CN108489976A - 一种金纳米棒金纳米簇复合物快速检测试剂盒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金纳米棒金纳米簇复合物快速检测试剂盒的制备方法。将准备好的金纳米棒溶液与11‑巯基十一烷酸作用;再离心分散后加入1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺活化;将活化好的金纳米棒溶液与谷胱甘肽还原法制备的金纳米簇溶液作用,再离心分散;将上一步所得金纳米棒金纳米簇复合纳米材料与前列腺癌DNA适配体相连接;在溶液中分别加入不同浓度的前列腺癌特异性抗原反应;并均加入显色剂和双氧水显色,将溶液体系环境调节至酸性,置于氙灯光照条件下反应,PSA浓度的不同,显色剂呈现的颜色也不一样,根据显色剂在波长650nm处的吸光度值与PSA浓度的关系,能计算得到待测样品中PSA的含量。
Description
技术领域
本发明属于化学生物传感以及生物检测技术领域,具体涉及一种基于局域表面等离子体共振的金纳米棒金纳米簇复合纳米材料快速检测试剂盒的制备方法及其应用。
背景技术
前列腺癌特异性抗原(PSA),正常人体水平是0.5-2ng/mL,早期患者为4-10ng/mL。前列腺癌过去在我国发生率较低,但随着人口老龄化和生活方式的改变,我国前列腺癌的发病率急剧上升,已经跃居男性恶性肿瘤的第6位,成为泌尿外科中发病率最高的肿瘤,在癌症初期,肿瘤标志物的血清浓度通常很低以至于很难检测到。因此,PSA含量的灵敏度和准确性检测具有相当重要的意义,急需构建一种精确、灵敏的分析方法来辅助肿瘤的早期诊断、监控病情的进展及临床治疗。
纳米生物技术是用于研究生命现象的纳米技术,是纳米技术和生物技术的结合。实现对纳米颗粒的尺寸大小、粒度分布、形状、表面修饰的控制,以及它们光电性质在化学中的应用,是纳米生物技术研究的关键。纳米金粒子具有较好的生物兼容性,一般生物大分子如酶以及其它蛋白质分子,固定在纳米金粒子上后可保留较好的生物活性,同时,纳米金具有特殊的氧化-还原能力,与普通金不同的强烈的表面等离子体共振光谱带等独特的光学特性。因此,在分子识别、生物分析化学中具有重要而广泛的应用价值。
金纳米棒具有独特的表面等离子体共振(SPR)特性,同时具有良好的稳定性和低的生物毒性。颜色的可调以及在催化、信息存储、生物医学等方面的广泛应用引起了业界的关注。
我们的研究表明通过金纳米棒局域表面等离子体共振(LSPR)诱导纳米复合物模拟酶性质能实现可视化快速检测。在氙灯光照条件下,金纳米棒表面自由电子与光子相互作用可产生沿金属表面传播的电子疏密波,当这些表面等离子体自由振荡频率与入射光频率一致时,会产生共振,从而可以加快金纳米棒复合纳米材料光催化显色。基于此,我们建立一种基于金纳米棒局域表面等离子体共振诱导金纳米棒金纳米簇复合纳米材料催化分解双氧水来检测肿瘤标志物的新方法,既可利用颜色变化对待测物进行可视化半定量检测,又可以通过吸光度的大小对待测物的准确含量进行定量检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种现象明显、操作简便、灵敏度高、准确有效的金纳米棒金纳米簇复合物快速检测试剂盒的制备方法。
本发明的金纳米棒金纳米簇复合物快速检测试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
(1)首先制备好金纳米棒溶液,将金纳米棒溶液在离心机上以10000rpm离心10分钟,去除上清液,再用二次蒸馏水进行分散后备用;
(2)依据金纳米棒上的金与巯基化合物可形成金硫化学键,将离心好的金纳米棒溶液与11-巯基十一烷酸(MUA)作用12小时;
(3)将步骤(2)所得溶液在离心机上以6000rpm的转速离心15分钟,去除上清液后,再用二次蒸馏水进行分散,然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化15分钟;
(4)将步骤(3)活化好的金纳米棒溶液与谷胱甘肽还原法制备的金纳米簇溶液作用30分钟,再以6000rpm转速离心15分钟,然后用二次蒸馏水进行分散,即可得到金纳米棒金纳米簇复合纳米材料;
(5)将步骤(4)得到的金纳米棒金纳米簇复合纳米材料通过金硫化学键与带巯基的前列腺癌DNA适配体(PSA-aptamer)相连接;
(6)依据前列腺癌DNA适配体(PSA-aptamer)与前列腺癌特异性抗原(PSA)的特异性结合,在步骤(5)所得溶液中分别加入不同浓度的前列腺癌特异性抗原(PSA),反应20分钟;
(7)在步骤(6)所得溶液中均分别加入显色剂(TMB)和双氧水(H2O2)显色,并将溶液体系环境调节至酸性,置于氙灯光照条件下反应,当金纳米棒表面自由电子与入射光波长一致时,可产生局域表面等离子体共振,从而加快显色反应,根据PSA浓度的不同,覆盖金纳米棒金纳米簇复合纳米材料表面金纳米簇的面积不一样,使得未被PSA覆盖的金纳米棒金纳米簇复合纳米材料表面的金纳米簇催化分解双氧水产生羟基自由基的量也会不一样,羟基自由基可以氧化TMB,进而使显色剂呈现的颜色也不一样,再根据显色剂(TMB)在波长650nm处的吸光度值与PSA浓度的关系,能计算得到待测样品中PSA的含量。
具体的,步骤(1)所述制备金纳米棒溶液采用晶种法进行制备。
进一步,在步骤(2)加入MUA作用之后,滴加少量表面活性剂(CTAB),再进行步骤(3)的离心,可防止聚沉现象发生。
进一步,步骤(4)中,修饰了具有过氧化物模拟酶活性的金纳米棒金纳米簇复合物,金纳米棒与金纳米簇的体积比优选为5:1,金纳米簇体积不宜过大。
进一步,步骤(7)中,加入显色剂后将溶液体系环境pH调节至5,显色效果最佳。
具体的,步骤(7)中,对前列腺癌特异性抗原(PSA)的检测限值为1×10-16g/mL。
本发明金纳米棒金纳米簇复合物快速检测试剂盒的制备方法,可应用于人体血清中的前列腺癌特异性抗原含量检测。并且,本发明方法采用在氙灯光照条件下反应,由于金纳米棒局域表面等离子体共振特性,可以有效加快反应速率,5分钟左右即可实现可视化检测。
本发明利用金纳米棒局域表面等离子体共振的特性及金纳米簇的过氧化物模拟酶性质,将金纳米棒与金纳米簇有机地结合起来,在金纳米棒表面修饰金纳米簇得到一种金纳米棒金纳米簇复合纳米材料,在合适的条件下,金纳米棒金纳米簇复合纳米材料具有过氧化物模拟酶的性质。此外,在氙灯光照条件下,当入射光与金纳米棒表面自由电子频率一致时,可产生局域表面等离子体共振,会加快金纳米棒金纳米簇复合纳米材料催化分解双氧水产生羟基自由基,从而加快反应速率。再依据抗体与抗原的特异性结合,成功地制备出检测PSA的超高灵敏度试剂盒,且现象明显,操作简便,灵敏度高,并能有效准确地应用于测定人体血清中PSA的浓度。
本发明检测前列腺癌特异性抗原的试剂盒为超高灵敏度试剂盒,它在5分钟左右能快速准确地检测PSA,使金纳米棒金纳米簇复合纳米材料成功取代传统的酶联免疫吸附反应中的生物酶。由于金纳米棒具有独特的光化学性质和表面等离子共振特性,金纳米棒复合纳米材料在光催化等方面具有很大的应用前景。另一方面,由羟基自由基来氧化显色剂,不同含量羟基自由基氧化显色剂的量不一样,使得体系表现出不同的颜色,建立可视化检测。
通过本发明的方法处理,能得到不同颜色的溶液,这种颜色的变化可根据体系产生羟基自由基的量来进行调控,通过颜色或吸光度值的变化达到了对PSA的超痕量检测,与现有技术相比,本发明方法简单,成本低,灵敏度高,能够实现快速准确的检测,并且对于其它生物大分子以及疾病的检测都具有十分重要的参比价值,具有很广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中金纳米棒及金纳米棒金纳米簇复合纳米材料吸收光谱图。实线为:金纳米棒溶液(λmax=782nm),虚线为:金纳米棒金纳米簇复合纳米材料(λmax=802nm)。
图2为本发明实施例1中金纳米棒(点划线)、金纳米簇(实线)、金纳米棒金纳米簇复合纳米材料(虚线)的荧光曲线图。
图3为本发明实施例1中金纳米棒金纳米簇复合纳米材料在不同pH下的显色图。图3中,在酸性条件下金纳米棒金纳米簇复合纳米材料能催化分解双氧水产生羟基自由基使TMB变蓝,其中pH=5时催化性最好,颜色最深;在碱性条件下几乎不能催化分解双氧水不能使TMB变蓝,呈现金纳米棒金纳米簇复合物原始的颜色。
图4为本发明实施例1中定性检测前列腺癌特异性抗原时的颜色变化图。图4中,抗原浓度越大,覆盖金纳米棒金纳米簇复合纳米材料表面金纳米簇的面积越多,使得未被抗原覆盖的金纳米棒金纳米簇复合纳米材料表面的金纳米簇催化分解双氧水产生羟基自由基的量就越少,TMB氧化的更少,从而使溶液颜色呈现从深到浅的变化。
图5为本发明实施例1中定性检测前列腺癌特异性抗原时在650nm处紫外吸收光谱图。
图6为本发明实施例1中定量检测前列腺癌特异性抗原标准溶液时的颜色变化图。图6中,在一定范围内,抗原浓度越大,覆盖金纳米棒金纳米簇复合纳米材料表面金纳米簇的面积越多,使得未被抗原覆盖的金纳米棒金纳米簇复合纳米材料表面的金纳米簇催化分解双氧水产生羟基自由基的量就越少,TMB氧化的更少,从而使溶液颜色呈现从深到浅的变化。
图7为本发明实施例1中定量检测前列腺癌特异性抗原标准溶液检测时在650nm处吸光度值变化的标准曲线图。
图8为本发明实施例2中将基于金纳米棒局域表面等离子体共振诱导金纳米棒金纳米簇复合物模拟酶性质实现可视化检测的超高灵敏度试剂盒应用于7个不同人血清中前列腺癌特异性抗原含量时的显色图。图8中,不同人体血清中所含前列腺癌特异性抗原的浓度不一样,覆盖金纳米棒金纳米簇复合纳米材料表面金纳米簇的面积不一样,使得未被PSA覆盖的金纳米棒金纳米簇复合纳米材料表面的金纳米簇催化分解双氧水产生羟基自由基的量也会不一样,氧化TMB的量不一样,进而使溶液呈现的颜色也不一样。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述。
实施例1:
用于前列腺癌特异性抗原的检测:
将10mL采用晶种法进行制备的金纳米棒溶液在离心机上以10000rpm离心10分钟,去除上清液,用二次蒸馏水进行分散,再加入2mL 5mmoL/L的MUA溶液反应12h后,在离心机上以6000rpm转速离心15分钟,离心前滴加少量CTAB,去除上清液后,再用10mL二次蒸馏水进行分散。然后加入75mmol/L的EDC和15mmol/L的NHS活化15分钟,以6000rpm转速离心15分钟后,用二次蒸馏水进行分散,再加入2mL与谷胱甘肽还原法制备的金纳米簇溶液,此时要注意的是,金纳米簇的量在保证充分反应的同时不宜过量加入,过量加入会发生聚沉,当金纳米棒与金纳米簇的体积比为5:1时效果比较好;反应30min后,以6000rpm转速离心15分钟,用10mL二次蒸馏水进行分散。然后加入2mL 10-4μmol/L的PSA-aptamer,在4℃作用12h,以5000rpm离心10min,用二次蒸馏水重新进行分散,备用。
在96孔聚苯乙烯微孔板中各加入100μL上述已连接PSA-aptamer的金纳米棒金纳米簇复合纳米材料,再分别加入100μL浓度为0、10-16、10-15、10-14、10-13、10-12、10-11、10-10g/mL的PSA,反应20min。再分别加入50μL 5mmol/L的TMB和50μL 100mmol/L的H2O2,最后用0.1mol/L HCl调节pH至5左右,然后放置在400nm以上可见光的氙灯下照射5min,其颜色变化如图4所示。待显色稳定后,在紫外分光光度计上测其吸收光谱,其吸收光谱如图5所示。PSA的定量检测中均平行三次,图6所示浓度从左至右依次为:0pg/mL、10pg/mL、20pg/mL、40pg/mL、60pg/mL、80pg/mL、100pg/mL、200pg/mL。在不同浓度的PSA条件下,由于PSA与其对应DNA适配体的特异性结合,覆盖金纳米棒金纳米簇复合纳米材料表面金纳米簇的面积不一样,显色剂呈现的颜色也不一样,当PSA的浓度为10-16g/mL时,此时PSA的浓度已经很小,与对应适配体结合的量已经很少,达到了对PSA检测的检测限,其检测限为10-16g/mL。根据显色剂在650nm处的吸光度值与PSA浓度之间的关系可获得线性关系良好的标准曲线,如图7所示,根据其标准曲线可计算出待测样品中PSA的含量。
实施例2:
用于人体血清中PSA含量的检测:
在96孔聚苯乙烯微孔板中各加入100μL已连接PSA-aptamer的金纳米棒金纳米簇复合纳米材料,再加入7个不同人的100μL稀释103倍的人体血清,反应20分钟。再分别加入50μL 5mmol/L的TMB和50μL 100mmol/L H2O2,最后用0.1mol/L HCl调节pH至5左右,然后放置在400nm以上可见光的氙灯下照射5min,其颜色变化如图8所示。加入不同人体血清之后的微孔板中,溶液颜色变化不同,即不同人血清中的前列腺癌特异性抗原含量不同。根据图7中的标准曲线即可计算出7个不同人血清中前列腺癌抗原的含量分别是(图8中从左至右)7.530ng/mL、11.318ng/mL、3.742ng/mL、46.924ng/mL、15.864ng/mL、37.833ng/mL、53.742ng/mL。
Claims (6)
1.一种金纳米棒金纳米簇复合物快速检测试剂盒的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)首先制备好金纳米棒溶液,将金纳米棒溶液在离心机上以10000rpm离心10分钟,去除上清液,再用二次蒸馏水进行分散后备用;
(2)依据金纳米棒上的金与巯基化合物可形成金硫化学键,将离心好的金纳米棒溶液与11-巯基十一烷酸(MUA)作用12小时;
(3)将步骤(2)所得溶液在离心机上以6000rpm的转速离心15分钟,去除上清液后,再用二次蒸馏水进行分散,然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化15分钟;
(4)将步骤(3)活化好的金纳米棒溶液与谷胱甘肽还原法制备的金纳米簇溶液作用30分钟,再以6000rpm转速离心15分钟,然后用二次蒸馏水进行分散,即可得到金纳米棒金纳米簇复合纳米材料;
(5)将步骤(4)得到的金纳米棒金纳米簇复合纳米材料通过金硫化学键与带巯基的前列腺癌DNA适配体(PSA-aptamer)相连接;
(6)依据前列腺癌DNA适配体(PSA-aptamer)与前列腺癌特异性抗原(PSA)的特异性结合,在步骤(5)所得溶液中分别加入不同浓度的前列腺癌特异性抗原(PSA),反应20分钟;
(7)在步骤(6)所得溶液中均分别加入显色剂(TMB)和双氧水(H2O2)显色,并将溶液体系环境调节至酸性,置于氙灯光照条件下反应,当金纳米棒表面自由电子与入射光波长一致时,可产生局域表面等离子体共振,从而加快显色反应,根据PSA浓度的不同,覆盖金纳米棒金纳米簇复合纳米材料表面金纳米簇的面积不一样,使得未被PSA覆盖的金纳米棒金纳米簇复合纳米材料表面的金纳米簇催化分解双氧水产生羟基自由基的量也会不一样,羟基自由基可以氧化TMB,进而使显色剂呈现的颜色也不一样,再根据显色剂(TMB)在波长650nm处的吸光度值与PSA浓度的关系,能计算得到待测样品中PSA的含量。
2.根据权利要求1所述金纳米棒金纳米簇复合物快速检测试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤(1)所述制备金纳米棒溶液采用晶种法进行制备。
3.根据权利要求1所述金纳米棒金纳米簇复合物快速检测试剂盒的制备方法,其特征在于:在步骤(2)加入MUA作用之后,滴加少量表面活性剂(CTAB),再进行步骤(3)的离心。
4.根据权利要求1所述金纳米棒金纳米簇复合物快速检测试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤(4)中,修饰了具有过氧化物模拟酶活性的金纳米棒金纳米簇复合物,金纳米棒与金纳米簇的体积比为5:1。
5.根据权利要求1所述金纳米棒金纳米簇复合物快速检测试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤(7)中,加入显色剂后将溶液体系环境pH调节至5。
6.根据权利要求1所述金纳米棒金纳米簇复合物快速检测试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤(7)中,对前列腺癌特异性抗原(PSA)的检测限值为1×10-16g/mL。
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