饰DNA,重新分散在5mM CTAB溶液中;本步骤所述的DNA分别选用两种DNA对金纳米棒进行修饰,其产物分别记为AuNRs-DNA1和AuNRs-DNA2;
(2)在试样瓶中分别加入AuNRs-DNA1、AuNRs-DNA2、和一定浓度的汞标准液,在室温下温育1h,得到头碰头的金纳米棒,从而实现拉曼信号增强。汞离子的浓度与拉曼信号成一定的函数关系。虽然DNA1与DNA2本身不是完全互补配对的,但由于T-Hg2+-T碱基错配,DNA1与DNA2在加入Hg2+条件可以发生杂交反应。
本发明还提供一种基于金纳米棒头尾自组装用作表面增强拉曼散射探针在分析检测当中的用途。
进一步设置是在孔板中加入AuNRs-DNA1、AuNRs-DNA2、汞标准液和罗丹明,振荡用以拉曼检测。
本发明利用金纳米棒的EE(end to end)自组装构建“热点”,利用SERS灵敏度高,甚至可以检测单分子,非常适合用于微量检测,同时无需繁琐的制样与前处理等特点,旨在突破原子荧光光谱法(AFS),冷原子吸收光谱法(CVAAS),电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)等传统分析方法的检测限,并在实验中突显出SERS探针高选择性的特点。
通过本申请的上述技术方案,本发明所获得的EE(end to end)自组装金纳米棒可准确检测出Hg2+,在拉曼分析检测领域中具有巨大的应用潜力和价值。
本发明利用,通过调节CTAB和pH值来避免静电吸附,从而实现大部分以巯基结合金纳米棒的方法,从而获得T-T错配的巯基DNA修饰在金纳米棒两端金纳米棒。有汞离子存在下,T-T错配的DNA发生杂交,实现金纳米棒头碰头自组装,拉曼信号进行放大。拉曼信号与汞离子的浓度成一定的比例关系。
而文件1只是提供了一种PCR扩增DNA方法自组装金纳米棒的方法,文件1中金纳米棒自组装可能是头碰头,也可能是肩并肩,也可能两种形式都有,而且文件1中,没有牵涉到汞离子的检测。文件1中在AuNRs表面修饰前端引物(F)与后端引物(R)中未说明定向修饰端面的原因,也没有表征定向修饰端面的效果图。本发明定向修饰原理可做如下解释:①由于卤素负离子会吸附在金纳米颗粒表面,因此,一般认为金纳米颗粒表面应带负电荷。但是由于CTAB 中带正电的季铵基团带正电,所以在CTAB溶液中合成的金纳米棒带正电。再者,CTAB优先吸附在特定的晶面上(金纳米棒的侧面)。综上所述,金纳米棒侧面带正电,两端带负电。②DNA的等电点在4-4.5。调节pH至4,DNA小于等电点带正电。③DNA选择性修饰在AuNRs两端。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1是本发明实施例1所得到的金纳米棒紫外可见吸收光谱图;
图2是本发明实施例2所得到的两端修饰DNA的金纳米棒紫外可见吸收光谱图;
图3是本发明实施例3所得到的EE(end to end)自组装金纳米棒紫外可见吸收光谱图;
图4是本发明实施例3所得到的EE(end to end)自组装金纳米棒透射电镜图(TEM);
图5是本发明实施例4所得到的金纳米棒EE自组装前后拉曼信号强度对比图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
如图1至图5所示,为本发明实施例中,
实施例1:轴比为R=3±0.1金纳米棒的制备
S1:在试管中加入1mL 0.2M CTAB(aq),高速搅拌下加入0.02mL 25mM HAuCl4(aq)。
S2:待溶液混合均匀,快速加入0.12mL 0.01M NaBH4(aq),溶液颜色即刻由金黄色变为棕色。
S3:继续搅拌2min,随后在28℃的水浴锅中静置2h。
S4:在烧杯中加入5mL 0.2M CTAB(aq),8mL超纯水,1mL 25mM HAuCl4(aq),待搅拌均匀,再加入0.125mL 0.01M AgNO3(aq)。
S5:用蠕动泵将0.29mL 0.1M抗坏血酸(aq)缓慢加入,直至溶液由金黄色变为无色,再加入50μL预先制备的种子溶液,28℃水浴保存4小时。
S6:溶液10000rpm离心,除去多余的CTAB溶液,重新分散在5mM CTAB 溶液中。
实施例2:在金纳米棒两端修饰DNA
将23μL 10μM DNA加入2mL上述所制金纳米棒溶液中,用0.1M HCl(aq) 调节pH=4,28℃水浴下,慢搅20小时。溶液8000rpm离心,除去多余的 DNA,重新分散在5mM CTAB溶液中。
实施例3:金纳米棒的EE(end to end)自组装
在试样瓶中加入450μL AuNRs-DNA1,450μLAuNRs-DNA2,100μL汞标准液,在28℃下慢搅反应2小时。
DNA1:5’-SH-C6-ACGTTCTTGTCTGT-CY5.5-3’
DNA2:5’-SH-C6-ACTGTCATGATCGT-CY5.5-3’
实施例4:基于金纳米棒的SERS探针用于检测Hg2+
在96孔板中加入75μL AuNRs-DNA1,75μLAuNRs-DNA2,50μL汞标准液和50μL 1×10-4R6G,振荡10min用以检测拉曼。
微观表征
对实施例1所得到的金纳米棒进行了微观表征,结果如下:
1.由图1的紫外可见吸收光谱图可知,所合成的金纳米棒λLSR=703nm。根据分立偶极近似(DDA)方法模拟得到在水中金棒纵向峰位与其轴比的关系为λLSR=96R+418,计算可得所制备的金纳米棒轴比为R=2.93。根据TEM初步统计,所制金纳米棒长轴大小在34±5nm,短轴大小在11nm±2nm,轴比 R=3.09,与DDA模拟计算结果相符。
对实施例2所得到的两端修饰DNA的金纳米棒进行了微观表征,结果如下:
2.由图2的紫外可见吸收光谱图可知,测得紫外有明显的DNA特征峰,足以说明金纳米棒已成功修饰DNA。DNA的紫外特征峰在260nm左右。金纳米棒加入DNA孵育20小时,离心。离心除去溶液中多余的DNA,避免溶液中未修饰于金棒的DNA产生紫外特征峰影响实验结果。
对实施例3所得到的EE(end to end)自组装金纳米棒进行了微观表征,结果如下:
3.由图3的紫外可见吸收光谱图可知,自组装后的金纳米棒纵向吸收峰λLSR=698nm,自组装前的金纳米棒纵向吸收峰λLSR=692nm,发生6nm的红移。根据相关文献(如Chem.Commun.2010,26,1332-1334,Acta Phys.-Chim.Sin. 2014,30(10),1827-183)说明EE(end to end)组装金纳米棒纵向吸收峰λLSR发生红移,SS(side by side)组装金纳米棒纵向吸收峰λLSR发生蓝移。由此我们可以说明该反应确实发生了EE自组装。
α,β-不饱和羰基的n-π*跃迁是产生260nm DNA紫外特征峰的主要原因。 T-Hg2+-T配位键的形成生成H+破坏了α,β-不饱和羰基的共轭作用,会使DNA 紫外特征峰消失。所以从图中我们还可以看出260nm处的DNA紫外特征峰消失,从而说明T-Hg2+-T配位键的形成。
4.由图4的透射电镜图(TEM)可见,金纳米棒确实发生了EE自组装。
对实施例4所得到的基于金纳米棒的SERS探针应用于Hg2+定性检测,结果如下:
5.由图5的金纳米棒EE自组装前后拉曼信号强度对比图,可简单确定金纳米棒自组装确实存在拉曼信号增强的作用。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已,当然不能以此来限定本发明之权利范围,因此依本发明权利要求所作的等同变化,仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (8)
1.一种金纳米棒的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
S1:在容器中加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液,高速搅拌下加入HAuCl4水溶液,待溶液混合均匀,快速加入NaBH4水溶液,继续搅拌,随后水浴静置,本步骤S1中十六烷基三甲基溴化铵:HAuCl4:NaBH4的加入量的摩尔比为:0.2:0.0001:(0.0012-0.0025);
S2:在容器中加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液、超纯水和HAuCl4水溶液,待搅拌均匀,再加入AgNO3水溶液,用蠕动泵将抗坏血酸水溶液缓慢加入,再加入步骤S1中制备的种子溶液,水浴;本步骤S2中十六烷基三甲基溴化铵:HAuCl4:AgNO3和抗坏血酸的加入量的摩尔比:1:0.025:0.0125:0.029;
S3:将所述步骤S2制备的溶液离心,除去多余的十六烷基三甲基溴化铵溶液,得到金纳米棒,将金纳米棒重新分散在十六烷基三甲基溴化铵水溶液中,得到金纳米棒溶液。
2.根据权利要求1所述的金纳米棒的制备方法,其特征在于:步骤S1中,十六烷基三甲基溴化铵水溶液的浓度为0.5mmol/L,HAuCl4水溶液的浓度为0.25mmol/L,NaBH4水溶液的浓度为0.01mol/L,水浴静置时间为2-4h。
3.根据权利要求1所述的金纳米棒的制备方法,其特征在于:步骤S2中,十六烷基三甲基溴化铵水溶液的浓度为0.5mmol/L,HAuCl4水溶液的浓度为0.25mmol/L,AgNO3水溶液的浓度为0.01mol/L,抗坏血酸水溶液的浓度为0.1mol/L。
4.根据权利要求1所述的金纳米棒的制备方法,其特征在于:抗坏血酸的加入量正好使得反应溶液从金黄色变为无色。
5.根据权利要求1所述的金纳米棒的制备方法,其特征在于:在步骤S2中加入如上述步骤S1中制备的种子溶液50-70μL。
6.一种基于金纳米棒头尾自组装表面增强拉曼探针的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)将DNA加入至如权利要求1-5之一所述的金纳米棒溶液中,用HCl水溶液调节pH=3-4,水浴下,慢搅,溶液离心,除去多余的DNA,获得金纳米棒两端修饰DNA,重新分散在5mMCTAB溶液中;本步骤所述的DNA分别选用两种DNA对金纳米棒进行修饰,其产物分别记为AuNRs-DNA1和AuNRs-DNA2;
(2)在试样瓶中分别加入AuNRs-DNA1、AuNRs-DNA2、汞标准液,通过层层自组装反应得到表面增强拉曼探针。
7.一种如权利要求6所述的表面增强拉曼散射探针在检测Hg2+分中的应用方法。
8.根据权利要求7所述应用方法包括如下步骤:
在孔板中加入AuNRs-DNA1、AuNRs-DNA2、汞标准液和罗丹明,振荡用以拉曼检测。
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YI WANG等: "End-to-end assembly of gold nanorods by means of oligonucleotide–mercury(II) molecular recognition", 《CHEMICAL COMMUNICATIONS》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN110625134A (zh) * | 2019-09-17 | 2019-12-31 | 天津工业大学 | 一种基于双层金纳米棒的防伪薄膜的制备方法 |
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CN113398950A (zh) * | 2021-05-19 | 2021-09-17 | 华南理工大学 | 一种晶面调控的负载型纳米合金催化剂及其制备方法与应用 |
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