CN111504995B - 一种基于比色原理检测磷脂酶a2的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明中公开了一种基于比色原理检测磷脂酶A2的方法及其应用。该方法可以基于石墨烯量子点具有类天然酶催化活性，在过氧化氢存在的酸性条件下能够有效催化底物TMB氧化，伴随着溶液颜色由无色转化为蓝色。本发明在过氧化氢和TMB共同存在的酸性条件下，根据准样品溶液的吸光值及其浓度关系绘制标准曲线，进而计算得出未知样品溶液中磷脂酶A2的浓度；或在智能手机检测系统的基础上，通过图像采集和颜色分析，通过计算标准样品溶液在RGB颜色模型中B分量颜色平均值，得到磷脂酶A2线性浓度和颜色分量平均值之间的线性关系；进而计算得出未知样品溶液中磷脂酶A2的浓度，从而实现磷脂酶A2的灵敏、准确、便捷和可视化的检测。
Description
技术领域
本发明属于医疗检测领域，特别涉及一种基于比色原理检测磷脂酶A2的方法及其应用。
背景技术
磷脂酶A2是广泛分布于人体的磷脂酶家族成员之一，其能够特异性作用于磷脂分子的sn-2酯键，水解磷脂形成游离态的脂肪酸和溶血磷脂分子，这些产物在磷脂更新和细胞信息传递等生理过程中发挥重要作用。因此，磷脂酶A2的活性水平在机体炎症和组织损伤时对于信息传递和膜通道活化等病理过程中起关键性作用。例如，研究表明磷脂酶A2在急性胰腺炎发生时会出现过早激活和过度释放，并直接参与急性胰腺炎的发病过程。磷脂酶A2的检测已成为包括急性胰腺炎在内的炎症相关疾病诊断中一项重要的检测指标。测定磷脂酶A2活性的常用方法包括光学法、电化学法、免疫法和色谱质谱联用方法等。尽管已运用于实际应用中，这些方法依存在检测成本高、步骤繁琐且周期长、特异性低或依赖专业仪器设备等不足。比色法(colorimetry)是通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法，以生成有色化合物的显色反应为基础。其所需仪器简单，操作简便，是广泛应用于分析检测的常用方法。
此外，随着电子技术的飞速发展，智能手机已经融入人们生活的方方面面，成为人们生活中不可或缺的一部分。随着智能手机硬件及系统的升级，手机的功能越来越强大。目前智能手机已实现对于心率、血压和运动状态等物理参量和生理信号的检测，以及进行污染微量物质的大数据监控管理。譬如，公开号为CN 207262061 U的中国专利申请“一种基于APP的甲烷智能检测系统”将甲烷探测仪与手机通过蓝牙模块进行连接，通过手机APP对探测仪获得的数据进行整理分析，解决在实际检测中针对检测区域特殊地形导致的高难度检测。又如公开号为CN 109959780 A的中国专利申请“一种微量物质检测装置、方法及智能手机”利用检测装置的摄像头对待测物进行拍照，然后通过手机APP对照片分析出样品中微量物质的含量。但这些方法都需要第三方的设备来辅助智能手机完成数据收集、数据接收的工作。此外，智能手机对于生化检测还较少触及。这可能是由于缺少适用于移动终端设备的生化传感检测体系的建立，以及相应的配套手机应用程序(applications,APP)的开发尚不成熟。目前，疾病标志物的检测大部分仍采用中心实验室集中检验，离不开分析仪器设备和专业操作人员，这在即时检验和居家监测领域的应用十分受限。依据智能手机的便携性、普及性和移动终端对于数据处理和传输的快捷性等优势，尤其是基于其强悍的处理器以及图像获取功能，配合个性化的应用程序开发，在智能手机上实现与生理病理相关的疾病标志物的实时传感检测，具有灵敏快捷、携带方便和使用简便的优点，在健康管理、临床诊疗、疾病监测等方面具有广阔的应用潜力。
将比色检测原理与便携性好普及性高的智能手机移动终端设备相结合，建立快速、便捷和灵敏的磷脂酶检测新方法对于临床诊断和居家监护具有非常重要意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于比色原理检测磷脂酶A2的方法。
本发明的另一目的在于提供所述基于比色原理检测磷脂酶A2的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基于比色原理检测磷脂酶A2的方法，为通过如下任一种方法实现：
(A)基于显色法检测磷脂酶A2：
S1、配制至少五个浓度的磷脂酶A2水溶液，然后分别加入包覆石墨烯量子点的脂质体混合后水浴反应，再加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、H2O2和酸性溶液继续反应，待反应结束后测量紫外吸收光谱，得到吸光值；
S2、根据步骤S1测量得到的吸光值与磷脂酶A2水溶液的浓度绘制标准曲线；
S3、将待测样品与包覆石墨烯量子点的脂质体混合后水浴反应，然后加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、H2O2和酸性溶液继续反应，待反应结束后测量紫外吸收光谱，得待测样品的吸光值；再根据步骤S2绘制的标准曲线获得待测样品中磷脂酶A2的浓度和/或含量；
(B)基于智能手机检测系统检测磷脂酶A2：
所述的基于智能手机检测系统包括依次连接的图像采集模块，图像预处理模块，颜色分析模块和检测结果显示模块；
所述的图像采集模块包括手机自带摄像头、比色皿和黑匣子，用于获取标准溶液和待测溶液的颜色图像(即数码照片)；
所述的图像预处理模块为将获取的标准溶液和待测溶液的颜色图像转换为位图格式，以不同的颜色模型分析，用于获得标准溶液和待测溶液的颜色分量平均值；
所述的颜色分析模块为根据标准溶液的颜色分量平均值及其浓度绘制关系曲线；
所述的结果显示模块为待测溶液的颜色分量平均值和绘制的关系曲线，获得待测溶液的浓度和/或含量；
所述的基于智能手机检测系统检测磷脂酶A2，通过如下步骤实现：
S4、配制至少五个浓度的磷脂酶A2水溶液，然后分别加入包覆石墨烯量子点的脂质体混合后水浴反应，再加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、H2O2和酸性溶液继续反应，待反应结束后用智能手机检测系统中的图像采集模块获取反应后的溶液的颜色图像；
S5、将步骤S4中获取颜色图像通过智能手机检测系统中的图像预处理模块，分别获取其颜色分量平均值；
S6、根据步骤S5中获取的颜色分量平均值和磷脂酶A2水溶液的浓度，通过智能手机检测系统中的颜色分析模块获得关系曲线；
S7、将包覆石墨烯量子点的脂质体加入到待测样品中，混合后水浴反应，再加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、H2O2和酸性溶液继续反应，待反应结束后通过智能手机检测系统中图像采集模块和图像预处理模块测定待测溶液的颜色分量平均值，然后根据步骤S6中的关系曲线，计算得到待测溶液中磷脂酶A2的浓度和/或含量。
步骤S1、S3、S4和S7中所述的包覆石墨烯量子点的脂质体优选为通过如下方法制备得到：
(1)将卵磷脂与胆固醇加入到氯仿中，超声使其分散均匀，然后旋蒸除去氯仿，得到脂质体薄膜；
(2)将石墨烯量子点溶液加入到脂质体薄膜中，冰浴超声分散均匀，得到混合溶液I；然后将混合溶液I通过聚碳酸酯膜反复挤压，得到混合溶液II；再将混合溶液II进行透析，得到包封石墨烯量子点的纳米脂质体。
步骤(1)中所述的卵磷脂与胆固醇的摩尔比为1～5：1；优选为5：1。
步骤(1)中所述的氯仿的用量为按每1.8mmol胆固醇配比1ml氯仿计算(或每10.8mmol卵磷脂和胆固醇配比1ml氯仿计算)。
步骤(1)中所述的超声的条件为：100W超声5～10min；优选为：100W超声5min。
步骤(1)中所述的旋蒸的条件为：40℃旋蒸15～60分钟；优选为40℃旋蒸60分钟。
步骤(2)中所述的石墨烯量子点与所述卵磷脂和胆固醇的总质量比为0.02～0.4:30；优选为0.2:30。
步骤(2)中所述的石墨烯量子点溶液为石墨烯量子点水溶液，或将石墨烯量子点溶于磷酸缓冲溶液得到的溶液；其浓度为0.01～0.2mg/mL；优选为0.1mg/mL。
所述的磷酸缓冲溶液为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的混合溶液，调节pH为7.0。
步骤(2)中所述的石墨烯量子点优选为通过如下方法制备得到：
(i)将碳黑加入到浓硝酸溶液中，于130℃条件下搅拌回流反应，待反应结束后冷却至室温，吸取上清液，加热除酸至pH为5～7，得到溶液A；
(ii)将溶液A过滤，取滤液；然后将滤液进行离心，取上清液；再将上清液加入到超滤离心管中，离心，取清液；最后将清液进行透析，待透析结束后，冷冻干燥，得到石墨烯量子点。
步骤(i)中所述的碳黑优选为carbot vulcan XC-72碳黑。
步骤(i)中所述的浓硝酸溶液的浓度5～8mol/L；优选为6mol/L。
步骤(i)中所述的回流反应优选为在油浴下进行回流反应。
步骤(i)中所述的回流反应的时间优选为24小时。
步骤(ii)中所述的过滤为依次用滤纸和针式过滤器进行过滤。
所述的针式过滤器的孔径大小为0.22μm。
步骤(ii)中所述的离心的条件均为：8000rpm离心10分钟。
步骤(ii)中所述的超滤离心管的孔径大小为3000Da。
步骤(ii)中所述的透析为采用截留分子量为100～500Da的透析袋进行透析。
步骤(ii)中所述的透析的条件为：以去离子水为透析液透析24h。
步骤(2)中所述的挤压的温度优选为40±2℃。
步骤(2)中所述的挤压为在脂质体挤出仪中进行。
步骤(2)中所述的聚碳酸酯膜的孔径大小为200nm。
步骤(2)中所述的挤出的次数为21次以上。
步骤(2)中所述的透析为采用截留分子量为8000Da的透析膜进行透析。
步骤(2)中所述的透析的时间为24小时。
步骤(2)中所述的超声的条件为：100W超声40～60min；优选为：100W超声50min。
步骤S1和S4中所述的磷脂酶A2水溶液的用量为按其在所述反应体系的终浓度为10～200U/L添加；优选为按其在所述反应体系的终浓度为10、20、50、100和200U/L添加。
步骤S1、S3、S4和S7中所述的包封石墨烯量子点的纳米脂质体的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0.029～0.058mg/ml添加计算；优选为按其在所述反应体系的终浓度为0.054mg/ml添加计算。
步骤S1、S3、S4和S7中所述的水浴反应的条件为：37℃水浴1小时。
步骤S1、S3、S4和S7中所述的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)为按其在所述反应体系的终浓度为0.5～0.6mmol/L添加计算；优选为按其在所述反应体系的终浓度为0.5mol/L添加计算。
步骤S1、S3、S4和S7中所述的H2O2为按其在所述反应体系的终浓度为0.1～0.2mM/L添加计算；优选为按其在所述反应体系的终浓度为0.1mM/L添加计算。
步骤S1、S3、S4和S7中所述的酸性溶液为酸性缓冲液；优选为醋酸-醋酸钠缓冲液；更优选为pH 3.8的醋酸-醋酸钠缓冲液。
步骤S1、S3、S4和S7中所述的继续反应的时间根据应溶液颜色变化，即由无色变成蓝色时终止；优选为15～30分钟；更优选为20分钟。
步骤S1和S3中所述的紫外吸收光谱的波长范围是500～800nm，选取吸光值的波长位置是652nm。
步骤(B)中所述的颜色分量平均值为颜色图像中划定区域内所有像素点各颜色分量除以像素点的个数作为这个区域的各颜色分量的平均值。
步骤S5中所述的位图格式中提取的颜色信息采用RGB(红绿蓝)、HSV(色调、饱和度、明度)、HSL(色调、饱和度、亮度)和CMYK(青-品红-黄-黑)中的任意一种表示；优选采用RGB(红绿蓝)蓝色分量表示；更优选为采用RGB(红绿蓝)中的蓝色(B)分量表示。
所述的基于比色原理检测磷脂酶A2的方法在检测磷脂酶A2(非疾病诊断目的)中的应用。
一种用于实现上述检测磷脂酶A2的方法的检测系统，所述的检测系统为基于智能手机检测系统，包括依次连接的图像采集模块，图像预处理模块，颜色分析模块和检测结果显示模块；
所述的图像采集模块包括手机自带摄像头、比色皿和黑匣子，用于获取标准溶液和待测溶液的颜色图像(即数码照片)；
所述的图像预处理模块为将获取的标准溶液和待测溶液的颜色图像转换为位图格式，以不同的颜色模型进行分析，用于获得标准溶液和待测溶液的颜色分量平均值；
所述的颜色分析模块为根据标准溶液的颜色分量平均值及其浓度绘制关系曲线；
所述的结果显示模块为待测溶液的颜色分量平均值和绘制的关系曲线，获得待测溶液的浓度和/或含量。
所述的比色皿优选为装有传感试剂的比色皿。
所述的传感试剂为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、H2O2和酸性溶液。
所述的酸性溶液为酸性缓冲液；优选为醋酸-醋酸钠缓冲液；更优选为pH 3.8的醋酸-醋酸钠缓冲液。
所述的位图格式中的提取的颜色信息采用RGB(红绿蓝)、HSV(色调、饱和度、明度)、HSL(色调、饱和度、亮度)和CMYK(青-品红-黄-黑)中的任意一种表示；优选采用RGB(红绿蓝)蓝色分量表示；更优选为采用RGB(红绿蓝)中的蓝色(B)分量表示。
所述的颜色分量平均值为颜色图像中划定区域内所有像素点各颜色分量除以像素点的个数作为这个区域的各颜色分量的平均值。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)利用脂质体的包覆功能，将纳米探针与磷脂囊泡结合，提供生化检测传感的新型信号放大策略。
(2)将待测物磷脂酶A2直接作为引起磷脂囊泡破裂的刺激因素，为环境刺激响应的智能仿生微囊泡的设计和构建新型智能仿生系统提供新思路。
(3)利用石墨烯量子点的纳米酶特性，即自身具有独特的类似天然过氧化物酶的催化活性，可替代天然酶用于显色反应。相比使用天然酶，石墨烯量子点具有成本低、易大量制造、便于存储且不易失活等优点。
(4)本发明通过磷脂酶A2特异性破解脂质体，从而释放其中包裹的石墨烯量子点。基于石墨烯量子点具有类天然酶催化活性，能够有效催化底物TMB氧化，伴随着溶液颜色由无色转化为蓝色，这一变化与磷脂酶A2的活性密切相关建立可视化检测磷脂酶A2的检测新原理。
(5)本发明利用智能手机进行图像采集和颜色分析，通过计算标准样品溶液在RGB颜色空间中各个分量的像素值，再通过最小二乘法拟合出磷脂酶A2检测的标准曲线，得到磷脂酶A2线性浓度和颜色分量像素值之间的对应关系；进而计算得出未知样品溶液中磷脂酶A2的浓度。从而实现磷脂酶A2的灵敏、准确、便捷和可视化的检测。
(6)本发明基于智能手机建立的磷脂酶A2检测传感平台，利用智能手机自身的高分辨率摄像头，通过设计手机应用软件对不同浓度试剂反应后的颜色信息进行处理，无需额外的设备和复杂的检测，就能实现对试剂浓度的快速检测。
(7)本发明将石墨烯量子点的类酶催化特性应用到疾病标志物的检测中，并开发智能手机在生物传感器领域用于疾病标志物检测的新应用。
(8)本发明所建立的基于智能手机的磷脂酶A2显色分析检测方法可适用于普遍的生物医学检测，对于医疗条件匮乏地区的医学检测具有巨大的应用价值和市场推广性。
附图说明
图1是本发明基于智能手机的磷脂酶A2的检测方法示意图。
图2是石墨烯量子点的表征图；其中，A为石墨烯量子点的扫描电镜照片；B为石墨烯量子点的原子力显微镜照片。
图3是不同激发波长下的石墨烯量子点发射光谱以及不同反应体系的紫外吸收光谱图；其中，A为在不同激发波长下的石墨烯量子点发射光谱图(插图为白光和365nm紫外光照射时石墨烯量子点溶液的图像)；B为不同反应体系的紫外吸收光谱图(图中：a为TMB+H2O2+GQD，b为TMB+H2O2，c为TMB+GQD，d为H2O2+GQD；插图照片为不同反应体系反应20分钟后的白光下拍摄图像)。
图4是石墨烯量子点与天然辣根过氧化物酶在不同pH条件下的催化活性比较图。
图5是石墨烯量子点与天然辣根过氧化物酶在不同温度条件下的催化活性比较图。
图6是脂质体的表征图；其中，A为脂质体的扫描电镜照片；B为脂质体的粒径分布情况(插图为白光照射时脂质体溶液图像)。
图7是磷脂酶A2活性引起的显色反应结果图；其中，A为不同活性浓度的磷脂酶A2使得脂质体破裂释放石墨烯量子点与TMB和H2O2反应后的紫外吸收光谱图；B为在652nm处的溶液吸光度随磷脂酶A2活性浓度变化的标准曲线。
图8是基于石墨烯量子点脂质体的磷脂酶A2显色检测的选择性实验结果。
图9是一种基于智能手机的磷脂酶A2的颜色检测系统图。
图10是智能手机对同一照片进行颜色检测分析后以不同颜色分量模型的显示界面图。
图11是不同活性浓度磷脂酶A2的图像的相应颜色模型的线性拟合结果图(磷脂酶A2的活性浓度分别为0，10，20，50，100，150，200，300U/L)；其中，A是RGB数值随磷脂酶A2活性浓度变化的拟合曲线；B是HSL数值随磷脂酶A2活性浓度变化的拟合曲线；C是HSV数值随磷脂酶A2活性浓度变化的拟合曲线；D是CMYK数值随磷脂酶A2活性浓度变化的拟合曲线。
图12是RGB颜色模型中B分量随磷脂酶A2活性浓度变化的标准曲线以及待测溶液中磷脂酶A2活性浓度的手机分析结果显示界面图；其中，A为RGB颜色模型中B分量随磷脂酶A2活性浓度变化的标准曲线；B为待测溶液中磷脂酶A2活性浓度的手机分析结果显示界面。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例1一种石墨烯量子点合成方法及其类过氧化物酶催化活性。
1.1石墨烯量子点合成
称取0.4g carbot vulcan XC-72碳黑(品牌：麦考林，购于广州普智生物科技有限公司)，加入到100mL 6mol/L的HNO3中，130℃(油浴)条件下搅拌回流反应24小时。然后将反应后的溶液冷却至室温，吸取上清液，加热除酸至pH为5～7，最终溶液体积为50mL，命名为溶液1。将得到的溶液1用滤纸(中速定性滤纸(速率102)，孔径为30～50微米，品牌：Biorad，北京百诺威生物科技有限公司)过滤两次，得到溶液2。再将溶液2用0.22μm的针式过滤器进行再次过滤，得到溶液3。将溶液3在8000rpm下离心10分钟，然后将上清液吸取到超滤离心管(孔径大小为3000Da)中，得到溶液4。将溶液4在8000rpm下离心(10分钟)，基本将所有清液与沉淀分离，最后将分离得到的清液放入截留分子量为100～500Da的透析袋中，以去离子水为透析液，透析24h。透析结束后，将溶液加到离心管内，冻干处理后即为石墨烯量子点(GQD)。
石墨烯量子点的扫描电镜照片如图2A所示，原子力显微镜照片如图2B所示。石墨烯量子点在不同激发波长(荧光分光光度计，405、425、445、465、485、505、525nm)下的发射光谱，以及在白光和365nm紫外光照射下的石墨烯量子点溶液的图像如图3A所示。
1.2石墨烯量子点的催化活性
将1.1中合成的石墨烯量子点加入到含有过氧化氢(购于上海麦克林生化科技有限公司，纯度大于99％)和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB，购于上海麦克林生化科技有限公司，纯度大于99％)的醋酸缓冲溶液(pH＝4)中，检测石墨烯量子点的催化活性；其中，反应体系中石墨烯量子点的浓度为0.004毫克/毫升，TMB的浓度为0.5mM，H2O2的浓度为0.1mM。
石墨烯量子点具有与天然过氧化物酶相似的催化活性，即在酸性环境下且过氧化氢存在条件下有效催化酶反应底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，使其发生氧化反应由无色反应物转变为蓝色产物。因此，当pH3.8的醋酸缓冲溶液中同时存在石墨烯量子点、TMB和过氧化氢时，反应体系的溶液颜色将有无色变为蓝色，图3B显示了不同反应体系反应20分钟后的紫外吸收光谱图(插图照片为不同反应体系反应20分钟后的白光下拍摄图像)。这一结果证明石墨烯量子点具有优异的类天然酶活性，可替代天然酶用于显色反应。
1.3石墨烯量子点的稳定性试验
1.3.1石墨烯量子点与天然辣根过氧化物酶在不同pH条件下的催化活性比较
石墨烯量子点作为纳米酶，自身具有与天然辣根过氧化物酶类似的催化活性，即催化过氧化氢还原生成水和氧气，同时催化其底物TMB氧化生成氧化态的TMB。本实验的目的在于比较石墨烯量子点与天然辣根过氧化物酶在不同pH条件下的催化活性，具体步骤如下：
将1.1中合成的石墨烯量子点和天然辣根过氧化物酶(150u/mg，购于上海麦克林生化科技有限公司)分别溶于0.5毫升不同pH(pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)缓冲溶液中，获得的含有石墨烯量子点的溶液的最终浓度均为20微克/毫升，含有天然辣根过氧化物酶的的溶液的最终浓度均为10纳克/毫升；其中所用缓冲液为：醋酸缓冲溶液(50mM，pH 2.0-pH 5.0)，磷酸缓冲溶液(50mM，pH6.0-7.0)以及Tris-盐酸缓冲溶液(50mM，pH8.0-10.0)。在室温下孵育4个小时后，再分别加入终浓度为0.6mmol/L 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB，购于上海麦克林生化科技有限公司，纯度大于99％)溶液和1mM过氧化氢溶液进行催化反应。
结果如图4所示：由图4的结果可知，石墨烯量子点与天然过氧化物酶分别在不同pH条件下经过4小时的孵育后，二者针对氧化还原反应的催化活性产生了巨大的差别。仅在适合于大部分生物物质保持其活性的适宜pH条件下如pH6-7时，天然辣根过氧化物酶具有良好的催化功能；当环境的pH在较高或较低数值时，天然辣根过氧化物酶的催化活性将受到严重的破坏，比如溶液的pH2或pH10时，过氧化物酶的催化活性大大降低了约60％。相比之下，纳米材料石墨烯量子点在较广的pH范围内能够维持良好的催化活性，在pH2到pH10这样的pH变化范围内，其催化功能未受明显影响，催化活性一直保持在约90％以上。这一结果说明相比于天然酶，石墨烯量子点在不同pH条件的外界环境下能够有效地维持其催化活性，不易受环境酸碱影响而失去催化活性，具有应用于更广泛检测条件的潜力。
1.3.2石墨烯量子点与天然辣根过氧化物酶在不同温度条件下的催化活性比较
本实验目的在于比较石墨烯量子点与天然辣根过氧化物酶在不同温度条件下的催化活性，具体步骤如下：将1.1中合成的石墨烯量子点和天然辣根过氧化物酶(150u/mg)分别溶于0.5毫升pH6的磷酸缓冲溶液(50mM)中，分别最终浓度分别为20微克/毫升和10纳克/毫升，在不同温度(4、15、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100℃)下孵育4个小时后，再分别加入终浓度为0.6mmol/L TMB溶液和1mM过氧化氢溶液进行催化反应。
结果如图5所示：由图5的结果可知，石墨烯量子点与天然过氧化物酶分别在不同温度条件下经过4小时的孵育后，二者针对氧化还原反应的催化活性产生了巨大的差别。天然辣根过氧化物酶是生物蛋白质，因此较高的环境温度容易致其失活。其催化活性随着温度高于40℃时发生剧烈的降低，当环境温度为70℃以上时，天然辣根过氧化物酶的催化活性仅存20％到30％。相比之下，石墨烯量子点作为无机纳米材料具有很强的结构稳定性，其催化活性基本不受环境温度的改变而改变，在低温或高温条件下催化活性都保持在95％到100％之间。这一结果说明相比于天然酶，石墨烯量子点的催化活性受外界环境的温度影响较小，能够在温度较为极端的情况下使用。
通过以上环境pH和温度对于石墨烯量子点和天然过氧化物酶催化活性的影响实验，可以证明石墨烯量子点较天然酶不仅具有成本低，可大量制造的优点，而且具有优异的稳定性，便于保存和在酸碱或高温条件下使用，能够成为天然酶的替代物用于更广泛的用途。
实施例2一种包覆石墨烯量子点的脂质体的合成方法
卵磷脂和胆固醇以5：1(摩尔比，共43.2mmol，30mg)的比例混合，溶于4ml氯仿中，超声(功率100W)5分钟使其分散均匀。随后通过旋转蒸发器在40℃下、减压旋蒸1小时以除去有机溶剂，烧瓶底部均匀的形成一层透明薄膜。此时加入2mL 0.1mg/ml的石墨烯量子点溶液(将实施例1制备石墨烯量子点溶于磷酸缓冲溶液(pH7.0)中)，冰浴超声(功率100W)50分钟，得到乳白色的浑浊液体。将其通过200nm的聚碳酸酯膜(即脂质体挤出仪使用的滤膜孔径为200nm)，反复挤压21次(40℃)。最后将得到的脂质体溶液用透析膜(截留分子量小于8000D)透析，以去离子水为透析液，透析24小时，移除未包封的石墨烯量子点，将获得的脂质体溶液储存在4℃下。
脂质体的扫描电镜结果如图6A所示，粒径分布情况如图6B所示(插图为白光照射时脂质体溶液图像)。从粒径分布和扫描电镜结果可知，本实施例制备的脂质体囊泡尺寸均匀，分散性好。
实施例3利用包覆石墨烯量子点的脂质体的特性检测磷脂酶A2的方法
本发明提供一种利用磷脂酶A2特异性破裂脂质体，释放其中包覆的石墨烯量子点，利用其类过氧化物酶的催化特性进行显色检测磷脂酶A2的方法。
3.1将4uL 13.6mg/mL的脂质体溶液(即实施例2制备的脂质体)用水稀释50倍，取195uL稀释后的脂质体，然后加入5uL不同活性浓度的磷脂酶A2在37℃下反应1h。然后加入785uL缓冲液(醋酸/醋酸钠缓冲液，0.1mol/L，pH＝3.8)，再加入10uL 50mM TMB溶液,然后加入5uL 20mM H2O2溶液，反应20分钟后(颜色变化为无色变成蓝色)，测量反应体系紫外吸收光谱；其中，反应体系中磷脂酶A2的终浓度分别为0、2、5、10、20、50、100、150、200、300U/L。
结果如图7所示：溶液在652nm处的吸光度随着磷脂酶A2活性浓度的增加而增加(图7A)；这一变化在磷脂酶A2的活性浓度在10到200U/L之间有良好的线性关系(图7B)。
3.2为验证该方法对于磷脂酶A2的检测具有单一性响应，采用不同类型的磷脂酶进行选择性实验。10uL 50U/L的磷脂酶C(PLC)，磷脂酶D(PLD)(磷脂酶C和磷脂酶D，品牌：源叶生物，均购自广州齐云生物科技有限公司)和磷脂酶A2(PL A2；品牌：源叶，上海源叶生物科技有限公司)溶液，分别与50倍稀释后的脂质体(即实施例2制备的脂质体)溶液200uL混合水浴1小时(37℃)，然后加入785uL缓冲液(醋酸/醋酸钠缓冲液，0.1mol/L，pH＝3.8)、TMB和H2O2反应20分钟(体系中H2O2和TMB最终浓度分别为0.1mM和0.5mM)，再测紫外吸收光谱。
结果如图8所示：磷脂酶C，磷脂酶D溶液混合水浴后的脂质体溶液，652nm处的紫外吸收峰值并没有明显变化，而与磷脂酶A2溶液混合水浴后的脂质体，652nm处的紫外吸收峰值显著升高，表面该方法对于检测磷脂酶A2具有良好的选择性。
实施例4基于手机的颜色分析检测系统和方法
4.1本发明中的检测所需硬件包括一个黑匣子(用于遮挡外部光源，可自制，暗箱或其他均可)、一个比色皿和一个智能手机；
本发明中的基于智能手机的检测系统包括依次连接的图像采集模块，图像预处理模块，颜色分析模块和检测结果显示模块；
所述的图像采集模块包括手机自带摄像头、比色皿和黑匣子；所述的比色皿装有传感试剂；将样品溶液加入到装有传感试剂的比色皿进行反应，反应完全后显色并置于黑匣子中，通过手机自带摄像头对比色皿中的溶液拍照，获取反应溶液的颜色图像(即数码照片)；所述的样品溶液包括已知浓度的标准溶液和未知浓度的待测溶液；除了直接调用手机摄像头实时拍照外，还可以采用其他方式(如相机等)获取反应溶液的颜色图像并存储于手机本地相册中，再进行后续操作；
所述的图像预处理模块为将获取的反应后的溶液的颜色图像转换为位图格式，以不同的颜色模型分析；基于智能手机的安卓系统，采用Java工具语言编写应用程序将图片位图格式中的像素信息转化为颜色信息，通常以红绿蓝(RGB)形式表示，RGB又可转换成其他对应的颜色模型，如色调饱和度明度(HSV)、色调饱和度亮度(HSL)和青-品红-黄-黑(CMYK)颜色模型，最终提取出对应的各颜色分量平均值(平均值是指兴趣区域所有点的各颜色RGB、HSV、HSL、CMYK平均值，就是所拍摄图像中划定区域内所有像素点各颜色分量都求出来，然后除以像素点的个数作为这个区域的各分量平均值)(形成多模式颜色检测分析系统)；在手机进行反应溶液的颜色检测时，调取拍摄的颜色图像后，分别点击RGB、HSV、HSL、CMYK虚拟按键，手机软件界面就会显示出该区域的各颜色模型分量参数(图10)，即可通过图像预处理模块获得反应后的标准溶液的颜色分量平均值(在RGB、HSV、HSL或CMYK颜色空间中各个分量的像素值)以及待测溶液的颜色分量平均值；
所述的颜色分析模块为根据标准溶液的颜色分量平均值及其浓度绘制关系曲线；
所述的结果显示模块为根据待测溶液的颜色分量平均值和绘制的关系曲线，计算得到待测溶液的浓度，也可以在进一步根据获得的待测溶液的浓度和体积，获得其含量；检测结果显示中调取图片的方式有两种，第一种是直接调用手机摄像头实时拍照，并对拍摄所得照片自动进行兴趣区的划定；第二种是调用手机本地相册中已有的图像手动进行兴趣区的划定；兴趣区图像加载到分析界面后(本实验采用的是第二种方式，分析照片时选用“file”)，计算得出图像的像素信息并进行浓度检测与显示。
4.2本发明中基于手机的颜色分析检测磷脂酶A2的分析方法的原理如图1所示，检测系统如图9所示，其检测方法具体如下：
(1)配制至少五个浓度的磷脂酶A2水溶液并将其置于比色皿中，然后分别加入实施例2中制备的包覆石墨烯量子点的脂质体混合后水浴，再加入传感试剂3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、H2O2和酸性溶液(pH3.8的醋酸缓冲溶液)进行反应，待反应结束后通过图像采集模块获取反应溶液的颜色图像(即数码照片)；本实施例配制的反应体系中，磷脂酶A2的终浓度为10、20、50、100、150、200、300U/L；TMB的终浓度为0.5mM；H2O2的终浓度为0.1mM；包覆石墨烯量子点的脂质的终浓度为0.054mg/ml，所用酸性溶液为pH 3.8、0.1mol/L的醋酸/醋酸钠缓冲液；本实验的全部反应都在比色皿中进行，也具有先在试管、烧杯等容器中反应，等反应结束后再将其转入到比色皿中；
(2)根据步骤(1)中获取的反应溶液的颜色图像，通过图像预处理模块分别获取RGB、HSV、HSL以及CMYK颜色分量平均值；
(3)根据步骤(2)中获取的RGB、HSV、HSL以及CMYK颜色分量平均值与磷脂酶A2水溶液的浓度，通过颜色分析模块获得关系曲线；这里可与分光光度计测得的曲线进行比较，从中选出一个拟合度最高的关系曲线作为后续测试的标准曲线，内置于手机应用软件中；其中，分光光度计测得的曲线为通过如下方法获得：配制至少五个浓度的磷脂酶A2水溶液然后分别加入实施例2中制备的包覆石墨烯量子点的脂质体混合后水浴，再加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、H2O2和酸性溶液进行反应，待反应结束后用分光光度计分别测量其吸光值，再根据吸光值与与磷脂酶A2水溶液的浓度绘制曲线；其中，反应体系中各物质及其浓度与上述步骤(1)相同；
对已知不同活度浓度(10、20、50、100、150、200、300U/L)的磷脂酶A2与TMB和H2O2反应的显色溶液相对应的RGB、HSV、HSL、CMYK各颜色分量平均值的数据进行拟合比较，结果如图11所示；本发明衡量选取灵敏度和拟合度最好的RGB数据模型中的B分量拟合曲线(图12A)作为后续测试的内置标准曲线；
(4)向待测样品加入实施例2中制备的包覆石墨烯量子点的脂质体混合后水浴，再加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、H2O2和酸性溶液进行反应，待反应结束后通过图像采集模块和图像预处理模块测定反应后的待测溶液的颜色分量平均值，然后根据步骤(3)中的关系曲线，计算得到待测溶液中磷脂酶A2的浓度和/或含量；其中，反应体系中TMB、H2O2以及所用酸性溶液与上述步骤(1)相同；
未知磷脂酶A2活性浓度的溶液在进行显色后置于暗箱中用手机拍摄溶液图像后，应用软件将根据该图像的颜色分量平均值带入内置标准曲线进行颜色分析检测，手动在手机软件界面点击“浓度(Concentration)”虚拟按键，手机屏幕上将显示所获得的待测磷脂酶A2的活性浓度数值，操作如图12B所示。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于比色原理检测磷脂酶A2的方法，其特征在于，为通过如下任一种方法实现：
（A）基于显色法检测磷脂酶A2：
S1、配制至少五个浓度的磷脂酶A2水溶液，然后分别加入包覆石墨烯量子点的脂质体混合后水浴反应，再加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、H2O2和酸性溶液继续反应，待反应结束后测量紫外吸收光谱，得到吸光值；
S2、根据步骤S1测量得到的吸光值与磷脂酶A2水溶液的浓度绘制标准曲线；
S3、将待测样品与包覆石墨烯量子点的脂质体混合后水浴反应，然后加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、H2O2和酸性溶液继续反应，待反应结束后测量紫外吸收光谱，得待测样品的吸光值；再根据步骤S2绘制的标准曲线获得待测样品中磷脂酶A2的浓度和/或含量；
（B）基于智能手机检测系统检测磷脂酶A2：
所述的基于智能手机检测系统包括依次连接的图像采集模块，图像预处理模块，颜色分析模块和检测结果显示模块；
所述的图像采集模块包括手机自带摄像头、比色皿和黑匣子，用于获取标准溶液和待测溶液的颜色图像；
所述的图像预处理模块为将获取的标准溶液和待测溶液的颜色图像转换为位图格式，以不同的颜色模型分析，用于获得标准溶液和待测溶液的颜色分量平均值；
所述的颜色分析模块为根据标准溶液的颜色分量平均值及其浓度绘制关系曲线；
所述的结果显示模块为待测溶液的颜色分量平均值和绘制的关系曲线，获得待测溶液的浓度和/或含量；
所述的基于智能手机检测系统检测磷脂酶A2，通过如下步骤实现：
S4、配制至少五个浓度的磷脂酶A2水溶液，然后分别加入包覆石墨烯量子点的脂质体混合后水浴反应，再加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、H2O2和酸性溶液继续反应，待反应结束后用智能手机检测系统中的图像采集模块获取反应后的溶液的颜色图像；
S5、将步骤S4中获取颜色图像通过智能手机检测系统中的图像预处理模块，分别获取其颜色分量平均值；
S6、根据步骤S5中获取的颜色分量平均值和磷脂酶A2水溶液的浓度，通过智能手机检测系统中的颜色分析模块获得关系曲线；
S7、将包覆石墨烯量子点的脂质体加入到待测样品中，混合后水浴反应，再加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、H2O2和酸性溶液继续反应，待反应结束后通过智能手机检测系统中图像采集模块和图像预处理模块测定待测溶液的颜色分量平均值，然后根据步骤S6中的关系曲线，计算得到待测溶液中磷脂酶A2的浓度和/或含量；
步骤S1、S3、S4和S7中所述的包覆石墨烯量子点的脂质体通过如下方法制备得到：
（1）将卵磷脂与胆固醇加入到氯仿中，超声使其分散均匀，然后旋蒸除去氯仿，得到脂质体薄膜；
（2）将石墨烯量子点溶液加入到脂质体薄膜中，冰浴超声分散均匀，得到混合溶液I；然后将混合溶液I通过聚碳酸酯膜反复挤压，得到混合溶液II；再将混合溶液II进行透析，得到包覆石墨烯量子点的脂质体；
步骤（1）中所述的卵磷脂与胆固醇的摩尔比为1~5：1；
步骤（2）中所述的石墨烯量子点与所述卵磷脂和胆固醇的总质量比为0.02～0.4:30。
2.根据权利要求1所述的基于比色原理检测磷脂酶A2的方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的石墨烯量子点溶液为石墨烯量子点水溶液，或将石墨烯量子点溶于磷酸缓冲溶液得到的溶液；
所述的石墨烯量子点溶液的浓度为0.01～0.2mg/mL。
3.根据权利要求1所述的基于比色原理检测磷脂酶A2的方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的石墨烯量子点通过如下方法制备得到：
（i）将碳黑加入到浓硝酸溶液中，于130℃条件下搅拌回流反应，待反应结束后冷却至室温，吸取上清液，加热除酸至pH为5～7，得到溶液A；
（ii）将溶液A过滤，取滤液；然后将滤液进行离心，取上清液；再将上清液加入到超滤离心管中，离心，取清液；最后将清液进行透析，待透析结束后，冷冻干燥，得到石墨烯量子点；
步骤（i）中所述的碳黑为carbot vulcan XC-72碳黑；
步骤（i）中所述的浓硝酸溶液的浓度5～8 mol/L；
步骤（i）中所述的回流反应为在油浴下进行回流反应；
步骤（i）中所述的回流反应的时间为24小时；
步骤（ii）中所述的过滤为依次用滤纸和针式过滤器进行过滤；
所述的针式过滤器的孔径大小为0.22μm；
步骤（ii）中所述的离心的条件均为：8000 rpm离心10 分钟；
步骤（ii）中所述的超滤离心管的孔径大小为3000 Da；
步骤（ii）中所述的透析为采用截留分子量为100~500 Da的透析袋进行透析；
步骤（ii）中所述的透析的条件为：以去离子水为透析液透析24h。
4.根据权利要求1所述的基于比色原理检测磷脂酶A2的方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的超声的条件为：100W超声5～10 min；
步骤（1）中所述的旋蒸的条件为：40℃旋蒸15~60分钟；
步骤（2）中所述的挤压的温度为40±2℃；
步骤（2）中所述的挤压为在脂质体挤出仪中进行；
步骤（2）中所述的聚碳酸酯膜的孔径大小为200nm；
步骤（2）中所述的挤出的次数为21次以上；
步骤（2）中所述的透析为采用截留分子量为8000 Da的透析膜进行透析；
步骤（2）中所述的透析的时间为24小时；
步骤（2）中所述的超声的条件为：100W超声40～60min。
5.根据权利要求1所述的基于比色原理检测磷脂酶A2的方法，其特征在于：
步骤S1和S4中所述的磷脂酶A2水溶液的用量为按其在所述反应体系的终浓度为10～200U/L添加；
步骤S1、S3、S4和S7中所述的包覆石墨烯量子点的脂质体的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0.029~0.058 mg/ml添加计算；
步骤S1、S3、S4和S7中所述的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺为按其在所述反应体系的终浓度为0.5～0.6mmol/L添加计算；
步骤S1、S3、S4和S7中所述的H2O2为按其在所述反应体系的终浓度为0.1～0.2mM/L添加计算；
步骤S1、S3、S4和S7中所述的酸性溶液为酸性缓冲液；
步骤S5中所述的位图格式中提取的颜色信息采用RGB、HSV、HSL和CMYK中的任意一种表示。
6.根据权利要求1所述的基于比色原理检测磷脂酶A2的方法，其特征在于：
步骤S1和S4中所述的磷脂酶A2水溶液的用量为按其在所述反应体系的终浓度为 10、20、50、100和200 U/L添加；
步骤S1、S3、S4和S7中所述的包覆石墨烯量子点的脂质体的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0.054 mg/ml添加计算；
步骤S1、S3、S4和S7中所述的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺为按其在所述反应体系的终浓度为0.5mmol/L添加计算；
步骤S1、S3、S4和S7中所述的H2O2为按其在所述反应体系的终浓度为0.1mM/L添加计算；
步骤S1、S3、S4和S7中所述的酸性溶液为pH 3.8的醋酸-醋酸钠缓冲液；
步骤S5中所述的位图格式中提取的颜色信息采用采用RGB中的蓝色分量表示。
7.根据权利要求1所述的基于比色原理检测磷脂酶A2的方法，其特征在于：
步骤S1、S3、S4和S7中所述的水浴反应的条件为：37℃水浴1小时；
步骤S1、S3、S4和S7中所述的继续反应的时间为15～30分钟。
8.权利要求1～7任一项所述的基于比色原理检测磷脂酶A2的方法在非疾病诊断目的的检测磷脂酶A2中的应用。
9.一种用于实现权利要求1～7任一项所述的检测磷脂酶A2的方法的检测系统，其特征在于：所述的检测系统为基于智能手机检测系统，包括依次连接的图像采集模块，图像预处理模块，颜色分析模块和检测结果显示模块；
所述的图像采集模块包括手机自带摄像头、比色皿和黑匣子，用于获取标准溶液和待测溶液的颜色图像；
所述的图像预处理模块为将获取的标准溶液和待测溶液的颜色图像转换为位图格式，以不同的颜色模型进行分析，用于获得标准溶液和待测溶液的颜色分量平均值；
所述的颜色分析模块为根据标准溶液的颜色分量平均值及其浓度绘制关系曲线；
所述的结果显示模块为待测溶液的颜色分量平均值和绘制的关系曲线，获得待测溶液的浓度和/或含量。
10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于：
所述的位图格式中提取的颜色信息采用RGB、HSV、HSL和CMYK中的任意一种表示。
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Also Published As
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