CN112548112A - 金纳米棒颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

金纳米棒颗粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

金纳米棒颗粒及其制备方法和应用，属于生物医学领域，本发明的金纳米棒颗粒的制备方法包括：将十六烷基三甲基溴化铵溶液与四氯金酸溶液混合均匀，加入硼氢化钠溶液形成棕黄色溶液即种子液；将十六烷基三甲基溴化铵溶液添加到硝酸银溶液中，加入四氯金酸溶液混合均匀后，加入到抗坏血酸溶液中形成生长液，溶液变为无色；向生长液中加入种子液，形成金纳米棒颗粒。本发明通过种子生长法制备金纳米棒颗粒，制备过程简单、方便，所制备的金纳米棒颗粒呈现出棒状结构，大小均一、分散性好的特性，长径比为：①2.2±0.2；②5.0±0.2。将anti‑EGFR修饰的金纳米棒颗粒与卵巢癌细胞基因耦联，实现对卵巢癌细胞的观察和信号探测。

Description

金纳米棒颗粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种金纳米棒颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
金纳米棒(gold nanorods，GNRs)是一种棒状纳米材料，一般指长径比介于2至25之间的一类纳米颗粒，近年来被广泛应用于生物医学领域，并且因其具有独特的光学性质而被广泛的用作于光学生物医学成像领域中的造影剂及肿瘤光热治疗。金的纳米材料是少数几种表面等离激元振动吸收(SPR)位于可见光波长范围的金属材料。金纳米棒在长轴和直径方向各自有独立的电子振动，沿半径的振动通常可与520nm的光发生共振，而沿长轴方向的共振则变化较大，随着长径比改变，可以从可见光区变化到近红外光区，一些生物样品(如蛋白、细胞以及DNA分子等)的自身荧光及光吸收对于经常使用的荧光标记存在干扰，而生物样品在近红外区(远离可见光区)的吸收很微弱，因此生物样品对金纳米材料在近红外区附近的纵向SPR共振峰(LSPR)影响可以忽略不计。而且有机染料的化学性质通常不稳定，易于光漂白，而金纳米材料性质稳定，可见光不容易穿透生物组织，利用近红外激光可以实现深层生物组织的成像，金纳米棒颗粒的荧光成像具有高强度、检测灵敏度高、生物标记率高等优点，并有可能用于手术中实时成像。
发明内容
本发明的目的是提供一种金纳米棒颗粒及其制备方法和应用。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的金纳米棒颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、配制种子液：将十六烷基三甲基溴化铵溶液与四氯金酸溶液混合均匀，加入硼氢化钠溶液形成棕黄色溶液即种子液；
步骤二、配制生长液：将十六烷基三甲基溴化铵溶液添加到硝酸银溶液中，加入四氯金酸溶液混合均匀后，加入到抗坏血酸溶液中形成生长液，溶液变为无色；
步骤三、金纳米棒的生长：向生长液中加入种子液，形成金纳米棒颗粒。
作为优选的实施方式，步骤一中，所述十六烷基三甲基溴化铵溶液的浓度为0.20M、体积为5ml；所述四氯金酸溶液的浓度为0.0005M、体积为5ml；所述硼氢化钠溶液的浓度为0.01M、体积为0.6ml。
作为优选的实施方式，所述十六烷基三甲基溴化铵溶液的浓度为0.20M、体积为5ml；所述硝酸银溶液的浓度为0.004M、体积为0.1ml；所述四氯金酸溶液的浓度为0.0788M、体积为70μL。
作为优选的实施方式，向温度为27～30℃的生长液中加入12μL种子液。
作为优选的实施方式，向温度为28.5℃的生长液中加入12μL种子液。
本发明还提供一种上述的制备方法所制备的金纳米棒颗粒。
本发明还提供一种上述的金纳米棒颗粒在卵巢癌细胞观察体系中的应用，该体系包括：金纳米棒颗粒、anti-EGFR、卵巢癌细胞。
作为优选的实施方式，卵巢癌细胞观察体系的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、金纳米棒颗粒表面蛋白抗体修饰
将表面修饰的金纳米棒颗粒加入200μL、182.5μmol/dm3的anti-EGFR抗体中，4℃超声48min，使anti-EGFR抗体与金纳米棒进行共价偶联；
步骤二、体系建立
将步骤一中的金纳米棒颗粒加入到卵巢癌细胞中，经anti-EGFR修饰后的金纳米棒颗粒与卵巢癌细胞表面发生特异性吸附，形成金纳米棒颗粒-anti-EGFR-卵巢癌细胞观察体系。
作为优选的实施方式，还包括采用11-巯基十一烷酸和/或11-巯基十一烷醇配体对金纳米棒进行表面修饰：先将11-巯基十一烷酸溶于20％的氢氧化钠溶液，向金纳米棒溶液中加入11-巯基十一烷酸和11-巯基十一烷醇中的一种或两种，常温反应24h，然后以6000r/min离心20min，移去上清液，再用高纯水超声分散，得到表面修饰的金纳米棒颗粒。
本发明的有益效果是：
本发明通过种子生长法制备了金纳米棒颗粒，制备过程简单、方便，并通过吸收光谱和共聚焦显微镜对其进行表征，研究其物化特性，以备后续研究用；然后利用anti-EGFR修饰金纳米棒颗粒，增强生物兼容性，最后，将anti-EGFR修饰的金纳米棒颗粒与卵巢癌细胞基因耦联，金纳米棒颗粒与卵巢癌细胞表面发生特异性吸附，形成金纳米棒颗粒-anti-EGFR-卵巢癌细胞观察体系，并进行相关表征，最后实现光声信号探测。
本发明在不影响金纳米棒颗粒光学特性的前提下，实现对卵巢癌细胞的观察，同时可以使药物顺利进行病变探测，恰当的控制金纳米棒颗粒与卵巢癌细胞的浓度配比，顺利实现信号探测。
附图说明
图1是本发明的金纳米棒颗粒的制备方法的流程图；
图2是金纳米棒颗粒的透射电镜图；
图3是金纳米棒颗粒的吸光度曲线；
图4是金纳米棒与anti-EGFR共价偶联示意图；
图5是不加入任何纳米粒子的卵巢癌细胞图像；
图6是加入未经过anti-EGFR修饰的金纳米棒的卵巢癌细胞图像；
图7是加入连接了anti-EGFR的金纳米棒的卵巢癌细胞图像。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
金纳米棒颗粒的制备流程如图1所示，具体包括以下步骤：
(1)配制种子液
将浓度为0.0005M、体积为5ml的十六烷基三甲基溴化铵溶液与浓度为0.0005M、体积为5ml的四氯金酸溶液混合均匀，在搅拌状态下加入冰凉的浓度为0.01M、体积为0.6ml的硼氢化钠溶液形成棕黄色溶液即种子液；对种子液进行强力搅拌，持续搅拌2分钟，溶液搅拌后保存在25℃中。
(2)配制生长液
将浓度为0.20M、体积为5ml的十六烷基三甲基溴化铵溶液添加到浓度为0.004M、体积为0.1ml的硝酸银溶液中，温和混合后，加入浓度为0.0788M、体积为70μL的四氯金酸溶液混合均匀后，加入到抗坏血酸溶液中形成生长液，抗坏血酸作为一种温和的还原剂，使生长液由深黄色变为无色。
(3)金纳米棒的生长
向温度为28.5℃的生长液中加入12μL种子液，溶液的颜色在10～20分钟内逐渐改变，最终生长成一定长径比的金纳米棒颗粒。
实施例2
(1)采用11-巯基十一烷酸和/或11-巯基十一烷醇配体对金纳米棒进行表面修饰：先将11-巯基十一烷酸溶于20％的氢氧化钠溶液，向金纳米棒溶液中加入11-巯基十一烷酸和11-巯基十一烷醇中的一种或两种，常温反应24h，然后以6000r/min离心20min，移去上清液，再用高纯水超声分散，得到表面修饰的金纳米棒颗粒。优选地，11-巯基十一烷酸与11-巯基十一烷醇的用量比为1∶1。
(2)金纳米棒颗粒表面蛋白抗体修饰
表面修饰的金纳米棒颗粒加入200μL、182.5μmol/dm3的anti-EGFR中，4℃超声48min。
(3)体系建立
将修饰后的金纳米棒颗粒加入到卵巢癌细胞中，经anti-EGFR修饰后的金纳米棒颗粒与卵巢癌细胞表面发生特异性吸附，形成金纳米棒颗粒-anti-EGFR-卵巢癌细胞观察体系。
试验例1
对金纳米棒颗粒进行TEM电镜扫描。
取实施例1的金纳米棒颗粒样品，用离心机将样品以10000r/min的速度，离心15分钟，去除上清液，再分散于二次水中，继续以上条件下离心样品，通过重复离心除去多余的表面活性剂。用移液枪将浓缩的金纳米棒溶液滴加到铜网表面，室温下自然干燥。放入样品盒，进行TEM电镜扫描。
如图2所示，通过种子生长法制备的不同长径比的金纳米棒颗粒，透射电镜图可以看出金纳米棒颗粒呈现出棒状结构，大小均一、分散性好的特性，对所拍得的图片进行分析，取多点统计，可计算金纳米棒的长径比分布。其长径比分别为：长径比分别为2.20、2.71和3.43。结果见表1所示。
表1.金纳米棒颗粒的形貌和最大吸收峰
Figure BDA0002791597730000061
金纳米棒具有特征吸收谱，其表面等离子共振峰(SPR)不同于球形颗粒，紫外可见光谱上表现为横向和纵向SPR峰，分别对应着为光沿着短轴和长轴的吸收和散射，其横向SPR峰位置基本上不随金纳米棒颗粒的尺寸变化而改变，而纵向SPR峰的位置与金纳米棒颗粒的长径比紧密相关，会随着长径比的增加而红移，如图3所示，金纳米棒颗粒在波长800nm时其吸光度值最大。
试验例2
利用胶体粒度Zeta电位测定仪(Nano ZS90德国马尔文)测定实施例1金纳米棒颗粒的表面电位，结果见表2，发现所制备的金纳米棒表面带有正电荷，其来源于金纳米棒颗粒表面吸附的大量CTAB分子，而且随着长径比从2.20增加到3.43，zeta电位也从+13.8mV增加到+28.32。
表2.各长径比金纳米棒的表面Zeta电位
Figure BDA0002791597730000071
本实验合成的较大长径比的金纳米棒颗粒，可减少或延迟细胞的摄取，故在肿瘤组织中渗透和滞留能力更强，为下一步卵巢癌的成像提供了材料基础。另外，随之长径比的增大，其纵向SPR峰位置接近于近红外区。根据近红外比可见光对生物组织的穿透性能更好的特点，更利于深层组织生物检测或诊疗一体化。
试验例3
先将11-巯基十一烷酸溶于20％的氢氧化钠溶液，向装有金纳米棒颗粒的试剂瓶中缓慢加入11-巯基十一烷酸和11-巯基十一烷醇中的一种或两种，常温反应24h，以6000r/min离心20min，移去上清液，然后用高纯水水超声分散，得到表面修饰的金纳米棒溶液。
经11-巯基十一烷酸和/或11-巯基十一烷醇表面修饰后，金纳米棒颗粒的表面性质会发生显著改变，由原来的电正性变为电负性，而且会随着11-巯基十一烷酸含量的提高，电负性增加。结果见表3所示。
表3金纳米棒的表面等电位
Figure BDA0002791597730000081
经表面修饰后，仅有微小的峰位移动，这与金纳米棒颗粒表面配体有关，金纳米棒颗粒的整体峰型未发生明显改变，说明金纳米棒颗粒的形貌没有改变，光学性质也未受到影响。修饰后的金纳米棒颗粒具有良好生物相容性，抗盐沉性质明显增强。
试验例4
金纳米棒与anti-EGFR的偶联采用EDC、NHS缩合方法，操作流程见图4。
试验例5
(1)卵巢癌SKOV3细胞的培养
1)复苏细胞：培养基37℃水浴预热，从液氮中取出细胞，迅速放入37℃水浴中解冻；在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，离心5min，转速1000rpm；弃去上清液，加入5ml培养基重悬细胞后转入培养瓶中，轻轻摇晃均匀；置于37℃，5％CO2的培养箱中培养；待细胞贴壁至80％左右换液
2)细胞换液：将培养皿置于显微镜下，观察SKOV3细胞贴壁且细胞之间形成集簇，培养液颜色变浅甚至泛黄。将培养皿至于超净台内。用移液枪将SKOV3细胞的旧培养液弃掉。用移液枪吸取事先配置好的DMEM培养液移至培养皿内，小心摇晃均匀后放置于细胞培养箱内。
3)细胞传代：自CO2培养箱取出培养瓶。放于倒置显微镜下，观察SKOV3细胞贴壁至80％左右，在超净工作台中，以吸管轻轻吹打有细胞的瓶壁，去除生长不好的细胞。弃去培养液。加0.04％EDTA数滴，浸过细胞。置于37℃的培养箱10min左右后取出，倒置于显微镜下观察，发现细胞变圆回缩，但又未自瓶壁脱落。在超净工作台中弃去EDTA，并加入含10％新生牛血清的DMEM培养基。将培养瓶内的细胞悬液按1∶2-1∶3比例传至新的培养皿中，得到卵巢癌SKOV3细胞株。
(2)金纳米棒颗粒与卵巢癌细胞之间的相互作用
首先将卵巢癌细胞分别于三个培养皿中进行传代，待细胞完全贴壁之后，一组加入20μL经过anti-EGFR修饰的金纳米棒颗粒溶液另一组加入20μL未经anti-EGFR修饰的金纳米棒颗粒溶液，然后继续孵育40h，40h后取出，吸弃培养基，用pH7.2的PBS缓冲溶液冲洗，然后在体视显微镜下观察并拍照。结果见图5、图6、图7。
图5是不加入任何纳米粒子的卵巢癌细胞图像，图像非常模糊，很难分辨。
图6是加入了20μL未经过anti-EGFR修饰的金纳米棒的卵巢癌细胞图像，可以看出由于金纳米棒的引入，光信号有所增强，但属于非特异性随机结合。
图7是加入了20μL连接了anti-EGFR的金纳米棒的卵巢癌细胞图像。
当表面修饰了anti-EGFR的金纳米棒加入到SKOV3细胞后，SKOV3细胞在显微镜下的光强显著增大。表皮生长因子受体存在于很多肿瘤细胞表面，因此卵巢癌细胞可以特异性的吸附连接了anti-EGFR的金纳米棒，而在显微镜下SKOV3细胞的细胞核附近发光说明金纳米棒已经连接上anti-EGFR并且进入到卵巢癌细胞内。在体视显微镜下可以看到与金纳米棒结合后的细胞图像，验证基于光学原理构建的金纳米棒颗粒可早期诊断病灶直径在0.5cm以下的卵巢癌病灶。
本发明通过在实现不同长径比金纳米棒可控制备的基础上，表面用11-巯基十一烷酸和11-巯基十一烷醇混合配体修饰降低毒性，提高生物相容性，并为后续共价偶联提供官能团。在体视显微镜下可以看到与金纳米棒结合前后的SKOV3细胞图像，根据图像可以判断经过修饰并且连接了anti-EGFR的金纳米棒可以进入卵巢癌细胞体内并聚集在细胞核附近。这为研究金纳米棒对卵巢癌细胞的早期诊断上提供了良好的研究背景，对于金纳米棒的医学应用起着重要的作用。
本发明公开了一种金纳米棒颗粒及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

Claims (6)

1.金纳米棒颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、配制种子液：将十六烷基三甲基溴化铵溶液与四氯金酸溶液混合均匀，加入硼氢化钠溶液形成棕黄色溶液即种子液；
步骤二、配制生长液：将十六烷基三甲基溴化铵溶液添加到硝酸银溶液中，加入四氯金酸溶液混合均匀后，加入到抗坏血酸溶液中形成生长液，溶液变为无色。
步骤三、金纳米棒的生长：向生长液中加入种子液，形成金纳米棒颗粒；步骤一中，所述十六烷基三甲基溴化铵溶液的浓度为0.20M、体积为5ml；所述四氯金酸溶液的浓度为0.0005M、体积为5ml；所述硼氢化钠溶液的浓度为0.01M、体积为0.6ml；
步骤二中，所述十六烷基三甲基溴化铵溶液的浓度为0.20M、体积为5ml；所述硝酸银溶液的浓度为0.004M、体积为0.1ml；所述四氯金酸溶液的浓度为0.0788M、体积为70μL；
步骤三中，向温度为27～30℃的生长液中加入12μL种子液。
2.根据权利要求1所述的金纳米棒颗粒的制备方法，其特征在于，步骤三中，向温度为28.5℃的生长液中加入12μL种子液。
3.一种根据权利要求1至2中任意一项所述的制备方法所制备的金纳米棒颗粒。
4.一种根据权利要求3所述的金纳米棒颗粒在卵巢癌细胞观察体系中的应用，其特征在于，该体系包括：金纳米棒颗粒、anti-EGFR、卵巢癌细胞。
5.根据权利要求4所述的金纳米棒颗粒在卵巢癌细胞观察体系中的应用其特征在于，卵巢癌细胞观察体系的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、金纳米棒颗粒表面蛋白抗体修饰
将表面修饰的金纳米棒颗粒加入200μL、182.5μmol/dm3的anti-EGFR抗体中，4℃超声48min，使anti-EGFR抗体与金纳米棒进行共价偶联；
步骤二、体系建立
将步骤一中的金纳米棒颗粒加入到卵巢癌细胞中，经anti-EGFR修饰后的金纳米棒颗粒与卵巢癌细胞表面发生特异性吸附，形成金纳米棒颗粒-anti-EGFR-卵巢癌细胞观察体系。
6.如权利要求5所述的卵巢癌细胞观察体系的制备方法，其特征在于，还包括采用11-巯基十一烷酸和/或11-巯基十一烷醇配体对金纳米棒进行表面修饰：先将11-巯基十一烷酸溶于20％的氢氧化钠溶液，向金纳米棒溶液中加入11-巯基十一烷酸和11-巯基十一烷醇中的一种或两种，常温反应24h，然后以6000r/min离心20min，移去上清液，再用高纯水超声分散，得到表面修饰的金纳米棒颗粒。
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