CN110586949B - 一种金纳米棒修饰方法及dna修饰的金纳米棒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种金纳米棒修饰方法，包括以下步骤：将金纳米棒和DNA悬于超纯水中，制备混合溶液；将所述混合溶液置于低温冷冻1～30min后，再在15℃～35℃条件下升温至15℃～35℃；离心，除去含游离DNA的上清液。本发明金纳米棒修饰方法的一个实施方式耗时少、无需额外添加试剂、操作方法简单；具有快速、高效、经济的优点。金纳米棒修饰不受DNA结构限制，所得产品表面DNA密度大，且可修饰DNA单链和双链，避免了现有方法存在操作繁琐、费时、需要额外添加试剂和DNA密度小的问题。

Description

一种金纳米棒修饰方法及DNA修饰的金纳米棒
技术领域
本发明属于金纳米棒修饰领域，涉及金纳米棒修饰方法以及该方法修饰得到的金纳米棒。
背景技术
金纳米棒具有形状的各向异性，有横向和纵向两个表面等离子共振(SPR)效应。可通过改变金纳米棒的长径比，在可见光区和近红外光(650～900纳米)区域精确调控纵向SPR吸收峰(LSPR)。利用近红外激光照射金纳米棒，可实现皮下深层组织的成像、光热治疗以及药物释放，在生物医学领域受到越来越多的关注。
目前，采用CTAB保护的金种子生长法制备金纳米棒具有操作简单，产量高和可重复性好的特点。然而，CTAB对细胞有毒性限制了金纳米棒在生物体内的应用。DNA修饰的金纳米棒兼具金纳米棒独特的光学性质和DNA的特异性碱基互补配对功能，将金纳米棒的应用拓宽到生物分子检测、生物传感器等领域。值得注意的是，金纳米棒表面的DNA密度与纳米材料稳定性、检测灵敏度、载药量等诸多性能密切相关。
金纳米棒与巯基修饰的DNA(DNA-SH)能形成金-巯键，从而实现金纳米棒表面结合DNA。目前文献和专利公开的金纳米棒DNA修饰方法有盐老化法、酸法和配体交换法三种，其特点分别为：
盐老化法：需要缓慢地增加溶液中盐浓度，适宜的盐浓度能够起到电荷屏蔽效果，减少DNA分子间的静电斥力，促进DNA分子在金棒表面吸附结合。但是，盐浓度的变化很难控制，需要辅以超声、涡旋、振荡等操作，以防止局部盐浓度迅速增加导致的金纳米瞬间聚沉问题。
酸法：需要添加高浓度酸，使溶液pH值为3，以保持金棒的稳定性，避免聚沉。但是在酸性条件下，DNA双链结构不稳定，会发生变性解链，因此酸法仅适用于修饰DNA单链。
配体交换法：需要用到表面活性剂和包括有毒溶剂在内的多种溶剂，例如甲苯，使金纳米棒在水相和有机相之间来回转移且保持稳定，不发生聚沉，从而有效偶联目标配体，最后再通过配体与DNA结合。
虽然上述三种方法都能够在金纳米棒表面通过金-巯键偶联DNA，但是发明人在实现本发明过程中，发现现有技术中至少存在如下问题中的一个问题：
1、金纳米棒修饰过程操作复杂、繁琐，需要试验人员具备一定的经验和技能，否则，容易导致金纳米棒修饰失败。
2、金纳米棒修饰过程耗时长，短则数小时，长则一两天，耗费试验人员大量宝贵时间。同时，在依赖于DNA修饰的金纳米棒的试验或治疗工作中，需要花大量时间来准备DNA修饰的金纳米棒，及时性差，工作效率低。
3、酸法相较于盐老化法和配体交换法更加快速、相对简便，但该法仍然需要在修饰过程中添加酸性试剂，而且仅适用于在金纳米棒表面修饰DNA单链，不适合修饰DNA双链，适用面较窄。
4、上述三种方法制备的DNA修饰金纳米棒，DNA密度较低。
发明内容
鉴于此，本发明目的在于提供一种快速、高效、经济的新方法，实现金纳米棒表面偶联高密度DNA。
发明人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种金纳米棒修饰方法，包括以下步骤：
A)将金纳米棒和DNA悬于超纯水中，制备混合溶液；
B)将所述混合溶液置于低温冷冻1～30min后，在15℃～35℃条件下升温至15℃～35℃；
C)离心，除去含游离DNA的上清液。
根据本发明金纳米棒修饰方法的一个具体实施方式，所述金纳米棒与DNA的物质的量的比为1:1000～15000。
根据本发明金纳米棒修饰方法的一个具体实施方式，所述DNA为末端修饰巯基的DNA-SH。
根据本发明金纳米棒修饰方法的一个具体实施方式，所述DNA的链长为12～40mer。
根据本发明金纳米棒修饰方法的一个具体实施方式，所述低温不高于-20℃。
根据本发明金纳米棒修饰方法的一个优选实施方式，所述低温冷冻为液氮冷冻2min
根据本发明金纳米棒修饰方法的一个优选实施方式，所述低温冷冻为干冰冷冻5min。
根据本发明金纳米棒修饰方法的一个优选实施方式，所述低温冷冻为-20℃冷冻10min。当然，温度越低，最低冷冻时长越短；温度越高，最低冷冻时长越长。
根据本发明金纳米棒修饰方法的一个具体实施方式，所述金纳米棒制备方法如下：
将3.7mL0.1摩尔/升CTAB和150μL0.01摩尔/升HAuCl4混合后加0.85mL去离子水，冰浴状态下再加入0.3mL0.01摩尔/升冰NaBH4水溶液，1200rpm快速搅拌2min，静置2～5h将立即生成得到CTAB包覆的金种子；
将已制备的金种子1.4mL加入到金纳米棒生长液中，450rpm快速搅拌2min，静置12h后12000g离心10分钟，用0.01摩尔/升CTAB溶液重悬金纳米棒，取上述金纳米棒溶液离心，除去大部分CTAB溶液，得到金纳米棒。
根据本发明金纳米棒修饰方法的一个优选实施方式，所述生长液由300mL0.1摩尔/升CTAB，16mL0.01摩尔/升HAuCl4，3mL0.01摩尔/升AgNO3，6mL0.5摩尔/升H2SO4，2.4mL0.1摩尔/升抗坏血酸组成。
根据本发明金纳米棒修饰方法的一个替代实施方式，所述DNA替换为PEI。即使用PEI修饰金纳米棒。
本发明还提供了一种利用前述任一方法获得的DNA修饰的金纳米棒，所述金纳米棒表面DNA分子数不低于200个。
与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：
a)本发明金纳米棒修饰方法的一个实施方式耗时少、无需额外添加试剂、操作方法简单；具有快速、高效、经济的优点。
b)本发明金纳米棒修饰方法的一个实施方式中，金纳米棒修饰不受DNA结构限制，可以修饰DNA单链，也可以修饰DNA双链，所得产品表面DNA密度大。
c)本发明金纳米棒修饰方法的一个实施方式中，在CTAB存在下，通过制备金种子和种子生长两个步骤合成CTAB覆盖的金纳米棒，金纳米棒的长径比可通过生长液各组分的摩尔浓度和pH值进行调整。
附图说明
图1是本发明金纳米棒修饰方法一较佳实施例中金纳米棒透射电镜图。
图2是本发明金纳米棒修饰方法一较佳实施例中DNA修饰金纳米棒透射电镜图。
图3是本发明金纳米棒修饰方法一较佳实施例中金纳米棒可见光-近红外光吸收谱图。
图4是本发明金纳米棒修饰方法一较佳实施例中DNA修饰金纳米棒可见光-近红外光吸收谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进行说明。
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。
实施例1
将3.7mL0.1摩尔/升CTAB和150μL0.01摩尔/升HAuCl4混合后加0.85mL去离子水，冰浴状态下再加入0.3mL0.01摩尔/升冰NaBH4水溶液，1200rpm快速搅拌2min，静置2h将立即生成得到CTAB包覆的金种子。
金纳米棒的生长液由300mL0.1摩尔/升CTAB，16mL0.01摩尔/升HAuCl4，3mL0.01摩尔/升AgNO3，6mL0.5摩尔/升H2SO4，2.4mL0.1摩尔/升抗坏血酸构成。
将已制备的金种子1.4mL加入到金纳米棒生长液中，450rpm快速搅拌2min，静置12h后12000g离心10分钟，用0.01摩尔/升的CTAB溶液重悬金纳米棒，备用。
取少量样品滴加到铜网上，自然风干后用透射电子显微镜观察金纳米棒形貌，结果见图1，测量金纳米棒的长径为42nm，短径为14nm，计算得到长径比为3:1。
取少量修饰了DNA的金纳米棒样品滴加到铜网上，自然风干后用透射电子显微镜观察金纳米棒形貌，结果见图2，可知由于DNA的保护，金纳米棒相对图1具有更随机的分散性。
另取少了样品用紫外-可见分光光度计检测金纳米棒在400～1000nm波长范围内的吸收光谱。结果如图3所示，金纳米棒的横向SPR为515nm，纵向SPR为834nm。
取上述金纳米棒溶液离心，除去CTAB溶液后，用含DNA-SH(5’-SH(CH)6TTTTTTTTTGCAACAACGTAC-FAM的水溶液重悬金纳米棒。DNA-SH与金纳米棒的摩尔比为5000:1。将所得的金纳米棒和DNA混合溶液于-20℃冷冻10分钟，在20℃条件下自然升温至环境温度。离心除去含游离DNA-SH的上清液，离心管底部的棕色沉淀即为表面修饰有高密度DNA的金纳米棒。
用含0.01％十二烷基硫酸钠的PBS溶液重悬沉淀，得到棕红色溶液，采用紫外可见分光光度仪检测金纳米棒在400～1000nm波长范围内的吸收光谱。结果如图4所示，DNA修饰金纳米棒的横向SPR为516nm，纵向SPR为806nm。与金纳米棒相比，横向SPR没有发生变化，DNA修饰后纵向SPR峰蓝移了28nm。
采用DTT方法检测金纳米棒表面DNA密度，检测一个金纳米棒表面DNA数量为236个。
实施例2
将3.7mL0.1摩尔/升CTAB和150μL0.01摩尔/升HAuCl4混合后加0.85mL去离子水，再加入0.3mL0.01摩尔/升冰NaBH4水溶液，1000rpm快速搅拌2min，2.5h将立即生成得到CTAB包覆的金种子。
金纳米棒的生长液由300mL0.1摩尔/升CTAB，16mL0.01摩尔/升HAuCl4，3mL0.01摩尔/升AgNO3，6mL0.5摩尔/升H2SO4，2.4mL0.1摩尔/升抗坏血酸构成。
将已制备的金种子1.4mL加入到金纳米棒生长液中，450rpm快速搅拌2min，静置15h后12000g离心10分钟，用0.01摩尔/升的CTAB溶液重悬金纳米棒，备用。
取上述金纳米棒溶液离心，除去CTAB溶液后，用含DNA-SH(5’-SH(CH)6AAAAAAAAAGCAACAACGTAC–FAM)的水溶液重悬金纳米棒。DNA-SH与金纳米棒的摩尔比为10000：1。将所得的金纳米棒和DNA混合溶液于液氮中冷冻2分钟，然后在30℃条件下自然升温至环境温度。离心除去含游离DNA-SH的上清液，离心管底部的棕色沉淀即为表面修饰有高密度DNA的金纳米棒。
用含0.01％十二烷基硫酸钠的PBS溶液重悬沉淀，得到棕红色DNA修饰金纳米棒溶液。采用实施例1所述DTT方法，检测一个金纳米棒表面DNA数量为251个。
实施例3
将3.7mL0.1摩尔/升CTAB和0.01摩尔/升150μLHAuCl4混合后加0.85mL去离子水，再加入0.3mL0.01摩尔/升冰NaBH4水溶液，1000rpm快速搅拌2min，2h将立即生成得到CTAB包覆的金种子。
金纳米棒的生长液由300mL0.1摩尔/升CTAB，16mL0.01摩尔/升HAuCl4，3mL0.01摩尔/升AgNO3，6mL0.5摩尔/升H2SO4，2.4mL0.1摩尔/升抗坏血酸构成。将已制备的金种子1.4mL加入到金纳米棒生长液中，450rpm快速搅拌2min，静置12h后12000g离心10分钟，用0.01摩尔/升的CTAB溶液重悬金纳米棒，备用。
取上述金纳米棒溶液离心，除去CTAB溶液后，用含DNA-SH(5’-SH(CH)6TTTTTTTTTGCAACAACGTAC–FAM)的水溶液重悬金纳米棒。DNA-SH与金纳米棒的摩尔比为15000:1。将所得的金纳米棒和DNA混合溶液于干冰中冷冻5分钟，然后在35℃条件下自然升温至环境温度。离心除去含游离DNA-SH的上清液，离心管底部的棕色沉淀即为表面修饰有高密度DNA的金纳米棒。
用含0.01％十二烷基硫酸钠的PBS溶液重悬沉淀，得到棕红色DNA修饰金纳米棒溶液。采用实施例1所述DTT方法，检测金纳米棒表面DNA数量为202个。
实施例4
金纳米棒CTAB溶液制备方法同实施例1。取金纳米棒CTAB溶液离心，除去CTAB溶液后，用含DNA-SH(5’-SH(CH)6TTTTTTTTTGCAACAACGTAC)和互补DNA(CCGTGTCTGGGGCCGACCGGCGCATTGGGTACGTTGTTGC-FAM-3’)的水溶液重悬金纳米棒。DNA-SH、互补DNA与金纳米棒的摩尔比为1000：1000：1。将所得的金纳米棒和DNA混合溶液于液氮中冷冻2分钟，然后在室温条件下自然升温至环境温度。离心除去含游离DNA-SH的上清液，离心管底部的棕色沉淀即为表面修饰有高密度DNA的金纳米棒。用含0.01％十二烷基硫酸钠的PBS溶液重悬沉淀，得到棕红色DNA修饰金纳米棒溶液。采用实施例1所述DTT方法，检测金纳米棒表面DNA数量为233个。
实施例5
将DNA-SH(5’-SH(CH)6TTTTTTTTTGCAACAACGTAC)与互补DNA(CCGTGTCTGGGGCCGACCGGCGCATTGGGTACGTTGTTGC-FAM-3’)混合，通过退火，形成双链DNA(dsDNA-SH)。
取实施例1所制备金纳米棒溶液离心，除去CTAB溶液后，用上述退火后的dsDNA-SH重悬金纳米棒。dsDNA-SH与金纳米棒的摩尔比为1000：1。将所得的金纳米棒和DNA混合溶液于干冰中冷冻5分钟，然后迅速恢复室温。离心除去含游离DNA-SH的上清液，离心管底部的棕色沉淀即为表面修饰有高密度DNA的金纳米棒。用含0.01％十二烷基硫酸钠的PBS溶液重悬沉淀，得到棕红色DNA修饰金纳米棒溶液。采用实施例1所述DTT方法，检测金纳米棒表面DNA数量为235个。
对比实施例
为进一步说明本发明与现有技术相比，具有突出的实质性特点和显著的进步，以下特别将本发明金纳米棒修饰方法与盐老化法修饰金纳米棒、酸法修饰金纳米棒进行对比。
本对比例中三种方法所用金纳米棒与实施例1中金纳米棒获得方法相同，金纳米棒尺寸为42X14nm；单链SH-DNA为5’-SH(CH)6TTTTTTTTTGCAACAACGTAC，双链互补DNA为CCGTGTCTGGGGCCGACCGGCGCATTGGGTACGTTGTTGC-FAM-3’。
盐老化法修饰
取用0.01摩尔/升CTAB溶液重悬的金纳米棒，以12000g的转速离心10min后，去掉上清液后用去离子水重悬沉淀，并迅速加入以0.1M DTT活化并过柱纯化的SH-DNA，DNA与金纳米棒的摩尔比为10000:1，经巯基化DNA与纳米金颗粒表面反应3h后，纳米金溶液中加入SDS达到0.01％终浓度，以及加入磷酸钠达到0.01M终浓度，并静置1h。每隔30min加入NaCl到纳米金溶液中，使得NaCl的终浓度依次为0.05M，0.1M，0.2M，0.3M，0.4M，0.5M。然后纳米金溶液在摇床中过夜，使得DNA负载量达到最大。为了去除溶液中未反应的SH-DNA，需将溶液进行离心并去除上清液，获得的沉淀在0.01％SDS的PBS溶液中重悬三次，即为较纯净的修饰了DNA的金纳米棒。
酸法修饰
取用0.01摩尔/升CTAB溶液重的悬金纳米棒，以12000g的转速离心10min后，去掉上清液后以去离子水重悬，再次以12000g的转速离心10min去掉上清液，加入含1XTBE、500mMNaCl和0.1％SDS的pH＝3的缓冲液，SH-DNA的浓度为3.125μM。5min后即反应完成，将溶液进行离心并去除上清液，获得的沉淀在0.01％SDS的PBS溶液中重悬三次，即为较纯净的修饰了DNA的金纳米棒。
本发明方法
金纳米棒CTAB溶液制备方法同实施例1。取金纳米棒CTAB溶液离心，除去CTAB溶液后，用含DNA-SH的水溶液重悬金纳米棒。DNA-SH与金纳米棒的摩尔比为5000:1。将所得的金纳米棒和DNA混合溶液于液氮中冷冻2分钟，然后在室温条件下自然升温至环境温度。离心除去含游离DNA-SH的上清液，离心管底部的棕色沉淀即为表面修饰有高密度DNA的金纳米棒。用含0.01％十二烷基硫酸钠的PBS溶液重悬沉淀，得到棕红色DNA修饰金纳米棒溶液。
采用DTT法检测上述三种方法制备的DNA修饰金纳米棒，结果如表1所示。
表1：三种方法制备DNA修饰金纳米棒每棒表面DNA个数
单链 预杂交双链
盐老化法 160±10 110±8
pH＝3酸法 203±8 不适用
本发明方法 235±12 218±16
独立样本t检验表明，与现有技术中的酸法和盐老化法相比，本发明方法中金纳米棒表面的DNA密度均显著大于前两者(p<0.01)。本发明金纳米棒修饰方法耗时少、无需额外添加试剂、操作方法简单，与传统方法相比，具有快速、高效、经济的优点。金纳米棒修饰受DNA结构限制小，所得产品表面DNA密度大。
在CTAB存在下，通过制备金种子和种子生长两个步骤合成CTAB覆盖的金纳米棒，金纳米棒的长径比可通过生长液各组分的摩尔浓度和pH值进行调整。
除了本发明实施例中所描述的金纳米棒制备方法，还可以使用晶种生长法、模板法、电化学法和光化学法等不同方法制备出分散性好颗粒均匀的金纳米棒作为修饰对象，将金纳米棒和DNA悬于超纯水中，制备混合溶液；将所述混合溶液置于-20℃及以下温度的低温中冷冻1～30min后，在15℃～35℃条件下升温至15℃～35℃；离心，除去含游离DNA的上清液，得到修饰有DNA的金纳米棒。
本发明方法还可以用PEI替换DNA对金纳米棒进行修饰，发明人通过试验验证了使用PEI修饰的金纳米棒分散良好，无团聚现象。
实施例6
金纳米棒CTAB溶液制备方法同实施例1。取金纳米棒CTAB溶液离心，除去CTAB溶液后，用含PEI的水溶液重悬金纳米棒。PEI与金纳米棒的摩尔比为10000:1。将所得的金纳米棒和PEI混合溶液于干冰冷冻7分钟，然后在室温条件下自然升温至环境温度。离心除去上清液，离心管底部的沉淀即为表面修饰有高密度PEI的金纳米棒。
本发明的具体实施方式中，所有参数都是使用的点值，应当理解的是，凡是在本发明所有所列范围内的任一点值，均能够实现本发明的目的，并且能够通过试验进行验证。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种金纳米棒修饰方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)将金纳米棒和DNA悬于超纯水中，制备混合溶液；
B)将所述混合溶液置于低温冷冻1～30min后，在15℃～35℃条件下升温至15℃～35℃；
C)离心，除去含游离DNA的上清液，离心管底部的棕色沉淀即为表面修饰有高密度DNA的金纳米棒；
所述金纳米棒与DNA的物质的量的比为1:1000～15000；
所述DNA为末端修饰巯基的DNA-SH；
所述金纳米棒制备方法如下：
将3.7mL0.1摩尔/升CTAB和150μL0.01摩尔/升HAuCl4混合后加0.85mL去离子水，冰浴状态下再加入0.3mL0.01摩尔/升冰NaBH4水溶液，1200rpm快速搅拌2min，静置2～5h将立即生成得到CTAB包覆的金种子；
将已制备的金种子1.4mL加入到金纳米棒生长液中，450rpm快速搅拌2min，静置12h后12000g离心10分钟，用0.01摩尔/升CTAB溶液重悬金纳米棒，取上述金纳米棒溶液离心，除去大部分CTAB溶液，得到金纳米棒；
所述生长液由300mL0.1摩尔/升CTAB，16mL0.01摩尔/升HAuCl4，3mL0.01摩尔/升AgNO3，6mL0.5摩尔/升H2SO4，2.4mL0.1摩尔/升抗坏血酸组成。
2.根据权利要求1所述的金纳米棒修饰方法，其特征在于，所述DNA的链长为12～40mer。
3.根据权利要求1所述的金纳米棒修饰方法，其特征在于，所述低温不高于-20℃。
4.根据权利要求3所述的金纳米棒修饰方法，其特征在于，所述低温冷冻为液氮冷冻2min，或干冰冷冻5min，或-20℃冷冻10min。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的金纳米棒修饰方法，其特征在于，所述表面修饰有高密度DNA的金纳米棒中每个金纳米棒表面DNA分子数为202～251个。
6.一种金纳米棒修饰方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)将金纳米棒和PEI悬于超纯水中，制备混合溶液；
B)将所述混合溶液置于低温冷冻1～30min后，在15℃～35℃条件下升温至15℃～35℃；
C)离心除去上清液，离心管底部的沉淀即为表面修饰有高密度PEI的金纳米棒；
所述金纳米棒与PEI的物质的量的比为1:10000；
所述金纳米棒制备方法如下：
将3.7mL0.1摩尔/升CTAB和150μL0.01摩尔/升HAuCl4混合后加0.85mL去离子水，冰浴状态下再加入0.3mL0.01摩尔/升冰NaBH4水溶液，1200rpm快速搅拌2min，静置2～5h将立即生成得到CTAB包覆的金种子；
将已制备的金种子1.4mL加入到金纳米棒生长液中，450rpm快速搅拌2min，静置12h后12000g离心10分钟，用0.01摩尔/升CTAB溶液重悬金纳米棒，取上述金纳米棒溶液离心，除去大部分CTAB溶液，得到金纳米棒；
所述生长液由300mL0.1摩尔/升CTAB，16mL0.01摩尔/升HAuCl4，3mL0.01摩尔/升AgNO3，6mL0.5摩尔/升H2SO4，2.4mL0.1摩尔/升抗坏血酸组成。
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