JPH0373855A - 免疫分析用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は免疫分析用試薬、更に詳細には、被検試料中に
存在する抗原又は抗体を、被検試料中に含まれる補体成
分の影響を受けることなく、簡単な操作で、感度よく測
定することのできる免疫分析用試薬に関する。

〔従来の技術〕

抗原抗体反応を利用する免疫測定法は各種内分泌疾患の
臨床診断等において極めて重要であり、種々の測定法が
知られている。その中でも、近年、マーカーを封入させ
たリポソームを調製してこれに抗原又は抗体を感作させ
、この感作リポソームを検体と共存させてリポソームに
共有結合している抗原又は抗体と検体中の抗体又は抗原
と反応させて抗原抗体複合体を形成し、この複合体を特
異的に破壊させてリポソームから流出するマーカーを測
定し、一方上記と同様の感作リポソームを種々既知量の
抗原又は抗体と共存させ、かつ上記と同様に流出マーカ
ーを測定して標準検量線を予め作成しておき、検体に関
する上記測定結果を上記標準検量線と照合させて、抗体
又は抗原を定量する方法が提案されており、この方法は
操作が簡単な点で注目をあびている。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記方法に使用される感作リポソームは、リポソームの
表面に抗体又は抗原を種々の方法によって固定したもの
であるが、その固定化法によっては、リポソームの表面
上で抗原抗体反応が生起しているにもかかわらず、充分
に補体を活性化することができないため、充分なマーカ
ーリリースが得られず、上記の免疫測定法に使用できな
かった。

本発明者は、斯かる問題点を解決する方法として、ハプ
テン°化リン脂質を配合して構成しｔ＝Ｖボソームに抗
体又は抗原を固定化すれば、補体活性が向上し、何れの
固定化法によって得られた感作リポソームでも免疫測定
法に使用できることを見出し、先に特許出願した（特願
昭６３−３１７２００号）。

感作リポソーム中に補体活性化能を有するハプテン基が
存在すると、リポソーム表面上で抗原抗体反応が起き、
補体が充分に活性化されてマーカーリリースが生ずる。

しかし、その反面、リポソーム表面上にハプテン基が存
在すると、被検試料中に補体成分が含まれている場合、
これによって抗原抗体反応に依存しないリポソームの溶
解現象が惹起され、マーカーリリースを生ずるため、正
確な測定ができないという問題点があった。

〔課題を解決するための手段〕 斯かる実状において、本発明者は更に研究を行った結果
、ハプテン化リン脂質を配合して構成したリポソームの
表面を還元剤で処理して、リポソーム表面に存在するハ
プテン基を不活性化すれば、抗原抗体反応非依存性のリ
ポソーム溶解現象を阻止できることを見出し、本発明を
完成した。

すなわち、本発明は、リン脂質、ハプテン化リン脂質及
びコレステロールを主要構成成分とするリポソームの表
面に抗体又は抗原を固定し、かつ該表面のハプテン基を
還元して不活性化し、更にリポソーム内に親水性標識物
質を封入したことを特徴とする免疫分析用試薬を提供す
るものである。

本発明のリポソームは、従来一般に使用されているリン
脂質、コレステロールとハプテン化リン脂質によって構
成される。

ハプテン化リン脂質としては、ジチオピリジル（ＤＴＰ
）−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（
ＤＰＰＢ）等が挙げられる。

本発明のリポソームの主要’４ｔＥｉ戊分のリン脂質と
コレステロールは約１：１　（モル比）が好ましい。ま
たハプテン化リン脂質はリン脂質１モルに対し０．００
５〜０．１モルが好ましい。

リポソーム内に封入される標識物質は、親水性であって
、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でなけ
ればならない。斯かる物質としては、例えば、高濃度で
は自己消光により蛍光は示さないが、低濃度（１０−’
Ｍ以下）で非常に強い蛍光を発するカルボキシフルオレ
セインのような蛍光性化合物；リポソーム外で酸化反応
により発光するルミノールやルシフェリンのような発光
性化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を有
する吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の作用に
より分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成をもたら
すグリコース及びシュークロースなどの糖類；テトラペ
ンチルアンモニウムのような比較的大きなイオン性化合
物；ニコチンアミドアゾニシンヌクレオチド（ＮＡＰ）
）のような補酵素類；メチルビオロゲンを初めとするラ
ジカル化合物などが望ましい。しかしながら、酵素類は
本発明においては標識物質として使用しない。これらの
化合物は、゛検出方法、感度及びリポソームの安定性等
の因子を勘案した上で、適宜に選択される。

本発明の免疫分析用試薬は、例えば次の方法で製造され
る。まず、リン脂質、ハプテン化リン脂質、コレステロ
ール、更に必要に応じて、抗体又は抗原と結合し得る官
能基を有する化合物、例えばＩＩ）ＰＰＢ、ヒドラジン
化合物、ヒドロキシルアミン化合物、ヒドラゾン化合物
を加え、Ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ法によってリポソームを調
製する。具体的には、上記混合物に溶媒を加えて反応さ
せた後、溶媒を留去し、吸引乾燥する。しかる後、壁面
に薄膜が形成されたフラスコ内に所定の標識物質の水溶
液を加え、密栓をして振とうし、リポソームの懸濁液を
得る。

一方、抗体又は抗原は、過ヨウ素酸法の場合には、抗体
の分子中の糖鎖水酸基のみがホルミル基に酸化されるよ
うな温和な条件で、過ヨウ素酸等を用いて酸化して修飾
抗体とする。またＮ−ヒドロキシスクシンイミドパルミ
チン酸エステル（ＮＨ３Ｐ）等の活性エステル法の場合
には、抗原又は抗体と当該活性エステルをインキュベー
トして修飾抗体とする。

次いで、このようにして調製したリポソームと修飾抗体
を緩衝液中で反応せしめれば、標識物質を内包し、表面
に抗体又は抗原が固定化されたマイクロカプセルが得ら
れる。

最後に抗体（又は抗原）感作リポソームの表面を還元処
理すれば本発明の免疫分析用試薬が得られる。還元剤と
しては、水素化ホウ素ナトリウム（Ｎａ口■４）、水素
化シアノホウ素ナトリウム（ＮａＢ）ｌｓｃＮ）、水素
化ホウ素リチウム（ＬｉＢＨ４）、ジメチルアミンボラ
ン［（ＣＩ’＋３）　２８ＮＢＨ３）　、）リメチルア
ミンボランＣ（Ｃｌ４３）　ａＮＪＩＨａ〕等を挙げる
ことができ、例えば、ＮａＢＬの最終濃度０．１ｍｇ／
−において良好な還元効果が得られる。

本発明の免疫分析用試薬を用いる被検試料中の抗原又は
抗体の定量は例えば次のようにして行われる。まず、該
試薬、抗原又は抗体を含む試料及び補体を適当な緩衝液
（例えば、ゼラチン−ベロナール緩衝液）中で混合し、
抗原−抗体と補体との結合反応を引き起こさせる。する
と、斯かる反応量に比例して、リポソーム内から標識物
質が放出されてくる。次いで、この標識物質に応じた分
析方法（例えば、標識物質が蛍光物質であれば、蛍光分
析法）により定量を行い、例えば、予め作成した検量線
により、試料中の抗体又は抗原の量を測定することがで
きる。

定量操作において使用する補体は、格別限定されないが
、通常、モルモット血清が用いられる。

しかし、ウサギ、マウス、ヒト等の血清を使用してもよ
い。

〔発明の効果〕

叙上の如く、ハプテン化リン脂質を構成成分としてリポ
ソームを調製した本発明免疫分析用試薬は、抗体又は抗
原の何れの固定化法によっても高い補体活性を示し、高
感度で被検試料中の抗原又は抗体を定量することができ
る。また本発明免疫分析用試薬は、リポソーム表面のハ
プテン基が不活性化されているので、抗原抗体反応非依
存性のリポソーム溶解現象がなく、その結果高い補体価
を使用して高いマーカーリリースを得ることができ、低
濃度の抗原又は抗体を高精度で測定することができる。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて説明する。

実施例１ ヒ）　ＣＲＰ抗原測定用リポソーム試薬の調製：（ｉ）
マーカー封入リポソームの調製ニジバルミトイルホスフ
ァチジルコリン（ＤＰＰＢ　：Ｌ　ＯｍＭ、　　１００
μｉｔ＞　、：’レスチロール（Ｃｈｏｌ　：１０ｍＭ
、１００μｍ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノ
ールアミン（ＤＰＰＢ：　１ｍＭ、　　１００μｊ２）
、ジチオピリジル化ジパルミトイルホスファチジルエタ
ノールアミン（ＤＴＰ−ＤＰＰＢ　：　１　ｍＭ。

１０μｍ＞　＝１　：　１　：０．１：０．０１　（モ
ル比）をクロロホルム（又はクロロホルム／メタノール
）に溶解したものを１０ｄナシ型フラスコにとり、溶媒
をエバポレーターで留去し、フラスコ内壁にフィルム状
に脂質薄膜を形成させる。この脂質薄膜を１〜２時間真
空乾燥した後、標識物質として０．２Ｍカルボキシフル
オレセイン溶液（ｐＨ７，５）１００μｌを添加し、ポ
ルテックスミキサーで５分間激しく攪拌する。次いで過
剰のカルボキシフルオレセインを遠心除去すれば、カル
ボキシフルオレセイン封入リポソームが得られる。この
際、遠心洗浄には０．ＯＩＭの炭酸緩衝液（０，１５Ｍ
　ＮａＣｊ！含有、　ｐｉ（９，２＞を用い、カルボキ
シフルオレセインが除去できたなら、５００μｌの炭酸
緩衝液に懸濁しておく。

（ｉｉ　）　　リポソームの抗体感作：ヤギ抗ＣＲＰ抗
体（ＩｇＧ分画）を予め０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，
０）に緩衝液を交換しておき、４．０ｍｇ／−の抗体溶
液とする。そこに固形のメタ過ヨウ素酸ナトリウム（Ｎ
ａＩＯ，）を１０ｍＭになるように添加し、室温で３０
分間遮光して反応させる。

次いで、セファデックスＧ−２５カラムを用いてＮａ１
Ｏａを除去するが、この際に０．０１Ｍ炭酸緩衝液（０
，１５Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ９，２）に緩衝液を交換する
と共に、分光光度計によりＡ２８０ｎｍで抗体の溶出を
ｍ認する。

次いで、先に得た抗体溶液（２■／ｒｎ１）５００μｌ
を（ｉ）で調製したリポソーム懸濁液５００μｌに添加
して緩徐に１５〜２０時間攪拌し、抗体感作リポソーム
を調製する。

（ｉｉｉ　）抗体感作リポソームの還元処理：（ｉｉ　
）で得られた抗体感作リポソーム溶液１−に１０■／−
の水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨｍ）を５〜２０μ
ｌ加え、室温で１時間反応させる。

次いで、未反応の抗体とＮａｐ）Ｉ４を除去するために
、ゼラチンベロナール緩衝液（ｐ）１７．５）で遠心し
た後、前記緩衝液ｆｍｌ！にリポソームを懸濁して抗体
感作リポソームを調製した。

実施例２ 補体の非特異反応の測定： 希釈にはゼラチンベロナール緩衝液に０．５ｍＭＭｇＣ
Ａ２及び０．１５　ｍＭ　ＣａＣｆ１２を添加した緩衝
液（ＧＶＢ”　）を使用した。測定には、実施例１で調
製したリポソーム試薬を１０００倍希釈して用いた。モ
ルモット補体は同様にＧＶＢ−で２〜２０　Ｃ）１５０
になるように希釈して用いた。測定は以下のように行っ
た。

９６穴マイクロプレートにＧＶＢで希釈したモルモット
補体（２〜２０　ＣＨ３０）　２５μｌと前記リポソー
ム溶液２５μｌを分注し、さらにＧＶＢを５０μｌ加え
、３７℃で１時間反応させた。その後、補体反応を停止
させるため１０　ｍＭ　ＢＩＩＴＡ含有ベロナール緩衝
液１００μ１−ｔ−添加した。モルモット補体価に依存
してリポソームから溶出したカルボキシフルオレセイン
の量を蛍光測定機（励起波長４９０　ｎｍ、蛍光波長５
３０　ｎｍ）により測定した。

その時の相対蛍光強度の計算は次式によって行われた。

相対蛍光強度（％） ＝　（（Ｆ、−Ｆ）／　（ＦＴ−Ｆ）　）　　Ｘ　１０
０Ｆ、：実測した蛍光強度 ＦＴ：検体の代わりに１０％トライトンＸ−１００溶液
を添加して得られた蛍光強度Ｆ　：検体の代わりにＧＶ
Ｂを添加して得られた蛍光強度 その結果は第１図のとおりである。第１図から明らかな
ように、ＮａＢ）Ｉ＜還元リポソームでは非還元リポソ
ームに比較して、補体の非特異的マーカーリリースの減
少が認められた。また、その補体の非特異的マーカーリ
リースは、ＮａＢＨ＝の濃度に依存して減少した。また
対照に５ＰＤＰ法で調製したリポソームの結果も示した
。これらの結果より、還元リポソームでは、高い補体価
まで安定であり、測定の際に高い補体価を使用できるこ
とが示された。

実施例３ ＣＲＰ検量線の作成： 希釈には、Ｇ　Ｖ　Ｂ　”−ｔ−用い、測定には実施例
１で調製したリポソーム試薬を１０００倍希釈して使用
した。

モルモット補体は、補体ブランクが相対蛍光強度１０％
以下になるような最高補体価を使用した（非還元リポソ
ーム：　４　ＣＨ３０，０，０５，０，１■／ｍｌ！！
。

ＮａＢＨ４還元リポソーム：　８　Ｃ１（５０，０，２
ｍｇ／ｍｊ’。

ＮａＢＨ４還元リポソーム：　１０　ＣＨ３０）　、そ
の際の希釈もＧＶＢ＋を用いた。二次抗体はウサギ抗Ｃ
ＲＰ抗体を１００倍希釈して用いた。測定は次のように
して行った。

９６穴マイクロプレートにＧＶＢ“で希釈したヒトＣＲ
Ｐ抗原溶液（０，２〜１００ｎｇ／−）　２５　ｐｉと
前記リポソーム溶液２５μｌを分注し、３７℃で１時間
反応させた。引き続き２次抗体と補体をそれぞれ２５μ
ｌずつ添加し、更に３７℃で１時間反応させた。補体反
応を停止させるために１０ｍＭＢＤＴＡ含有ベロナール
緩衝液１００μｌを添加した。

蛍光測定及び相対蛍光強度の計算は実施例２に従って行
った。その結果を第２図に示した。第２図よりＮａＢＩ
（ａで還元処理をしたリポソームでは、非還元処理リポ
ソームに比較して高い補体価を用いて測定できるために
高いマーカーリリースが得られた。また対照として５Ｐ
ＤＰ法で調製したリポソームのＣＲＰ検量線を付加した
。この５ＰＤＰ法リポソームでの使用補体価は３　ＣＨ
３０である。このＳＰ［ｌＰ法リポソームに比較しても
ＮａＢＨａ還元リポソームは高いマーカーリリースを示
した。

実施例４ ヒト血清中のＣＲＰ抗原の測定： ヒト血清をＧＶＢで２倍に希釈し、５６℃で３０分間非
働化した後、血清中のＣＲＰ抗原濃度が約１〜ｌＱｎｇ
／ｍｊ！となるように血清をＧＶＢで希釈した。

次いで実施例３で行った測定方法に従い検体の相対蛍光
強度を求め、その相対蛍光強度に対応するＣＲＰ抗原の
濃度を、実施例３で作製した検量線から求めた。また５
ＲＩＯによるヒト血清中ＣＲＰ抗原の測定は、Ｎ−イム
ノＣＲＰ　ｒニッスイ」のプレートを用いて行った。

その結果を第３図に示した。第３図より、本発明試薬を
用いる方法、（ＬＩＬＡ）と５ＲＩＯの相関では、Ｌｒ
ＬＡの検体希釈倍数（１００倍〜５００００倍）を考る
一次回帰式はＹ　＝　−０，２５＋　１．３３Ｘであり
相関係数はｒ　＝　０．９７５６であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のＮａＢｔｌ、還元リポソームと非還
元リポソームの補体に対する非特異的マーカーリリース
の比較を示す。第２図はＮａＢＨ＜還元リポソームを用
いてＣＲＰ抗原を測定する際の検量線である。第３図は
ヒト血清中のＣＲＰ抗原の測定における５ＲＩＯとＬＩ
ＬＡの相関図である。 以上 第 図 −−−− ・−一一一・ ムーー、Δ ム、−−ム ＣＲＰＡｇ（ｎｇ／ｍ１） 非還元処理 Ｎａ　ＢＨ４０，０５ｍｇ　７ｍｊ処理ＮａＢＨ４０，
１０ｍｇ　７ｍｌ処理 Ｎａ８８４０．２０ｍｇ／ｒｒ＋１処理５ＰＤＰ法

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １　リン脂質、ハプテン化リン脂質及びコレステロール
   を主要構成成分とするリポソームの表面に抗体又は抗原
   を固定し、かつ該表面のハプテン基を還元して不活性化
   し、更にリポソーム内に親水性標識物質を封入したこと
   を特徴とする免疫分析用試薬。