JPH0556797A - リポソーム破壊物質の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】反応素子封入リポソームをリポソーム破壊物質
を用いて破壊する工程、該リポソームより放出される反
応素子を試薬と反応させる工程、次いで該反応により生
ずる生成物を検出する工程を有することを特徴とするリ
ポソーム破壊物質の検出方法。 【効果】リポソーム破壊物質、例えばホスホリパーゼ類
ではほ乳類由来のＰＬＡ２を簡易にかつ高感度に検出す
ることができることから、例えば生体において白血球、
すい臓及び肝臓等の特異臓器及び組織特異的に発現して
いるＰＬＡ２の精製等における酵素活性の検出に有用で
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、反応素子を封入したリ
ポソームを破壊させるリポソーム破壊物質、例えばリパ
ーゼのような酵素や生理活性物質などを簡便にかつ高感
度に検出する方法に関する。更に詳しくは、このような
反応素子を封入したリポソームを被検体中のリパーゼ等
の酵素や生理活性物質の作用により破壊し、リポソーム
から放出された反応素子をこれと反応する酵素基質等の
試薬と反応させ、これにより生じる反応生成物を分光光
度計等の分光学的方法または肉眼などにより検出する方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】リポソ
ームをある目的物質の検出手段に利用しようとする方法
は、従来よりいくつかの報告がなされている。例えば、
免疫リポソームを用いた抗原の検出に補体を用いてリポ
ソームを破壊する方法が知られている。即ち、蛍光物質
等を封入したリポソームの表面に抗体を結合させ、抗原
と反応後、補体を用いてリポソームを破壊し、蛍光強度
を測定することによって抗原を検出する方法（特開昭６
３−１５１８５８号公報）が知られている。

【０００３】このようにリポソームは免疫測定試薬とし
て、あるいはＤｒｕｇ Ｄｅｒｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅ
ｍ（ＤＤＳ）等（特開昭６４−５７１５２号公報，特開
昭６１−２６９０７０号公報）においてよく用いられて
いる。しかし、このようなリポソームを破壊する物質自
体を積極的に簡易にかつ高感度に検出する方法は未だ知
られていない。例えば、一般的にリポソームを破壊する
物質として知られているＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，Ｔ
ｗｅｅｎ ２０及びＳｏｄｉｕｍ Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌ
ａｔｅ等の化学的に合成された界面活性剤は、リポソー
ムを破壊する物質として知られてはいるが、これらはそ
の性質を利用して他の物質を検出する手段として利用さ
れるのみで、そのもの自体を検出しているのではない。

【０００４】その他、現在リポソーム破壊物質として知
られているタンパク質としては、例えば２６個のアミノ
酸からなる生理活性ペプチド物質である、蜂毒のメリチ
ン〔Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄ，Ｗ．Ｊ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈ
ｅｍ．３０：１４４１（１９８４）〕が知られている。
これはホスホリパーゼを活性化して作用する物質であ
り、また前記の免疫リポソームの破壊に用いられる補体
〔特開昭６０−１３８４６５号公報、Ｋｉｎｓｋｙ，
Ｓ．Ｃ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８：４１４９
（１９６９）〕等も、リポソームを破壊する物質として
知られている。しかし、前記のようにこれらのリポソー
ム破壊物質自体を簡易にかつ高感度に検出する方法は未
だ見い出されていない。

【０００５】例えば、リポソームの膜を破壊する活性を
有する物質の検出方法としては、赤血球を用いた溶血反
応を調べる方法が従来より知られている〔Ｈａｂｅｒｍ
ａｎｎ，Ｅ．，ａｎｄ Ｒｅｉｚ，Ｋ．Ｇ．，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｚ．３４１（１９６５）４５１〕。しかし、こ
の方法は高感度な方法ではなく、定量性に乏しく精度的
に問題があること、各種の反応試薬を用いる毎に遠心分
離等の煩雑な操作を伴うこと、さらに反応時間が１〜２
時間に及ぶこと等が問題点として指摘されている。

【０００６】一方、リパーゼ類の検出方法としては各種
の方法が知られており、例えばリパーゼの基質である脂
質分子を溶液中でエマルジョンに分散させ、これに酵素
溶液を添加し酵素反応生成物を定量する方法（Ｍｉｃｈ
ａｅｌ Ａ．Ｗｅｌｌｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
８，４１４（１９６９）， Ｊ．Ｈ．Ｍｏｏｒｅ，Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ。Ａｃｔａ ８４，４１
（１９６４））が知られているが、この方法はリポソー
ムを破壊することによるものではない。従って、本発明
の目的はリポソーム破壊物質を簡易にかつ高感度に検出
する方法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは前記課題を
解決するために鋭意研究した結果、リポソームの膜に対
する破壊活性を有する物質、例えば各種のリパーゼ等の
市販酵素、生理活性物質及び界面活性剤等を用い、反応
素子封入リポソームの破壊によって放出される反応素子
による反応を指標としてリポソームの破壊活性を調べた
結果、本発明の方法がリポソーム破壊物質の活性をよく
反映した高感度な検出方法であることを見い出し、しか
も従来法以上に短時間でできる簡易な方法として有用で
あることを見い出し本発明に至った。即ち、本発明の要
旨は反応素子封入リポソームをリポソーム破壊物質を用
いて破壊する工程、該リポソームより放出される反応素
子を試薬と反応させる工程、次いで該反応により生ずる
生成物を検出する工程を有することを特徴とするリポソ
ーム破壊物質の検出方法に関する。

【０００８】本発明における反応素子としては、反応触
媒機能を持った酵素が最適であるが、呈色、白濁等の分
光学的に検出可能な反応系につながるような機能性を持
った分子であれば特に限定はされない。リポソーム中へ
の封入数から言えば、低分子で比較的安定且つ安価なも
のがよい。このような反応素子としては例えば、フォス
ファターゼ、グルコオキシターゼ、パーオキシターゼ、
グルコースオキシターゼが例示され、好ましくは Horse
radish Peroxidase(ＨＲＰ）が挙げられる。反応素子と
してこの酵素を用いた場合、リポソームから放出された
ＨＲＰと反応する試薬として蛍光基質から発光基質まで
多種類の酵素基質を入手出来る点で有利である。同様に
例えば、反応素子としてアルカリホスファターゼを用い
る場合、試薬として化学発光性基質である３−（２’−
ｓｐｉｒｏａｄａｍａｎｔａｎｅ）−４−ｍｅｔｈｏｘ
ｙ−４−３（３”−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）−ｐ
ｈｅｎｙｌ−１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ（ＡＭＰＰ
Ｄ）〔Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ，Ｉ．Ｎａｔｕｒｅ ３３
８，５９９−６００（１９８９）〕を用いることができ
る。

【０００９】このようにリポソームより放出される反応
素子を試薬と反応させる工程で用いられる試薬として
は、リポソーム内部に封入された酵素等の反応素子と反
応して生ずる生成物を、発色量の測定等により検出でき
る物質が用いられる。但し、試薬のなかにはそれ自身で
膜透過能の強いものもあるので、作製したリポソーム膜
に対応した試薬を選定する必要がある。また、試薬の濃
度による浸透圧の影響により膜を破壊する場合もある。
また、イオン強度があまり高いとリポソーム膜にダメー
ジを与える可能性があるが、この傾向は緩衝液の種類に
よって緩和され、またブランク値をとっておけば十分是
正される。このような観点からすれば、ＨＲＰを反応素
子とする場合、ＨＲＰに対する酵素基質であるＨ₂Ｏ₂
−ＴＭＢ系は後記の実施例で示すように、リポソームへ
の影響がなく、しかも反応素子であるＨＲＰに対して相
関した反応を示すことから、好適な試薬であり、好まし
い組合わせとして挙げることができる。

【００１０】また、酵素以外に酵素基質を反応素子とし
て封入した場合にも、該反応素子の放出量を酵素を試薬
として添加することにより検出することも可能である。
具体的には、蛍光基質であるメチルウンベリフェロンの
ガラクトピラノース配糖体を反応素子とし、ガラクトシ
ダーゼを試薬として添加する組み合わせが例示される。

【００１１】さらに、反応素子としてビオチンまたは抗
原等の化学物質を用いる場合、これらの反応素子の認識
物質であるアビジンまたは抗体等をそれぞれ試薬として
用い、酵素等で標識した未封入の化学物質とリポソーム
から放出される反応素子としての化学物質との間で認識
物質への結合に競争反応を行なわせる方法も有効であ
る。

【００１２】反応生成物を検出する工程における手段と
しては、分光学的、電気化学的および生化学的等がある
が、なかでも分光光度計等を用いて分光学的に検出する
方法が好ましい。

【００１３】本発明におけるリポソームは、リパーゼ等
のリポソーム破壊物質により分解される燐脂質等の脂質
を構成成分とし、かつ内部に反応素子を封入したリポソ
ームである。組成成分としてはホスファチジルコリン
（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）ま
たはホスファチジルグリセロール（ＰＧ）等が例示され
る。これらの脂質の一種類以上の燐脂質を主成分とする
リポソーム構成脂質としては、Dimyristoyl Phosphatid
yl Choline(DMPC)、Cholesterol(CHOL) 、Dicetylphosp
hate(DCP) 、Dilauroyl Phosphatidylethanolamine(DLP
E)を挙げることができる。

【００１４】本発明においては、これらのうち特に限定
されるものではないが、好ましくは常温付近でリポソー
ム膜の流動性を維持し、かつ安定なリポソームの形成に
寄与しうる前記の燐脂質及びコレステロールを含むもの
が望ましい。又これらの燐脂質以外にも検出目的とする
リパーゼ等の酵素類の基質特異的な構造を有する脂質分
子をリポソームの構成脂質として組み入れて用いること
もできる。但し，リポソーム内部への反応素子の封入能
を保持するためにも、これらの構成脂質の種類と組成を
検討する必要がある。

【００１５】前記のような反応素子封入リポソームを破
壊する工程で用いられるリポソーム破壊物質とは、リポ
ソームに作用してリポソームの膜を破壊し、内部に封入
した反応素子を放出させることができる物質をいい、本
発明においては検出の目的物質とされるものをいう。リ
ポソーム破壊物質としては、このような性質を有する物
質であれば特に限定されるものではないが、通常、酵素
または生理活性物質が挙げられる。酵素としてはホスホ
リパーゼＡ２のようなリパーゼ類が挙げられ、生理活性
物質としては、リパーゼ活性化因子、膜透過性タンパク
質、膜結合性タンパク質、金属キレート剤、界面活性剤
など膜への作用を有するものが挙げられる。

【００１６】本発明の方法について、さらに具体的に説
明する。例えば、リポソーム膜の構成脂質として脂質Ｄ
ＭＰＣ、ＣＨＯＬ、ＤＣＰを各々１３．０、１．５、
１．０ｍｇ用い、内部にＨＲＰ酵素を封入したリポソー
ムを調製し、またＣＨＯＬの代わりにＤＬＰＥを用いて
粒径約０．１μｍのＳｍａｌｌ Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ
ｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ（ＳＵＶ）を得、これらのＨＲＰ酵
素封入リポソームを用いて各種リパーゼなどのリポソー
ム破壊物質の活性を測定した場合、各種リパーゼによる
リポソームの破壊能に著しい差が生じている。

【００１７】リポソーム破壊活性の測定法は以下の手順
による。即ち、反応素子として前記のＨＲＰを封入した
リポソーム約２００〜３００ｐｍｏｌをＨｅｐｅｓ緩衝
液（pH７．２）に溶解し、リポソーム破壊物質として市
販の各種リパーゼを燐酸緩衝液（pH７．２）に溶解して
２〜１０ｕｎｉｔｓ（Ｕ）の溶液にしたもの、Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００、Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌ
ａｔｅ等の界面活性剤を水溶液に溶解したもの、または
脂質分子と錯体を形成する抗生物質等の溶液を用い、こ
れらを前記のＨＲＰ酵素封入リポソームと反応させリポ
ソームを破壊した。

【００１８】１〜２分後にＨＲＰの基質である過酸化水
素−ベンジジン色素（Ｈ₂ Ｏ₂ −ＴＭＢ）溶液を添加
し、室温で放置または３７℃でインキュベーションしな
がら、数分間隔で約３０分間、リポソームより放出され
たＨＲＰによる酵素反応の結果生じる生成物量を波長６
５０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。その
結果、用いたリポソーム破壊物質の特異性、濃度等に依
存して、放出されたＨＲＰによる酵素反応の結果生じる
基質の変化量である６５０ｎｍの吸光度に大きな差を生
じた。また、精製リポソームを１ｍＭＣａＣｌ₂ のＨｅ
ｐｅｓ緩衝溶液に希釈調製したものを用いて同じ実験を
行なった場合には、基質溶液によるリポソームの自然破
壊値（バックグラウンド値）が約３倍減少した。これら
の結果より、用いたホスホリパーゼなどのリポソーム破
壊物質が作用する基質の特異な構造部位に依存してリポ
ソームの破壊能に差があることが示された。例えば、ホ
スホリパーゼＢ、Ｃ、Ｄ又はＮｙｓｔａｔｉｎ，Ａｍｐ
ｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂは殆ど破壊活性を持たなかっ
た。

【００１９】リポソーム破壊物質として市販酵素を用い
る場合、その純度、安定化等に違いがあっても、ほ乳類
の牛膵臓由来ホスホリパーゼＡ２が最も高感度であり、
このホスホリパーゼＡ２は瞬時にリポソームを破壊し
た。又同じ酵素番号（ＥＣ ３．１．１．４）であって
も、バクテリアや他のほ乳動物等由来の異なるホスホリ
パーゼＡ２では、リポソーム破壊能に大きな違いが有っ
た。即ち、例えば、Ｂｅｅ Ｖｅｎｏｍ（蜂毒）、Ｃｒ
ｏｔａｌｕｓ ｄｕｒｉｓｓｕｓ ｔｅｒｒｉｆｉｃｕ
ｓ Ｖｅｎｏｍ（蛇毒）はリポソーム破壊活性を持たな
いが、Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ（牛膵臓）由来
のホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）は、強いリポソーム
破壊活性をもつ。これは数百ｐｍｏｌの燐脂質からなる
リポソームに対して、約５０Ｕの牛膵臓由来のＰＬＡ２
を用いて本発明の方法によりリパーゼ活性を測定したと
ころ、１分以内に放出した酵素による酵素活性は、６５
０ｎｍの吸光度で１．５に達し、市販の酵素では最も強
いリポソーム破壊活性を持つリパーゼの一つであった。
一方、生理活性ペプチドであるメリチンを用いて前記組
成のリポソームを破壊した結果では５〜５０μｇの市販
メリチンを用いてもリポソームの破壊活性は殆ど認めら
れなかった。

【００２０】ホスホリパーゼ以外のリパーゼでは、Ｐｏ
ｒｃｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ（豚膵臓）由来のトリア
シルグリセライドリパーゼ（ＥＣ ３．１．１．３）に
牛膵臓由来のＰＬＡ２の場合の約１０％の破壊活性を持
つものが存在した。また、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００等
の界面活性剤によるリポソームの破壊では、経時的に放
出される酵素の失活を招き、一方牛膵臓由来のＰＬＡ2
による破壊では、酵素活性に何等影響を与えなかった。
その結果、牛膵臓由来ＰＬＡ2 による破壊後の酵素活性
値は界面活性剤の場合のそれと比較し経時的に大きな差
を生じ、約３０分後では界面活性剤の場合の吸光度値は
ＰＬＡ２の場合の約１／３で一定になったままであっ
た。

【００２１】これらの市販の酵素にＨＲＰ酵素の阻害剤
であるアザイド（ＮａＮ₃ ）や硫酸アンモニュウムが酵
素安定化剤として含まれている場合は、酵素阻害をほぼ
１００％なくす為等の点から、３０００倍以上の体積の
緩衝液で１回に１２時間以上の透析を２回以上繰り返
し、更に希釈して用いるのがよい。また、リポソーム自
体は窒素置換した状態で約一ヶ月、４℃で安定である
が、長期保存したのち使用する場合には、測定に用いる
前に分子量６万の分子振るい膜で自然破壊したリポソー
ムを除き残りを再度利用することが望ましい。

【００２２】本発明の方法において検出可能な物質、例
えば前記のようなリパーゼ等の酵素、生理活性物質及び
界面活性剤等によるリポソームの破壊について、具体的
に説明する。即ち、実施例で後述するように、リパーゼ
の中でもホスホリパーゼＢ，Ｃ，Ｄについては破壊活性
が見られず、牛膵臓由来のＰＬＡ２の場合に強い活性が
認められる。このことより牛膵臓由来のＰＬＡ２は、ホ
スファチジルコリン，ホスファチジルエタノールアミン
等の親水基に正の電荷を持つ燐脂質を特異的に認識し、
ジアシルグリセロール構造の２−位の脂肪酸エステル結
合の加水分解に伴い残ったリゾ体間の立体的な問題か
ら、近傍の脂肪酸エステルの炭素鎖部分同志の疎水結合
力が弱くなり、膜の流動性が失われ、更に高濃度で浸透
圧の高い酵素基質が添加されることによって、流動性を
失い膜構築が欠損したリポソームが比較的簡単に破壊さ
れると思われる〔Ｐａｕｌ Ｄ．Ｂｏｙｅｒ，Ｔｈｅ
Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｖｏｌ５，７１−８５（１９７
１）〕。

【００２３】また、この時生成したリゾ体（リゾフォス
ファチド）の強い界面活性作用によると考えられてい
る。また、同様な理由によりトリアシルグリセロールに
特異的なリパーゼの場合には、ホスホリパーゼの場合の
ような正の電荷を持つ塩基性の燐脂質を認識するのと異
なり、寧ろ燐酸ジセチルのような負の電荷を持つ燐脂質
に作用するのではないかと推測される。ところで、これ
ら酵素類のリポソームの破壊速度は酵素類の持つｔｕｒ
ｎ ｏｖｅｒ数及び反応のＫｍ，Ｖｍａｘ等の反応速度
論的熱力学的性質に関係している一方で、リポソーム膜
中への酵素類の組み込み能が考えられる。このような点
は、酵素蛋白質の高次構造を含んだ酵素化学的性質の違
いに依存し、ひいては生体内での局在部位、生理作用等
の影響を強く受けていると推察される。このような酵素
化学的な性質の違い故に、後述の実施例で示される同一
酵素番号（ＥＣ ３．１．１．４）のＰＬＡ２でさえ，
蛇毒，蜂毒または細菌由来等の由来が異なればリポソー
ムの破壊能に差が生じる。最近の研究では、ＰＬＡ２は
二次構造上のジスルフィド結合の位置の違いによって、
膵臓分泌型の１群と蛇毒型の２群に分類される[ Ｈｅｉ
ｎｒｉｋｓｏｎ，Ｒ．Ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２５２，４９１３−４９２１（１９７７）]。本
発明の方法で強い活性を示すのは１型の膵臓由来の方で
ある。これら両群のＰＬＡ２は共にＮ末端に２１−２３
の比較的共通なアミノ酸からなるシグナルペプチドを持
ち分子量も１３Ｋダルトン付近でよく似ている。

【００２４】これらＰＬＡ２の界面活性化機構の解明に
おいては、本発明の方法におけるようなリポソームを用
いた実験例はないが、酵素の２分子会合化による活性化
機構が提唱されている〔Ｔｏｍａｓｓｅｌｌｉ，Ａ.
Ｇ. ，Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ，２６４，１００４１
−１００４７（１９８９）〕。

【００２５】前記の蜂毒のメリチンは、アミノ酸２６個
から成りＮ末端には比較的疎水性のアミノ酸を持ちＣ末
端にはアルギニン等の塩基性の親水性残基を持つアミノ
酸を結合しており、水溶液中では４分子会合した高次構
造をとり、界面活性作用を持つと言われている〔Ｋｒｅ
ｉｌ，Ｇ．，Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３
３，５５８−５６６（１９７３）〕。

【００２６】従って、膜構造との相互作用、特に取り込
み能はペプチド構造中でも一次構造のＮ末端やＣ末端の
アミノ酸配列や二次構造のα−ヘリックス形成能に依存
している可能性が高いが、脂質膜中での活性発現能には
むしろ三次及び四次構造の様な高次構造の適当な条件を
満たすことが重要であり、このような適当な高次構造変
化のもとで活性発現したリパーゼ酵素が強いリポソーム
破壊能を持つことが予想される。

【００２７】このような本発明の方法を用いる場合、リ
ポソーム中に封入した反応素子と試薬との反応の結果、
数分でリパーゼ等のリポソーム破壊物質を溶液の色変化
により肉眼で判定可能であり、破壊活性の測定には測定
機器を使用する必要がなく時間の消費を少なくすること
ができるので有利である。また、完全に精製された試料
でない混合物の形のものであっても、含まれるリポソー
ム破壊物質を迅速かつ簡便に検出することができ、特に
天然に存在するようなリポソーム破壊物質の検出に効果
的である。

【００２８】本発明の方法は、従来より知られている溶
血現象を応用する方法よりも次の点で優れている。即
ち、リポソームを構成する脂質の成分を目的とするリポ
ソーム破壊物質が反応する基質分子に置き換えることに
より、目的とするリポソーム破壊物質を間接的に高感度
に検出することができる点である。また、赤血球に比較
してリポソームは相互に凝集することが少なく、保存性
にも優れる事、ｉｎ ｖｉｖｏに近い状態でのリポソー
ム破壊物質の活性を正確に測定することができる点であ
る。

【００２９】このように本発明の方法によるリパーゼ等
のリポソーム破壊物質の検出は、リポソームの膜に用い
る脂質分子の種類に依存し、例えばホスファチジルコリ
ンやホスファチジルエタノールアミンに富んだリポソー
ムを用いた場合には、これら脂質を基質とするＰＬＡ２
のような酵素が特に高い酵素活性を示す特定な酵素とし
て検出されてくるのみならず、豚膵臓由来のトリアシル
グリセライドリパーゼのような必ずしも燐脂質の持つ脂
肪酸エステル結合を特異的に認識しないリパーゼでも本
発明の方法により弱いながら活性を持ち検出可能であ
る。このことから、本発明の方法を用いれば、ほ乳類の
膵臓由来のＰＬＡ２と似た性質を持つ新規のリパーゼが
検索できることをも示唆している。また、リパーゼ以外
にも一般的にリポソームを破壊する物質である界面活性
物質等の検出が可能である。

【００３０】本発明の方法は、産業上の応用として以下
に挙げる各種用途の試薬類の検出において用いることが
できる。 １）医薬食品業界のみならず、研究用試薬としても広範
囲に利用されるリパーゼ類の検出 ２）近年、特にその生理作用が重要視されているアラキ
ドン酸代謝等に関連するホスホリパーゼＡ２酵素の簡便
な検出 ３）リポソームを利用した高感度免疫センサー等に利用
されるリポソーム破壊剤としての生理活性物質の検出 ４）Ｔｗｅｅｎ ２０，Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００等の
界面活性作用を持ち膜酵素の可溶化等に有用な物質の検
出

【００３１】本発明の応用例としては、例えば最初の検
出の結果ある程度リポソーム破壊活性を持った分画がリ
パーゼ等の酵素または生理活性ペプチドを含んでいると
解れば、カラムによる精製段階において各フラクション
の活性測定は、極微量の試料溶液量で十分活性を検出で
きる。これはリポソーム内部に酵素分子等の反応素子を
封入しておりリポソーム破壊物質によるリポソーム破壊
活性が増幅されて検出されるからである。例えば、後述
の実施例で記載するように、ＰＬＡ２の場合はリポソー
ムの破壊に必要な酵素量は、数ｕｎｉｔｓ（Ｕ）で十分
であり、しかもリポソーム中には数十分子のＨＲＰ酵素
が封入されているので、ｐｍｏｌのリポソーム量で十分
発色しリパ−ゼ活性の判定が可能である。

【００３２】また、本発明は新規な生理活性物質等の検
出以外にも既に破壊活性を持つリパーゼ等の酵素の活性
チェックと定量性にも有効である。具体的には後述の実
施例で示されるように、特に牛膵臓由来の場合のような
ほ乳類由来のＰＬＡ２の存在をチェックしたい時に効果
的である。

【００３３】最近ラットやヒト血小板から精製されたＰ
ＬＡ2 の燐脂質に対する特異性について、ラットの場合
はホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）やホスファ
チジルコリン（ＰＣ）の２−位の脂肪酸に特異性はない
が[ Ｏ．Ｃｏｌａｒｄ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔａ，９２１，３３３（１９８７）] 、ヒトの
場合はこの位置の脂肪酸がアラキドン酸に特異的である
と言われていることやＰＥまたはＰＣを基質とする２種
類の酵素が存在すると言われている[ Ｄ．Ｋ．Ｋｉｍ，
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０４，４９２（１９８８）]
。動物体内でのアラキドン酸の遊離は、それ以降につ
づくアラキドン酸カスケードと呼ばれる一連の酵素反応
を通して生体の恒常維持に重要な役割を果たしているこ
とが最近注目されている。この様な酵素系で重要な働き
をするアラキドン酸の遊離に特異的なＰＬＡ２の検出に
も本発明の方法が有効である。つまり、本発明の方法の
応用として予めこのような脂肪酸部分の構造の違う燐脂
質や親水基の異なる燐脂質を構成要素とするリポソーム
を用いることで感度よく短時間で容易に特異性の異なる
酵素類を検出できる。

【００３４】また、リポソーム膜を用いる本発明の方法
が効果的な応用例としては、小腸に存在し脂質の代謝に
重要であると考えられており、強固に膜と結合している
Ｃａイオン非依存型の比較的膜内在性のリパーゼの検出
についてである。即ち、膜蛋白の再構成系を伴うリポソ
ーム膜を利用した本発明の方法が、このような膜結合性
のリパーゼ酵素の検出に特に効果的である〔Ｐｉｎｄ，
Ｓ．，Ｌｉｐｉｄｓ，２４，３５７−３６２（１９８
９）〕。

【００３５】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例に何等限定されるもの
ではない。本実施例で用いられるＨＲＰ酵素封入リポソ
ームの調製方法、および各種リパーゼ等による破壊の方
法は次のとおりである。 １）ＨＲＰ酵素封入リポソームの調製 ２．０ｍｌのクロロホルムと１．０ｍｌのジエチルエー
テルを１０．０ｍｌのナスフラスコ中に入れ、これにＤ
ＭＰＣ、ＤＬＰＥ及びＤＣＰを各々、１０．５、１．
８、１．０ｍｇ加え混合して溶解した。次に反応素子と
して燐酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解したＨＲＰ（約
１．０ｍｇ／ｍｌ）を１．０ｍｌ加えて激しく撹拌し、
エマルジョンを形成させた。ロータリーエヴァポレータ
ーを用いて、減圧下でこのエマルジョン溶液から完全に
有機溶媒を除き、ｂａｔｈ ｔｙｐｅの超音波洗浄器を
用いて３７℃で数分間、さらにｐｒｏｂｅ ｔｙｐｅの
超音波発信機で約１分間超音波処理した。この後、分子
量６万の分子振るい膜を利用して、５０００ｒｐｍ×４
０分間の遠心分離を行い、未封入のＨＲＰと沈澱物質を
除いた。

【００３６】Ｈｅｐｅｓ緩衝液を加え、この操作を数回
くりかえし、濾液のＨＲＰ酵素活性をチェックした。基
質を加え６５０ｎｍの吸収がほぼなくなった状態で、こ
のリポソ−ム溶液約０．８ｍｌをＨｅｐｅｓ緩衝液で平
衡化したセファロース４Ｂカラム（４１．０×１．６ｃ
ｍ）にて、リポソームの精製を行なった。流速は約４．
０ｍｌ／時間であった。リポソーム流出分画の同定は、
流出分画を２０倍希釈したものを用いて、２８０ｎｍに
おける吸光度を測定することにより、１％ＤＳＣで処理
し、酵素活性の増加が認められる分画を求めた。その結
果、リポソームは、ｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅ付近に流出
した。

【００３７】２）ＨＲＰ酵素封入リポソ−ムの各種リパ
ーゼ等による破壊 前記１）により得られたリポソームを分子量６万の分子
ふるいで濃縮し、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．２）に
透析した。さらに同緩衝液で希釈したリポソーム溶液を
約０．５〜１．０μｌ取って５０μｌのＨｅｐｅｓ緩衝
液を含むマイクロウエルに移し、約２．０〜１０．０Ｕ
の各種リパーゼを含む４．０−２０．０μｌの燐酸緩衝
溶液または５０μｌの０．１％Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｅｏｘ
ｙｃｈｏｌａｔｅ（ＳＤＣ）溶液を加え、最後に５０μ
ｌのＨＲＰ酵素基質〔ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐ
ｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅ
ｍ，Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．：ＴＭＢ溶液（０．４ｇ／リ
ットル）と０．０２％Ｈ₂ Ｏ₂ クエン酸緩衝液を等量混
合〕を加え、約３０分間、６５０ｎｍの吸光度をマイク
ロプレートリーダー〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃ
ｅｓ社，Ｍ−Ｖｍａｘ〕で測定した。リパーゼを加えた
後、３７℃でインキュベーションを行なうときは、マイ
クロプレートインキュベーター（ＳＣＩＮＩＣＳ社）を
用いた。また、反応の停止には、５０μｌの３ＮＨ₃ Ｐ
Ｏ₄ を加え、この時には４５０ｎｍの吸光度を測定し
た。

【００３８】各種リパーゼによるリポソーム破壊の確認
は、放出されるＨＲＰの酵素活性を測定する方法の他
に、濁度の変化を５００〜６００ｎｍの吸光度で測定す
るか、２８０ｎｍの吸光度を測定して行った。また、粒
径の測定または濃度変化の測定にはレーザー粒径解析装
置で粒径及び散乱光強度を測定することにより行った。

【００３９】実施例で用いた各種のリパ−ゼは次のとお
りである。 〔Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２類〕 Ｓｉｇｍａ，Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｎｃ．由来，Ｌｏｔ
129F−8250 〃 ，Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｐａｎｃ．由来，Ｌｏｔ 129
−8005 〃 ，Ｂｅｅ Ｖｅｎｏｍ 由来，Ｐ９２７９ 〃 ，Ｃｒｏｔａｌｕｓ Ｖｅｎｏｍ由来，Ｐ５９１
０ 〃 ，Ｓ・ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ 由来，Ｐ５
９１３ 〔Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｂ類〕 Ｓｉｇｍａ，Ｖｉｂｒｉｏ Ｓｐｅｃｉｅｓ 由来，Ｌ
ｏｔ 29F-0488 〔Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ類〕 Ｓｉｇｍａ，Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ 由来，Ｎ
ｏ．Ｐ−1392 〃 ，Ｂ．Ｃｅｒｅｕｓ 由来，Type XIII ，Lot 29
F −06941 〔Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ Ｔｙｐｅ Ｖ〕 Ｓｉｇｍａ，Ｃａｂｂａｇｅ 由来，Ｌｏｔ 88F −86
40 〔Ｌｉｐａｓｅ Ｔｙｐｅ Ｖ Ｉ−Ｓ〕 Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ 由
来，Ｎｏ. Ｌ−０３８２

【００４０】実施例１（牛膵臓由来ＰＬＡ2 によるリポ
ソームの破壊） ポリスチレン製で平底のマイクロプレートの各ウエルに
５０μｌのＨｅｐｅｓ緩衝液、０．５μｌのリポソーム
溶液及び各（１）８．０６Ｕ；（２）６．４Ｕ；（３）
３．２Ｕ；（４）１．６Ｕ；（５）０．０８Ｕの牛膵臓
由来ＰＬＡ２溶液を加え、１〜２分後に５０μｌの基質
溶液を加え、常温で約２０分間、数分間隔に６５０ｎｍ
の吸光度を測定した。ブランクとして（Ａ）リポソーム
溶液にＰＬＡ２を加えない場合、（Ｂ）リポソームを加
えないでＰＬＡ２を加えた場合も活性測定を行なった。
また緩衝液でトータルの体積を一定にした。各時間経過
した後の（Ａ）値を各測定値から引き、それらの値を単
純平均した値をｏｎｅ ｄｏｔとした。（Ｂ）値は時間
に依存せず、吸光度は千分の１の値までほぼ一定してい
た。その結果を図１に示したが、リポソーム破壊の度合
はＰＬＡ２の使用量に依存して生じ、反応に用いたＰＬ
Ａ２の量が増えれば、リポソームの破壊によって生じる
封入酵素の放出量が増大した。このことから、１．０Ｕ
以下の極微量のＰＬＡ２の使用量であっても放出される
酵素の活性を指標にして、肉眼でしかも短時間で目的と
する牛膵臓由来ＰＬＡ２を検出できることが判明した。

【００４１】実施例２（細菌由来ＰＬＡ２及び界面活性
剤によるリポソームの破壊） 実施例１で用いたものと同一の酵素番号（３．１．１．
４）で由来（細菌のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏ
ｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）の異なる細菌由来ＰＬＡ２を用
い、また界面活性剤である１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００を用いてリポソームの破壊能を調べた。反応条件は
実施例１と同一であり、用いた細菌由来ＰＬＡ２の酵素
量（単位）は（１）１２２．０Ｕ（３０μｌ）；（２）
３００．０Ｕ（５０μｌ）で、界面活性剤の場合は、
（３）１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１０μｌを用
いた。その結果を、図２に示したが、界面活性剤である
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００は明らかにリポソーム膜の破
壊を招いていることが判明した。

【００４２】一方、細菌由来のＰＬＡ２を用いた場合に
は、実施例１で牛膵臓由来のＰＬＡ２を用いた場合に比
較し大過剰の酵素量を用いたにもかかわらずリポソーム
膜の破壊は殆ど生じなかった。従って、同じ酵素番号の
酵素で且つ基質である燐脂質は同じでも酵素由来が異な
れば活性に著しい差が生じることが判明した。

【００４３】実施例３（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ
Ｄ（ＰＬＤ）又はＰＬＡ２を用いたリポソームの破壊） 実施例１と同様の条件で、二種類の酵素ＰＬＤ又はＰＬ
Ａ2 を用いてリポソームの破壊を行なった。用いた各酵
素量は，（１）３００ＵのＰＬＤ；（２）６０ＵのＰＬ
Ａ２であった。その結果を、図３に示したが、ＰＬＡ２
に比較し過剰量のＰＬＤを用いたにもかかわらずＰＬＤ
酵素はリポソーム膜を破壊しなかった。このことは、明
らかにリポソームを破壊するＰＬＡ２と同じく燐脂質を
基質とするＰＬＤ酵素が、燐脂質への作用部位が異なる
ためにリポソームの破壊を招かないのではないかと言う
ことを示唆している。従って、このような種類のリパー
ゼは本発明の方法では検出できないことを示している。

【００４４】実施例４（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｅｏｘｙｃｈ
ｏｌａｔｅによるリポソームの破壊と吸光度変化） 前記のＨＲＰ酵素封入リポソ−ムの各種リパーゼ等によ
る破壊の検討により明らかにリポソームを破壊すること
が判明した界面活性剤、Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｅｏｘｙｃｈ
ｏｌａｔｅ（ＳＤＣ）を用いてリポソーム膜を処理し、
これに伴う２８０ｎｍの吸光度変化を測定した。即ち、
反応は分光光度計用のマイクロセル中に０．５ｍｌのＨ
ｅｐｅｓ緩衝液を入れ、次に０．１ｍｌのリポソーム溶
液を加え更に１０％ＳＤＣを１０μｌ加え、２８０ｎｍ
の吸光度変化を測定し、約３０秒後に再度２０μｌのＳ
ＤＣ溶液を加え同様に吸光度を測定した。また、本実施
例においては酵素分子の封入されていないリポソームを
用いた。その結果を、図４に示したが、ＳＤＣの臨界ミ
セル濃度以上では明らかにリポソームが破壊され、これ
に伴い２８０ｎｍの吸光度が破壊前の約０．６から破壊
後の約０．０３に減少したことを示している。

【００４５】

【発明の効果】本発明の方法を用いることにより、リポ
ソーム破壊物質、例えばホスホリパーゼ類ではほ乳類由
来のＰＬＡ２を簡易にかつ高感度に検出することができ
る。従って、例えば生体において白血球、すい臓及び肝
臓等の特異臓器及び組織特異的に発現しているＰＬＡ２
の精製等における酵素活性の検出に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、牛膵臓由来ＰＬＡ２溶液を用いた場合
の反応時間と６５０ｎｍの吸光度の関係を示した図であ
る。図中の（１）〜（５）の牛膵臓由来ＰＬＡ２の酵素
量は、（１）８．０６Ｕ；（２）６．４Ｕ；（３）３．
２Ｕ；（４）１．６Ｕ；（５）０．０８Ｕである。

【図２】図２は、細菌由来ＰＬＡ２又は界面活性剤を用
いた場合の反応時間と６５０ｎｍの吸光度の関係を示し
た図である。図中の（１）は細菌由来ＰＬＡ２の酵素量
１２２．０Ｕ（３０μｌ）、（２）は細菌由来ＰＬＡ２
の酵素量３００．０Ｕ（５０μｌ）で、（３）は１０％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１０μｌを示す。

【図３】図３は、ＰＬＤ又はＰＬＡ２を用いた場合の反
応時間と６５０ｎｍの吸光度の関係を示した図である。
図中の（１）は３００ＵのＰＬＤ、（２）は６０ＵのＰ
ＬＡ２を示す。

【図４】図４は、Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａ
ｔｅ（ＳＤＣ）を用いてリポソーム膜を処理した際の２
８０ｎｍの吸光度変化を示した図である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 反応素子封入リポソームをリポソーム破
   壊物質を用いて破壊する工程、該リポソームより放出さ
   れる反応素子を試薬と反応させる工程、次いで該反応に
   より生ずる生成物を検出する工程を有することを特徴と
   するリポソーム破壊物質の検出方法。
2. 【請求項２】 リポソーム破壊物質が酵素または生理活
   性物質である請求項１記載の検出方法。
3. 【請求項３】 リポソーム破壊物質がホスホリパーゼＡ
   ２である請求項２記載の検出方法。
4. 【請求項４】 反応素子がHorseradish Peroxidase（Ｈ
   ＲＰ）である請求項１記載の検出方法。
5. 【請求項５】 リポソームがホスファチジルコリン（Ｐ
   Ｃ），ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）および
   ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）からなる群から選
   ばれる少なくとも一種類以上を主成分とするものである
   請求項１記載の検出方法。
6. 【請求項６】 反応素子と試薬を反応させて生ずる生成
   物を分光学的に検出することを特徴とする請求項１記載
   の検出方法。