CN109239064A - 一种含铜纳米棒复合物快速检测试剂盒的制备方法及应用 - Google Patents
一种含铜纳米棒复合物快速检测试剂盒的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种含铜纳米棒复合物快速检测试剂盒的制备方法及应用。制备含铜纳米棒复合物；在离心管中加入不同浓度葡萄糖溶液，再加入葡萄糖氧化酶，再加入含铜纳米棒复合物及显色剂，调节pH，根据显色剂在波长652nm处吸光度值与葡萄糖浓度关系获得线性关系良好的标准曲线，据此计算得到待测样品中葡萄糖含量；在离心管中加入已连接INS‑aptamer的含铜纳米棒复合物，再加入不同浓度胰岛素，再加入双氧水溶液和TMB显色，根据显色剂在波长652nm处吸光度值与胰岛素浓度关系获得线性关系良好的标准曲线，据此计算得到待测样品中胰岛素含量。本发明还可用来区分1型糖尿病和2型糖尿病。本发明现象明显、操作简便、灵敏度高、准确有效。
Description
技术领域
本发明属于化学生物传感以及生物检测技术领域，具体涉及一种具有过氧化物模拟酶性质的含铜纳米棒复合物快速检测试剂盒的制备方法及其应用。
背景技术
糖尿病是一个全球性的健康问题，它降低了许多人的生活质量，也是由于健康成本增加和经济活动丧失而给社会带来的主要经济负担。
糖尿病是一种慢性代谢疾病，主要可分为1型糖尿病(T1DM)或2型糖尿病(T2DM)，T1DM因胰腺β细胞破坏而减少或不产生胰岛素，而T2DM患者细胞内胰岛素敏感性较低。因此，T1DM患者和T2DM患者的特点都是血糖水平的改变。当胰岛素水平低或不存在时，血糖浓度增加，导致高血糖。高血糖可导致长期并发症，如心脏病、中风、肾病、视网膜病变、周围神经病变和下肢截肢。T1DM发病较快，主要临床表现为多尿、多汗、体重下降伴酮症。它是由T细胞介导的胰岛β细胞自身免疫破坏引起的，导致胰岛素缺乏。相反，T2DM是一种相对的胰岛素缺乏症，胰岛β细胞的功能随着时间的推移而丧失，随着时间的推移，患者会出现胰岛素分泌减少的现象，从而需要外源性胰岛素来控制血糖。其症状包括皮肤干燥、排尿量增加、对光线敏感、疲劳、视力障碍和口渴。T2DM患者的年龄、家族史、缺乏体育锻炼、不健康饮食、高血压、血脂异常、妊娠期糖尿病和肥胖等因素往往是共同存在的危险因素。
胰岛素(Insulin)是一种多肽，它作为人体内唯一能降低血糖的激素，同时促进脂肪、蛋白质、糖原合成。随着现代社会饮食结构复杂和遗传因素不同，糖尿病在人群中频繁发生，鉴定糖尿病中必然离不开对胰岛素浓度的检测。当前胰岛素检测主流方法分为免疫检测方法和非免疫检测方法。免疫检测方法包括放射免疫法以及酶联免疫法和发光免疫法等。非免疫检测法包括同位素稀释法以及高效液相色谱法等。
尽管临床实验室经常检测胰岛素和葡萄糖水平，但直到现在，研究人员还很少将两者结合在一起进行测试。
近年来，基于纳米材料的生物传感器在生物检测、生物技术和生物医学等领域得到了广泛的研究和应用，其中最常用的纳米材料是由碳纳米管、金纳米粒子、二氧化硅纳米粒子、量子点、和石墨烯等。
无机纳米粒子的合成和修饰在生物医学应用方面取得了重大进展，这些纳米材料提供了一个可拓展的平台，可以将两个或多个功能模块结合起来提供多种功能。研究发现核壳结构的复合金纳米棒在检测范围、适用条件以及检测灵敏度等多个方面，均明显优越于单一成分的金纳米棒的相关特性，应用前景广阔。一些纳米材料具有过氧化物模拟酶的性质，与天然酶相比，制备简单、易于存取、价格低廉，在一定条件下可以专一高效地催化化学反应。
本发明制备了一种具有过氧化物模拟酶的含铜纳米棒复合物，基于这种含铜纳米棒复合物可以很好地检测葡萄糖及胰岛素，以往的研究大部分只局限于这其中一种的检测。在此，本发明不仅能够分别对这两种物质进行很好的检测，还进一步设计成对这两种物质进行联合检测，既可利用颜色变化对待测物进行可视化半定量检测，又可以通过葡萄糖和胰岛素浓度比值的大小显色来区分1型、2型糖尿病，对于控制和预防糖尿病有很好的应用前景。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种现象明显、操作简便、灵敏度高、准确有效的含铜纳米棒复合物快速检测试剂盒的制备方法。
本发明的含铜纳米棒复合物快速检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)首先制备好金纳米棒溶液，向金纳米棒溶液中加入硫代硫酸钠(Na2S2O3)溶液，置于50℃热水中反应5分钟后，再加入硝酸铜(Cu(NO3)2)溶液，即得到具有过氧化物模拟酶性质的含铜纳米棒复合物；
(2)将步骤(1)制备的含铜纳米棒复合物在离心机上以8000rpm离心10分钟，去除上清液，再用二次蒸馏水进行分散后备用；
(3)检测葡萄糖的含量：在不同的离心管中各加入不同浓度的葡萄糖溶液，再分别加入葡萄糖氧化酶反应，然后分别加入步骤(2)制备的含铜纳米棒复合物以及显色剂(TMB)，最后用0.1mol/L HCl调节pH，待显色稳定后，在紫外分光光度计上测其吸收光谱；依据葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下能够分解产生双氧水，利用含铜纳米棒复合物的过氧化物模拟酶性质进一步催化分解双氧水产生羟基自由基，从而使显色剂(TMB)显色；根据葡萄糖浓度的不同，产生双氧水的量不一样，含铜纳米棒复合物催化分解双氧水产生的羟基自由基也不一样，进而使显色呈现一定梯度，再根据显色剂在波长652nm处的吸光度值与葡萄糖浓度的关系可获得线性关系良好的标准曲线，根据其标准曲线能计算得到待测样品中葡萄糖的含量；
(4)往步骤(2)制备的含铜纳米棒复合物中加入胰岛素DNA适配体(INS-aptamer)；依据含铜纳米棒复合物上的金与巯基可形成金硫化学键，将含铜纳米棒复合物溶液通过金硫化学键与带巯基的胰岛素DNA适配体(INS-aptamer)相连接；
(5)依据胰岛素DNA适配体(INS-aptamer)与胰岛素的特异性结合，在不同的离心管中各加入步骤(4)所得已连接INS-aptamer的含铜纳米棒复合物，再分别加入不同浓度的胰岛素，反应20分钟；
(6)向步骤(5)所得溶液体系中加入双氧水溶液和TMB显色，再根据显色剂在波长652nm处的吸光度值与胰岛素浓度的关系可获得线性关系良好的标准曲线，根据其标准曲线能计算得到待测样品中胰岛素的含量。
具体的，步骤(1)所述制备金纳米棒溶液是采用晶种法进行制备。
具体的，步骤(1)所述在制备含铜纳米棒复合物过程中，加入硫代硫酸钠溶液后纳米棒的纵向等离子体共振吸收峰会发生红移，继续加入硝酸铜溶液后，其纵向等离子体共振吸收峰会发生蓝移。
具体的，步骤(3)中，在葡萄糖溶液中加入葡萄糖氧化酶反应，其反应温度为37℃，反应时间为30分钟；加入显色剂后将溶液体系环境pH用0.1mol/L HCl调节至6；对葡萄糖浓度的检测限值为2.5×10-6mol/L。
具体的，步骤(4)中，含铜纳米棒复合物中加入INS-aptamer在4℃作用12小时后，再以4000rpm离心10分钟，去除上清液，再用二次蒸馏水进行分散。
具体的，步骤(6)中，对胰岛素浓度的检测限值为0.014μU/mL。
本发明的第二个目的在于提供上述含铜纳米棒复合物快速检测试剂盒的应用：由于1型糖尿病和2型糖尿病中的胰岛素含量及葡萄糖和胰岛素之间的浓度比不同，利用葡萄糖分解产生双氧水和胰岛素对含铜纳米棒复合物的覆盖，调节含铜纳米棒复合物的用量和pH，采用TMB显色来区分1型糖尿病和2型糖尿病。
因此，本发明的含铜纳米棒复合物快速检测试剂盒，不仅可以应用于人体血清中的血糖及胰岛素含量的检测。并且，本发明方法通过显色为1型、2型糖尿病的区分提供可能，用肉眼可以直接进行观察。
本发明利用金纳米棒表面可调控及易于修饰的特性，向金纳米棒中加入硫代硫酸钠和硝酸铜溶液，得到一种具有过氧化物模拟酶的含铜纳米棒复合物。根据葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下可以分解产生双氧水，而含铜纳米棒复合物又可以进一步地催化分解双氧水，产生羟基自由基来氧化TMB使溶液颜色变蓝，从而可以间接检测人体血清中葡萄糖的含量。此外，在含铜纳米棒复合物上修饰带巯基的胰岛素适配体，依据适配体与胰岛素的特异性结合，可以达到检测胰岛素的目的。将两者进一步联系起来，利用葡萄糖分解得到的双氧水作为检测胰岛素显色需要加入的双氧水，在一定条件下，由于葡萄糖和胰岛素浓度的比不同，可以初步用肉眼来区分1型、2型糖尿病，且现象明显，操作简便，灵敏度高。
本发明的含铜纳米棒复合物快速检测试剂盒，它能快速准确地检测葡萄糖及胰岛素，使含铜纳米棒复合物成功取代传统的酶联免疫吸附反应中的生物酶。含铜纳米棒复合物容易制备且不易失活的特性是其作为模拟酶催化反应的一大优势。
通过本发明的方法处理，采用TMB对葡萄糖和胰岛素进行显色，溶液颜色变化明显，这种颜色的变化可根据体系产生羟基自由基的量来进行调控，通过颜色或吸光度值的变化达到了对葡萄糖和胰岛素的高灵敏检测。将两者进行联系起来，既可利用颜色变化对待测物进行可视化半定量检测，又可以通过葡萄糖和胰岛素浓度比值的大小显色来区分1型、2型糖尿病，对于控制和预防糖尿病有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中金纳米棒、核壳金纳米棒及含铜纳米棒复合物的紫外吸收光谱图。实线1为：金纳米棒溶液(λmax＝777nm)，虚线2为：核壳金纳米棒溶液(λmax＝862nm)，点划线3为含铜纳米棒复合物(λmax＝787nm)。
图2为本发明实施例1中含铜纳米棒复合物在不同pH下的显色图。在酸性条件下含铜纳米棒复合物能催化分解双氧水产生羟基自由基使TMB变蓝，其中pH＝6时催化性最好，颜色最深。在碱性条件下几乎不能催化分解双氧水不能使TMB变蓝，呈现含铜纳米棒复合物原始的颜色。
图3为本发明实施例1中定量检测双氧水的颜色变化图，双氧水浓度越大颜色越深。
图4为本发明实施例1中定量检测双氧水在652nm处吸光度值变化的标准曲线图。
图5为本发明实施例2中定性检测葡萄糖的颜色变化图，葡萄糖浓度越大，产生双氧水越多，颜色越深。
图6为本发明实施例2中定性检测葡萄糖时在652nm处紫外吸收光谱图。
图7为本发明实施例2中定量检测葡萄糖的颜色变化图。
图8为本发明实施例2中定量检测葡萄糖在652nm处吸光度值变化的标准曲线图。
图9为本发明实施例3中定性检测胰岛素的颜色变化图。
图10为本发明实施例3中定量检测胰岛素的颜色变化图。胰岛素浓度越大，覆盖含铜纳米棒复合物的面积越多，使得未被胰岛素覆盖的含铜纳米棒复合物催化分解双氧水产生羟基自由基的量就越少，TMB呈现颜色逐渐变浅的梯度变化。
图11为本发明实施例3中定量检测胰岛素在652nm处吸光度值变化的标准曲线图。
图12为本发明实施例4中葡萄糖与胰岛素随浓度配比的不同显色变化图。不同人体血清中所含葡萄糖和胰岛素的浓度不一样，通过调节pH，当葡萄糖与胰岛素的浓度比值大于某一值时显色，此时与1型糖尿病表现为胰岛素含量明显不足(C胰岛素<5μU/mL)的特征相符。当葡萄糖与胰岛素的浓度比值小于某一值时不显色，此时与2型糖尿病表现为抵抗胰岛素(C胰岛素>5μU/mL)的特征相符，以此通过显色来区分1型、2型糖尿病。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述。
实施例1：
首先制备含铜纳米棒复合物。往30mL采用晶种法进行制备的金纳米棒溶液中加入200μL 1M Na2S2O3溶液，置于50℃热水中加热5分钟后得到核壳金纳米棒，在紫外可见光光度计上测其对应的吸收峰，金纳米棒的纵向等离子体吸收峰会发生红移，往溶液中继续加入400μL 0.2M Cu(NO3)2溶液，核壳纳米棒的纵向等离子体吸收峰又会发生蓝移得到含铜纳米棒复合物，如图1中所示，作用12小时后，在离心机上以8000rpm离心10分钟，去除上清液，用二次蒸馏水进行分散备用。
准备14支离心管，向离心管中分别加入300μL含铜纳米棒复合物，再分别加入300μL 5mmol/L TMB和300μL 10mmol/L H2O2，再用HCl和NaOH将离心管中溶液调节pH至1至14，观察颜色变化情况，如图2所示，从图2中可知，pH在6左右时显色效果最佳。
进一步探究含铜纳米棒复合物催化分解双氧水能力大小。准备7支离心管，向离心管中分别加入300μL含铜纳米棒复合物，再各加入300μL 5mmol/L TMB和300μL浓度分别为0、0.001、0.005、0.01、0.015、0.02、0.04mmol/L H2O2，调节pH至6，颜色变化如图3所示。待显色稳定后，在紫外分光光度计上测其652nm处吸光度值。双氧水浓度的不同，含铜纳米棒复合物催化分解双氧水产生得到的羟基自由基的量不一样，显色剂呈现的颜色也不一样，根据显色剂在652nm处的吸光度值与双氧水浓度之间的关系可获得线性关系良好的标准曲线，如图4所示。
实施例2：
用于葡萄糖的检测：
往30mL采用晶种法进行制备的金纳米棒溶液中加入200μL 1M Na2S2O3溶液，置于50℃热水中加热5分钟，5分钟后再加入400μL 0.2M Cu(NO3)2溶液，作用12小时后，在离心机上以8000rpm离心10分钟，去除上清液，用二次蒸馏水进行分散备用。在9支离心管中分别加入300μL浓度为0、0.001、0.01、0.02、0.4、0.8、2、4、8mM的葡萄糖溶液和300μL 0.1mg/mL葡萄糖氧化酶，置于37℃反应30min。再分别加入300μL含铜纳米棒复合物和300μL 5mmol/LTMB，最后用0.1mol/L HCl调节pH至6左右，其颜色变化如图5所示。待显色稳定后，在紫外分光光度计上测其吸收光谱，葡萄糖浓度为0.001、0.01、0.02、0.4、0.8、2、4、8mM的紫外吸收光谱如图6所示。葡萄糖的定量检测中均平行三次，图7所示浓度从左至右依次为：0、0.0025、0.005、0.01、0.02、0.05、0.2、0.4mM。葡萄糖浓度的不同，在葡萄糖氧化酶作用下产生得到双氧水的量不一样，含铜纳米棒复合物催化分解双氧水产生得到的羟基自由基的量不一样，显色剂呈现的颜色也不一样，根据显色剂在652nm处的吸光度值与葡萄糖浓度之间的关系可获得线性关系良好的标准曲线，如图8所示，根据其标准曲线可计算出待测样品中葡萄糖的含量。
实施例3：
用于胰岛素含量的检测：
往10mL含铜纳米棒复合物中加入200μL 10-4μmol/L的INS-aptamer，在4℃作用12h，以4000rpm离心10min，用二次蒸馏水重新进行分散，备用。
在8支离心管中各加入100μL上述已连接INS-aptamer的含铜纳米棒复合物，再分别加入300μL浓度为0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mg/mL的胰岛素，反应20min后，加入200μL10mmol/L的双氧水溶液反应30分钟，再分别加入300μL 5mmol/L TMB。30分钟后，其颜色变化如图9所示。胰岛素的定量检测中均平行三次，浓度从左至右依次为：0、0.014、0.054、0.216、0.270、0.540、2.16μU/mL，颜色变化如图10所示。在不同浓度的胰岛素条件下，由于胰岛素与其对应DNA适配体的特异性结合，覆盖含铜纳米棒复合物的面积不一样，显色剂呈现的颜色也不一样，根据金颗粒在652nm处的吸光度值与胰岛素浓度之间的关系可获得线性关系良好的标准曲线，如图11所示，根据其标准曲线可计算出待测样品中胰岛素的含量。
实施例4：
用于1型、2型糖尿病的区分：
往20mL含铜纳米棒复合物中加入400μL 10-4μmol/L的INS-aptamer，在4℃下作用12h后，以4000rpm离心10min，用二次蒸馏水重新进行分散，备用。
准备两组离心管，每组10支，往第一组离心管中分别加入200μL稀释102倍10个不同人的血清(其葡萄糖浓度分别为7.2、8.87、12.1、6.9、15.4、17.59、10.5、11.8、7.8、9.7mmol/L；对应的胰岛素浓度分别为1.82、2.7、4.2、3.1、4.9、3.7、4.05、3.9、2.5、3.32μU/mL)和200μL 0.1mg/mL葡萄糖氧化酶，往第二组离心管中分别加入200μL稀释102倍10个不同人的血清(其葡萄糖浓度分别为7.2、8.87、12.1、6.9、15.4、17.59、10.5、11.8、7.8、9.7mmol/L；对应的胰岛素浓度分别为5.9、10.1、11.2、6.2、9.0、8.1、5.2、12.1、5.2、7.4μU/mL)和200μL 0.1mg/mL葡萄糖氧化酶，两组离心管置于37℃反应30分钟。再分别加入200μL5mmol/L的TMB和200μL上述已修饰胰岛素DNA适配体的含铜纳米棒复合物，最后用1mol/LHCl调节pH至2左右，其颜色变化如图12所示，图12中，上排10支离心管为第一组离心管，从左至右对应的胰岛素浓度分别为1.82、2.7、4.2、3.1、4.9、3.7、4.05、3.9、2.5、3.32μU/mL；其下排10支离心管为第二组离心管，从左至右对应的胰岛素浓度分别为5.9、10.1、11.2、6.2、9.0、8.1、5.2、12.1、5.2、7.4μU/mL。不同人体血清中所含葡萄糖和胰岛素的浓度不一样，通过调节pH，当葡萄糖与胰岛素的浓度比值大于2.22时显色，此时与1型糖尿病表现为胰岛素含量明显不足(C胰岛素<5μU/mL)的特征相符。当葡萄糖与胰岛素的浓度比值小于2.2时不显色，此时与2型糖尿病表现为抵抗胰岛素(C胰岛素>5μU/mL)的特征相符，以此通过显色来区分1型、2型糖尿病。
Claims (9)
1.一种含铜纳米棒复合物快速检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)首先制备好金纳米棒溶液，向金纳米棒溶液中加入硫代硫酸钠(Na2S2O3)溶液，置于50℃热水中反应5分钟后，再加入硝酸铜(Cu(NO3)2)溶液，即得到具有过氧化物模拟酶性质的含铜纳米棒复合物；
(2)将步骤(1)制备的含铜纳米棒复合物在离心机上以8000rpm离心10分钟，去除上清液，再用二次蒸馏水进行分散后备用；
(3)检测葡萄糖的含量：在不同的离心管中各加入不同浓度的葡萄糖溶液，再分别加入葡萄糖氧化酶反应，然后分别加入步骤(2)制备的含铜纳米棒复合物以及显色剂(TMB)，最后用0.1mol/L HCl调节pH，待显色稳定后，在紫外分光光度计上测其吸收光谱；依据葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下能够分解产生双氧水，利用含铜纳米棒复合物的过氧化物模拟酶性质进一步催化分解双氧水产生羟基自由基，从而使显色剂(TMB)显色；根据葡萄糖浓度的不同，产生双氧水的量不一样，含铜纳米棒复合物催化分解双氧水产生的羟基自由基也不一样，进而使显色呈现一定梯度，再根据显色剂在波长652nm处的吸光度值与葡萄糖浓度的关系可获得线性关系良好的标准曲线，根据其标准曲线能计算得到待测样品中葡萄糖的含量；
(4)往步骤(2)制备的含铜纳米棒复合物中加入胰岛素DNA适配体(INS-aptamer)；依据含铜纳米棒复合物上的金与巯基可形成金硫化学键，将含铜纳米棒复合物溶液通过金硫化学键与带巯基的胰岛素DNA适配体(INS-aptamer)相连接；
(5)依据胰岛素DNA适配体(INS-aptamer)与胰岛素的特异性结合，在不同的离心管中各加入步骤(4)所得已连接INS-aptamer的含铜纳米棒复合物，再分别加入不同浓度的胰岛素，反应20分钟；
(6)向步骤(5)所得溶液体系中加入双氧水溶液和TMB显色，再根据显色剂在波长652nm处的吸光度值与胰岛素浓度的关系可获得线性关系良好的标准曲线，根据其标准曲线能计算得到待测样品中胰岛素的含量。
2.根据权利要求1所述含铜纳米棒复合物快速检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述制备金纳米棒溶液是采用晶种法进行制备。
3.根据权利要求1所述含铜纳米棒复合物快速检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述在制备含铜纳米棒复合物过程中，加入硫代硫酸钠溶液后纳米棒的纵向等离子体共振吸收峰会发生红移，继续加入硝酸铜溶液后，其纵向等离子体共振吸收峰会发生蓝移。
4.根据权利要求1所述含铜纳米棒复合物快速检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，在葡萄糖溶液中加入葡萄糖氧化酶反应，其反应温度为37℃，反应时间为30分钟。
5.根据权利要求1所述含铜纳米棒复合物快速检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，加入显色剂后将溶液体系环境pH用0.1mol/L HCl调节至6。
6.根据权利要求1所述含铜纳米棒复合物快速检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，对葡萄糖浓度的检测限值为2.5×10-6mol/L。
7.根据权利要求1所述含铜纳米棒复合物快速检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，含铜纳米棒复合物中加入INS-aptamer在4℃作用12小时后，再以4000rpm离心10分钟，去除上清液，再用二次蒸馏水进行分散。
8.根据权利要求1所述含铜纳米棒复合物快速检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤(6)中，对胰岛素浓度的检测限值为0.014μU/mL。
9.一种如权利要求1所述含铜纳米棒复合物快速检测试剂盒的应用，其特征在于：由于1型糖尿病和2型糖尿病中的胰岛素含量及葡萄糖和胰岛素之间的浓度比不同，利用葡萄糖分解产生双氧水和胰岛素对含铜纳米棒复合物的覆盖，调节含铜纳米棒复合物的用量和pH，采用TMB显色来区分1型糖尿病和2型糖尿病。
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