JPH061275B2 - 逆潜伏特異的結合測定法 - Google Patents
逆潜伏特異的結合測定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は特異的結合測定法、特に臨床的に興味ある物質
の測定のための免疫検定法の分野に関する。特異的結合
測定技術の発達により、液状媒質中に非常に低濃度に存
在する、診断上、医学上、環境上および産業上重要な種
々の有機物質測定のための極めて有用な分析が提供され
た。特異的結合測定法はリガンド、すなわち測定すべき
結合し得る被分析物と、それに対する結合パートナーす
なわち受容体との間の特異的相互作用を基礎としてい
る。受容体の存在は結合されたまたは結合されていない
標識被分析物を機械的に分離するのに利用することがで
き、また標識に影響を与えて検出可能な信号を適当に変
化させるようにすることができる。前者の場合は通常不
均一系と呼び、後者の場合は分離工程が無くなるので均
一系と呼ばれる。リガンドおよびその結合パートナーの
一方がハプテンまたは抗原であり他方が対応する抗体で
ある場合はこの測定法は免疫検定法として知られてい
る。全般的には、オーデル（odell）およびドーガデイ
（Daughaday）編、プリンシプルズ オブ コンペテイ
テイブ プロテンバインデイングアツセイ（競争的タン
パク質結合測定法の原理）、（J.B.Lippincott社、フイ
ラデルフイア、１９７１年）を参照されたい。
の測定のための免疫検定法の分野に関する。特異的結合
測定技術の発達により、液状媒質中に非常に低濃度に存
在する、診断上、医学上、環境上および産業上重要な種
々の有機物質測定のための極めて有用な分析が提供され
た。特異的結合測定法はリガンド、すなわち測定すべき
結合し得る被分析物と、それに対する結合パートナーす
なわち受容体との間の特異的相互作用を基礎としてい
る。受容体の存在は結合されたまたは結合されていない
標識被分析物を機械的に分離するのに利用することがで
き、また標識に影響を与えて検出可能な信号を適当に変
化させるようにすることができる。前者の場合は通常不
均一系と呼び、後者の場合は分離工程が無くなるので均
一系と呼ばれる。リガンドおよびその結合パートナーの
一方がハプテンまたは抗原であり他方が対応する抗体で
ある場合はこの測定法は免疫検定法として知られてい
る。全般的には、オーデル（odell）およびドーガデイ
（Daughaday）編、プリンシプルズ オブ コンペテイ
テイブ プロテンバインデイングアツセイ（競争的タン
パク質結合測定法の原理）、（J.B.Lippincott社、フイ
ラデルフイア、１９７１年）を参照されたい。
従来の標識複合体特異的結合測定法においては、測定す
べき液状媒質の試料を種々の試剤組成物と結合させる。
かかる組成物には標識と一体化した結合成分を含有して
成る標識複合体が含まれる。複合体中の結合成分は、試
剤組成物に他の成分があればその成分および分析すべき
媒質中のリガンドと共に結合反応系を形成して２種のま
たは２形態の複合体、例えば結合された種（複合錯体）
と遊離種とを生ずる。結合された種においては複合体の
結合成分例えばハプテンまたは抗原は対応する結合パー
トナー例えば抗体によつて結合されているのに対し、遊
離種においては結合成分はこのような結合をしていな
い。結合された種になる複合体と遊離種になる複合体と
の相対的量または比率は被検試料中の検出すべきリガン
ドの存在（または量）の関数である。
べき液状媒質の試料を種々の試剤組成物と結合させる。
かかる組成物には標識と一体化した結合成分を含有して
成る標識複合体が含まれる。複合体中の結合成分は、試
剤組成物に他の成分があればその成分および分析すべき
媒質中のリガンドと共に結合反応系を形成して２種のま
たは２形態の複合体、例えば結合された種（複合錯体）
と遊離種とを生ずる。結合された種においては複合体の
結合成分例えばハプテンまたは抗原は対応する結合パー
トナー例えば抗体によつて結合されているのに対し、遊
離種においては結合成分はこのような結合をしていな
い。結合された種になる複合体と遊離種になる複合体と
の相対的量または比率は被検試料中の検出すべきリガン
ドの存在（または量）の関数である。
天然の細胞膜の多くの性質は、リポソームと称する簡単
な脂質二分子層系によつて再現することができる。これ
らの性質の一つにリーシス（溶解）がある。リーシスは
通常の化学薬品例えば洗剤、または免疫学的反応によつ
て達成することができる。小胞例えばリポソームの膜が
外部から透過し得る抗原を含む場合、これは対応する抗
体と反応して凝集を起す。抗原感作リポソームが補体の
存在において対応する抗体と反応すると膜は被可逆的に
損傷を受け、もはや無傷の選択的透過生隔壁としては機
能しなくなる。これがイムノリシス（免疫溶解）であ
る。イムノリシスの程度は、従来イムノリシスによつて
放出される標識分子を内部に有する抗原増感リポソーム
を使用してモニターされてきた。
な脂質二分子層系によつて再現することができる。これ
らの性質の一つにリーシス（溶解）がある。リーシスは
通常の化学薬品例えば洗剤、または免疫学的反応によつ
て達成することができる。小胞例えばリポソームの膜が
外部から透過し得る抗原を含む場合、これは対応する抗
体と反応して凝集を起す。抗原感作リポソームが補体の
存在において対応する抗体と反応すると膜は被可逆的に
損傷を受け、もはや無傷の選択的透過生隔壁としては機
能しなくなる。これがイムノリシス（免疫溶解）であ
る。イムノリシスの程度は、従来イムノリシスによつて
放出される標識分子を内部に有する抗原増感リポソーム
を使用してモニターされてきた。
リポソームの溶解の研究は種々の標識系を使用して行わ
れてきた。リポソーム外部に標識と反応する試剤を使用
しない一つの型の標識系が開示されており、この系では
リポソームは内部に電子常磁性共鳴スピン標識、例えば
安定な遊離起例えばテンポコリンを有している。テンポ
コリンは水溶性であるが膜は透過しないのでリポソーム
または小胞内に囲み込むことができ、脂質二分子層を通
つて漏洩することがない。リポソーム内に囲み込まれた
テンポコリンは小振幅の特有の広い常磁性共鳴信号を生
ずる。これは高濃度のスピン分子が存在しこれらが相互
に近接しているため信号を交換するからである。リポソ
ーム膜が例えば補体による活性化によつて破壊されると
テンポコリン分子は放出されて外部媒質中で希釈され
る。この結果常磁性共鳴スペクトルには容易に検出し得
る質的および量的の変化を生ずる。Humphries，G.M.お
よびMcConnell，H.M.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，７２：
２４８３−２４８８７（１９７５）を参照されたい。さ
らにまたWei等、J.Immunol.Methods，９：１６５−１７
０（１９７５）；Chan等、J.Immunol.Methods，２１：
１８５−１９５（１９７８）およびHsia等、Ann.N.Y.Ac
ad.Sci.，３０８：１３９−１４８（１９７８）を参照
されたい。リポソーム外部の標識反応性試剤を使用しな
い今一つの標識系では、けい光体例えば１−アミノナフ
タレン−３，６，８−トリスルホネートと消光剤例えば
ａ，ａ′−ジピリジニウムｐ−キシレンジブロミドとを
含有する組成物をリポソーム内部に封入して使用する。
リポソームのイムノリシスによつてけい光体および消光
剤が逸出し続いて外部媒質中で希釈されるため消光が無
くなり高いけい光信号を生ずる。Smolarsky等、J.Immun
ol.Methods，１５：２５５−２６５（１９７７）および
Geiger等、J.Immunol.Methods，１７：７−１９（１９
７７）を参照されたい。
れてきた。リポソーム外部に標識と反応する試剤を使用
しない一つの型の標識系が開示されており、この系では
リポソームは内部に電子常磁性共鳴スピン標識、例えば
安定な遊離起例えばテンポコリンを有している。テンポ
コリンは水溶性であるが膜は透過しないのでリポソーム
または小胞内に囲み込むことができ、脂質二分子層を通
つて漏洩することがない。リポソーム内に囲み込まれた
テンポコリンは小振幅の特有の広い常磁性共鳴信号を生
ずる。これは高濃度のスピン分子が存在しこれらが相互
に近接しているため信号を交換するからである。リポソ
ーム膜が例えば補体による活性化によつて破壊されると
テンポコリン分子は放出されて外部媒質中で希釈され
る。この結果常磁性共鳴スペクトルには容易に検出し得
る質的および量的の変化を生ずる。Humphries，G.M.お
よびMcConnell，H.M.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，７２：
２４８３−２４８８７（１９７５）を参照されたい。さ
らにまたWei等、J.Immunol.Methods，９：１６５−１７
０（１９７５）；Chan等、J.Immunol.Methods，２１：
１８５−１９５（１９７８）およびHsia等、Ann.N.Y.Ac
ad.Sci.，３０８：１３９−１４８（１９７８）を参照
されたい。リポソーム外部の標識反応性試剤を使用しな
い今一つの標識系では、けい光体例えば１−アミノナフ
タレン−３，６，８−トリスルホネートと消光剤例えば
ａ，ａ′−ジピリジニウムｐ−キシレンジブロミドとを
含有する組成物をリポソーム内部に封入して使用する。
リポソームのイムノリシスによつてけい光体および消光
剤が逸出し続いて外部媒質中で希釈されるため消光が無
くなり高いけい光信号を生ずる。Smolarsky等、J.Immun
ol.Methods，１５：２５５−２６５（１９７７）および
Geiger等、J.Immunol.Methods，１７：７−１９（１９
７７）を参照されたい。
今一つの標識系はリポソーム外部の反応環境内で電極を
使用するものである。この一つの例ではカリウムを入れ
たリポソームを使用する。リポソームのイムノリシスに
よつてカリウムイオンが外部に出て外部環境内のイオン
選択性電極と反応する。Katsu等、Chem.Pharm.Bull，３
０：１５０４−１５０７（１９８２）を参照されたい。
テトラペンチルアンモニウムイオンもリポソーム内に封
入されイムノリシスの際にイオン選択性電極を使用して
検出されている。Shiba等、Anal.Chem.，５２：１６１
０（１９８０）およびChem.Lett.１５５（１９８０）を
参照されたい。またヒツジの赤血球ゴースト（膜）にト
リメチルフエニルアンモニウムイオンを負荷し、イオン
選択性電極によつてリーシスの検出を行つている。Ｄ′
Orazio等、Anal.Chem.，４９：２０８３（１９７７）お
よびＤ′Orazioら、Anal.Chem.Acta２５：１０９（１９
７９）を参照されたい。
使用するものである。この一つの例ではカリウムを入れ
たリポソームを使用する。リポソームのイムノリシスに
よつてカリウムイオンが外部に出て外部環境内のイオン
選択性電極と反応する。Katsu等、Chem.Pharm.Bull，３
０：１５０４−１５０７（１９８２）を参照されたい。
テトラペンチルアンモニウムイオンもリポソーム内に封
入されイムノリシスの際にイオン選択性電極を使用して
検出されている。Shiba等、Anal.Chem.，５２：１６１
０（１９８０）およびChem.Lett.１５５（１９８０）を
参照されたい。またヒツジの赤血球ゴースト（膜）にト
リメチルフエニルアンモニウムイオンを負荷し、イオン
選択性電極によつてリーシスの検出を行つている。Ｄ′
Orazio等、Anal.Chem.，４９：２０８３（１９７７）お
よびＤ′Orazioら、Anal.Chem.Acta２５：１０９（１９
７９）を参照されたい。
ここに述べる第一の型の標識系の一つはリポソームまた
は赤血球膜小胞内に基質を封入使用するものである。リ
ポソームのイムノリシスが起きると基質が外部に出て、
外部の酵素含有組成物と反応して検出し得る応答を生ず
る。この初期の例ではリポソーム内にグルコースを封入
使用する。イムノリシスによつてグルコースが外部に
出、リポソームからのグルコースの放出は、ヘキソキナ
ーゼ（グルコース−６−リン酸脱水素酵素）および必要
な補助因子の存在におけるNADP+の還元によつて生ずる
３４０ナノメートルにおける吸光度増加により測定され
る。Hixby等、Proc.Nat.Acad.Sci.，６４：２９０−２
９５（１９６９）；Kinsky等、Biochemistry，８：４１
４９−４１５８（１９６９）；Kinsky等、Biochemistr
y，９：１０４８（１９７０）を参照されたい。この型
の標識系のさらに最近の例においては、けい光原基質
（ウンベリフエロンホスフエート）または色素原基質
（ｐ−ニトロフエニルホスフエート）をリポソームに封
入する。リポソームのイムノリシスによつて基質が外部
に出て外部液中の酵素（アルカリ性ホスフアターゼ）と
反応する。遊離の基質が生成し、信号の増加が生ずる。
Six等、Biochemistry，１３：４０５０（１９７４）；U
emura等、J.Biochem.，８７：１２２１（１９８０）；
およびUemura等、J.Immunol.Methods，５３：２２１−
２３２（１９８２）を参照されたい。
は赤血球膜小胞内に基質を封入使用するものである。リ
ポソームのイムノリシスが起きると基質が外部に出て、
外部の酵素含有組成物と反応して検出し得る応答を生ず
る。この初期の例ではリポソーム内にグルコースを封入
使用する。イムノリシスによつてグルコースが外部に
出、リポソームからのグルコースの放出は、ヘキソキナ
ーゼ（グルコース−６−リン酸脱水素酵素）および必要
な補助因子の存在におけるNADP+の還元によつて生ずる
３４０ナノメートルにおける吸光度増加により測定され
る。Hixby等、Proc.Nat.Acad.Sci.，６４：２９０−２
９５（１９６９）；Kinsky等、Biochemistry，８：４１
４９−４１５８（１９６９）；Kinsky等、Biochemistr
y，９：１０４８（１９７０）を参照されたい。この型
の標識系のさらに最近の例においては、けい光原基質
（ウンベリフエロンホスフエート）または色素原基質
（ｐ−ニトロフエニルホスフエート）をリポソームに封
入する。リポソームのイムノリシスによつて基質が外部
に出て外部液中の酵素（アルカリ性ホスフアターゼ）と
反応する。遊離の基質が生成し、信号の増加が生ずる。
Six等、Biochemistry，１３：４０５０（１９７４）；U
emura等、J.Biochem.，８７：１２２１（１９８０）；
およびUemura等、J.Immunol.Methods，５３：２２１−
２３２（１９８２）を参照されたい。
標識として酵素を内部に封入保有するリポソームのイム
ノリシスをはじめとする溶解も報告されている。酵素は
外部反応媒質中の基質と反応して検出し得る応答を生ず
る。例えばヘキソキナーゼ（グルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ）とＢ−ガラクトシダーゼとを含む封入
酵素標識を使用する実験が行われた。Kataoka等、Bioch
em.Biophys.Acta，２９８：１５８−１７９（１９７
３）参照。また、西洋わさびのペルオキシダーゼをリポ
ソーム内に封入することができる。このペルオキシダー
ゼはイムノリシスに際して外部に出て次の反応の触媒と
なる： NADHの酸化によつて酸素が消費され水が生成する。酸素
の消耗を酸素電極によつて検出する。Haga，Biochem.Bi
ophys.Res.Comm.，９５：１８７−１９２（１９８０）
参照。
ノリシスをはじめとする溶解も報告されている。酵素は
外部反応媒質中の基質と反応して検出し得る応答を生ず
る。例えばヘキソキナーゼ（グルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ）とＢ−ガラクトシダーゼとを含む封入
酵素標識を使用する実験が行われた。Kataoka等、Bioch
em.Biophys.Acta，２９８：１５８−１７９（１９７
３）参照。また、西洋わさびのペルオキシダーゼをリポ
ソーム内に封入することができる。このペルオキシダー
ゼはイムノリシスに際して外部に出て次の反応の触媒と
なる： NADHの酸化によつて酸素が消費され水が生成する。酸素
の消耗を酸素電極によつて検出する。Haga，Biochem.Bi
ophys.Res.Comm.，９５：１８７−１９２（１９８０）
参照。
いくつかの文献には酵素含有リポソームの溶解による酵
素活性の増強についての報告がある。例えばSolomon
等、Biochem.Biophys.Acta，４５５：３２２−３４２
（１９７６）はグルコースオキシダーゼ含有リポソーム
を音波処理または洗剤処理によつて溶解した場合のこの
観察を報告している。封入されたグルコースオキシダー
ゼの酵素活性が、非分離型検定においてリポソームの二
分子層膜のグルコースに対する透過性の尺度の役をなし
た。同じ反応混合物において、グルコースの酸化を酵素
含有リポソームの洗剤による溶解の前および後に酵素電
極を使用して酸素の取込みによつて追跡した。溶解後の
酵素活性は溶解前の４．６０倍も大きいことが観測され
た。
素活性の増強についての報告がある。例えばSolomon
等、Biochem.Biophys.Acta，４５５：３２２−３４２
（１９７６）はグルコースオキシダーゼ含有リポソーム
を音波処理または洗剤処理によつて溶解した場合のこの
観察を報告している。封入されたグルコースオキシダー
ゼの酵素活性が、非分離型検定においてリポソームの二
分子層膜のグルコースに対する透過性の尺度の役をなし
た。同じ反応混合物において、グルコースの酸化を酵素
含有リポソームの洗剤による溶解の前および後に酵素電
極を使用して酸素の取込みによつて追跡した。溶解後の
酵素活性は溶解前の４．６０倍も大きいことが観測され
た。
Tokunaga等〔FEBS Letters，１０６：８５−８８（１９
７９）〕はアルカリ性ホスフアターゼ、ａ−グルコシダ
ーゼとａ−ガラクトシダーゼを含有するリポソームの透
過性の試験管内非分離型測定法を報告している。同じ反
応混合物中で洗剤によるリーシスの前と後とに基質およ
び共役酵素反応を使用して酵素活性を測定した。アルカ
リ性ホスフアターゼを使用して観察された酵素活性はリ
ーシス後はリーシス前の１７．５倍も大きかつた。これ
らの著者は、もしある酵素−基質対のKmがリポソームの
内部と外部とで等しいならば、小胞内酵素活性を基質の
見掛透過速度と関係づけられることができると述べてい
る。
７９）〕はアルカリ性ホスフアターゼ、ａ−グルコシダ
ーゼとａ−ガラクトシダーゼを含有するリポソームの透
過性の試験管内非分離型測定法を報告している。同じ反
応混合物中で洗剤によるリーシスの前と後とに基質およ
び共役酵素反応を使用して酵素活性を測定した。アルカ
リ性ホスフアターゼを使用して観察された酵素活性はリ
ーシス後はリーシス前の１７．５倍も大きかつた。これ
らの著者は、もしある酵素−基質対のKmがリポソームの
内部と外部とで等しいならば、小胞内酵素活性を基質の
見掛透過速度と関係づけられることができると述べてい
る。
Magee等〔J.Cell Biology，６３：４９２−５０４（１
９７４）〕は西洋わさびペルオキシダーゼを含有するリ
ポソームを使用している。西洋わさびペルオキシダーゼ
の酵素活性を同一反応混合物内で洗浄によるリーシスの
前と後とに分光光度測定によつて測定した。観察された
酵素活性のリーシス前後の比は８．３に達した。彼等
は、リポソームはそのポリエン系抗生物質に対する感度
と免疫溶解に対する感受性とにより、透過性研究におけ
る膜の模型として有用と報告されていると述べている。
９７４）〕は西洋わさびペルオキシダーゼを含有するリ
ポソームを使用している。西洋わさびペルオキシダーゼ
の酵素活性を同一反応混合物内で洗浄によるリーシスの
前と後とに分光光度測定によつて測定した。観察された
酵素活性のリーシス前後の比は８．３に達した。彼等
は、リポソームはそのポリエン系抗生物質に対する感度
と免疫溶解に対する感受性とにより、透過性研究におけ
る膜の模型として有用と報告されていると述べている。
数種の均一系標識複合体特異的結合測定系が既に知られ
ており、その一つはUllmanらにより米国特許第４，１９
３，９８３号明細書に開示されている。この測定系にお
いては標識およびリガンドまたはリガンド類似体が、水
性環境中でその状態を保持し得るコロイド状粒子、例え
ばリポソームの外部表面に非共有結合的に結合される。
個々のコロイド状粒子は、リガンドまたはその類似体と
標識との平均的空間的関係を実質的に一定に保つ中心な
いし核として作用する。標識とリガンドとを粒子表面上
で比較的近接させておくことにより、標識と標識の隣り
のリガンドに結合された受容体との近接を利用して公知
技術により標識からの信号を加減することができる。イ
ムノリシスはどこにも示浚されていない。実際この文献
が明瞭に示していることは、もし小胞が溶解すれば、こ
の分析法に必要な標識とリガンドとの空間的関係（近
接）に悪影響を及ぼすであろうということである。
ており、その一つはUllmanらにより米国特許第４，１９
３，９８３号明細書に開示されている。この測定系にお
いては標識およびリガンドまたはリガンド類似体が、水
性環境中でその状態を保持し得るコロイド状粒子、例え
ばリポソームの外部表面に非共有結合的に結合される。
個々のコロイド状粒子は、リガンドまたはその類似体と
標識との平均的空間的関係を実質的に一定に保つ中心な
いし核として作用する。標識とリガンドとを粒子表面上
で比較的近接させておくことにより、標識と標識の隣り
のリガンドに結合された受容体との近接を利用して公知
技術により標識からの信号を加減することができる。イ
ムノリシスはどこにも示浚されていない。実際この文献
が明瞭に示していることは、もし小胞が溶解すれば、こ
の分析法に必要な標識とリガンドとの空間的関係（近
接）に悪影響を及ぼすであろうということである。
表面に結合したリガンドまたはリガンド類似体と小胞内
部に封入された標識または試剤物質とを有するように製
造または処理された多分子層脂質膜を使用する特異的結
合測定系が提案されている。この分析における残りの試
剤としては（１）リガンドに対する結合パートナー例え
ば抗体および（２）結合パートナーの表面結合リガンド
との結合に際して小胞の溶解を起す補対が含まれる。全
般に関し、McConnell、米国特許第３，８５０，５７８
号明細書およびMcConnell等、米国特許第３，８８７，
６９８号明細書およびGregoriadis等、Liposomes in Bi
ological Systems（生物学的系におけるリポソーム）
（ジヨンウイリーアンドサンズ、ニユーヨーク、１９８
０年）、特に第１２章「Liposomes as Diagnostic Tool
s（診断用手段としてのリポソーム）」を参照された
い。
部に封入された標識または試剤物質とを有するように製
造または処理された多分子層脂質膜を使用する特異的結
合測定系が提案されている。この分析における残りの試
剤としては（１）リガンドに対する結合パートナー例え
ば抗体および（２）結合パートナーの表面結合リガンド
との結合に際して小胞の溶解を起す補対が含まれる。全
般に関し、McConnell、米国特許第３，８５０，５７８
号明細書およびMcConnell等、米国特許第３，８８７，
６９８号明細書およびGregoriadis等、Liposomes in Bi
ological Systems（生物学的系におけるリポソーム）
（ジヨンウイリーアンドサンズ、ニユーヨーク、１９８
０年）、特に第１２章「Liposomes as Diagnostic Tool
s（診断用手段としてのリポソーム）」を参照された
い。
さらに、酵素を内部に封入したリポソームの使用を示唆
した免疫検定系が開示されている。Hsia等の米国特許第
４，２３５，７９２号明細書には標識を含有する抗原増
感リポソームのイムノリシスを使用する競合的均一系免
疫検定法が記載されている。開示された標識の中には酵
素も記されている（コラム６、第２４−２８行）。
した免疫検定系が開示されている。Hsia等の米国特許第
４，２３５，７９２号明細書には標識を含有する抗原増
感リポソームのイムノリシスを使用する競合的均一系免
疫検定法が記載されている。開示された標識の中には酵
素も記されている（コラム６、第２４−２８行）。
Coleの米国特許第４，３４２，８２６号明細書には抗原
増感された酵素含有リポソームを使用する特異的結合測
定法が開示されている。これらのリポソームは対応する
抗体の結合および活性補体の固定によつて免疫特異的に
酵素を放出する。酵素の放出により酵素活性の有無が検
出される。Coleは酵素活性がリーシスによつて本質的に
増大するような、例えば「信号：ノイズ」比が少くとも
５−１０、好ましくは６０以上であるような均一系を提
供するという利点を強調している。
増感された酵素含有リポソームを使用する特異的結合測
定法が開示されている。これらのリポソームは対応する
抗体の結合および活性補体の固定によつて免疫特異的に
酵素を放出する。酵素の放出により酵素活性の有無が検
出される。Coleは酵素活性がリーシスによつて本質的に
増大するような、例えば「信号：ノイズ」比が少くとも
５−１０、好ましくは６０以上であるような均一系を提
供するという利点を強調している。
小胞標識系を目指す上記の各方法は、標識を反応媒質か
ら隔離してイムノリシス以前の信号発生を最小とする
（潜伏）点においてそれぞれ何等かの進歩を与えるもの
である。すなわち無傷のリポソームから観測される信号
は溶解されたリポソームからの信号に比して相当弱い。
上記文献によつて示された通り、この目的は、リポソー
ム免疫検定の改善において考慮すべき主要な点であると
広く認められてきた。さらに、この分野における文献が
総合的に教える所は、リーシス以前の完全隔離とイムノ
リシス後の高強度信号発生とを組合せれば、得られる利
益はさらに大きくなるということである。
ら隔離してイムノリシス以前の信号発生を最小とする
（潜伏）点においてそれぞれ何等かの進歩を与えるもの
である。すなわち無傷のリポソームから観測される信号
は溶解されたリポソームからの信号に比して相当弱い。
上記文献によつて示された通り、この目的は、リポソー
ム免疫検定の改善において考慮すべき主要な点であると
広く認められてきた。さらに、この分野における文献が
総合的に教える所は、リーシス以前の完全隔離とイムノ
リシス後の高強度信号発生とを組合せれば、得られる利
益はさらに大きくなるということである。
上記の従来の諸方法と対照的に本発明によれば、ある種
の標識含有リポソームは無傷の場合に高強度の信号を発
生し、溶解または膜透過性変化の場合に信号が減少また
は消滅する（逆潜伏）ことが発見された。本発明では、
小胞外部のある試剤が小胞に何等の変化が生ずる前に封
入された標識に接近することができ、小胞の変化によつ
て試験組成物中の他の試剤または成分が標識に近接し得
るようになるような、小胞と選ばれた試剤（複数）との
組合せを使用する。本発明によつて得られる従来の均一
系検定法と比較しての利点としては、感度の増加（少く
とも、血清試料中約１０-18モル濃度（Ｍ）の範囲まで
のリガンド測定）、血清干渉の減少、均一系特異的結合
測定法の実験記録の単純化、および従来の均一系検定法
におけるよりも広い範囲の高分子および低分子リガンド
（被分析物）への適用可能性が挙げられる。
の標識含有リポソームは無傷の場合に高強度の信号を発
生し、溶解または膜透過性変化の場合に信号が減少また
は消滅する（逆潜伏）ことが発見された。本発明では、
小胞外部のある試剤が小胞に何等の変化が生ずる前に封
入された標識に接近することができ、小胞の変化によつ
て試験組成物中の他の試剤または成分が標識に近接し得
るようになるような、小胞と選ばれた試剤（複数）との
組合せを使用する。本発明によつて得られる従来の均一
系検定法と比較しての利点としては、感度の増加（少く
とも、血清試料中約１０-18モル濃度（Ｍ）の範囲まで
のリガンド測定）、血清干渉の減少、均一系特異的結合
測定法の実験記録の単純化、および従来の均一系検定法
におけるよりも広い範囲の高分子および低分子リガンド
（被分析物）への適用可能性が挙げられる。
以上の利点は、(a)リガンドに対する結合パートナー、
(b)少くとも二つの構成要素を有する検出系、(c)表面に
結合したリガンドまたはリガンド類似体と内部に前記検
出系の第一の構成要素を有する選択的に透過可能な小
胞、(d)表面結合リガンドまたはリガンド類似体と結合
パートナーとの結合に応答して小胞の透過性を変化させ
る物質、および(e)前記第一の構成要素と反応して検出
し得る応答を生じこの応答は小胞が結合パートナーおよ
び小胞変性物質の存在下にあると低下するものとする、
前記検出系の少くとも一つの追加的構成要素を含有して
成る、試料中のリガンド測定用組成物によつて達成され
る。
(b)少くとも二つの構成要素を有する検出系、(c)表面に
結合したリガンドまたはリガンド類似体と内部に前記検
出系の第一の構成要素を有する選択的に透過可能な小
胞、(d)表面結合リガンドまたはリガンド類似体と結合
パートナーとの結合に応答して小胞の透過性を変化させ
る物質、および(e)前記第一の構成要素と反応して検出
し得る応答を生じこの応答は小胞が結合パートナーおよ
び小胞変性物質の存在下にあると低下するものとする、
前記検出系の少くとも一つの追加的構成要素を含有して
成る、試料中のリガンド測定用組成物によつて達成され
る。
さらに本発明によれば、本発明の試験用組成物をリガン
ドを含むと思われる試料と混合し、検出し得る信号に生
ずる変化を観測することから成る、試料中のリガンド測
定のための特異的結合測定法が提供される。好ましくは
上記混合工程は、リガンドを含むと思われる試料、該リ
ガンドに対する結合パートナー、ルミネセンス剤、補体
およびリガンドで増感したペルオキシダーゼ含有リポソ
ームの混合物をつくり、この混合物をインキユベート
し、その混合物を過酸化水素と混合することから成る。
過酸化水素との混合後混合物のルミネセンスを観察す
る。ルミネセンスの強度と継続時間との増加は試料中の
リガンドの濃度増加と直接に関係し、またその濃度増加
の結果である。この信号増大は、リポソーム表面に結合
すべき結合パートナーが減少しリポソーム表面で補体の
固定が始まることと関係している。先に記したようにこ
れは、従来観察された信号応答の場合には試料のリガン
ド濃度が高いほど観察される信号が低いのと対照的であ
る。
ドを含むと思われる試料と混合し、検出し得る信号に生
ずる変化を観測することから成る、試料中のリガンド測
定のための特異的結合測定法が提供される。好ましくは
上記混合工程は、リガンドを含むと思われる試料、該リ
ガンドに対する結合パートナー、ルミネセンス剤、補体
およびリガンドで増感したペルオキシダーゼ含有リポソ
ームの混合物をつくり、この混合物をインキユベート
し、その混合物を過酸化水素と混合することから成る。
過酸化水素との混合後混合物のルミネセンスを観察す
る。ルミネセンスの強度と継続時間との増加は試料中の
リガンドの濃度増加と直接に関係し、またその濃度増加
の結果である。この信号増大は、リポソーム表面に結合
すべき結合パートナーが減少しリポソーム表面で補体の
固定が始まることと関係している。先に記したようにこ
れは、従来観察された信号応答の場合には試料のリガン
ド濃度が高いほど観察される信号が低いのと対照的であ
る。
先に述べた通り本発明のリポソームは溶解した場合より
も無傷の場合の方が高いルミネセンスを示す。この現象
は、このようなリポソームがリガンドまたはリガンド類
似体で増感された場合、有用で新規な均一系免疫検定法
の基礎を与える。これらは特異的結合パートナー例えば
抗体と相互に作用して、補体の存在においてリーシスを
起す組成物を与えることができる。かかるリーシスの結
果ルミネセンスは減少する。一方において、試料中のリ
ガンドは増感されたリポソームと抗体獲得を争い、この
競合の程度に応じて補体によるリーシスが減少する。こ
のため、試料中のリガンド濃度が増加するとルミネセン
ス強度が増加するという関係の薬量−応答曲線が得られ
る。
も無傷の場合の方が高いルミネセンスを示す。この現象
は、このようなリポソームがリガンドまたはリガンド類
似体で増感された場合、有用で新規な均一系免疫検定法
の基礎を与える。これらは特異的結合パートナー例えば
抗体と相互に作用して、補体の存在においてリーシスを
起す組成物を与えることができる。かかるリーシスの結
果ルミネセンスは減少する。一方において、試料中のリ
ガンドは増感されたリポソームと抗体獲得を争い、この
競合の程度に応じて補体によるリーシスが減少する。こ
のため、試料中のリガンド濃度が増加するとルミネセン
ス強度が増加するという関係の薬量−応答曲線が得られ
る。
本発明の好ましい態様には、ルミネセンス性特異的結合
測定用試薬組成物、この試験用組成物の一つ以上の成分
を組入れた試験装置、試験用組成物の一つ以上の成分を
それぞれ組入れた容器または装置を他の成分または材料
と組合せ包装したものから成る試験用キツト、および本
発明のこの試料用組成物、装置およびキットを使用する
方法が含まれる。以下の記載において特定の態様のみに
ついて使用される特定の用語は特記しない限りすべての
態様に対し適用されるものである。
測定用試薬組成物、この試験用組成物の一つ以上の成分
を組入れた試験装置、試験用組成物の一つ以上の成分を
それぞれ組入れた容器または装置を他の成分または材料
と組合せ包装したものから成る試験用キツト、および本
発明のこの試料用組成物、装置およびキットを使用する
方法が含まれる。以下の記載において特定の態様のみに
ついて使用される特定の用語は特記しない限りすべての
態様に対し適用されるものである。
試験の対象となる試料液体には生物学的、生理学的、産
業的、環境的およびその他の種類の液体が含まれる。特
に興味があるのは生物学的液体、例えば血清、血漿、
尿、脳脊髄液、唾液、ミルク、肉汁その他の培養地、お
よびそれらすべての上澄液並びに画分である。興味ある
生理学的液としては輸液、緩衝液、防腐または抗菌溶液
等が挙げられる。産業的の液としては、例えば医薬、乳
製品、麦芽発酵飲料の製造に使用する発酵培地その他の
製造工程液が挙げられる。従来の方法によって試験され
るその他の起源の試料液もこの用語の範囲内にあると考
えられ、同様に本発明に従つて測定することができる。
業的、環境的およびその他の種類の液体が含まれる。特
に興味があるのは生物学的液体、例えば血清、血漿、
尿、脳脊髄液、唾液、ミルク、肉汁その他の培養地、お
よびそれらすべての上澄液並びに画分である。興味ある
生理学的液としては輸液、緩衝液、防腐または抗菌溶液
等が挙げられる。産業的の液としては、例えば医薬、乳
製品、麦芽発酵飲料の製造に使用する発酵培地その他の
製造工程液が挙げられる。従来の方法によって試験され
るその他の起源の試料液もこの用語の範囲内にあると考
えられ、同様に本発明に従つて測定することができる。
「リガンド」なる用語は、試料液例えば上記したような
試料液中のその存在を定性的にまたは定量的に測定すべ
き任意の物質、または同類の物質の群をいう。本発明の
測定は特異的結合パートナーの存在するリガンドの検出
および、逆に、ある液体媒質がリガンドを結合する（通
常試料中のリガンドに対する結合パートナーの存在によ
って）能力の検出に適用することができる。リガンドは
通常ペプチド、タンパク質、炭水化物、糖タンパク質、
ステロイドまたはその他の有機分子でその特異的結合パ
ートナーが存在するかまたは免疫学的もしくは合成的手
段によってそれを与えることができるものである。機能
的用語を用いるならば、リガンドは通常、抗原およびそ
の抗体、ハプテンおよびその抗体、ならびにホルモン、
ビタミン、中間代謝物および薬理学的剤、およびそれら
の受容体および結合物質から選ばれる。本発明を使用し
て検出し得るリガンドの具体例としてはホルモン例えば
インリユリン、絨毛膜生殖腺刺戟ホルモン、チロキシ
ン、トリヨードチロニン、卵胞刺戟ホルモン、黄体形成
ホルモン、甲状腺刺戟ホルモンおよびエストリオール；
抗原およびハプテン例えばフエリチン、ブラジキニン、
プロスタグランジンおよび腫瘍特異性抗原；ビタミン例
えばビオチン、ビタミンB12、葉酸、ビタミンＥ、ビタ
ミンＡ、およびアスコルビン酸；中間代謝物例えば
３′，５′−アデノシンモノホスフエートおよび３′，
５′−グアノシンモノホスフエート；薬理学的剤または
薬剤例えばアミノグリコシド抗生物質例えばゲンタミシ
ン、アミカシンおよびシソミシン、または乱用性薬物例
えばアヘンアルカロイドおよび麦角誘導体；抗体例えば
肝炎およびアレルゲンに対するミクロソーム的抗体；お
よび特異的結合受容体例えばチロキシン結合グロブリ
ン、アビジン、内因性因子およびトランスコバラミンが
挙げられる。
試料液中のその存在を定性的にまたは定量的に測定すべ
き任意の物質、または同類の物質の群をいう。本発明の
測定は特異的結合パートナーの存在するリガンドの検出
および、逆に、ある液体媒質がリガンドを結合する（通
常試料中のリガンドに対する結合パートナーの存在によ
って）能力の検出に適用することができる。リガンドは
通常ペプチド、タンパク質、炭水化物、糖タンパク質、
ステロイドまたはその他の有機分子でその特異的結合パ
ートナーが存在するかまたは免疫学的もしくは合成的手
段によってそれを与えることができるものである。機能
的用語を用いるならば、リガンドは通常、抗原およびそ
の抗体、ハプテンおよびその抗体、ならびにホルモン、
ビタミン、中間代謝物および薬理学的剤、およびそれら
の受容体および結合物質から選ばれる。本発明を使用し
て検出し得るリガンドの具体例としてはホルモン例えば
インリユリン、絨毛膜生殖腺刺戟ホルモン、チロキシ
ン、トリヨードチロニン、卵胞刺戟ホルモン、黄体形成
ホルモン、甲状腺刺戟ホルモンおよびエストリオール；
抗原およびハプテン例えばフエリチン、ブラジキニン、
プロスタグランジンおよび腫瘍特異性抗原；ビタミン例
えばビオチン、ビタミンB12、葉酸、ビタミンＥ、ビタ
ミンＡ、およびアスコルビン酸；中間代謝物例えば
３′，５′−アデノシンモノホスフエートおよび３′，
５′−グアノシンモノホスフエート；薬理学的剤または
薬剤例えばアミノグリコシド抗生物質例えばゲンタミシ
ン、アミカシンおよびシソミシン、または乱用性薬物例
えばアヘンアルカロイドおよび麦角誘導体；抗体例えば
肝炎およびアレルゲンに対するミクロソーム的抗体；お
よび特異的結合受容体例えばチロキシン結合グロブリ
ン、アビジン、内因性因子およびトランスコバラミンが
挙げられる。
「結合パートナー」または「受容体」なる用語は他の物
質よりも優先的にリガンドに対して特異的結合親和性を
有する任意の物質、または物質群を指す。本発明の実施
態様の大部分においては、試料中のリガンドまたはその
結合エフエクターと免疫化学的に相互作用を行う特異的
結合測定用試剤が使用される。すなわち、試料中のリガ
ンドまたはその結合エフエクターおよび（または）試剤
の間には抗原−抗体またハプテン−抗体関係が生ずる。
従つてかかる測定は免疫検定と呼ばれ、リガンドおよび
その受容体、または結合パートナーとの間の特殊の相互
作用は免疫化学的結合である。モノクローナル抗体は特
に適当な受容体である。しかしホルモン、ビタミン、中
間代謝物、薬理学的剤、およびそれらそれぞれの受容体
および結合物質間の相互作用を含め、リガンドと結合パ
ートナーとの間のその他の接合相互作用が特異的結合測
定法の基礎として役立つことは当業界でよく知られてい
る。例えば結合剤またはパートナーとしてのポリペプチ
ドホルモン受容体がLangan等（編）、リガンドアツセイ
（リガンド検定）（Masson Publishing U.S.A.社、ニユ
ーヨーク、２１１頁以降（１９８１年））に論じられて
いる。
質よりも優先的にリガンドに対して特異的結合親和性を
有する任意の物質、または物質群を指す。本発明の実施
態様の大部分においては、試料中のリガンドまたはその
結合エフエクターと免疫化学的に相互作用を行う特異的
結合測定用試剤が使用される。すなわち、試料中のリガ
ンドまたはその結合エフエクターおよび（または）試剤
の間には抗原−抗体またハプテン−抗体関係が生ずる。
従つてかかる測定は免疫検定と呼ばれ、リガンドおよび
その受容体、または結合パートナーとの間の特殊の相互
作用は免疫化学的結合である。モノクローナル抗体は特
に適当な受容体である。しかしホルモン、ビタミン、中
間代謝物、薬理学的剤、およびそれらそれぞれの受容体
および結合物質間の相互作用を含め、リガンドと結合パ
ートナーとの間のその他の接合相互作用が特異的結合測
定法の基礎として役立つことは当業界でよく知られてい
る。例えば結合剤またはパートナーとしてのポリペプチ
ドホルモン受容体がLangan等（編）、リガンドアツセイ
（リガンド検定）（Masson Publishing U.S.A.社、ニユ
ーヨーク、２１１頁以降（１９８１年））に論じられて
いる。
「選択的に透過可能な小胞」なる語は、内部のある容積
を囲い込み、一つ以上の成分から構成され上記の内部容
積を構成する一つ以上の内部隔室を形成する壁を有す
る、単一のまたは多くの隔室から成る嚢を指す。かゝる
小胞の一例は、細胞膜を開いて内部の成分を除去し、膜
を再シールして形成される細胞ゴーストである。別の例
は、連続壁すなわち二分子層脂質膜を形成する脂質、特
に少くとも一つのリン脂質を含有する脂質混合物から成
る単一室または多室の小胞であるリポソームである。こ
れら脂質混合物の共通的成分はコレステロールである。
全脂質モル当り約１０−４０モル％のコレステロールを
含有する脂質混合物が本発明の組成物および方法に有用
なリポソーム製造に使用し得ることが判明した。リポソ
ームは任意の多くの方法によって製造することができ
る。例えば多層小胞（MLVs）はフイルム蒸発および脂質
フイルムの水和によって製造することができる。逆相蒸
発小胞（REVs）も製造することができる。これらは有用
な小胞の提供技術の例の二三を示したものである。リポ
ソームおよびその形成の概説については、Papaahadjopo
ulos等（編）、リポソームズ、Ann.N.Y.Acad.Sci.，３
０８巻（１９７８年）；Tom等（編）、Liposomes and I
mmunobiology（リポソームおよび免疫生物学）、Elsevi
er North Holland社、N.Y.（１９８０年）；およびGreg
oriadis等、Liposomes in Biological Systems（生物学
的系におけるリポソーム）、John Wiley & Sons社，N.
Y.（１９８０年）を参照されたい。
を囲い込み、一つ以上の成分から構成され上記の内部容
積を構成する一つ以上の内部隔室を形成する壁を有す
る、単一のまたは多くの隔室から成る嚢を指す。かゝる
小胞の一例は、細胞膜を開いて内部の成分を除去し、膜
を再シールして形成される細胞ゴーストである。別の例
は、連続壁すなわち二分子層脂質膜を形成する脂質、特
に少くとも一つのリン脂質を含有する脂質混合物から成
る単一室または多室の小胞であるリポソームである。こ
れら脂質混合物の共通的成分はコレステロールである。
全脂質モル当り約１０−４０モル％のコレステロールを
含有する脂質混合物が本発明の組成物および方法に有用
なリポソーム製造に使用し得ることが判明した。リポソ
ームは任意の多くの方法によって製造することができ
る。例えば多層小胞（MLVs）はフイルム蒸発および脂質
フイルムの水和によって製造することができる。逆相蒸
発小胞（REVs）も製造することができる。これらは有用
な小胞の提供技術の例の二三を示したものである。リポ
ソームおよびその形成の概説については、Papaahadjopo
ulos等（編）、リポソームズ、Ann.N.Y.Acad.Sci.，３
０８巻（１９７８年）；Tom等（編）、Liposomes and I
mmunobiology（リポソームおよび免疫生物学）、Elsevi
er North Holland社、N.Y.（１９８０年）；およびGreg
oriadis等、Liposomes in Biological Systems（生物学
的系におけるリポソーム）、John Wiley & Sons社，N.
Y.（１９８０年）を参照されたい。
リポソームは表面に合体したリガンドまたはリガンド類
似体部分を有するようにつくることができる。かかるリ
ポソームはリガンド−両親媒性物質複合体（通常リガン
ド−カプラー−両親媒性物質分子の形をとる）を使用し
て形成される。両親媒性物質は水溶性と水不溶性の両領
域を含有する物質である。その最も良い例は脂質両親媒
性物質、例えばホスフアチジルエタノールアミン、ホス
フアチジルセリン、ホスフアチジルイノシトール、スフ
インゴミエリンセレブロシド、ホスフアチジン酸、プラ
スマロゲン、カルジオリピンおよび脂肪酸である。
似体部分を有するようにつくることができる。かかるリ
ポソームはリガンド−両親媒性物質複合体（通常リガン
ド−カプラー−両親媒性物質分子の形をとる）を使用し
て形成される。両親媒性物質は水溶性と水不溶性の両領
域を含有する物質である。その最も良い例は脂質両親媒
性物質、例えばホスフアチジルエタノールアミン、ホス
フアチジルセリン、ホスフアチジルイノシトール、スフ
インゴミエリンセレブロシド、ホスフアチジン酸、プラ
スマロゲン、カルジオリピンおよび脂肪酸である。
対象の抗原性物質を両親媒性分子にカツプリングするに
は、種々のカツプリング剤およびカツプリング反応を使
用することができる。すなわち例えば抗原性物質のカル
ボン酸基を両親媒性分子のアミノ基と直接反応させてカ
ツプリングし、Ｎ置換基が両親媒性分子の残基である抗
原性Ｎ置換アミドを製造することができる。別の例では
抗原性物質を両親媒性物質にカツプリングするために特
定の試剤を使用し、このカツプリング試剤を先ず抗原性
物質か両親媒性分子かのいずれかと反応させて反応性中
間体または前駆体を製造し、次にこれをさらに反応させ
て最終のリガンドまたは増感剤複合体を製造することが
できる。かかるカツプリング試剤の例としてはアシルイ
ソシアネート、４−フルオロ−３−ニトロフエニルアジ
ド、およびマレイン酸とその誘導体（アミン基と反応さ
せてＮ，Ｎ′−置換マレイミドを得ることができる）が
挙げられる。抗原を選ばれた両親媒性物質例えばホスフ
アチジル−エタノールアミン、−セリンまたは−イソシ
トールと先ず反応させ次に脂質混合物中に加えてこの混
合物からリポソームを形成し得るということはこの場合
極めて好都合である。何故なら、このカツプリング反応
は、必ずしも他の、例えば酵素含有の系と相溶性である
ことを要しない各種溶媒中で実施し得るからである。
は、種々のカツプリング剤およびカツプリング反応を使
用することができる。すなわち例えば抗原性物質のカル
ボン酸基を両親媒性分子のアミノ基と直接反応させてカ
ツプリングし、Ｎ置換基が両親媒性分子の残基である抗
原性Ｎ置換アミドを製造することができる。別の例では
抗原性物質を両親媒性物質にカツプリングするために特
定の試剤を使用し、このカツプリング試剤を先ず抗原性
物質か両親媒性分子かのいずれかと反応させて反応性中
間体または前駆体を製造し、次にこれをさらに反応させ
て最終のリガンドまたは増感剤複合体を製造することが
できる。かかるカツプリング試剤の例としてはアシルイ
ソシアネート、４−フルオロ−３−ニトロフエニルアジ
ド、およびマレイン酸とその誘導体（アミン基と反応さ
せてＮ，Ｎ′−置換マレイミドを得ることができる）が
挙げられる。抗原を選ばれた両親媒性物質例えばホスフ
アチジル−エタノールアミン、−セリンまたは−イソシ
トールと先ず反応させ次に脂質混合物中に加えてこの混
合物からリポソームを形成し得るということはこの場合
極めて好都合である。何故なら、このカツプリング反応
は、必ずしも他の、例えば酵素含有の系と相溶性である
ことを要しない各種溶媒中で実施し得るからである。
別の方法として、リガンドをあらかじめ形成されたリポ
ソームの表面に共有結合によって結合しまたは吸着させ
ることができる。リポソームをあらかじめ形成する場合
その外部表面に、抗原が共有結合によつて結合し得るよ
うないくつかの化学的官能性を持たせることができる。
これらのうち重要なものとしては、ホスフアチジル−エ
タノールアミンから導かれるアミノ基、ホスフアチジル
−イノシトールによるヒドロキシル基、および脂肪酸ま
たはホスフアチジル−セリンによって与えられるヒドロ
キシル基が挙げられる。この場合抗原をあらかじめ形成
したリポソームにカツプリングするには、二官能性カツ
プリング剤、例えばグルタルアルデヒド、ジイミドエス
テル、芳香族または脂肪族ジイソシアネート、ジカルボ
ン酸のビス−ｐ−ニトロフエニルエステル、芳香族ジス
ルホニルクロリドおよび二官能性ハロゲン化アリール例
えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、
ｐ，ｐ′−ジフルオロ−ｍ，ｍ′−ジニトロジフエニル
スルホンを使用する在来の化学反応によることができ
る。かかるカツプリングに適用し得る適当な反応はWill
iams等、Methods in Immunology and Immunochemistry
（免疫学および免疫化学における方法）、第１巻、Acad
emic Press社、ニユーヨーク（１９６７年）に記載され
ている。ある場合には、ＵｅｍｕｒａおよびＫｉｎｓｋ
ｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１：４０８５−４０
９４（１９７２）に示されるように、抗原をリポソーム
表面に吸着させることができる。
ソームの表面に共有結合によって結合しまたは吸着させ
ることができる。リポソームをあらかじめ形成する場合
その外部表面に、抗原が共有結合によつて結合し得るよ
うないくつかの化学的官能性を持たせることができる。
これらのうち重要なものとしては、ホスフアチジル−エ
タノールアミンから導かれるアミノ基、ホスフアチジル
−イノシトールによるヒドロキシル基、および脂肪酸ま
たはホスフアチジル−セリンによって与えられるヒドロ
キシル基が挙げられる。この場合抗原をあらかじめ形成
したリポソームにカツプリングするには、二官能性カツ
プリング剤、例えばグルタルアルデヒド、ジイミドエス
テル、芳香族または脂肪族ジイソシアネート、ジカルボ
ン酸のビス−ｐ−ニトロフエニルエステル、芳香族ジス
ルホニルクロリドおよび二官能性ハロゲン化アリール例
えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、
ｐ，ｐ′−ジフルオロ−ｍ，ｍ′−ジニトロジフエニル
スルホンを使用する在来の化学反応によることができ
る。かかるカツプリングに適用し得る適当な反応はWill
iams等、Methods in Immunology and Immunochemistry
（免疫学および免疫化学における方法）、第１巻、Acad
emic Press社、ニユーヨーク（１９６７年）に記載され
ている。ある場合には、ＵｅｍｕｒａおよびＫｉｎｓｋ
ｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１：４０８５−４０
９４（１９７２）に示されるように、抗原をリポソーム
表面に吸着させることができる。
本発明の組成物はさらに、表面結合リガンドまたはリガ
ンド類似体と結合パートナーとの結合に応答して小胞の
透過性を変化させる物質を含有する。この物質の主要な
例は、一括して補体と呼ばれる一群の化合物である。補
体は、細胞膜破壊またはリーシスを通ずる免疫複合体に
より誘起される組織損傷の主要な体液性エフエクターの
一つである。補体固定抗体の小胞、例えばリポソームま
たは細胞ゴースト表面のリガンドまたはリガンド類似体
への結合により補体の固定が誘起されることが判明して
いる。その結果として、実際の膜破壊またはリーシス、
もしくはそれが無ければ無傷の筈の膜内の機能的「孔」
の生成を通じて生ずる膜の透過性の変化によって、小胞
内部に存在した検出系成分が放出され、または外部媒質
中の成分が小胞内の検出成分に接近することが可能とな
る。使用する補体の入手源となる動物種は、公知の反応
性によつて抗体および抗体増感免疫原の源と相容性でな
ければならない。補体とその効果の概論については、Ra
pp等、Molecular Basis of Complemnt Action（補体作
用の分子的基礎）、Appleton-Century-Crofts社（１９
７０年）を参照されたい。また補体の役割については先
に引用した他のリポソーム免疫検定法に関する文献の多
くに論じられている。
ンド類似体と結合パートナーとの結合に応答して小胞の
透過性を変化させる物質を含有する。この物質の主要な
例は、一括して補体と呼ばれる一群の化合物である。補
体は、細胞膜破壊またはリーシスを通ずる免疫複合体に
より誘起される組織損傷の主要な体液性エフエクターの
一つである。補体固定抗体の小胞、例えばリポソームま
たは細胞ゴースト表面のリガンドまたはリガンド類似体
への結合により補体の固定が誘起されることが判明して
いる。その結果として、実際の膜破壊またはリーシス、
もしくはそれが無ければ無傷の筈の膜内の機能的「孔」
の生成を通じて生ずる膜の透過性の変化によって、小胞
内部に存在した検出系成分が放出され、または外部媒質
中の成分が小胞内の検出成分に接近することが可能とな
る。使用する補体の入手源となる動物種は、公知の反応
性によつて抗体および抗体増感免疫原の源と相容性でな
ければならない。補体とその効果の概論については、Ra
pp等、Molecular Basis of Complemnt Action（補体作
用の分子的基礎）、Appleton-Century-Crofts社（１９
７０年）を参照されたい。また補体の役割については先
に引用した他のリポソーム免疫検定法に関する文献の多
くに論じられている。
本発明の組成物には、少くとも二つの成分を含む検出系
が使用される。第一の成分は小胞内部にあり、少くとも
一つの追加的成分は第一の成分と反応して検出可能な応
答を生ずることができ、この応答は結合パートナーおよ
び小胞変性物質と小胞との結合によって低下するもので
ある。この主要な例はルミネセンス検出系である。ルミ
ネセンスは化学的な発光である。放射された光の測定に
基礎をおく分析は従来法に比して、高感度、広い直線的
範囲、一試験当りの低コスト、および比較的簡単で安価
な装置等の長所を有する。最も興味を持たれているのは
化学ルミネセンス（CL）および生物発光（BL）である。
後者は生物学的系に見いだされる特殊な形式のルミネセ
ンスに対して与えられた名称で、触媒作用をするタンパ
ク質がルミネセンス反応の効率を増加させる。実際、あ
る場合にはタンパク質成分なしでは反応は不可能であ
る。一般論についてはKricka等（編）、Clinical and B
iochemical Luminescence（臨床的および生化学的ルミ
ネセンス）（Marcel Dekker社、N.Y.，ＮＹ（１９８２
年）；DeLuca等（編）、Bioluminescence and Chemilum
inescence,Basic Chemistry and Analytical Applicatt
ons（生物発光および化学ルミネセンス、基礎化学およ
び分析的応用）（Acadmic Press社，N.Y.，ＮＹ（１９
８１年））；Morawetz等（編）、Luminescence form Bi
ological and Synthetic Macromolecules（生物学的お
よび合成高分子からのルミネセンス）、（第８回Katzir
会議、Ann.N.Y.Acad.Sci.,３６６巻（１９８１年））；
およびProceedings of International Symposium on An
alytical Application of Bioluminescence and Chemil
uminescence（生物発光および化学ルミネセンスの分析
的応用に関する国際シンポシウム紀要）（State Printi
ng & Publishing社、Westlake Village，カリホルニア
（１９７９年））を参照されたい。
が使用される。第一の成分は小胞内部にあり、少くとも
一つの追加的成分は第一の成分と反応して検出可能な応
答を生ずることができ、この応答は結合パートナーおよ
び小胞変性物質と小胞との結合によって低下するもので
ある。この主要な例はルミネセンス検出系である。ルミ
ネセンスは化学的な発光である。放射された光の測定に
基礎をおく分析は従来法に比して、高感度、広い直線的
範囲、一試験当りの低コスト、および比較的簡単で安価
な装置等の長所を有する。最も興味を持たれているのは
化学ルミネセンス（CL）および生物発光（BL）である。
後者は生物学的系に見いだされる特殊な形式のルミネセ
ンスに対して与えられた名称で、触媒作用をするタンパ
ク質がルミネセンス反応の効率を増加させる。実際、あ
る場合にはタンパク質成分なしでは反応は不可能であ
る。一般論についてはKricka等（編）、Clinical and B
iochemical Luminescence（臨床的および生化学的ルミ
ネセンス）（Marcel Dekker社、N.Y.，ＮＹ（１９８２
年）；DeLuca等（編）、Bioluminescence and Chemilum
inescence,Basic Chemistry and Analytical Applicatt
ons（生物発光および化学ルミネセンス、基礎化学およ
び分析的応用）（Acadmic Press社，N.Y.，ＮＹ（１９
８１年））；Morawetz等（編）、Luminescence form Bi
ological and Synthetic Macromolecules（生物学的お
よび合成高分子からのルミネセンス）、（第８回Katzir
会議、Ann.N.Y.Acad.Sci.,３６６巻（１９８１年））；
およびProceedings of International Symposium on An
alytical Application of Bioluminescence and Chemil
uminescence（生物発光および化学ルミネセンスの分析
的応用に関する国際シンポシウム紀要）（State Printi
ng & Publishing社、Westlake Village，カリホルニア
（１９７９年））を参照されたい。
溶液中におけるCLの過程には次の三つの段階がある：
(a)予備的反応による、鍵となる中間物の生成、(b)鍵的
中間物の化学エネルギーが電子的励起エネルギーに転換
される励起工程および(c)化学反応によって生成した励
起された生成物からの光の放射。一般に反応物には酸化
剤と還元剤とが含まれ還元剤が、酸化される結果として
発光する。触媒、例えばヘムまたはペルオキシダーゼを
含有する方が好ましいことがしばしばある。この項に述
べるCL反応はすべて、酸化剤の過酸化水素を検出するの
が共通の特徴である。このため臨床化学者にとっては時
に興味あるものとなる。というのは現在多くの臨床的測
定に使用されている比色的過酸化物検出法に代る方法と
なり得るからである。
(a)予備的反応による、鍵となる中間物の生成、(b)鍵的
中間物の化学エネルギーが電子的励起エネルギーに転換
される励起工程および(c)化学反応によって生成した励
起された生成物からの光の放射。一般に反応物には酸化
剤と還元剤とが含まれ還元剤が、酸化される結果として
発光する。触媒、例えばヘムまたはペルオキシダーゼを
含有する方が好ましいことがしばしばある。この項に述
べるCL反応はすべて、酸化剤の過酸化水素を検出するの
が共通の特徴である。このため臨床化学者にとっては時
に興味あるものとなる。というのは現在多くの臨床的測
定に使用されている比色的過酸化物検出法に代る方法と
なり得るからである。
一般に過酸化水素は最も普通に使用される酸化剤であ
る。使用されるその他の酸化剤としてはエチルヒドロペ
ルオキシド、次亜塩素酸塩、ヨウ素、過マンガン酸塩お
よび適当な触媒の存在における酸素が挙げられる。中間
体または最終生成物として酸化剤例えば過酸化水素を生
ずる共役酵素系をはじめとする酵素系が、本発明による
ルミネセンス検出系用のかかる酸化剤の源として使用さ
れてきた。例としてグルコース／グルコースオキシダー
ゼまたはグリセロール／グリセロールオキシダーゼ反応
による過酸化水素の生成がある。
る。使用されるその他の酸化剤としてはエチルヒドロペ
ルオキシド、次亜塩素酸塩、ヨウ素、過マンガン酸塩お
よび適当な触媒の存在における酸素が挙げられる。中間
体または最終生成物として酸化剤例えば過酸化水素を生
ずる共役酵素系をはじめとする酵素系が、本発明による
ルミネセンス検出系用のかかる酸化剤の源として使用さ
れてきた。例としてグルコース／グルコースオキシダー
ゼまたはグリセロール／グリセロールオキシダーゼ反応
による過酸化水素の生成がある。
過酸化水素との反応の結果としての化学ルミネセンスの
現象は光を発する数種の還元剤化合物（ルミネセンス発
光団）、特に環式ジアシルヒドラジドにおいて見いださ
れている。最も普通に使用されるものゝ一つはルミノー
ル（５−アミノ−２，３−ジヒドロフタラジン−１，４
−ジオン）である。アミノ基の位置の移動は効率を低下
させる。例えばイソルミノール（６−アミノ−２，３−
ジヒドロフタラジン−１，４−ジオン）の効率はルミノ
ールの１０％である。環構造における置換はルミネセン
スに著しく影響する。ベンゼン核における電子吸引性置
換基はルミネセンスを減少させるが電気供与性の置換基
は光効率を増加させ、５および８位の置換は６および７
位よりも有効である。複素環を置換すると発光は全く起
きなくなる。ルミノールの有環同族体でルミノールより
３００％も効率の良いものが製造されている。Mc Capr
a、the Chemiluminescence of Organic Compounds（有機
化合物の化学ルミネセンス）、Q.Rev（四半期報）（ロ
ンドン）、２０：４８５（１９６６）を参照されたい。
ルシゲニンス（例えばビス−Ｎ−メチルアクリジニウム
ナイトレート）、アクリジニウムフエニルカルボキシレ
ート、シウ酸ジアリール例えばビス（トリクロロフエニ
ル）オキザレート、ロフインおよびポリヒドロキシフエ
ノール例えばピロガロールまたは没食子酸を使用するも
のを含めてその他いくつかの化学ルミネセンス系が開発
されている。ルミネセンスおよびその化学的測定におけ
る役割りに関する優れた概観が、Gorus等、Application
s of Bio-and Chemiluminescence in the Clinical Lab
oratory（臨床研究室における生物発光および化学ルミ
ネセンスの応用）、Clin.Chem.，２５：５１２−５１９
（１９７９）およびWhitehead等、Analytical Luminesc
ence：Its Potential in the Clinical Laboratory（分
析用ルミネセンス：その臨床試験室における使用可能
性）、Clin.Chem，２５：１５３１−１５４６（１９７
９）によって得られる。
現象は光を発する数種の還元剤化合物（ルミネセンス発
光団）、特に環式ジアシルヒドラジドにおいて見いださ
れている。最も普通に使用されるものゝ一つはルミノー
ル（５−アミノ−２，３−ジヒドロフタラジン−１，４
−ジオン）である。アミノ基の位置の移動は効率を低下
させる。例えばイソルミノール（６−アミノ−２，３−
ジヒドロフタラジン−１，４−ジオン）の効率はルミノ
ールの１０％である。環構造における置換はルミネセン
スに著しく影響する。ベンゼン核における電子吸引性置
換基はルミネセンスを減少させるが電気供与性の置換基
は光効率を増加させ、５および８位の置換は６および７
位よりも有効である。複素環を置換すると発光は全く起
きなくなる。ルミノールの有環同族体でルミノールより
３００％も効率の良いものが製造されている。Mc Capr
a、the Chemiluminescence of Organic Compounds（有機
化合物の化学ルミネセンス）、Q.Rev（四半期報）（ロ
ンドン）、２０：４８５（１９６６）を参照されたい。
ルシゲニンス（例えばビス−Ｎ−メチルアクリジニウム
ナイトレート）、アクリジニウムフエニルカルボキシレ
ート、シウ酸ジアリール例えばビス（トリクロロフエニ
ル）オキザレート、ロフインおよびポリヒドロキシフエ
ノール例えばピロガロールまたは没食子酸を使用するも
のを含めてその他いくつかの化学ルミネセンス系が開発
されている。ルミネセンスおよびその化学的測定におけ
る役割りに関する優れた概観が、Gorus等、Application
s of Bio-and Chemiluminescence in the Clinical Lab
oratory（臨床研究室における生物発光および化学ルミ
ネセンスの応用）、Clin.Chem.，２５：５１２−５１９
（１９７９）およびWhitehead等、Analytical Luminesc
ence：Its Potential in the Clinical Laboratory（分
析用ルミネセンス：その臨床試験室における使用可能
性）、Clin.Chem，２５：１５３１−１５４６（１９７
９）によって得られる。
先に記したように、生物発光（BL）は生物学的系に見い
だされるルミネセンスの一形式である。
だされるルミネセンスの一形式である。
大部分のBL系においては、酵素であるルシフエラーゼが
基質のルシフエリンのルミネセンス的酸化の触媒とな
る。「ルシフエラーゼ」なる一般名は基質例えばルシフ
エリンの酸化の触媒となって発光を生ずる酵素を指す。
「ルシフエリン」なる一般名は、酸化されて電子的に励
起された一重項状態となることができ、かつ基底状態に
戻る際に光を発する、還元された化学物を指す。これら
の系のうち最もよく研究されたものは螢のもので、これ
に対する反応は次式で示される： この反応はグリシン緩衝液（ｐＨ７．８）中で約２５℃
で行うのが最も良い。その他のBL系の大部分は海洋有機
物、例えば海洋バクテリアにおいて観察されている。例
えばビブリオ フイツシエリ（Vibrio fischeri）およ
びベネケア ハルベイイ（Beneckea harveyi）における
反応系は次のように示される： この反応においてＲＣＨＯは長鎖脂肪族アルデヒドであ
る。この反応は２５℃以下でＶ．fischeriに対してはpH
約６．４−７．２の範囲、Ｂ．harveyiに対してはpH
５．６−６．８の範囲で最も良く行われる。これらの、
およびその他のBL系もGorus等（上出）およびWhitehead
等（上出）に詳細に論じられている。
基質のルシフエリンのルミネセンス的酸化の触媒とな
る。「ルシフエラーゼ」なる一般名は基質例えばルシフ
エリンの酸化の触媒となって発光を生ずる酵素を指す。
「ルシフエリン」なる一般名は、酸化されて電子的に励
起された一重項状態となることができ、かつ基底状態に
戻る際に光を発する、還元された化学物を指す。これら
の系のうち最もよく研究されたものは螢のもので、これ
に対する反応は次式で示される： この反応はグリシン緩衝液（ｐＨ７．８）中で約２５℃
で行うのが最も良い。その他のBL系の大部分は海洋有機
物、例えば海洋バクテリアにおいて観察されている。例
えばビブリオ フイツシエリ（Vibrio fischeri）およ
びベネケア ハルベイイ（Beneckea harveyi）における
反応系は次のように示される： この反応においてＲＣＨＯは長鎖脂肪族アルデヒドであ
る。この反応は２５℃以下でＶ．fischeriに対してはpH
約６．４−７．２の範囲、Ｂ．harveyiに対してはpH
５．６−６．８の範囲で最も良く行われる。これらの、
およびその他のBL系もGorus等（上出）およびWhitehead
等（上出）に詳細に論じられている。
「過酸化的に活性な物質」なる語は、考慮対象の物質の
正確な化学的活性を定義するものである。ペルオキシダ
ーゼは、過酸化水素が他の物質を酸化する反応を促進す
る酵素である。ペルオキシダーゼは一般に鉄ポルフイリ
ン部分を組込んだタンパク質である。ペルオキシダーゼ
は西洋わさび、じやがいも、いちじく樹液およびかぶ中
に（植物ペルオキシダーゼ）、ミルク中に（ラクトペル
オキシダーゼ）、そして白血球中に（ベルドペルオキシ
ダーゼ）存在する。このものはまた、微生物中に存在し
発酵によつて製造することができる。ある種の合成ペル
オキシダーゼ、例えばTheorellおよびMaehlyによりActa
Chem.Scand.，４：４２２−４３４（１９５０）に開示
されたものもH2O2検出系に十分使用できる。より不満足
なものとしてはヘミン、メトヘモグロビン、オキシヘモ
グロビン、ヘモグロビン、ヘモクロモゲン、アルカリ性
ヘマチン、ヘミン誘導体および過酸化物またはペルオキ
シダーゼ様活性、すなわち他の物質の過酸化水素その他
の過酸化物による酸化を促進する能力を示すある種の他
の化合物等がある。酵素ではないが過酸化的活性を示す
他の物質としてはシリカゲルに吸着した第二クロム塩
（例えば硫酸クロム(III)カリウム）、スルホシアン酸
鉄、タンニン酸鉄、フエロシアン化第一鉄等がある。
正確な化学的活性を定義するものである。ペルオキシダ
ーゼは、過酸化水素が他の物質を酸化する反応を促進す
る酵素である。ペルオキシダーゼは一般に鉄ポルフイリ
ン部分を組込んだタンパク質である。ペルオキシダーゼ
は西洋わさび、じやがいも、いちじく樹液およびかぶ中
に（植物ペルオキシダーゼ）、ミルク中に（ラクトペル
オキシダーゼ）、そして白血球中に（ベルドペルオキシ
ダーゼ）存在する。このものはまた、微生物中に存在し
発酵によつて製造することができる。ある種の合成ペル
オキシダーゼ、例えばTheorellおよびMaehlyによりActa
Chem.Scand.，４：４２２−４３４（１９５０）に開示
されたものもH2O2検出系に十分使用できる。より不満足
なものとしてはヘミン、メトヘモグロビン、オキシヘモ
グロビン、ヘモグロビン、ヘモクロモゲン、アルカリ性
ヘマチン、ヘミン誘導体および過酸化物またはペルオキ
シダーゼ様活性、すなわち他の物質の過酸化水素その他
の過酸化物による酸化を促進する能力を示すある種の他
の化合物等がある。酵素ではないが過酸化的活性を示す
他の物質としてはシリカゲルに吸着した第二クロム塩
（例えば硫酸クロム(III)カリウム）、スルホシアン酸
鉄、タンニン酸鉄、フエロシアン化第一鉄等がある。
前記したようにルミネセンス検出においては光エネルギ
ーが発生する。このエネルギーは別の波長の、または全
く異る型の、検出し得る応答を生ずる別の分子に転移す
ることができる。例えばけい光団を検出系に加えること
ができる。ルミネセンス発光団とけい光団とは、けい光
団の励起波長の光が放射されるように選ぶことができ
る。従つて選択したけい光団によって規定される波長の
けい光が検出される。この、またその他のエネルギー転
移機構をルミネセンス系と組み合せて検出し得る信号を
自由に変化することができる。エネルギー転移系の一つ
の利点は、被測定試料の固有またはバックグラウンド発
光でルミネセンス系によって生ずる信号と容易に識別が
できないものの干渉を克服または防止し得ることであ
る。
ーが発生する。このエネルギーは別の波長の、または全
く異る型の、検出し得る応答を生ずる別の分子に転移す
ることができる。例えばけい光団を検出系に加えること
ができる。ルミネセンス発光団とけい光団とは、けい光
団の励起波長の光が放射されるように選ぶことができ
る。従つて選択したけい光団によって規定される波長の
けい光が検出される。この、またその他のエネルギー転
移機構をルミネセンス系と組み合せて検出し得る信号を
自由に変化することができる。エネルギー転移系の一つ
の利点は、被測定試料の固有またはバックグラウンド発
光でルミネセンス系によって生ずる信号と容易に識別が
できないものの干渉を克服または防止し得ることであ
る。
さらに、種々の阻害剤、消光剤または調節剤を添加して
検出系の反応性または信号を変化させることができる。
酵素活性を阻害または低下する物質は既知であり、これ
を添加して酵素がリポソームから放出された場合これに
影響を与え、またはリポソームの透過性が変化した場合
にこのリポソームを透過するようにすることができる。
例えば、シアンイオンは測定系にそれ以外の影響を及ぼ
さずに、放出されたペルオキシダーゼの活性を低下させ
ることが認められた。またペルオキシダーゼ活性を阻害
する抗体が記載されている。ルミネセンスまたはけい光
信号を消す物質を添加して、観測される逆潜伏現象を増
強することができる。このような消光物質および機構が
いくつか知られている。例えば上述のルミネセンス／け
い光エネルギー転移は、抗原／抗体結合が生じた場合に
そのけい光が消されるようなけい光物質を使用して達成
することができる。このことは在来の結合測定系と関連
して、Ｊ．Clin.Path.，３０：５２６（１９７７）に記
載されている。酵素モジユレーター系はBoguslaski等の
米国特許第４，１３４，７９２号明細書に記載されてい
る。
検出系の反応性または信号を変化させることができる。
酵素活性を阻害または低下する物質は既知であり、これ
を添加して酵素がリポソームから放出された場合これに
影響を与え、またはリポソームの透過性が変化した場合
にこのリポソームを透過するようにすることができる。
例えば、シアンイオンは測定系にそれ以外の影響を及ぼ
さずに、放出されたペルオキシダーゼの活性を低下させ
ることが認められた。またペルオキシダーゼ活性を阻害
する抗体が記載されている。ルミネセンスまたはけい光
信号を消す物質を添加して、観測される逆潜伏現象を増
強することができる。このような消光物質および機構が
いくつか知られている。例えば上述のルミネセンス／け
い光エネルギー転移は、抗原／抗体結合が生じた場合に
そのけい光が消されるようなけい光物質を使用して達成
することができる。このことは在来の結合測定系と関連
して、Ｊ．Clin.Path.，３０：５２６（１９７７）に記
載されている。酵素モジユレーター系はBoguslaski等の
米国特許第４，１３４，７９２号明細書に記載されてい
る。
本発明の測定方法には通常、リガンド含有試料、リガン
ド増感、ペルオキシダーゼ含有リポソームに特異的な抗
体および補体の組合せが含まれる。適当なインキユベー
シヨン期間後、上記混合物をルミネセンス性化合物およ
び酸化剤としての過酸化水素と混合する。これによつて
生じたルミネセンスを感光性検出器例えば光電子増倍
管、写真フイルムまたは半導体ダイオード等によつて測
定する。
ド増感、ペルオキシダーゼ含有リポソームに特異的な抗
体および補体の組合せが含まれる。適当なインキユベー
シヨン期間後、上記混合物をルミネセンス性化合物およ
び酸化剤としての過酸化水素と混合する。これによつて
生じたルミネセンスを感光性検出器例えば光電子増倍
管、写真フイルムまたは半導体ダイオード等によつて測
定する。
以下の実施例に本発明の開発において実施した実験を記
述する。可能な場合には常に市販の標準的な試薬級薬品
を使用した。
述する。可能な場合には常に市販の標準的な試薬級薬品
を使用した。
例 １ ルミネセンス性リポソーム系の逆潜伏 本例に示す実験は西洋わさびペルオキシダーゼを含有す
るリポソーム（HRP／リポソーム）、化学ルミネセンス
性（CL）化合物およびＣＬ化合物に対する酸化剤を含有
して成る反応混合物にリポソームを溶解する洗剤を作用
させた場合のその混合物のルミネセンスの変化を示すも
のである。以下に述べる通り極めて予想外の現象が観察
された。
るリポソーム（HRP／リポソーム）、化学ルミネセンス
性（CL）化合物およびＣＬ化合物に対する酸化剤を含有
して成る反応混合物にリポソームを溶解する洗剤を作用
させた場合のその混合物のルミネセンスの変化を示すも
のである。以下に述べる通り極めて予想外の現象が観察
された。
西洋わさびペルオキシダーゼ含有リポソームは次のよう
にして調製した。クロロホルム−メタノール（容積比
４：１）１２ml中卵レシチン（シグマケミカル社、セン
トルイス、ミズーリー）１３mg、ジセチルホスフエート
（シグマケミカル社、上出）３mg、コレステロール１．
１mgの混合物をなし型フラスコの内面上で蒸発して脂質
フイルムを作成した。水アスピレータによる減圧下４０
℃で乾燥フイルムが認められるまで蒸発を行い、次にこ
のフイルムを０．５mmHgの減圧下で２時間さらに乾燥し
た。得られた脂質フイルムを、緩衝液１ｍｌ当り２．０
mgの西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）（マイルズラ
ボラトリー社、エルカールト、インデイアナ）を含有す
るトリス緩衝液４．０mlにより、棒磁石でかきまぜなが
ら４℃で一夜水和した。トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン（TRIS）の緩衝原液（トリス緩衝液）はトリ
ス溶液（６０．５ｇ／、pH８．６）１００mlをNaCl溶
液（５８．６ｇ／）１５０mlと混合し蒸留水で１．０
として最終濃度をトリス０．０５Ｍ、NaCl０．１５Ｍ
とすることによって製造した。かくして生成したリポソ
ームは、１．５×３２cmのセフアロース６Ｂ（フアルマ
シアフアイン ケミカルズ社、ピスカタウエイ、ニユー
ジヤーシイ）カラム上脂質懸濁液１．０mlでトリス緩衝
液を溶離剤とするゲル排除クロマトグラフイによって遊
離ペルオキシダーゼと分離した。溶出液１．８mlづつの
４０画分を集めた。HRP／リポソームはギルフオード２
５０型分光光度計（ギルフオード インストルメント
社、オベルリン、オハイオ）を使用して４１０ｎｍにお
ける吸光度ピーク（濁りによる）の存在によって確認さ
れる通り画分１１−１４に単離された。画分１２と１３
とを合一し４℃で窒素ふんい気下に貯蔵した。
にして調製した。クロロホルム−メタノール（容積比
４：１）１２ml中卵レシチン（シグマケミカル社、セン
トルイス、ミズーリー）１３mg、ジセチルホスフエート
（シグマケミカル社、上出）３mg、コレステロール１．
１mgの混合物をなし型フラスコの内面上で蒸発して脂質
フイルムを作成した。水アスピレータによる減圧下４０
℃で乾燥フイルムが認められるまで蒸発を行い、次にこ
のフイルムを０．５mmHgの減圧下で２時間さらに乾燥し
た。得られた脂質フイルムを、緩衝液１ｍｌ当り２．０
mgの西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）（マイルズラ
ボラトリー社、エルカールト、インデイアナ）を含有す
るトリス緩衝液４．０mlにより、棒磁石でかきまぜなが
ら４℃で一夜水和した。トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン（TRIS）の緩衝原液（トリス緩衝液）はトリ
ス溶液（６０．５ｇ／、pH８．６）１００mlをNaCl溶
液（５８．６ｇ／）１５０mlと混合し蒸留水で１．０
として最終濃度をトリス０．０５Ｍ、NaCl０．１５Ｍ
とすることによって製造した。かくして生成したリポソ
ームは、１．５×３２cmのセフアロース６Ｂ（フアルマ
シアフアイン ケミカルズ社、ピスカタウエイ、ニユー
ジヤーシイ）カラム上脂質懸濁液１．０mlでトリス緩衝
液を溶離剤とするゲル排除クロマトグラフイによって遊
離ペルオキシダーゼと分離した。溶出液１．８mlづつの
４０画分を集めた。HRP／リポソームはギルフオード２
５０型分光光度計（ギルフオード インストルメント
社、オベルリン、オハイオ）を使用して４１０ｎｍにお
ける吸光度ピーク（濁りによる）の存在によって確認さ
れる通り画分１１−１４に単離された。画分１２と１３
とを合一し４℃で窒素ふんい気下に貯蔵した。
ルミノール試薬溶液は次のようにして製造した。ルミノ
ール（アルドリツチ ケミカル社、ミルウオーキー、ウ
イスコンシン）２２１．５mgをトリス緩衝液５０mlに溶
解し、これに５０％（Ｗ／Ｖ）NaOH４滴を加えてルミノ
ールを完全に溶解させ２．５×１０-2Ｍルミノール溶液
とした。この溶液０．５mlをトリス緩衝液４９．５mlと
混合しルミノール濃度２．５×１０-4Ｍのルミノール試
薬溶液とした。
ール（アルドリツチ ケミカル社、ミルウオーキー、ウ
イスコンシン）２２１．５mgをトリス緩衝液５０mlに溶
解し、これに５０％（Ｗ／Ｖ）NaOH４滴を加えてルミノ
ールを完全に溶解させ２．５×１０-2Ｍルミノール溶液
とした。この溶液０．５mlをトリス緩衝液４９．５mlと
混合しルミノール濃度２．５×１０-4Ｍのルミノール試
薬溶液とした。
H2O2試薬は３０％（Ｖ／Ｖ）H2O2水溶液（フイツシヤ
サイエンテイフイツク社、オレンジブルグ、ニユーヨー
ク）１４μをトリス緩衝液５０mlに加えて調製した。
サイエンテイフイツク社、オレンジブルグ、ニユーヨー
ク）１４μをトリス緩衝液５０mlに加えて調製した。
合一したHRP／リポソーム画分（画分１２および１３）
を次のようにしてH2O2の存在でルミノールの接触的酸化
により検定した。トリス緩衝液HRP／リポソームの一連
の希釈度のもの１．０mlづつを調製した。同じ一連の希
釈度のものをトリトン−Ｘ−１００（ローム アンド
ハース社、フイラデルフイア、ペンシルバニア）１％
（Ｗ／Ｖ）を含むトリス緩衝液中で調製した。各希釈液
１００μを、ターナー２０型ルミノメーター（ターナ
ーデザイン社、アウンテビユー、カリホルニア）内に位
置しトリス緩衝液中２．５×１０-3ＭH2O2２００μと
２．５×１０-4Ｍルミノール２００μとを入れた別々
のポリプロピレンチユーブに注入した。このようにし
て、測定すべき特定の反応混合物内で反応を開始させた
後各混合物のルミネセンスを、０．５秒の遅延時間後６
０秒間信号を積算してモニターし任意のルミネセンス単
位として記録した。リポソームの各希釈度に対してトリ
トンＸ−１００で化学的に溶解したHRP／リポソームお
よび無傷のHRP／リポソームについて観測された積算ル
ミネセンス、ならびに溶解されたHRP／リポソームと無
傷のものとの信号の比（Ｌ／Ｉ）を第１表に示す。
を次のようにしてH2O2の存在でルミノールの接触的酸化
により検定した。トリス緩衝液HRP／リポソームの一連
の希釈度のもの１．０mlづつを調製した。同じ一連の希
釈度のものをトリトン−Ｘ−１００（ローム アンド
ハース社、フイラデルフイア、ペンシルバニア）１％
（Ｗ／Ｖ）を含むトリス緩衝液中で調製した。各希釈液
１００μを、ターナー２０型ルミノメーター（ターナ
ーデザイン社、アウンテビユー、カリホルニア）内に位
置しトリス緩衝液中２．５×１０-3ＭH2O2２００μと
２．５×１０-4Ｍルミノール２００μとを入れた別々
のポリプロピレンチユーブに注入した。このようにし
て、測定すべき特定の反応混合物内で反応を開始させた
後各混合物のルミネセンスを、０．５秒の遅延時間後６
０秒間信号を積算してモニターし任意のルミネセンス単
位として記録した。リポソームの各希釈度に対してトリ
トンＸ−１００で化学的に溶解したHRP／リポソームお
よび無傷のHRP／リポソームについて観測された積算ル
ミネセンス、ならびに溶解されたHRP／リポソームと無
傷のものとの信号の比（Ｌ／Ｉ）を第１表に示す。
第１表のデータは予期しなかつた現象を実証している。
無傷のリポソームについて観測されたルミネセンスは化
学的に溶解されたリポソームのよりも大きい。これは、
溶解されたリポソームのルミネセンス応答を無傷リポソ
ームのルミネセンス応答で除した比が１．０より小さい
という点で逆潜伏を表わしている。この観察は、後の実
施例で示すように、無傷のリポソームからのルミネセン
スが溶解されたリポソームからのルミネセンスより大き
い特異的結合測定法の構成の基礎をなすものである。
無傷のリポソームについて観測されたルミネセンスは化
学的に溶解されたリポソームのよりも大きい。これは、
溶解されたリポソームのルミネセンス応答を無傷リポソ
ームのルミネセンス応答で除した比が１．０より小さい
という点で逆潜伏を表わしている。この観察は、後の実
施例で示すように、無傷のリポソームからのルミネセン
スが溶解されたリポソームからのルミネセンスより大き
い特異的結合測定法の構成の基礎をなすものである。
例 ２ 次の実験は例１において観察され報告されたような、無
傷のリポソームのルミネセンスが化学的に溶解されたリ
ポソームの「消化された」ルミネセンスより大きいとい
うことが、遊離のペルオキシダーゼが溶解剤例えばトリ
トン−Ｘ−１００洗浄剤の影響を受け潜在的に不活性化
されることによつて起るのか否かを検討するために行つ
たものである。
傷のリポソームのルミネセンスが化学的に溶解されたリ
ポソームの「消化された」ルミネセンスより大きいとい
うことが、遊離のペルオキシダーゼが溶解剤例えばトリ
トン−Ｘ−１００洗浄剤の影響を受け潜在的に不活性化
されることによつて起るのか否かを検討するために行つ
たものである。
先ず、ＨＲＰ２．０mgをトリス緩衝液５．０mlに溶解し
て、吸光率９１ｍＭ−１ｃｍ−１を使用して４０３ｎｍ
における吸光度での測定による濃度１×１０−５ＭＨＲ
ＰのＨＲＰ溶液を調製した。このＨＲＰ溶液をトリス緩
衝液中で一連の希釈度に希釈した。トリトン−Ｘ−１０
０ １％（Ｗ／Ｖ）を含有するトリス緩衝液中で同じ一
連の希釈度の液を調製した。これらの溶液のそれぞれか
ら１００μをとり、ターナー２０型ルミノメーター内
に位置してトリス緩衝液中２．５×１０-3ＭH2O2２００
μと２．５×１０-4Ｍルミノール２００μとを入れ
た別々の８×５０mmのポリプロピレンチユーブに注入し
た。このようにして測定すべき特定の反応混合物中で反
応を開始させた後各混合物内のルミネセンスを０．５秒
の遅延時間後６０秒間積算してモニターし記録した。各
希釈度におけるトリトン−Ｘ−１００あり、およびなし
でのHRP溶液について観測した積算化学ルミネセンスな
らびにその比を第２表に示す。
て、吸光率９１ｍＭ−１ｃｍ−１を使用して４０３ｎｍ
における吸光度での測定による濃度１×１０−５ＭＨＲ
ＰのＨＲＰ溶液を調製した。このＨＲＰ溶液をトリス緩
衝液中で一連の希釈度に希釈した。トリトン−Ｘ−１０
０ １％（Ｗ／Ｖ）を含有するトリス緩衝液中で同じ一
連の希釈度の液を調製した。これらの溶液のそれぞれか
ら１００μをとり、ターナー２０型ルミノメーター内
に位置してトリス緩衝液中２．５×１０-3ＭH2O2２００
μと２．５×１０-4Ｍルミノール２００μとを入れ
た別々の８×５０mmのポリプロピレンチユーブに注入し
た。このようにして測定すべき特定の反応混合物中で反
応を開始させた後各混合物内のルミネセンスを０．５秒
の遅延時間後６０秒間積算してモニターし記録した。各
希釈度におけるトリトン−Ｘ−１００あり、およびなし
でのHRP溶液について観測した積算化学ルミネセンスな
らびにその比を第２表に示す。
トリトン−Ｘ−１００の存在する場合、H2O2によるルミ
ノールのペルオキシダーゼを触媒とする酸化の促進が認
められた。すなわちトリトン−Ｘ−１００はルミノール
のペルオキシダーゼ接触酸化を阻害せず従つて前例に述
べた消光現象の原因ではない。
ノールのペルオキシダーゼを触媒とする酸化の促進が認
められた。すなわちトリトン−Ｘ−１００はルミノール
のペルオキシダーゼ接触酸化を阻害せず従つて前例に述
べた消光現象の原因ではない。
例 ３ 次の実験はH2O2によるルミノールの遊離ペルオキシダー
ゼを触媒とする酸化において観察される化学ルミネセン
ス信号に対する空のリポソームの影響を検討するために
行つた。これは逆潜伏現像が遊離ペルオキシダーゼと空
のリポソームとの共存によつて生ずるのか否かを確める
ために行つたものである。
ゼを触媒とする酸化において観察される化学ルミネセン
ス信号に対する空のリポソームの影響を検討するために
行つた。これは逆潜伏現像が遊離ペルオキシダーゼと空
のリポソームとの共存によつて生ずるのか否かを確める
ために行つたものである。
リポソームは次のようにして調製した。先ず４：１CHCl
3／メタノール（Ｖ／Ｖ）１３ml中卵レシチン７．３m
g、ジセチルホスフエート１．７５mgおよびコレステロ
ール２．９mgの混合物を５０mlなし型フラスコの内表面
上で蒸発乾固して脂質フイルムを作成した。蒸発は例１
と同様に減圧下で行つた。かくして得た脂質フイルムを
ペルオキシダーゼを添加していないトリス緩衝液２．０
mlで棒磁石でかきまぜながら４℃で一夜水和し、かくし
て生成したリポソーム製剤を、下記のように使用するた
め４℃に貯蔵保存した。
3／メタノール（Ｖ／Ｖ）１３ml中卵レシチン７．３m
g、ジセチルホスフエート１．７５mgおよびコレステロ
ール２．９mgの混合物を５０mlなし型フラスコの内表面
上で蒸発乾固して脂質フイルムを作成した。蒸発は例１
と同様に減圧下で行つた。かくして得た脂質フイルムを
ペルオキシダーゼを添加していないトリス緩衝液２．０
mlで棒磁石でかきまぜながら４℃で一夜水和し、かくし
て生成したリポソーム製剤を、下記のように使用するた
め４℃に貯蔵保存した。
HRP１３．６mgをトリス緩衝液５．０mlに添加し、吸光
率９１mM-1cm-1を使用して４０３nmにおける吸光度で測
定した濃度５×１０-5ＭHRPのHRP溶液を調製した。次に
この溶液０．２５mlとトリス緩衝液２５mlと混合希釈し
て濃度５×１０-7Ｍの溶液とし、その溶液を使用して
（１）酵素のみ、（２）酵素プラストリトン−Ｘ−１０
０、（３）酵素プラス空リポソーム、および（４）酵素
プラストリトンおよび空リポソームを有する試料を調製
した。上記混合物および対照物（HRP欠）それぞれの配
合を第３表に示す。これらの溶液１００μづつを、ト
リス緩衝液中２．５×１０-3ＭH2O2２００μと２．５
×１０-4Ｍルミノール２００μとを入れ、ターナー２
０型ルミノメーター内に位置した別々のポリプロピレン
チューブに注入した。このようにして測定すべき特定の
反応混合物中で反応を開始させた後、ルミネセンスを
０．５秒の遅延時間後６０秒間積算してモニターし、記
録した。各管におけるＣＬ応答を例１と同様にして観測
し、これも第３表に示す。
率９１mM-1cm-1を使用して４０３nmにおける吸光度で測
定した濃度５×１０-5ＭHRPのHRP溶液を調製した。次に
この溶液０．２５mlとトリス緩衝液２５mlと混合希釈し
て濃度５×１０-7Ｍの溶液とし、その溶液を使用して
（１）酵素のみ、（２）酵素プラストリトン−Ｘ−１０
０、（３）酵素プラス空リポソーム、および（４）酵素
プラストリトンおよび空リポソームを有する試料を調製
した。上記混合物および対照物（HRP欠）それぞれの配
合を第３表に示す。これらの溶液１００μづつを、ト
リス緩衝液中２．５×１０-3ＭH2O2２００μと２．５
×１０-4Ｍルミノール２００μとを入れ、ターナー２
０型ルミノメーター内に位置した別々のポリプロピレン
チューブに注入した。このようにして測定すべき特定の
反応混合物中で反応を開始させた後、ルミネセンスを
０．５秒の遅延時間後６０秒間積算してモニターし、記
録した。各管におけるＣＬ応答を例１と同様にして観測
し、これも第３表に示す。
第３表のデータから先ず、HRPを含有しない試料(a)−
(d)、特に空のリポソームを含む(c)および(d)において
は極めて弱いルミネセンスしか認められないことがわか
る。試料(e)−(f)はHRP５０μの存在において高い水
準のルミネセンスを示す。これと対照的に、試料(g)お
よび(h)はトリトン−Ｘ−１００の存在および不在にお
いてそれぞれ、HRP５０μおよび空リポソームを含有
しており、リポソームの存在しない場合の僅か半分のル
ミネセンスを示した。試料(g)と(h)との比較からトリト
ン−Ｘ−１００はリポソームの存在においてルミネセン
スを少し増加させる効果を有することがわかる。試料
(i)および(j)はHRP１００μの存在において高水準の
ルミネセンスを示す。これと対照的に試料(k)および(l)
はトリトン−Ｘ−１００の存在および不在においてそれ
ぞれ、HRP１００μと空リポソームを含有するが、実
質的により弱いルミネセンスを示した。試料(k)および
(l)の比較からトリトン−Ｘ−１００はリポソームの存
在する場合ルミネセンスを少し強くする効果を有するこ
とがわかる。要約すると、リポソーム外部の西洋わさび
ペルオキシダーゼに空リポソームを添加するとルミネセ
ンス信号の減少が生ずる。インキユベーシヨン混合物に
トリトン−Ｘ−１００が加えられると化学ルミネセンス
信号は強化される。
(d)、特に空のリポソームを含む(c)および(d)において
は極めて弱いルミネセンスしか認められないことがわか
る。試料(e)−(f)はHRP５０μの存在において高い水
準のルミネセンスを示す。これと対照的に、試料(g)お
よび(h)はトリトン−Ｘ−１００の存在および不在にお
いてそれぞれ、HRP５０μおよび空リポソームを含有
しており、リポソームの存在しない場合の僅か半分のル
ミネセンスを示した。試料(g)と(h)との比較からトリト
ン−Ｘ−１００はリポソームの存在においてルミネセン
スを少し増加させる効果を有することがわかる。試料
(i)および(j)はHRP１００μの存在において高水準の
ルミネセンスを示す。これと対照的に試料(k)および(l)
はトリトン−Ｘ−１００の存在および不在においてそれ
ぞれ、HRP１００μと空リポソームを含有するが、実
質的により弱いルミネセンスを示した。試料(k)および
(l)の比較からトリトン−Ｘ−１００はリポソームの存
在する場合ルミネセンスを少し強くする効果を有するこ
とがわかる。要約すると、リポソーム外部の西洋わさび
ペルオキシダーゼに空リポソームを添加するとルミネセ
ンス信号の減少が生ずる。インキユベーシヨン混合物に
トリトン−Ｘ−１００が加えられると化学ルミネセンス
信号は強化される。
例 ４ ルミネセンスリポソームテオフイリン測定 テオフイリン（１，３−ジメチルキサンチン）は気管支
ぜん息の治療にひろく使用される。この薬は治療範囲が
１０−２０μｇ／mlと狭く一２０μｇ／mlを超える濃度
では有毒となり得るので、血清中の薬剤濃度を綿密に監
視する必要がある。以下に述べる実験は本発明の逆潜伏
ルミネセンス免疫検定がテオフイリンの血清中濃度の定
量に使用し得ることを実証するものである。
ぜん息の治療にひろく使用される。この薬は治療範囲が
１０−２０μｇ／mlと狭く一２０μｇ／mlを超える濃度
では有毒となり得るので、血清中の薬剤濃度を綿密に監
視する必要がある。以下に述べる実験は本発明の逆潜伏
ルミネセンス免疫検定がテオフイリンの血清中濃度の定
量に使用し得ることを実証するものである。
増感HRP／リポソームの調製 テオフイリン増感HRP／リポソームは次のようにして調
製した。先ず４：１（Ｖ／Ｖ）クロロホルム／メタノー
ル１０．０ml中卵レシチン７．３mg、ジセチルホスフエ
ート１．７mg、コレステロール０．６mgおよびテオフイ
リン複合体０．１５mgの混合物をなし型フラスコの内表
面上で乾固して例１と同様にして脂質フイルムを作成し
た。使用したテオフイリン増感剤はテオフイリン−ジパ
ルミトイルホスフアチジルエタノールアミン複合体（テ
オフイリン−DPPE）である。かかる複合体はHagaら、Bi
ochem. Biophys. Res. Comm.，９５：１８７−１９２
（１９８０）に記載の方法によつて製造することができ
る。この同じテオフイリン−DPPを改変法によつて合成
し分析してその同一性および純度を確めた。精製複合体
は、調製的液体クロマトグラフにより薄層クロマトグラ
フで単一のスポツトを示す画分として得た。この複合体
の同一性はNMR，UVおよびＩＲスペクトル、および元素
分析によつて確認した。
製した。先ず４：１（Ｖ／Ｖ）クロロホルム／メタノー
ル１０．０ml中卵レシチン７．３mg、ジセチルホスフエ
ート１．７mg、コレステロール０．６mgおよびテオフイ
リン複合体０．１５mgの混合物をなし型フラスコの内表
面上で乾固して例１と同様にして脂質フイルムを作成し
た。使用したテオフイリン増感剤はテオフイリン−ジパ
ルミトイルホスフアチジルエタノールアミン複合体（テ
オフイリン−DPPE）である。かかる複合体はHagaら、Bi
ochem. Biophys. Res. Comm.，９５：１８７−１９２
（１９８０）に記載の方法によつて製造することができ
る。この同じテオフイリン−DPPを改変法によつて合成
し分析してその同一性および純度を確めた。精製複合体
は、調製的液体クロマトグラフにより薄層クロマトグラ
フで単一のスポツトを示す画分として得た。この複合体
の同一性はNMR，UVおよびＩＲスペクトル、および元素
分析によつて確認した。
かくして作成した脂質フイルムを、２mg／mlのHRPを含
有するトリス緩衝液２．０mlにより、磁気かくはん子で
かきまぜながら４℃で一夜水和した。生成したテオフイ
リン増感HRP／リポソームを、１．５×３２cmのセフア
ローズ６Ｂカラムでトリス緩衝液を溶離剤として脂質懸
濁液１．０mlをクロマトグラフにかけて、遊離ペルオキ
シダーゼから分離した。１．８mlの溶出液フラクシヨン
４０個を採取した。テオフイリン増感HRP／リポソーム
はフラクシヨン１２−１４に、遊離ペルオキシダーゼは
画分２７−３４に見いだされた。
有するトリス緩衝液２．０mlにより、磁気かくはん子で
かきまぜながら４℃で一夜水和した。生成したテオフイ
リン増感HRP／リポソームを、１．５×３２cmのセフア
ローズ６Ｂカラムでトリス緩衝液を溶離剤として脂質懸
濁液１．０mlをクロマトグラフにかけて、遊離ペルオキ
シダーゼから分離した。１．８mlの溶出液フラクシヨン
４０個を採取した。テオフイリン増感HRP／リポソーム
はフラクシヨン１２−１４に、遊離ペルオキシダーゼは
画分２７−３４に見いだされた。
採取した溶出液画分はそれぞれ次のようにして、分光測
定法により試験してペルオキシダーゼの有無を解認し
た。各画分５０μをトリス緩衝液２００μと混合し
た。平行してそれぞれの各分５０μをトリトン−Ｘ−
１００ １％（Ｗ／Ｖ）を含有するトリス緩衝液２００
μと混合した。それぞれの混合液の一部２０μを、
トリス緩衝液３．０mlとグイアコール（guiacol）（ｏ
−メトキシフエノール、マテソン、コレマンアンドベル
社、ノーウツド、オハイオ）試薬原液（２．４５mg／ml
トリス緩衝液）５０μとを入れた光路長１．０ｃｍの
キユベツトに加えた。これらのキユベツトをそれぞれギ
ルフオード２５０型分光光度計内に置き、３０％（Ｖ／
Ｖ）H2O2水溶液（フイツシヤーサイエンテイフイツク
社、ピツツバーグ、ペンシルバニア）５０μとトリス
緩衝液１００mlとを混合して調製したH2O2貯蔵溶液５０
μを添加して反応を開始させた。各キユベツトの内容
物を、４３６nmで反応開始後６０秒間モニターした。こ
の試験の結果ペルオキシダーゼが画分１２−１４および
２７−３４に存在することが確められた。前記した通り
リポソームは画分１２−１４にのみ認められるので、画
分２７−３４は遊離の西洋わさびペルオキシザーゼを含
有していることが確められた。
定法により試験してペルオキシダーゼの有無を解認し
た。各画分５０μをトリス緩衝液２００μと混合し
た。平行してそれぞれの各分５０μをトリトン−Ｘ−
１００ １％（Ｗ／Ｖ）を含有するトリス緩衝液２００
μと混合した。それぞれの混合液の一部２０μを、
トリス緩衝液３．０mlとグイアコール（guiacol）（ｏ
−メトキシフエノール、マテソン、コレマンアンドベル
社、ノーウツド、オハイオ）試薬原液（２．４５mg／ml
トリス緩衝液）５０μとを入れた光路長１．０ｃｍの
キユベツトに加えた。これらのキユベツトをそれぞれギ
ルフオード２５０型分光光度計内に置き、３０％（Ｖ／
Ｖ）H2O2水溶液（フイツシヤーサイエンテイフイツク
社、ピツツバーグ、ペンシルバニア）５０μとトリス
緩衝液１００mlとを混合して調製したH2O2貯蔵溶液５０
μを添加して反応を開始させた。各キユベツトの内容
物を、４３６nmで反応開始後６０秒間モニターした。こ
の試験の結果ペルオキシダーゼが画分１２−１４および
２７−３４に存在することが確められた。前記した通り
リポソームは画分１２−１４にのみ認められるので、画
分２７−３４は遊離の西洋わさびペルオキシザーゼを含
有していることが確められた。
その他の試薬調製 テオフイリン１．２５，２．５，５，１０，２０，５０
および１００μｇ／mlを含有するテオフイリン試料は、
テオフイリン（シグマ社、前出）５．３mgをトリス緩衝
液５０mlに溶解したテオフイリン原液をさらにトリス緩
衝液で適宜希釈して調製した。
および１００μｇ／mlを含有するテオフイリン試料は、
テオフイリン（シグマ社、前出）５．３mgをトリス緩衝
液５０mlに溶解したテオフイリン原液をさらにトリス緩
衝液で適宜希釈して調製した。
抗テオフイリン抗体試薬は市販の抗テオフイリンウサギ
抗血清（カレスタツド社、オースチン、テキサス、カタ
ログNo.３３４）から次のようにして調製した。カレス
タツド抗血清１００μをトリス緩衝液９００μに添
加して１：１０（Ｖ／Ｖ）抗体溶液原液とした。
抗血清（カレスタツド社、オースチン、テキサス、カタ
ログNo.３３４）から次のようにして調製した。カレス
タツド抗血清１００μをトリス緩衝液９００μに添
加して１：１０（Ｖ／Ｖ）抗体溶液原液とした。
補体試薬は次のようにして調製した。凍結乾燥したモル
モツト血清を入れたガラス瓶（ペルフリーズ社、ロジヤ
ーズ、アラスカ、カタログNO.３８００５−１）に蒸留
水３．０mlを加えて再構成した。再構成した補体含有血
清０．５mlをアジドートリス緩衝液と混合して１：１０
（Ｖ／Ｖ）希釈液とし測定操作に使用した。このアジド
ートリス緩衝液はアジ化ナトリウム２０８．１mgをトリ
ス緩衝液１００mlに溶解して作成した。
モツト血清を入れたガラス瓶（ペルフリーズ社、ロジヤ
ーズ、アラスカ、カタログNO.３８００５−１）に蒸留
水３．０mlを加えて再構成した。再構成した補体含有血
清０．５mlをアジドートリス緩衝液と混合して１：１０
（Ｖ／Ｖ）希釈液とし測定操作に使用した。このアジド
ートリス緩衝液はアジ化ナトリウム２０８．１mgをトリ
ス緩衝液１００mlに溶解して作成した。
測定操作および結果 先ず前記のテオフイリン試料それぞれ１０mlを２組の試
験管セツトの一つの管に分注した。次で抗体溶液原液を
トリス緩衝液に１：５に希釈した液５０μを第一組の
管の各管に入れ、抗体原液をトリス緩衝液に１：１０に
希釈した液５０μを第二組の管の各管に入れた。次
に、テオフイリン感作リポソーム液（画分１３）をトリ
ス緩衝液に１：４に希釈したもの４０μを第一組の各
管内の混合物に加え、トリス緩衝液に１：１０に希釈し
たもの４０μを第二組の各管内の混合物に加えた。次
で両方の組を３７℃で５分間インキユベートした。５分
間インキユベート後、補体試薬をトリス緩衝液に１：１
０に希釈したもの１００μを両組の各管内の混合物に
加え、３７℃でさらに５分間インキユベートした。
験管セツトの一つの管に分注した。次で抗体溶液原液を
トリス緩衝液に１：５に希釈した液５０μを第一組の
管の各管に入れ、抗体原液をトリス緩衝液に１：１０に
希釈した液５０μを第二組の管の各管に入れた。次
に、テオフイリン感作リポソーム液（画分１３）をトリ
ス緩衝液に１：４に希釈したもの４０μを第一組の各
管内の混合物に加え、トリス緩衝液に１：１０に希釈し
たもの４０μを第二組の各管内の混合物に加えた。次
で両方の組を３７℃で５分間インキユベートした。５分
間インキユベート後、補体試薬をトリス緩衝液に１：１
０に希釈したもの１００μを両組の各管内の混合物に
加え、３７℃でさらに５分間インキユベートした。
また対照用試料を、１０，５０，１００μｇ／mlテオフ
イリン試料１０μとテオフイリンを含有せぬブランク
トリス緩衝液とを使用し、抗体および補体の代りにリポ
ソーム液の１：４希釈物４０μとトリス緩衝液１５０
μとを添加して調製した。これら調製液の１００μ
づつをとり、ターナー２０型ルミノメーター内に位置し
２．５×１０-4Ｍルミノール試薬２００μと２．５×
１０-3ＭH2O2試薬２００μとを入れた別々のポリプロ
ピレン管に注入した。かくして測定すべき特定の反応混
合物中で反応を開始した後、ルミネセンスの強度を０．
５秒の遅延時間後６０秒間積算してモニターし記録し
た。結果を第IV表に示す。
イリン試料１０μとテオフイリンを含有せぬブランク
トリス緩衝液とを使用し、抗体および補体の代りにリポ
ソーム液の１：４希釈物４０μとトリス緩衝液１５０
μとを添加して調製した。これら調製液の１００μ
づつをとり、ターナー２０型ルミノメーター内に位置し
２．５×１０-4Ｍルミノール試薬２００μと２．５×
１０-3ＭH2O2試薬２００μとを入れた別々のポリプロ
ピレン管に注入した。かくして測定すべき特定の反応混
合物中で反応を開始した後、ルミネセンスの強度を０．
５秒の遅延時間後６０秒間積算してモニターし記録し
た。結果を第IV表に示す。
両試薬配合のいずれに対しても試料テオフイリン濃度増
加と共にルミネセンスが増大することが認められる。こ
れに対し、対照液においては試料テオフイリン濃度に関
係無く一様に減少のないルミネセンスが生ずる。このこ
とは、少くとも１．２５μｇ／mlという低濃度および毒
性投与量閾値の５倍の濃度においてテオフイリンを定量
的に測定するための免疫検定用組成物および方法への逆
潜伏現象の応用を明快かつ単純に立証するものである。
加と共にルミネセンスが増大することが認められる。こ
れに対し、対照液においては試料テオフイリン濃度に関
係無く一様に減少のないルミネセンスが生ずる。このこ
とは、少くとも１．２５μｇ／mlという低濃度および毒
性投与量閾値の５倍の濃度においてテオフイリンを定量
的に測定するための免疫検定用組成物および方法への逆
潜伏現象の応用を明快かつ単純に立証するものである。
例 ５ 本例は、反応混合物のルミネセンスを反応開始後一定時
間毎に記録するペルオキシダーゼのルミネセンス検定に
おいて無傷のリポソームおよびトリトンＸ−１００によ
り化学的に溶解されたリポソームについて観察される信
号に対する、ペルオキシダーゼ阻害剤であるシアンイオ
ンの影響を示すものである。
間毎に記録するペルオキシダーゼのルミネセンス検定に
おいて無傷のリポソームおよびトリトンＸ−１００によ
り化学的に溶解されたリポソームについて観察される信
号に対する、ペルオキシダーゼ阻害剤であるシアンイオ
ンの影響を示すものである。
例１に調製したリポソームを例１に記載の方法に従いゲ
ル排除クロマトグラフ法によつて遊離ペルオキシダーゼ
と分離した。流出リポソーム画分を合一し懸濁原液とし
て４℃で貯蔵した。リポソーム懸濁原液をトリス緩衝液
に１：４０で希釈して使用用懸濁液を調製した（無傷リ
ポソーム）。同様にして、リポソーム懸濁原液をトリト
ン−Ｘ−１００ ０．２％（Ｗ／Ｖ）含有トリス緩衝液
に１：４０に希釈した液を調製した（溶解リポソー
ム）。
ル排除クロマトグラフ法によつて遊離ペルオキシダーゼ
と分離した。流出リポソーム画分を合一し懸濁原液とし
て４℃で貯蔵した。リポソーム懸濁原液をトリス緩衝液
に１：４０で希釈して使用用懸濁液を調製した（無傷リ
ポソーム）。同様にして、リポソーム懸濁原液をトリト
ン−Ｘ−１００ ０．２％（Ｗ／Ｖ）含有トリス緩衝液
に１：４０に希釈した液を調製した（溶解リポソー
ム）。
トリス緩衝液中シアン化ナトリウム（NaCN１mMの原液
（１mM CN-TRIS）を、NaCN ５．０mgをトリス緩衝液１
００mlに溶解して調製した。トリス緩衝液中シアン化ナ
トリウムの試薬溶液は1mMCN-TRISから、トリス緩衝液中
にNaCN ０．０８３，０．２，０．３３，０．５および
０．７５mMを含有するように調製した。
（１mM CN-TRIS）を、NaCN ５．０mgをトリス緩衝液１
００mlに溶解して調製した。トリス緩衝液中シアン化ナ
トリウムの試薬溶液は1mMCN-TRISから、トリス緩衝液中
にNaCN ０．０８３，０．２，０．３３，０．５および
０．７５mMを含有するように調製した。
無傷の、および化学的に溶解されたリポソームのルミネ
センスは、１／４０リポソーム希釈液１００μを、ト
リス緩衝液３００μかシアン化物試薬溶液の一つ３０
０μかのいずれかと、トリス緩衝液中５×１０-3ＭH2
O2溶液５０μと、トリス緩衝液中ルミノール１０-2Ｍ
の溶液５０μとを入れた別々のポリプロピレン管に注
入して測定した。これらの管をターナー２０型ルミノメ
ーター内に置いた。反応開始の１５分後にルミネセンス
を記録した。第５表に、試薬中のシアン化物の各濃度
（〔CN〕mM）に対する無傷のおよび化学的に溶解された
リポソームについて観察されたルミネセンス、並びに溶
解および無傷のHRP／リポソームからの信号の比（Ｌ／
Ｉ比）を示す。
センスは、１／４０リポソーム希釈液１００μを、ト
リス緩衝液３００μかシアン化物試薬溶液の一つ３０
０μかのいずれかと、トリス緩衝液中５×１０-3ＭH2
O2溶液５０μと、トリス緩衝液中ルミノール１０-2Ｍ
の溶液５０μとを入れた別々のポリプロピレン管に注
入して測定した。これらの管をターナー２０型ルミノメ
ーター内に置いた。反応開始の１５分後にルミネセンス
を記録した。第５表に、試薬中のシアン化物の各濃度
（〔CN〕mM）に対する無傷のおよび化学的に溶解された
リポソームについて観察されたルミネセンス、並びに溶
解および無傷のHRP／リポソームからの信号の比（Ｌ／
Ｉ比）を示す。
シアン化物が存在しない実験条件ではＬ／Ｉ比は０．７
６であつた。最低のシアン化物試薬濃度（０．０８３m
M）においてＬ／Ｉ比は０．０１であつた。無傷のリポ
ソームのルミネセンスは試験したシアン化物の濃度範囲
では３４％以下しか阻害されなかつた。化学的に溶解さ
れたリポソームのルミネセンスはこの実験に使用したシ
アン化物の濃度において９７％以上阻害された。すなわ
ち、これはシアン化物の存在が観測される逆潜伏現像を
助長することを実証するものである。
６であつた。最低のシアン化物試薬濃度（０．０８３m
M）においてＬ／Ｉ比は０．０１であつた。無傷のリポ
ソームのルミネセンスは試験したシアン化物の濃度範囲
では３４％以下しか阻害されなかつた。化学的に溶解さ
れたリポソームのルミネセンスはこの実験に使用したシ
アン化物の濃度において９７％以上阻害された。すなわ
ち、これはシアン化物の存在が観測される逆潜伏現像を
助長することを実証するものである。
例 ６ 本例は、逆潜伏比がシアンイオンなしでは認められない
ような条件下での、ペルオキシダーゼの阻害剤であるシ
アンイオンの使用による逆潜伏比を示すものである。
ような条件下での、ペルオキシダーゼの阻害剤であるシ
アンイオンの使用による逆潜伏比を示すものである。
例４によつて調製した西洋わさびペルオキシダーゼを含
有するテオフイリン増感リポソームを一連の本実験に使
用した。リポソームの使用用懸濁液はフラクシヨン１３
の一部をとりトリス緩衝液で希釈して次のように調製し
た。画分１３の一部１２μをトリス緩衝液５８８mlに
加えて１／５０希釈液を調製した（無傷リポソーム）。
同様に画分１３の一部１２μをトリトン−Ｘ−１００
０．７％（Ｗ／Ｖ）を含有するトリス緩衝液５８８μ
に加えて１／５０希釈液を調製した（溶解リポソー
ム）。
有するテオフイリン増感リポソームを一連の本実験に使
用した。リポソームの使用用懸濁液はフラクシヨン１３
の一部をとりトリス緩衝液で希釈して次のように調製し
た。画分１３の一部１２μをトリス緩衝液５８８mlに
加えて１／５０希釈液を調製した（無傷リポソーム）。
同様に画分１３の一部１２μをトリトン−Ｘ−１００
０．７％（Ｗ／Ｖ）を含有するトリス緩衝液５８８μ
に加えて１／５０希釈液を調製した（溶解リポソー
ム）。
１mM CN-TRIS ２．０mlをトリス緩衝液４．０mlに加え
て、トリス緩衝液中シアン化ナトリウム０．３３mMの試
薬溶液を調製した。
て、トリス緩衝液中シアン化ナトリウム０．３３mMの試
薬溶液を調製した。
ルミノール試薬は例１に記したようにして調製したトリ
ス緩衝液中ルミノール２．５×１０-2Ｍの原液からこれ
をトリス緩衝液に希釈に希釈して製造した。ルミノール
試薬の濃度は第６表に示す。
ス緩衝液中ルミノール２．５×１０-2Ｍの原液からこれ
をトリス緩衝液に希釈に希釈して製造した。ルミノール
試薬の濃度は第６表に示す。
過酸化水素試薬は次のようにして調製した。３０％（Ｖ
／Ｖ）H2O2水溶液５７μのトリス緩衝液１０．０mlに
添加してH2O2５×１０−２Ｍの原液をつくつた。次にこ
の原液をトリス緩衝液で希釈して第６表に示す濃度の過
酸化水素試薬を調製した。
／Ｖ）H2O2水溶液５７μのトリス緩衝液１０．０mlに
添加してH2O2５×１０−２Ｍの原液をつくつた。次にこ
の原液をトリス緩衝液で希釈して第６表に示す濃度の過
酸化水素試薬を調製した。
無傷の、および化学的に溶解されたリポソームのルミネ
センスは無傷リポソームの使用用懸濁液１００μまた
は化学的に溶解されたリポソームの使用用溶液１００μ
を、０．３３mM CN-TRIS ３００μ、ルミノール試
薬の一つ５０μ、およびH2O2試薬の一つ５０μを入
れた別々のポリプロピレンチユーブに注入して測定し
た。チユーブはターナー２０型ルミノメーター内に置い
た。各管内の反応につき、遅延時間０．５秒の後６０秒
間信号を積算してルミネセンスをモニターし記録した。
センスは無傷リポソームの使用用懸濁液１００μまた
は化学的に溶解されたリポソームの使用用溶液１００μ
を、０．３３mM CN-TRIS ３００μ、ルミノール試
薬の一つ５０μ、およびH2O2試薬の一つ５０μを入
れた別々のポリプロピレンチユーブに注入して測定し
た。チユーブはターナー２０型ルミノメーター内に置い
た。各管内の反応につき、遅延時間０．５秒の後６０秒
間信号を積算してルミネセンスをモニターし記録した。
また、シアン化物試薬の代りにトリス緩衝液を使用した
対照実験においても、無傷の、および化学的に溶解され
たリポソームのルミネセンスを記録した。シアン化物不
在の場合の観測したルミネセンス、試薬中のルミノール
と過酸化水素との濃度、および溶解リポソームと無傷リ
ポソームの信号の比（Ｌ／Ｉ比）を第６表実験(a)に示
す。同様に、反応混合物中のシアン化ナトリウムの濃度
が０．２mMの場合の実験で観測されたルミネセンスを第
６表、実験(b)−(e)に示す。
対照実験においても、無傷の、および化学的に溶解され
たリポソームのルミネセンスを記録した。シアン化物不
在の場合の観測したルミネセンス、試薬中のルミノール
と過酸化水素との濃度、および溶解リポソームと無傷リ
ポソームの信号の比（Ｌ／Ｉ比）を第６表実験(a)に示
す。同様に、反応混合物中のシアン化ナトリウムの濃度
が０．２mMの場合の実験で観測されたルミネセンスを第
６表、実験(b)−(e)に示す。
第６表のデータは、逆潜伏比が認められないような条件
（実験(a)）下でルミネセンス反応混合物にペルオキシ
ダーゼの阻害剤を添加すると（実験(b)）、溶解リポソ
ームからの信号は無傷リポソームよりも大幅に減少する
ことを示す。反応混合物中にシアン化物が存在しない場
合のＬ／Ｉ比は５．６であつたが（実験(a)）、ペルオ
キシダーゼに対する阻害剤すなわちシアン化物が存在す
る場合Ｌ／Ｉ比は０．０９であつた（実験(b)）。実験
(b)−(e)はH2O2およびルミノール濃度を変化させた場合
の逆潜伏を示す。
（実験(a)）下でルミネセンス反応混合物にペルオキシ
ダーゼの阻害剤を添加すると（実験(b)）、溶解リポソ
ームからの信号は無傷リポソームよりも大幅に減少する
ことを示す。反応混合物中にシアン化物が存在しない場
合のＬ／Ｉ比は５．６であつたが（実験(a)）、ペルオ
キシダーゼに対する阻害剤すなわちシアン化物が存在す
る場合Ｌ／Ｉ比は０．０９であつた（実験(b)）。実験
(b)−(e)はH2O2およびルミノール濃度を変化させた場合
の逆潜伏を示す。
例 ７ 本例では、西洋わさびペルオキシダーゼを含有するリポ
ソームをテオフイリンの免疫検定操作に使用し、無傷リ
ポソームからのルミネセンス信号が溶解リポソームのよ
りも大きい場合について述べる。ペルオキシダーゼはH2
O2を酸化剤とするルミノールの酸化によつて測定した。
ルミネセンスは反応開始の一定時間後に信号を記録して
モニターした。ペルオキシダーゼの阻害剤（シアンイオ
ン）をルミネセンス反応混合物に加えておいた。
ソームをテオフイリンの免疫検定操作に使用し、無傷リ
ポソームからのルミネセンス信号が溶解リポソームのよ
りも大きい場合について述べる。ペルオキシダーゼはH2
O2を酸化剤とするルミノールの酸化によつて測定した。
ルミネセンスは反応開始の一定時間後に信号を記録して
モニターした。ペルオキシダーゼの阻害剤（シアンイオ
ン）をルミネセンス反応混合物に加えておいた。
試薬調製 例４で調製したペルオキシダーゼ含有テオフイリン増感
リポソームを一連の本実験に使用した。リポソーム懸濁
液は画分１３（例４）をトリス緩衝液で1/10に希釈して
調製した（リポソーム試薬）。
リポソームを一連の本実験に使用した。リポソーム懸濁
液は画分１３（例４）をトリス緩衝液で1/10に希釈して
調製した（リポソーム試薬）。
抗テオフイリン抗血清および補体は例４に記載したのと
同じものから得た。抗体試薬は抗テオフイリン抗血清を
トリス緩衝液で1/10に希釈して調製した（抗体試薬）。
補体試薬はモルモツト血清をトリス緩衝液で1/10に希釈
して調製した（補体試薬）。
同じものから得た。抗体試薬は抗テオフイリン抗血清を
トリス緩衝液で1/10に希釈して調製した（抗体試薬）。
補体試薬はモルモツト血清をトリス緩衝液で1/10に希釈
して調製した（補体試薬）。
テオフイリン２．５，５，１０，２０，４０，６０およ
び１００μｇ／mlのテオフイリン試薬を、例４のテオフ
イリン原液をトリス緩衝液で希釈して調製した。
び１００μｇ／mlのテオフイリン試薬を、例４のテオフ
イリン原液をトリス緩衝液で希釈して調製した。
H2O2５×１０-2Ｍの試薬溶液を、３０％（Ｖ／Ｖ）H2O2
５７μをトリス緩衝液１０．０mlに添加して調製した
（H2O2試薬）。
５７μをトリス緩衝液１０．０mlに添加して調製した
（H2O2試薬）。
ルミノール１０-2Ｍの試薬溶液を、５０％（Ｗ／Ｖ）Na
OH４滴を加えたトリス緩衝液約８０ml中にルミノール１
７９mgを溶解して調製した。この溶液のpHを希塩酸で
８．６に調節し、トリス緩衝液を加えて容積を１００ml
とした（ルミノール試薬）。
OH４滴を加えたトリス緩衝液約８０ml中にルミノール１
７９mgを溶解して調製した。この溶液のpHを希塩酸で
８．６に調節し、トリス緩衝液を加えて容積を１００ml
とした（ルミノール試薬）。
トリス緩衝液（pH８．６）中NaCN０．３３Ｍの試薬溶液
を例６と同様にして調製した（シアン化物試薬）。
を例６と同様にして調製した（シアン化物試薬）。
測定操作および結果 別々の試験管内で、前記のテオフイリン試料の一つ２０
μ、またはトリス（テオフイリン０μｇ／ml）２０μ
を、抗体試薬５０μおよび補体試薬１００μと共
に３７℃で５分間インキユベートした。前記の試料、抗
体および補体試薬の混合物にリポソーム試薬５０μを
加え、３７℃でさらに２分間インキユベーシヨンを続け
た。これらの測定混合物のそれぞれから１００μづつ
をとり、ターナー２０型ルミノメーター内に位置した別
々のポリプロピレンチユーブに注入した。各ポリプロピ
レンチユーブにはシアン化物試薬３００μ、H2O2試薬
５０μ、およびルミノール試薬５０μを入れておい
た。各管について反応開始１１分後ルミネセンスを記録
した。
μ、またはトリス（テオフイリン０μｇ／ml）２０μ
を、抗体試薬５０μおよび補体試薬１００μと共
に３７℃で５分間インキユベートした。前記の試料、抗
体および補体試薬の混合物にリポソーム試薬５０μを
加え、３７℃でさらに２分間インキユベーシヨンを続け
た。これらの測定混合物のそれぞれから１００μづつ
をとり、ターナー２０型ルミノメーター内に位置した別
々のポリプロピレンチユーブに注入した。各ポリプロピ
レンチユーブにはシアン化物試薬３００μ、H2O2試薬
５０μ、およびルミノール試薬５０μを入れておい
た。各管について反応開始１１分後ルミネセンスを記録
した。
各試料内のテオフイリン濃度およびルミネセンス観測値
を第７表に示す。
を第７表に示す。
試料、抗体試薬、補体試薬、リポソーム試薬、シアン化
物試薬、H2O2試薬およびルミノール試薬の混合物のルミ
ネセンスと、試料中のテオフイリン量との薬量−応答関
係は第７表に示すデータから明かである。
物試薬、H2O2試薬およびルミノール試薬の混合物のルミ
ネセンスと、試料中のテオフイリン量との薬量−応答関
係は第７表に示すデータから明かである。
例 ８ 次の一連の実験は、ペルオキシダーゼ含有テオフイリン
増感リポソームの免疫検定における、グルコースオキシ
ダーゼ、グルコースおよび酸素を使用しての酸素からH2
O2の発生、およびペルオキシダーゼの阻害剤であるシア
ン化物の使用を示すものである。
増感リポソームの免疫検定における、グルコースオキシ
ダーゼ、グルコースおよび酸素を使用しての酸素からH2
O2の発生、およびペルオキシダーゼの阻害剤であるシア
ン化物の使用を示すものである。
試薬調製 トリス緩衝液中テオフイリン２．５，５，１０，２０，
４０，６０および１００μｇ／mlのテオフイリン溶液を
例４のテオフイリン原液から調製した。各テオフイリン
溶液１．０mlづつをとり正常家兎血清（アービンサイエ
ンテイフイツク社、アービン、カルホルニア）１．０ml
と混合して１．２５，２．５，５，１０，２０，３０，
および５０μｇ／mlのテオフイリン試料を得た。同様
に、トリス緩衝液１．０mlを正常ウサギ血清１．０mlと
を混合してテオフイリン０μｇ／mlの試料を調製した。
４０，６０および１００μｇ／mlのテオフイリン溶液を
例４のテオフイリン原液から調製した。各テオフイリン
溶液１．０mlづつをとり正常家兎血清（アービンサイエ
ンテイフイツク社、アービン、カルホルニア）１．０ml
と混合して１．２５，２．５，５，１０，２０，３０，
および５０μｇ／mlのテオフイリン試料を得た。同様
に、トリス緩衝液１．０mlを正常ウサギ血清１．０mlと
を混合してテオフイリン０μｇ／mlの試料を調製した。
５０％（Ｗ／Ｖ）NaOH８滴を加えたトリス緩衝液約４０
mlにルミノール７１９．８mgを溶解してルミノール８×
１０-2Ｍの溶液を調製し、トリス緩衝液で最終容積を５
０mlとした。この溶液は使用前０．４５μ「ミリポア
フイルター」で濾過した。８×１０-2Ｍのルミノール溶
液１０．０mlとトリス緩衝液１０．０mlとを混合してル
ミノール４×１０-2Ｍの原液を調製した。
mlにルミノール７１９．８mgを溶解してルミノール８×
１０-2Ｍの溶液を調製し、トリス緩衝液で最終容積を５
０mlとした。この溶液は使用前０．４５μ「ミリポア
フイルター」で濾過した。８×１０-2Ｍのルミノール溶
液１０．０mlとトリス緩衝液１０．０mlとを混合してル
ミノール４×１０-2Ｍの原液を調製した。
グルコースオキシダーゼ（ベーリンゲルマンハイム社、
インデイアナポリス、インデイアナ。黒色アスペルギル
スからの凍結乾燥グレード１）の４．０mg／ml溶液を、
グルコースオキシダーゼ４０mgをトリス緩衝液１０．０
mlに溶解して調製した。この溶液１．０mlをとり、トリ
ス緩衝液９．０mlと混合してグルコースオキシダーゼ
０．４mg／mlの原液を調製した。
インデイアナポリス、インデイアナ。黒色アスペルギル
スからの凍結乾燥グレード１）の４．０mg／ml溶液を、
グルコースオキシダーゼ４０mgをトリス緩衝液１０．０
mlに溶解して調製した。この溶液１．０mlをとり、トリ
ス緩衝液９．０mlと混合してグルコースオキシダーゼ
０．４mg／mlの原液を調製した。
画分１３（例４）０．２５mlをトリス緩衝液２．２５ml
と混合してテオフイリン増感リポソームの1/10希釈液を
調製した。
と混合してテオフイリン増感リポソームの1/10希釈液を
調製した。
４×１０-2Ｍのルミノール原液２．０mlを、1/10リポソ
ーム懸濁液２．０mlおよびグルコースオキシダーゼ０．
４mg／ml溶液と混合して、ルミノール、グルコースオキ
シダーゼ、およびテオフイリン増感リポソームを含有す
る試薬を調製した（試薬１）。
ーム懸濁液２．０mlおよびグルコースオキシダーゼ０．
４mg／ml溶液と混合して、ルミノール、グルコースオキ
シダーゼ、およびテオフイリン増感リポソームを含有す
る試薬を調製した（試薬１）。
グルコース（アルドリツチ社、ミルウオーキー、ウイス
コンシン）１．８２ｇをトリス緩衝液５０．０mlに溶解
して０．２Ｍのグルコース溶液を調製した。この０．２
Ｍグルコース溶液０．５mlを例５で調製した１mM CN-TR
IS ２．０mlと混合して、トリス緩衝液中グルコース４
×１０-2Ｍ、NaCN ０．８mMの原液をつくつた。
コンシン）１．８２ｇをトリス緩衝液５０．０mlに溶解
して０．２Ｍのグルコース溶液を調製した。この０．２
Ｍグルコース溶液０．５mlを例５で調製した１mM CN-TR
IS ２．０mlと混合して、トリス緩衝液中グルコース４
×１０-2Ｍ、NaCN ０．８mMの原液をつくつた。
抗テオフイリン抗血清およびモルモツト血清は例４に記
載したと同じ出所のものである。ウサギ抗テオフイリン
抗血清０．２５mlをトリス緩衝液４．７５mlと混合して
抗テオフイリン血清の1/20希釈液を調製した。補体の1/
1.25希釈液はモルモツト血清２．０mlをトリス緩衝液
０．５mlと混合して調製した。
載したと同じ出所のものである。ウサギ抗テオフイリン
抗血清０．２５mlをトリス緩衝液４．７５mlと混合して
抗テオフイリン血清の1/20希釈液を調製した。補体の1/
1.25希釈液はモルモツト血清２．０mlをトリス緩衝液
０．５mlと混合して調製した。
ウサギ抗テオフイリン抗血清の1/20希釈液１．０mlをモ
ルモツト血清の1/1.25希釈液１．０mlおよびトリス緩衝
液中グルコース４×１０-2Ｍ、ＮａＣＮ０．８mMの原液
２．０mlと混合して、グルコース、シアン化物、抗テオ
フイリン抗血清および補体を含有する試薬を調製した
（試薬２）。
ルモツト血清の1/1.25希釈液１．０mlおよびトリス緩衝
液中グルコース４×１０-2Ｍ、ＮａＣＮ０．８mMの原液
２．０mlと混合して、グルコース、シアン化物、抗テオ
フイリン抗血清および補体を含有する試薬を調製した
（試薬２）。
測定操作および結果 ５０％（Ｖ／Ｖ）正常ウサグ血清中のテオフイリン試料
のそれぞれ２０μをとり、別々にポリプロピレンチユ
ーブ内の試薬１ ２００μに加え混合した。これに試
薬２ ２００μを加え、混合して反応を開始させた。
次に各ポリプロピレンチユーブをターナー２０型ルミノ
メーター内に置き、測定開始１５分後にルミネセンスを
観察、記録した。
のそれぞれ２０μをとり、別々にポリプロピレンチユ
ーブ内の試薬１ ２００μに加え混合した。これに試
薬２ ２００μを加え、混合して反応を開始させた。
次に各ポリプロピレンチユーブをターナー２０型ルミノ
メーター内に置き、測定開始１５分後にルミネセンスを
観察、記録した。
第８表に各試料のテオフイリン濃度および記録したルミ
ネセンスを示す。
ネセンスを示す。
各試料中のテオフイリン量と記録されたルミネセンスと
の間の薬量応答関係は第８表に示すデータから明かであ
る。
の間の薬量応答関係は第８表に示すデータから明かであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヴアイアリト、リプマン アメリカ合衆国ニユージヤーズイ州07666、 テイーネツク、スタンデイシユ．ロウド 607番 (56)参考文献 特開 昭56−132564（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−151097（ＪＰ，Ａ)
Claims (20)
- 【請求項１】（ａ）リガンドに対する結合パートナー、 （ｂ）少くとも二つの構成要素を有する検出系、 （ｃ）表面に結合したリガンドまたはリガンド類似体と
内部に前記検出系の第一の構成要素を有する選択的に透
過可能な小胞、 （ｄ）表面結合リガンドまたはリガンド類似体と結合パ
ートナーとの結合に応答して小胞の透過性を変化させる
物質、および （ｅ）前記第一の構成要素と反応して検出し得る応答を
生じこの応答は小胞が結合パートナーおよび小胞変性物
質の存在下にあると低下するものとする、前記検出系の
少くとも一つの追加的構成要素 を含有して成る、試料中のリガンド測定用組成物。 - 【請求項２】小胞が脂質膜を含有して成る前項（１）に
記載の組成物。 - 【請求項３】脂質膜がリン脂質を含有して成る前項
（２）に記載の組成物。 - 【請求項４】脂質膜がステロールを組込んでいる前項
（２）に記載の組成物。 - 【請求項５】脂質膜が、リガンドまたはリガンド類似体
が結合する両親媒性物質を含有する前項（２）に記載の
組成物。 - 【請求項６】小胞が生理学的細胞膜である前項（１）に
記載の組成物。 - 【請求項７】検出系の第一の構成要素が過酸化的に活性
な物質を含有して成り、少くとも一つの追加的構成要素
がルミネセンス発光団を含有して成る前項（１）に記載
の組成物。 - 【請求項８】過酸化物に活性な物質がペルオキシダーゼ
を含有して成る前項（７）に記載の組成物。 - 【請求項９】少くとも一つの追加的構成要素が、過酸化
的に活性な物質に対する基質である、ルミネセンス発光
団に対する酸化剤をさらに含有して成る前項（７）に記
載の組成物。 - 【請求項１０】酸化剤が過酸化水素である前項（９）に
記載の組成物。 - 【請求項１１】少くとも一つの追加的構成要素が、ルミ
ネセンス発光団に対する酸化剤を産生するに有効な酵素
系をさらに含有して成る前項（７）に記載の組成物。 - 【請求項１２】酵素系がグリコースオキシダーゼおよび
グルコースを含有して成る前項（１１）に記載の組成
物。 - 【請求項１３】検出系がエネルギー移送系をさらに含有
して成る前項（１）に記載の組成物。 - 【請求項１４】検出系がルミネセンス発光団を含有して
成り、エネルギー移送系がルミネセンス発光団の波長に
おいて光エネルギーを吸収し別の波長においてけい光を
発するけい光団を含有して成る前項（１３）に記載の組
成物。 - 【請求項１５】小胞の透過可能性が増加した場合に前記
検出系のルミネセンスを減少させる追加的物質を含有し
て成る前項（１）に記載の組成物。 - 【請求項１６】追加的物質がシアン化物である前項（１
５）に記載の組成物。 - 【請求項１７】リガンドがハプテンまたは抗原であり、
結合パートナーがそれに対する抗体である前項（１）に
記載の組成物。 - 【請求項１８】小胞変性物質が補体である前項（１）に
記載の組成物。 - 【請求項１９】（ａ）リガンドに対する抗体、 （ｂ）補体、 （ｃ）ルミネセンス発光団、 （ｄ）過酸化水素および （ｅ）リガンドまたはリガンド類似体をその表面に、ペ
ルオキシダーゼをその内部に有し前記抗体および補体と
結合する際に低下する検出し得る信号を発するリポソー
ム を含有して成る、前項（１）に記載の組成物。 - 【請求項２０】（イ）試料を （ａ）リガンドに対する結合パートナー、 （ｂ）少くとも二つの構成要素を有する検出系、 （ｃ）表面に結合したリガンドまたはリガンド類似体と
内部に前記検出系の第一の構成要素を有する選択的に透
過可能な小胞、 （ｄ）表面結合リガンドまたはリガンド類似体と結合パ
ートナーとの結合に応答して小胞の透過性を変化させる
物質、および （ｅ）前記第一の構成要素と反応して検出し得る応答を
生じこの応答は小胞が結合パートナーおよび小胞変性物
質の存在下にあると低下するものとする、前記検出系の
少くとも一つの追加的構成要素 を含有して成る、組成物と結合させて反応混合物を形成
させ、 （ロ）該混合物内の検出し得る応答の低下を測定し、そ
して （ハ）既知量のリガンドを含有する一連の標準組成物の
存在下で得られた応答と試料の存在下で得られた検出し
得る応答とを比較して試料中のリガンドの存在及び量を
検知する ことから成る、試料中のリガンドの存在及び量を検知す
る方法。
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