JPH04200632A

JPH04200632A - リポソームの破壊方法

Info

Publication number: JPH04200632A
Application number: JP33636390A
Authority: JP
Inventors: Kiyoshi Kotani; 小谷　清
Original assignee: Toyo Ink Mfg Co Ltd
Current assignee: Artience Co Ltd
Priority date: 1990-11-29
Filing date: 1990-11-29
Publication date: 1992-07-21

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、リポソームの破壊方法に関する。さらに詳し
くは、リポソームの中でも特に膜組成の一部にリン脂質
を含み内部に標識物質、薬物、蛋白質などを封入したリ
ポソーム、リポソームの表面に抗体である免疫グロブリ
ン分子を結合した免疫リポソーム等の、いわゆるマイク
ロカプセルとしてのリポソームの利用において、例えば
これらのリポソームを破壊することにより内部から放出
された化合物を用いて工業的に有用な反応に応用しよう
とする場合、医薬品等に利用しようとする場合等におけ
るリポソームの破壊方法に関するものである。

〔従来の技術〕

リポソームは、従来より脂質人工膜として、試薬、薬物
のキャリヤーとしての利用、保護カプセルとして用いら
れ得るマイクロカプセルとしての利用、さらに免疫分析
法において用いられる反応素子としての利用など、各種
用途に利用されている。例えば、免疫分析法では免疫反
応等により特別に分離または標識された免疫リポソーム
を破壊することにより放出された封入化合物を定性及び
定量することにより、または放出された化合物が次の反
応を行うことにより生じる反応生成物を定性及び定量す
ることにより、間接的に免疫反応に関与した抗原または
抗体の定性及び定量を行うことができる。

このようなリポソームの利用においては、リボソームを
破壊することか必要となるが、リポソームの破壊に関す
る従来の方法は、主に二通り提案されている。

第一の方法は界面活性剤を利用する方法であり、なかで
も非イオン系界面活性剤であるＴｒｉｔＯｎ　　χ＝１
００　［Ａｎｚａｉ、　Ｋ、　、　Ｃｈｅｍ、　Ｐｈａ
ｒｍ、　Ｂｕｌｌ、　、　２８（１９８０）　１７６２
］。

Ｔｗｅｅｎ　８０［Ｇ、Ｅｙｔａｎ、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔ
ｔｅｒｓ、５７（１９７５）１２１−１２５１を用いる
場合が良く知られている。

また、イオン系界面活性剤では、コール酸ナトリウム（
（Ｊａｖｉｅｒ　Ｒｕ１ｚ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅ
ｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ、　Ａｃｔａ、　９３７（１
９８８）１２７−１３４］を用いることが知られている
。第二の方法は血清成分である補体（特開昭６０−１３
８４６６号公報、同６１−２６９０７０号公報）を用い
る場合である。この方法は、その反応原理からリポソー
ムが先に述べた免疫リポソームの場合しか用いられない
のか一般的である。即ち、免疫リポソームを用いた免疫
反応の結果生じるリポソーム表面での免疫複合体の形成
後、該免疫複合体形成リポソームのみを特異的に破壊す
る場合に用いられる。

その他、衝撃波（特開昭６２−２５８３１５号公報）や
熱（特開平２−１４０４号公報）を用いることによって
リポソームを破壊し封入化合物を放出させる方法も知ら
れている。しかし、これらの方法では、封入された化合
物が低分子量の薬物などの場合にしか用いられず、しか
もリポソーム膜の瞬時な破壊よりもむしろ徐々に長時間
かけて破壊または構造を変化させ内蔵する封入物を放出
させるものであるため、短時間での破壊には用いること
はできない。

〔発明が解決しようとする課題〕

従来からリポソームの破壊に用いられている前記の界面
活性剤を用いる方法は、マイクロカプセルとしてのリポ
ソームの内部に封入された化合物が特に生理活性ペプチ
ドや酵素等である場合、以下に挙げる問題点が指摘され
ている。

１）界面活性剤がリポソームの破壊濃度において、放出
された封入化合物を失活させることがある。例えば封入
物質が酵素の場合、リポソーム破壊後の酵素反応におい
て十分な酵素活性を示し難く、経時的に酵素反応生成物
量を測定すると測定値にバラツキが多い。

２）破壊反応の進行に伴い、放出された封入物質の酵素
タンパク質などが界面活性剤と反応して白濁性の浮遊物
質または沈澱物質を生じさせるため、酵素反応生成物の
分光学的測定法による定量に障害を与える事がある。

３）この様な白濁の傾向は、ｐＨに依存しており、酵素
反応を酸性溶液で停止させた場合に通常量も著しい。従
って、一般的な酵素反応の停止法である塩酸、硫酸やト
リクロロ酢酸などの酸性溶液を用いた反応停止法を用い
ると、溶液の白濁を招き著しく検出感度を下げることが
ある。

４）前記ｌ）〜３）から破壊時には、リポソームの濃度
に依存した最少量の界面活性剤を使用するのが望ましい
が、リポソームが免疫リポソームなとの検査、診断用の
免疫分析用反応素子である場合、その用途から生成する
免疫複合体量か少なく、又その濃度を事前に予知できな
いので複合体を形成した免疫リポソームの破壊に必要な
最少量の界面活性剤濃度を知ることか出来なく、必然的
に１）、２）、３）の様な問題が生じてくる。

次に、破壊に補体を用いる方法では、次のような問題が
指摘されている。

ｌ）前記の様に補体による破壊可能なリポソームは現在
のところ、その表面上で免疫反応を行い得る免疫リポソ
ームの場合のみである。

２）一般に用いられる補体溶液は、動物の血清を希釈し
たものであるため不純物による非特異的吸着の結果生じ
る免疫複合体か補体反応に関与する可能性がある。従っ
て、免疫分析における検出感度が低下するおそれがある
。

３）補体反応は、一般的に１５分位から数時間に及ぶな
ど、時間が掛かり過ぎるため迅速な免疫分析法には不敵
光である。

４）補体反応は、一般的に３７°Ｃで行われるので恒温
槽などを用いた反応か必要である。

５）リポソーム表面上での免疫反応に対してのみ補体に
よる破壊のシグナルとなり得るので、抗体によらない標
識により分離、標識されたリポソ−ムは、破壊の為のシ
グナルとなり得ない。例えば、リポソームのサイズによ
る区別やリポソーム表面に結合した蛍光物質、酵素等の
標識による区別によって得られたリポソームは、そのま
ま補体を用いて破壊することは出来ない。即ち、リポソ
ームを補体で破壊する場合は、破壊反応の前提としてリ
ポソーム表面上での免疫複合体の形成が必要になってく
ることである（特開昭６０−１３８４６５号公報）。

これらのことを比較すれば、次の様なことが判る。

ｌ）免疫分析法の用途に対してのみ、補体によるリポソ
ームの破壊が比較的感度の良い方法として応用出来る得
るが、反応時間が長くかつ反応温度が３７°Ｃであると
いう問題がある。

２）薬物や反応試薬のキャリヤー、保護カプセルとして
の利用においては、熱やｐＨによる破壊が適当であろう
。しかし、これらによる破壊においては反応系全体を加
熱したり、ｐＨ変化させなければならないために条件決
定や操作が煩雑である。又この方法では容易に膜の破壊
を受けることになるが、それではかえってキャリヤーや
保護カプセルの役目を果せなくなるので、膜組成のうち
特に脂肪酸組成が特定のものに限定されてくることが問
題となる。

このように、リポソームの破壊法には種々の問題点が指
摘されており、これらの欠点を育していない新しい破壊
法の開発が望まれているが、未だ見い出されていないの
が実情である。

従って、本発明の目的は、前記のような従来法において
指摘されいた種々の問題点を解消した、リポソームの有
用な破壊法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した
結果、ホスホリパーゼを用いたリポソームの破壊方法が
有用であることを見い出し本発明を完成するに至った。

即ち、本発明の要旨は、リン脂質を構成成分として含有
するリポソームの破壊方法において、ホスホリパーゼを
用いて酵素処理することを特徴とするリポソームの破壊
方法に関する。

本発明において用いられるホスホリパーゼは、一般に基
質であるリン脂質の作用部位の違いによりホスホリパー
ゼＡＩ、　Ａ２．　　Ｂ、　Ｃ，及びＤの５種類のもの
が良く知られている（Ｐａｕｌ　Ｄ、　Ｂｏｙｅｒ　　
Ｔｈｅ　　Ｅｎｚｙｍｅｓ、　　Ｖｏｌ　　Ｖ（１９７
１）　　Ｐ７１−Ｐ８５）。

本発明においては、これらのうち特に限定されるもので
はないが、好ましくは破壊効果が優れている点からホス
ホリパーゼＡ２である。

例えば後述の実施例で示す様にＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ
７，２）中、常温でＤｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ　Ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｉｄｙｌＣｈｏｌｉｎｅ（ＤＭＰＣ）　：　Ｃ
ｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（ＣＨＯＬ）　　：　Ｄｉｃｅｔ
ｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＤＣＰ）　＝１３．０　：　
１．５　：　１．０（ｍｇ型重量からなるリポソームを
破壊する時、リポソームの破壊効果の最も高いホスホリ
パーゼは酵素番号、ＥＣ。

３、　１．　１．　４のホスホリパーゼＡ２である。即
ち、５０μｍのＨｅｐｅｓ緩衝液中で５０　ｕｎｉｔｓ
（５０μｌ）のホスホリパーゼを用い、１．０μｍの精
製したＨｏｒｓｅ　Ｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓ
ｅ（ＨＲＰ）酵素封入リポソーム（約２６０　ｐｍｏｌ
脂質分子）と反応させると、瞬時に（約数秒）でリポソ
ーム膜は完全に破壊され、放出された酵素による酵素活
性は、３０秒以内で酵素反応生成物の６５０ｎｍにおけ
る吸光度が酵素処理前の０．０４から２．０付近に達し
た。　ホスホリパーゼＡ２の由来は、市販のものては、
蛇毒、蜂毒及び牛、豚等の動物のものが知られており、
いずれでもよいが、生化学で通常用いられる緩衝液中、
常温でｐＨ７，０付近におけるリポソームの破壊には、
牛や豚などのは乳類の膵臓由来のものが特に効果的であ
る。

本発明におけるホスホリパーゼは、このように公知の酵
素であり、例えば、ホスホリパーゼＡ２は、蛇毒、蜂毒
や牛や豚などのは乳類の膵臓から常法により抽出して得
ることができ（Ｇ、　Ｈ，ｄ’ｅ　Ｈａｓｓ、　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ、　Ａｃ
ｔａ、　１０３．（１９６８）　１５９〜）、常法によ
り精製したものを使用する。

また、本発明においては市販のホスホリパーゼを用いて
もよく、例えば後述の実施例で用いたようなＳ　ｉ　ｇ
ｍａ社製の各種のホスホリパーゼを用いることができる
。

ホスホリパーゼの中でもホスホリパーゼＡ２は特にホス
ファチジルエタノールアミン（ＰＥ）とホスファチジル
コリン（ＰＣ）脂質に対して基質特異性が高いため、リ
ポソームの膜成分として、これらのＰＣ及び／又はＰＥ
等からなるリン脂質を含んだものである場合、破壊され
る速度が早い。

マイクロカプセルとしてのリポソームは、高分子な酵素
のようなタンパク質を取り込んだ、Ｓｍａ　１１　Ｕｎ
ｉｌａｍｅｌｌａｒ　Ｖｅｓｉｃｌｅ（ＳＵＶ）［Ｇａ
ｒｒｙ　Ａｄｒｉａｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｙ、
１８（１９７９）５６１０−５６１４］　、またはＬａ
ｒｇｅ　Ｏｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　Ｖｅｓｉｃｌｅ（Ｌ
ＬＩＶ）として利用されるが、どちらの場合も本発明で
あるホスホリパーゼによる破壊方法を用いることができ
る。

本発明におけるホスホリパーゼを用いる酵素処理は、通
常ホスホリパーゼの力価として４３ｕｎｉｔｓ／ｍｇ・
タンパク質のものを、粒径１００〜１５０ｎｍのリポソ
ーム１０８〜１０１０個に対し２〜１０　ｕｎｉｔｓ用
いて行う。

本発明の破壊法においては、必ずしも疎水性の溶液でな
くても、生化学で用いる普通の緩衝液、例えば、リン酸
、Ｔｒｉｓ、　Ｈｅｐｅｓ等の緩衝液の中で酵素処理に
よる破壊反応は速やかに進行する。

本発明の破壊方法において、酵素処理に適したｐＨは７
．２であり、酵素処理の温度は３７°Ｃである。また、
酵素処理の時間は、通常１分〜２０分好ましくは２〜３
分である。

破壊反応の進行は、リポソームに封入さた酵素や標識物
質の放出量を直接又は、間接的に定量することで検知す
ることができる。

例えば、ＨＲＰ酵素を封入したリポソームの場合は、こ
のリポソーム溶液に牛膵臓由来のホスホリパーゼＡ２を
加えた後、大過剰濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）及び酸
化還元色素（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ　ｂｅｎｚｉｄｉ
ｎｅ（ＴＭＢ）］基質を加えれば、リポソームからの放
出酵素量を酵素反応生成物であるＴＭＢ酸化物の水溶液
中での６５０ｎｍにおける特異的な吸光度を調べること
で検知可能である。又膜の破壊度はホスホリパーゼ処理
リポソーム溶液のレーザー粒径解析装置による光散乱強
度の測定からリポソームサイズを計算することによって
も確かめることができる。

このように本発明におけるホスホリパーゼは、５種類の
ものが挙げられるが、最も効果的なホスホリパーゼＡ２
の作用メカニズムは、主に膜構成成分であるホスファチ
ジルコリンジアシルエステルやホスファチジルエタノー
ルアミンジアシルエステルなど、グリセロールリン酸ジ
アシルエステル構造上でグリセロールの２位に結合した
アシルエステルを加水分解することによると考えられて
いる（Ｐａｕｌ　Ｄ、　Ｂｏｙｅｒ、　Ｔｈｅ　Ｅｎｚ
ｙｍｅｓ、　Ｖｏｌ、　Ｖ、　ｐｐ、　７１−８３、１
９７１）。

更に、この位置を加水分解することで他のリン脂質分子
の脂肪鎖間との疎水結合による相互作用を切断し分子構
造を破壊することで膜の流動性を失わせ、生じた膜内外
の浸透圧差、封入高分子化合物等の運動エネルギーなど
が原因で膜が破壊されると考えられる。リポソーム破壊
に要する時間は、添加するホスホリパーゼのユニット数
の増加に伴い減少する。又、反応温度が、３７°Ｃ付近
で破壊速度が速いのは、ホスホリパーゼの酵素反応がこ
の温度付近で活性化されること以外にリポソーム膜の流
動性が高まることにもよると考えられる。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、
本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。

ＨＲＰ酵素封入リポソームの作成１）ＰＣ及びＰＥを含むリポソームの作成りＭＰ　Ｃ，
約１１．０ｍｇ、Ｄｉｌａｕｒｏｙｌ　Ｐｈｏｓｐｈａ
ｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＬＰＥ）、約
１．８■、ＤＣＰ約０．５ｍｇを用い、ＩＯ，Ｏｍ？容
量のナスフラスコ中のクロロホルム、２．０ｍｌに溶か
した。この脂質溶液に１．５ｍ　１０）　ＨＲＰ　酵素
（ＨＯＲ３ＥＲＡＤＩＳＨＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ、　Ｅ
ＩＡＧＲＡＤＥ、　ＺＹＭＥＤ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩ
ＥＳ、　ＩＮＣ，社製、　Ｌｏｔ　Ｎｏ、００２０４６
８３）Ｈｅｐｅｓ溶液（１ｍｇ／ｍ　１　、　ｐ　Ｈ７
，２）を加え激しく混合しながら完全なエマルジョン溶
液にした。このエマルジョン溶液をロータリーエラアポ
レータ−下で水流ポンプで引きながら完全に有機溶媒を
飛ばした。

次に、ｂａｔｈ　ｔｙｐｅ超音波洗浄器中、３７℃で数
分超音波処理し完全に均一な溶液にした。つづいてｐｒ
ｏｂｅ　ｔｙｐｅの超音波発信機で、数分間超音波処理
した。このリポソーム溶液を１．５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ
−Ｐａｑｕｅ　（商品名、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）と
混合し超遠心用チューブ（体積ｔｏ、ｏｍ　１　）に移
した。

次に、混合溶液の上部表面に０．５ｍｌの５０ｍＭＨｅ
ｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７，２）を載せ、５０．００Ｏｒｐ
ｍで１時間超遠心した。この後、上部緩衝液相をマイク
ロピペットで取り６万の分子量分画膜を付けた遠心管中
に移し更に緩衝液１．５ｍｌを加え、６，０００ｒｐｍ
で約４０分間遠心し濃縮した。

この操作を数回繰り返し、最後に濃縮されたリポソーム
溶液約０．５ｍｌを、５０　ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐ
Ｈ７，２）で平衡化された５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２０
０カラム（長さ、８０ａｎＸ径、１．６ａｎ）にて、流
速約５、Ｑｍｌ／時間で、２．５　ｍ　ｌ　／Ｆｒａｃ
ｔｉｏｎ分取した。

各フラクションの活性測定は、以下の方法で行い、最後
にカラム精製のＨＲＰ酵素封入リポソームを得た。この
ようにして精製した酵素活性分画を集め６万の分子量分
画膜を付けた遠心管中に移し６゜００Ｏｒｐｍで遠心し
濃縮、洗浄し精製酵素封入リポソームを作成した。

次に、このリポソームをポアサイズ５０ｎｍのポリカー
ボネート膜を用いて窒素加圧下で濾過、濃縮し、約０．
５ｍｌにした。

次にポアサイズ１１００ｎの同−膜で濾過し、粒径１１
００ｎ以下のＳＵＶの精製リポソームを得た。また、未
通過のリポソーム溶液をポアサイズ４００ｎｍの同−膜
で濾過し、主に粒径１１００−４００ｎ間のＬＵＶのリ
ポソームを得た。

２）ＰＥを含みＰＣを含まないＨＲＰ酵素封入リポソー
ム（Ａ）の作成りＬＰＥ　：　ＣＨＯＬ　：　ＤＣＰ＝８．０　：１．
５　　：　１．０（■重量）を用い前記と同様にしてＨ
ＲＰ酵素封入リポソームを作成した。

３）ＰＣを含みＰＥを含まないＨＲＰ酵素封入リポソー
ム（Ｂ）の作成。

ＤＭＰＣ：　ＣＨＯＬ　：　ＤＣＰ＝１３．Ｏ：　１．
５　：　１．０（■重量）を用い前記と同様にして封入
リポソームを作成した。　尚、前記のリポソーム作成に
用いた市販脂質は、次の通りである。

ＤＭＰＣ：フナコシ薬品■社製、商品コードＤＬＰＥ：
ＡＶＡＮＴＩ　　ＤＯＬＡＲＬＩＰＩＤＳ、ＩＮＣ，社
製、＃１２０ＰＥ−１８゜Ｃｈｏｌ：ＮＵ−ＣＨＥＫ−ＰＲＥＰ、ＩＮＣ。

社製、＃ＣＨ−８００−Ｎ２０−８９゜ＤＣＰ　　：東
京化成工業■社製、Ｐ１０６９＃ＡＶＯ１゜実施例１（ＳＵＶリポソームのホスホリパーゼＡ２又はＩ％ＳＤ
Ｃによる破壊方法）本実施例は、すべて常温において径６．　４ｍｍの９６
穴マイクロウエル（ＣＯＲＮＩＮＧ社製、１２５８６０
）中で行った。

反応条件は以下の順に溶液を加えて行き、ホスホリパー
ゼ溶液または対照として界面活性剤である１％Ｓ　Ｄ　
Ｃ（Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ　）を加
えた後と最後の酵素基質を加えた後で各々マイクロウェ
ルミキサーで攪拌を行った。５０μｍのＨｅｐｅｓ緩衝
液（ｐ　Ｈ７，２）　０．５μｌのＰＣ及びＰＥを含む
リポソーム溶液、５０μｍの１％ＳＤＣ溶液または８．
１ｕｎｉｔｓ（８，１０）の牛膵臓由来のＰｈｏｓｐｈ
ｏｌｉｐａｓｅ　Ａ　２　（Ｓｉｇｍａ社製、　Ｌｏｔ
　１２９Ｆ８２５０　）　　（ＰＬＡ２）を含む５０μ
Ｉのリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）、最後に５０μｍの基
質溶液〔商品名、ＴＭＢ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｆ　Ｐｅｒ
ｏｘｊｄａｓｅ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｙｓｔｅｍ、
Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、社製：２５．ｃｚｌのＴＭＢ溶液（
０，４ｇ／　１　）と２５μｍの０．０２％Ｈ２０□ク
エン酸緩衝液を混合〕を加え、時間の経過に従い酵素反
応生成物であるＴＭＢ酸化物溶液の６５０ｎｍにおける
吸光度を測定した。

又、反応を停止する時は、３ＮのＨ２ＰＯ，溶液を５０
μｌ加えた。この酸処理で反応溶液の色が青から黄色に
変化するので、反応を停止した後の吸光度測定は波長４
５０ｎｍを用いた。Ｂ　ｌ　ａｎｋ値としては、上記Ａ
ｓ５ａｙ条件で１％ＳＤＣまたはホスホリパーゼ溶液の
代わりに、等量のリン酸緩衝液を加え、同様に各反応時
間経過後の値を用いた。

破壊に伴う正規のＨＲＰ酵素活性値は、１９６ＳＤＣま
たはホスホリパーゼ溶液を加えた場合の値からＢ　ｌ　
ａｎｋ値を差し引いた値を用いた。０分の時の吸光度は
、はぼゼロであった。吸光度の測定は、マイクロプレー
トリーダー、Ｍ−Ｖｍａｘ（商品名、Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用い、測定値は０、Ｄ値２
．０までを有効とした。

また、３７℃でのホスホリパーゼよるリポソームの破壊
反応は、マイクロプレートインキュベーター（ＳＣＩＮ
ＩＣ３Ｃ製ＮＩＣいた。

その結果、第１図に示すようにＰＬＡ２を用いた場合は
、図中の（Ａ）に示すようにリポソーム膜を完全に破壊
する５０μｍの１％ＳＤＣ（図中（Ｂ））に比較して、
時間の経過に伴いはるかに安定した強い発色を示した。

このことから、ＰＬＡ２を用いた場合、破壊力と同時に
放出された酵素の安定性の保持の面でも、ＰＬＡ２の方
が優れていることが判明した。

実施例２（温度３７°ＣにおけるＳＵＶリポソームのホスホリパ
ーゼＡ２による破壊方法）実施例１と同様の方法により５０μｌのＨｅｐｅｓ緩衝
液に０．５μｍのＰＣ及びＰＥを含むリポソームを加え
、次に牛膵臓由来ＰＬＡ２溶液、各（１）、５μｍ　（
０，４Ｕ）　　；　　（２）、１０μｍ（０゜８Ｕ）；
　　（３）、２０μｍ　　（１，８Ｕ）を加え、３７℃
で反応させた。

その結果、第２図に示すように、実施例１て示した常温
の場合に比較すると、１ｕｎｉｔ数当りで約１．５倍活
性化されていることが判った。図中の（１）、（２）、
（３）は前記のＰＬＡ２溶液の各酵素量の場合を示す。

実施例３（温度３７°ＣにおけるホスホリパーゼＡ２によるリポ
ソーム（Ａ）及び（Ｂ）の破壊方法）組成の異なる前記
の二種類のリポソーム（Ａ）及び（Ｂ）の精製物質各約
１．０ｍｌをＨｅｐｅｓ緩衝液で１０００倍に希釈し、
各１．　０　（Ａ）又は２．０μｍ　（Ｂ）を分取し５
０μｍ（５０Ｕ）の牛膵臓由来のＰＬＡ２を用い実施例
２と同様にして温度３７°Ｃで破壊実験を行った。

その結果、第３図に示すように破壊後の流出酵素による
酵素活性は３０秒以内で６５０　ｎｍの吸光度が１．５
付近に達し以降一定になった。

このことから、リポソーム（Ａ）、（Ｂ）がＰＬＡ２に
より速やかに破壊されたことが判った。

また図中の（Ａ）はリポソーム（Ａ）を酵素処理したも
ので、図中の（Ｂ）はリポソーム（Ｂ）を酵素処理した
ものである。

〔発明の効果〕

本発明の破壊方法を用いることにより、次のような効果
が得られる。

１）本発明のホスホリパーゼによる破壊法では、破壊後
に放出されたリポソーム内蔵の封入酵素や標識化合物を
失活させることなく、透明な溶液状態で、且つ放出され
た酵素による酵素反応では時間に比例した鮮明な発色を
示すこと。

２）破壊における反応時間が数分て済むので検査、診断
における免疫分析に有用で在ること。

３）ホスホリパーゼのリポソーム破壊における酵素反応
が常温においても、十分に反応が進行し、リポソームの
破壊を生じること。

４）破壊に必要なリポソームの膜組成か広い範囲のリン
脂質に依存しており又リン脂質を構成する脂肪酸の種類
に殆ど依存しないこと。

５）酵素反応を利用しているので微量の酵素で速やかに
反応が進行すること。

６）リポソームそのものを破壊するのでサイズ、密度な
どの差で区別されたリポソームであれば、特別な修飾を
必要とせず、どのようなものでも破壊可能であること。

７）６）より、修飾リポソームの反応素子としての用途
以外に薬物や薬物のキャリヤーとしての利用時にも本破
壊法は有効であること。

８）ホスホリパーゼは有機溶媒中でも反応するので、疎
水溶液でのリポソームの破壊も可能であることこと。

従って、以上の特徴から本発明であるホスホリパーゼに
よるリポソームの破壊法は、薬物のキャリヤーや保護カ
プセルとしてのリポソームの用途におけるリポソームの
破壊のみならず、特に分析法への応用において酵素や生
理活性ペプチドのような不安定なペプチド化合物を封入
したリポソームや免疫反応素子としての免疫リポソーム
である場合に、特に有用性に優れている。　又、このよ
うな穏やかな破壊法の利用でｉｎ　ｖｉｔｒｏでの酵素
封入リポソームなどのマイクロカプセルの有用性か高ま
る可能性が示唆される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１におけるホスホリパーゼ又は１％Ｓ
ＤＣによる破壊方法での吸光度を示した図である。第２図は、実施例２におけるホスホリパーゼＡ２による
破壊方法での吸光度を示した図である。第３図は、実施例３におけるホスホリパーゼＡ２による
リポソーム（Ａ）、（Ｂ）を用いての破壊方法での吸光
度を示した図である。第１図０、Ｄ。０　　　　５　　　１０　　　１５　　２０　　（分）
反応時間第　　２　　図反応時間　　　　（分）第　　３　　図０１．０２．０３．０４．０反応時間　　　　　（分）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）リン脂質を構成成分として含有するリポソームの
破壊方法において、ホスホリパーゼを用いて酵素処理す
ることを特徴とするリポソームの破壊方法。
（２）請求項（１）記載のホスホリパーゼが、ホスホリ
パーゼＡ２である請求項（１）記載のリポソームの破壊
方法。