CN108526484A - 巯基dna修饰金纳米棒及其制备方法、重金属汞离子的检测方法和应用 - Google Patents

巯基dna修饰金纳米棒及其制备方法、重金属汞离子的检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种巯基DNA修饰金纳米棒及其制备方法、重金属汞离子的检测方法和应用，该制备方法，包括：1)将十六烷基三甲基溴化铵CTAB、氯金酸混合，接着加入硼氢化钠进行接触反应直至体系变成黄褐色以得到种子液；2)将十六烷基三甲基溴化铵CTAB、硝酸银、氯金酸混合，接着加入抗坏血酸进行接触反应直至体系变成无色以得到生长液；3)将种子液、生长液进行接触反应以制得金纳米棒GNRs溶液；4)将巯基DNA与金纳米棒GNRs溶液进行孵育、后处理以得到巯基DNA修饰金纳米棒GNRs‑ssDNA‑2。该巯基DNA修饰金纳米棒能够与汞离子形成T‑Hg2+‑T夹心式结构以构建Cy5核苷酸‑金纳米棒荧光共振能量转移体系来达到对Hg2+的检测。

Description

巯基DNA修饰金纳米棒及其制备方法、重金属汞离子的检测方 法和应用
技术领域
本发明涉及金纳米材料，具体地，涉及一种巯基DNA修饰金纳米棒及其制备方法、重金属汞离子的检测方法和应用。
背景技术
目前，环境污染已成为人们、国家乃至整个世界关注的重点。当今工业污染严重，特别是重金属污染，微量的重金属可致使身体疾病。Hg(Ⅱ)作为重金属离子之一，能通过在水中沉积的微生物甲基化作用转化成甲基汞。环境、水以及食品中汞离子通过血液循环累积在体内汞离子浓度达到25nmol/L时，通过食物链富集在人体内对许多器官如心脏，肾脏，脑，胃和肠道都具有不同程度的毒性。美国国家环境保护局(EPA)评估所有的包括自然环境和人体排出金属汞的排放量约7500吨/每年，其对人体的毒性量已经非常大，所以准确灵敏的检测汞离子具有重要的意义。
在已创建的众多Hg2+的检测方法中，迄今为止，检测汞离子的方法有许多种。如利用上转换纳米粒子NaYF4:Yb,Tm和金纳米棒之间的荧光共振能量转移检测汞离子，但其过程较为复杂。文献(S.J.Wu,N.Duan,Z.Shi,C.C.Fang,Z.P.Wang,Talanta,128(2014)327-336)用双荧光共振能量转移检测铅离子和汞离子，但是该检测方法实验材料复杂，仪器昂贵，检测的灵敏度和选择性较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种巯基DNA修饰金纳米棒及其制备方法、重金属汞离子的检测方法和应用，该巯基DNA修饰金纳米棒能够与汞离子形成T-Hg2+-T夹心式结构以构建Cy5核苷酸-金纳米棒荧光共振能量转移体系来达到对Hg2+的检测，该含巯基核苷酸修饰的贵金属纳米材料对重金属汞离子检测具有选择性好和灵敏度高检测的优点，进而使得其能够在实际水样中实现快速、灵敏地检测重金属汞离子的目的。
为了实现上述目的，本发明提供了一种巯基DNA修饰金纳米棒的制备方法，包括：
1)将十六烷基三甲基溴化铵CTAB、氯金酸混合，接着加入硼氢化钠进行接触反应直至体系变成黄褐色以得到种子液；
2)将十六烷基三甲基溴化铵CTAB、硝酸银、氯金酸混合，接着加入抗坏血酸进行接触反应直至体系变成无色以得到生长液；
3)将种子液、生长液进行接触反应以制得金纳米棒GNRs溶液；
4)将巯基DNA与金纳米棒GNRs溶液进行孵育、后处理以得到巯基DNA修饰金纳米棒GNRs-ssDNA-2。
本发明还提供了一种巯基DNA修饰的金纳米棒，该巯基DNA修饰的金纳米棒通过上述备方法制备而得。
本发明也提供了一种重金属汞离子的检测方法，该检测方法包括：
1)将上述GNRs-ssDNA-2溶于水中形成GNRs-ssDNA-2溶液；
2)将已经浓度的检测底物溶液加入GNRs-ssDNA-2溶液中进行接触反应，接着检测荧光强度，然后以检测底物的浓度为横坐标，荧光强度差值为纵坐标绘制工作曲线或者计算出工作曲线方程；
3)将未知浓度的检测底物溶液加入溶液中进行接触反应，接着检测荧光强度，然后根据工作曲线或者工作曲线方程计算出检测底物的浓度；
其中，检测底物为二价汞离子。
本发明进一步提供了一种上的检测方法在检测水样中的应用。
通过上述技术方案，本发明首先通过种子液、生长液制备金纳米棒(GNRs)，金纳米棒有两个等离子体共振吸收峰(SPR)，横向的吸收峰(520-530nm)基本不会移动，纵向的吸收峰(600-1600nm)会随着长径的增加而改变；而且金纳米棒的尺寸可调，表面易于修饰，光热转换效率高，进而使其成为光声学和光热治疗的载体；与此同时，同球型金纳米粒子相比，金纳米棒的比表面积更大，能够更好地增强猝灭效果。
接着，将巯基DNA2(ssDNA2)修饰到金纳米棒(GNRs)的表面，即得到了GNRs-ssDNA2，然后在Hg2+离子的存在下，带有荧光染料的DNA(ssDNA1)会与GNRs-ssDNA2形成T-Hg2+-T夹心式结构，在Hg2+离子的存在下拉近了两者的距离，金纳米棒的紫外吸收光谱与能量供体的发射光谱有很大的重叠，近而会产生荧光共振能量转移(FRET)现象；进而通过荧光共振能量转移(FRET)现象实现了对Hg2+的检测。
其中，能量共振转移(FRET)是指能量供体与能量受体之间的一种能量传递现象。简单来说是当受体分子与供体分子相距一定距离、且供受体的基态及第一电子激发态两者振动能级间的能量差相互适应时，处于激发态的供体将把一部分或全部能量转移给受体，使受体被激发，在整个能量转移过程中，以非辐射跃迁的方式进行，不涉及光子的发射和重新吸收。该过程需要两个必备条件：1)供体的发射光谱与受体的吸收光谱有很大程度的重叠；2)供体和受体之间的距离较近(1-10nm)。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明的原理图；
图2是检测例1的金纳米棒的透射电镜图；
图3是检测例2的荧光强度曲线图；
图4是检测例2的荧光强度差值对重金属汞离子的工作曲线图；
图5是应用例2的检测干扰结果统计图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种巯基DNA修饰金纳米棒的制备方法，包括：
1)将十六烷基三甲基溴化铵CTAB、氯金酸混合，接着加入硼氢化钠进行接触反应直至体系变成黄褐色以得到种子液；
2)将十六烷基三甲基溴化铵CTAB、硝酸银、氯金酸混合，接着加入抗坏血酸进行接触反应直至体系变成无色以得到生长液；
3)将所述种子液、生长液进行接触反应以制得金纳米棒GNRs溶液；
4)将巯基DNA与金纳米棒GNRs溶液进行孵育、后处理以得到所述巯基DNA修饰金纳米棒GNRs-ssDNA-2。
在本发明的步骤1)中，各物料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了提高金纳米棒的产率、制备速率以及制得的巯基DNA修饰金纳米棒的性能，优选地，在步骤1)中，所述CTAB、氯金酸、硼氢化钠的摩尔比为1-2mmol：0.0025-0.0030mmol：0.006-0.007mmol。
在本发明的步骤1)中，溶液的接触反应条件可以在宽的范围内选择，但是为了提高金纳米棒的产率、制备速率以及制得的巯基DNA修饰金纳米棒的性能，优选地，所述接触反应满足以下条件：反应温度为25-30℃，反应时间为5-10min。
在本发明的步骤1)中，硼氢化钠的温度可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高金纳米棒的产率、制备速率以及制得的巯基DNA修饰金纳米棒的性能，优选地，所述硼氢化钠为0-4℃。
在本发明的步骤1)中，部分物料的提供方式可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高金纳米棒的产率、制备速率以及制得的巯基DNA修饰金纳米棒的性能，优选地，所述CTAB、氯金酸、硼氢化钠通过溶液的形式提供，且所述溶液中使用的溶剂为水。
在本发明的步骤2)中，各物料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了提高金纳米棒的产率、制备速率以及制得的巯基DNA修饰金纳米棒的性能，优选地，在步骤2)中，所述CTAB、硝酸银、氯金酸、抗坏血酸的摩尔比为1-2mmol：0.32-0.35μmol：0.005-0.006mmol：5.516-5.600μmol。
在本发明的步骤2)中，溶液的接触反应条件可以在宽的范围内选择，但是为了提高金纳米棒的产率、制备速率以及制得的巯基DNA修饰金纳米棒的性能，优选地，所述接触反应满足以下条件：反应温度为25-30℃，反应时间为5-10min。
在本发明的步骤2)中，部分物料的提供方式可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高金纳米棒的产率、制备速率以及制得的巯基DNA修饰金纳米棒的性能，优选地，所述CTAB、硝酸银、氯金酸、抗坏血酸通过溶液的形式提供，且所述溶液中使用的溶剂为水。
在本发明的步骤3)中，各物料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了提高金纳米棒的产率、制备速率以及制得的巯基DNA修饰金纳米棒的性能，优选地，在步骤3)中，所述种子液、生长液的体积比为10-15μL：5-6mL。
在本发明的步骤3)中，接触反应的条件可以在宽的范围内选择，但是为了提高金纳米棒的产率、制备速率以及制得的巯基DNA修饰金纳米棒的性能，优选地，所述接触反应满足以下条件：反应温度为25-30℃，反应时间为30-45min。
在本发明的步骤4)中，各物料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了提高金纳米棒的产率、制备速率以及制得的巯基DNA修饰金纳米棒的性能，优选地，在步骤3)中，所述巯基DNA、金纳米棒GNRs溶液的用量比为0.002-0.003μmol：10-12mL。
在本发明的步骤4)中，孵育的条件可以在宽的范围内选择，但是为了提高金纳米棒的产率、制备速率以及制得的巯基DNA修饰金纳米棒的性能，优选地，所述孵育满足以下条件：孵育温度为30-35℃，孵育时间为22-24h。
在本发明的步骤3)中，巯基DNA的具体种类可以在宽的范围内选择，但是为了提高金纳米棒的产率、制备速率以及制得的巯基DNA修饰金纳米棒的性能，优选地，所述巯基DNA中DNA序列为3′-HS-GTTCTTCCGGTCTCCTCTCTCCT。
在本发明的步骤3)中，后处理的具体步骤可以在宽的范围内选择，但是为了提高金纳米棒的产率、制备速率以及制得的巯基DNA修饰金纳米棒的性能，优选地，所述后处理为离心、洗涤。
本发明还提供了一种巯基DNA修饰的金纳米棒，该巯基DNA修饰的金纳米棒通过上述制备方法制备而得。
本发明也提供了一种重金属汞离子的检测方法，该检测方法包括：
1)将上述GNRs-ssDNA-2溶于水中形成GNRs-ssDNA-2溶液；
2)将已经浓度的检测底物溶液、Cy5-ssDNA1加入所述GNRs-ssDNA-2溶液中进行接触反应，接着检测荧光强度，然后以所述检测底物的浓度为横坐标，荧光强度差值为纵坐标绘制工作曲线或者计算出工作曲线方程；
3)将未知浓度的检测底物溶液、Cy5-ssDNA1加入所述溶液中进行接触反应，接着检测荧光强度，然后根据所述工作曲线或者工作曲线方程计算出所述检测底物的浓度；
其中，检测底物为二价汞离子。
在上述检测方法的步骤1)中，各物料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高该检测方法的选择性和灵敏度，优选地，在步骤1)中，所述GNRs-ssDNA-2、水的用量比0.5-1mg：9-10mL。
在上述检测方法的步骤2)-3)中，接触反应的条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高该检测方法的选择性和灵敏度，优选地，在步骤2)-3)中，所述接触反应满足以下条件：反应温度为20-35℃，反应时间为30-45min。
在上述检测方法的步骤2)-3)中，Cy5-ssDNA1的用量可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高该检测方法的选择性和灵敏度，优选地，Cy5-ssDNA1、GNRs-ssDNA-2溶液的用量比为4-5mmol：10-15mL。
在上述检测方法的步骤2)-3)中，Cy5-ssDNA1的具体种类可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高该检测方法的选择性和灵敏度，优选地，Cy5-ssDNA1的序列为5′-Cy5-CTTGTTGGCCTGTGGTGTGTGGA。
在上述检测方法的中，检测条件的不同对工作曲线方程会存在一定的影响，但是为了进一步提高该检测方法的选择性和灵敏度，在上述优选条件下，作曲线方程优选为ΔI＝31.86707+1.32731C，其中，ΔI＝I-I0，I0代表的Hg2+不存在时的体系的发光强度，I代表Hg2+存在时的体系的发光强度，C为所述检测底物的浓度。
本发明进一步提供了一种如上述的检测方法在检测水样中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1
1)制备种子液：将5.00mL 60℃的CTAB(0.200mol/L)溶液和5.00mLHAuCl4(5.00×10-4mol/L)溶液在不停搅拌下混合，然后快速加入0.600mL0-4℃的NaBH4(1.00×10-2mol/L)溶液，溶液由无色变成黄褐色，快速搅拌2min后存放到30℃水浴锅中，备用。其中，CTAB、HAuCl4和NaBH4溶液的溶剂均为水。
2)制备生长液：将5.00mL 60℃的CTAB(0.200mol/L)溶液80.0μL AgNO3(4.00×10-3mol/L)溶液、5.00mL HAuCl4(1.00×10-3mol/L)溶液依次混合，然后逐滴滴加70.0μL抗坏血酸溶液(7.88×10-2mol/L)并不断搅拌，溶液颜色由黄色变成无色，同样存放于30℃水浴锅中。其中，CTAB、硝酸银、氯金酸、抗坏血酸溶液的溶剂均为水。
3)0.5h后，用移液枪吸取12.0μL种子液加入5mL生长液中，混合均匀，继续在30℃水浴锅中反应45min，溶液变成深紫色，离心洗涤；即可得到GNRs溶液，于4℃冰箱中保存。
4)修饰过程：向得到的10mL GNRs溶液中加入20μL巯基DNA(巯基DNA序列为3′-HS-GTTCTTCCGG TCTCCTCTCTCCT，巯基标记物为HS，浓度为100μmol/L)，在30℃恒温孵育24h，然后离心、洗涤，得到巯基DNA修饰的金纳米棒即GNRs-ssDNA-2。
实施例2
1)制备种子液：将10mL 60℃的CTAB(0.200mol/L)溶液和6mL HAuCl4(5.00×10- 4mol/L)溶液在不停搅拌下混合，然后快速加入0.700mL 0-4℃的NaBH4(1.00×10-2mol/L)溶液，溶液由无色变成黄褐色，快速搅拌2min后存放到30℃水浴锅中，备用。其中，CTAB、HAuCl4和NaBH4溶液的溶剂均为水。
2)制备生长液：将10mL 60℃的CTAB(0.200mol/L)溶液87μL AgNO3(4.00×10- 3mol/L)溶液、6mL HAuCl4(1.00×10-3mol/L)溶液依次混合，然后逐滴滴加71μL抗坏血酸溶液(7.88×10-2mol/L)并不断搅拌，溶液颜色由黄色变成无色，同样存放于溶液30℃水浴锅中。其中，CTAB、硝酸银、氯金酸、抗坏血酸溶液的溶剂均为水。
3)0.5h后，用移液枪吸取10μL种子液加入5mL生长液中，混合均匀，继续在30℃水浴锅中反应30min，溶液变成深紫色，离心洗涤；即可得到GNRs溶液，于4℃冰箱中保存。
4)修饰过程：向得到的10mL GNRs溶液中加入20μL巯基DNA(巯基DNA中DNA序列为3′-HS-GTTCTTCCGG TCTCCTCTCTCCT，巯基标记物为HS，浓度为100μmol/L)，在35℃恒温孵育22h，然后离心、洗涤，得到巯基DNA修饰的金纳米棒即GNRs-ssDNA-2。
检测例1
通过牌号为JEOL 2010的透射电子显微镜对实施例1制得的GNRs-ssDNA-2进行形貌表征，检测结果如图2。由图2可知，金纳米棒纳米材料呈棒状。
检测例2
重金属汞离子的检测：
在检测重金属汞离子的过程中，将实施例1制得的巯基DNA修饰金纳米棒水溶液(10mL，浓度为0.1mg/mL)、4mmolCy5-ssDNA1和不同浓度汞离子溶液在25℃下搅拌下反应30min后，利用牌号F-2500型荧光分光光度计进行检测，荧光光谱见图3，并绘制工作曲线结果如图4，工作曲线方程为ΔI＝31.86707+1.32731C，(ΔI＝I-I0，I0和I分别对应代表的是Hg2+不存在和存在时体系的发光强度，C为检测底物的浓度)，荧光强度差值与汞离子浓度之间具有一定范围的线性关系。
应用例1
采用与标准加入法对处理过的实际水样进行检测：
按照检测例2的方法对实际水样中的汞离子进行检测，再向实际水样中加入已知浓度的汞离子，再次测定。其中加入表示通过标准加入法向体系中加入标准汞离子样品，发现表示在未知样品加入后，测得的荧光强度值，再根据工作曲线，得出的浓度值。具体结果见表1，其中RSD为相对标准偏差。
表1
应用例2
干扰检测(nM代表nmol/L)：
将实施例1的产物与各种干扰物质混合，依次加入50.0uL巯基核苷酸功能化的金纳米棒，加入干扰物质为(Hg2+：500nM、Ni+：500nM、Cd2+：500nM、Cr3+：500nM、Ca2+：500nM、Ba2+：500nM、Pb2+：500nM、Cu2+：500nM、Fe3+：500nM、Co2+：500nM、Zn2+：500nM、Mn2+：500nM)在25℃下震荡30min,用荧光分光光度计对其吸收强度进行检测。根据所得的荧光强度值，绘制柱状图，结果见图5，由图可知各种干扰物对体系均无影响。第一条柱状图为重金属汞离子，可以看出其抗干扰效果较强。
按照上述检测例和应用例对实施例2制得的产物进行相同的检测，检测结果实施例1的产物的检测结果基本保持一致的。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种巯基DNA修饰金纳米棒的制备方法，其特征在于，包括：
1)将十六烷基三甲基溴化铵CTAB、氯金酸混合，接着加入硼氢化钠进行接触反应直至体系变成黄褐色以得到种子液；
2)将十六烷基三甲基溴化铵CTAB、硝酸银、氯金酸混合，接着加入抗坏血酸进行接触反应直至体系变成无色以得到生长液；
3)将所述种子液、生长液进行接触反应以制得金纳米棒GNRs溶液；
4)将巯基DNA(ssDNA2)与金纳米棒GNRs溶液进行孵育、后处理以得到所述巯基DNA修饰金纳米棒GNRs-ssDNA-2。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤1)中，所述CTAB、氯金酸、硼氢化钠的摩尔比为1-2mmol：0.0025-0.0030mmol：0.006-0.007mmol；
优选地，所述接触反应满足以下条件：反应温度为25-30℃，反应时间为5-10min；
更优选地，所述硼氢化钠为0-4℃；
进一步优选地，所述CTAB、氯金酸、硼氢化钠通过溶液的形式提供，且所述溶液中使用的溶剂为水。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤2)中，所述CTAB、硝酸银、氯金酸、抗坏血酸的摩尔比为1-2mmol：0.32-0.35μmol：0.005-0.006mmol：5.516-5.600μmol；
优选地，所述接触反应满足以下条件：反应温度为25-30℃，反应时间为5-10min；
进一步优选地，所述CTAB、硝酸银、氯金酸、抗坏血酸通过溶液的形式提供，且所述溶液中使用的溶剂为水。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤3)中，所述种子液、生长液的体积比为10-15μL：5-6mL；
优选地，所述接触反应满足以下条件：反应温度为25-30℃，反应时间为30-45min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤4)中，所述巯基DNA、金纳米棒GNRs溶液的用量比为0.002-0.003μmol：10-12mL；
优选地，所述孵育满足以下条件：孵育温度为30-35℃，孵育时间为22-24h；
更优选地，所述巯基DNA序列号为3′-HS-GTTCTTCCGGTCTCC TCTCTCCT；
进一步优选地，所述后处理为离心、洗涤。
6.一种巯基DNA修饰的金纳米棒，其特征在于，所述巯基DNA修饰的金纳米棒通过权利要求1-5中任意一项制备方法制备而得。
7.一种重金属汞离子的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
1)将如权利要求6所述GNRs-ssDNA-2溶于水中形成GNRs-ssDNA-2溶液；
2)将已经浓度的检测底物溶液、Cy5-ssDNA1加入所述GNRs-ssDNA-2溶液中进行接触反应，接着检测荧光强度，然后以所述检测底物的浓度为横坐标，荧光强度差值为纵坐标绘制工作曲线或者计算出工作曲线方程；
3)将未知浓度的检测底物溶液、Cy5-ssDNA1加入所述溶液中进行接触反应，接着检测荧光强度，然后根据所述工作曲线或者工作曲线方程计算出所述检测底物的浓度；
其中，检测底物为二价汞离子。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其中，在步骤1)中，所述GNRs-ssDNA-2、水的用量比0.5-1mg：9-10mL；
优选地，在步骤2)-3)中，所述接触反应满足以下条件：反应温度为20-35℃，反应时间为30-45min；
更优选地，Cy5-ssDNA1、GNRs-ssDNA-2溶液的用量比为4-5mmol：10-15mL；
进一步优选地，所述Cy5-ssDNA1的序列号为5’-Cy5-CTTGTTGGCCTGTGGTGTGTGGA。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其中，所述工作曲线方程为ΔI＝31.86707+1.32731C，其中，ΔI＝I-I0，I0代表的Hg2+不存在时的体系的发光强度，I代表Hg2+存在时的体系的发光强度，C为所述检测底物的浓度。
10.一种如权利要求7-8中任意一项所述的检测方法在检测水样中的应用。
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