JP2707334B2 - 免疫分析用試薬 - Google Patents
免疫分析用試薬Info
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- JP2707334B2 JP2707334B2 JP20978889A JP20978889A JP2707334B2 JP 2707334 B2 JP2707334 B2 JP 2707334B2 JP 20978889 A JP20978889 A JP 20978889A JP 20978889 A JP20978889 A JP 20978889A JP 2707334 B2 JP2707334 B2 JP 2707334B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は免疫分析用試薬、更に詳細には、被検試料中
に存在する抗原又は抗体を、被検試料中に含まれる補体
成分の影響を受けることなく、簡単な操作で、感度よく
測定することのできる免疫分析用試薬に関する。
に存在する抗原又は抗体を、被検試料中に含まれる補体
成分の影響を受けることなく、簡単な操作で、感度よく
測定することのできる免疫分析用試薬に関する。
抗原抗体反応を利用する免疫測定法は各種内分泌疾患
の臨床診断等において極めて重要であり、種々の測定法
が知られている。その中でも、近年、マーカーを封入さ
せたリポソームを調製してこれに抗原又は抗体を感作さ
せ、この感作リポソームを検体と共存させてリポソーム
に共有結合している抗原又は抗体と検体中の抗体又は抗
原と反応させて抗原抗体複合体を形成し、この複合体を
特異的に破壊させてリポソームから流出するマーカーを
測定し、一方上記と同様の感作リポソームを種々既知量
の抗原又は抗体と共存させ、かつ上記と同様に流出マー
カーを測定して標準検量線を予め作成しておき、検体に
関する上記測定結果を上記標準検量線と照合させて、抗
体又は抗原を定量する方法が提案されており、この方法
は操作が簡単な点で注目をあびている。
の臨床診断等において極めて重要であり、種々の測定法
が知られている。その中でも、近年、マーカーを封入さ
せたリポソームを調製してこれに抗原又は抗体を感作さ
せ、この感作リポソームを検体と共存させてリポソーム
に共有結合している抗原又は抗体と検体中の抗体又は抗
原と反応させて抗原抗体複合体を形成し、この複合体を
特異的に破壊させてリポソームから流出するマーカーを
測定し、一方上記と同様の感作リポソームを種々既知量
の抗原又は抗体と共存させ、かつ上記と同様に流出マー
カーを測定して標準検量線を予め作成しておき、検体に
関する上記測定結果を上記標準検量線と照合させて、抗
体又は抗原を定量する方法が提案されており、この方法
は操作が簡単な点で注目をあびている。
上記方法に使用される感作リポソームは、リポソーム
の表面に抗体又は抗原を種々の方法によって固定したも
のであるが、その固定化法によっては、リポソームの表
面上で抗原抗体反応が生起しているにもかかわらず、充
分に補体を活性化することができないため、充分なマー
カーリリースが得られず、上記の免疫測定法に使用でき
なかった。
の表面に抗体又は抗原を種々の方法によって固定したも
のであるが、その固定化法によっては、リポソームの表
面上で抗原抗体反応が生起しているにもかかわらず、充
分に補体を活性化することができないため、充分なマー
カーリリースが得られず、上記の免疫測定法に使用でき
なかった。
本発明者は、斯かる問題点を解決する方法として、ハ
プテン化リン脂質を配合して構成したリポソームに抗体
又は抗原を固定化すれば、補体活性が向上し、何れの固
定化法によって得られた感作リポソームでも免疫測定法
に使用できることを見出し、先に特許出願した（特願昭
63−317200号）。
プテン化リン脂質を配合して構成したリポソームに抗体
又は抗原を固定化すれば、補体活性が向上し、何れの固
定化法によって得られた感作リポソームでも免疫測定法
に使用できることを見出し、先に特許出願した（特願昭
63−317200号）。
感作リポソーム中に補体活性化能を有するハプテン基
が存在すると、リポソーム表面上で抗原抗体反応が起
き、補体が充分に活性化されてマーカーリリースが生ず
る。しかし、その反面、リポソーム表面上にハプテン基
が存在すると、被検試料中に補体成分が含まれている場
合、これによって抗原抗体反応に依存しないリポソーム
の溶解現象が惹起され、マーカーリリースを生ずるた
め、正確な測定ができないという問題点があった。
が存在すると、リポソーム表面上で抗原抗体反応が起
き、補体が充分に活性化されてマーカーリリースが生ず
る。しかし、その反面、リポソーム表面上にハプテン基
が存在すると、被検試料中に補体成分が含まれている場
合、これによって抗原抗体反応に依存しないリポソーム
の溶解現象が惹起され、マーカーリリースを生ずるた
め、正確な測定ができないという問題点があった。
斯かる実状において、本発明者は更に研究を行った結
果、ハプテン化リン脂質を配合して構成したリポソーム
の表面を還元剤で処理して、リポソーム表面に存在する
ハプテン基の不活性化すれば、抗原抗体反応非依存性の
リポソーム溶解現象を阻止できることを見出し、本発明
を完成した。
果、ハプテン化リン脂質を配合して構成したリポソーム
の表面を還元剤で処理して、リポソーム表面に存在する
ハプテン基の不活性化すれば、抗原抗体反応非依存性の
リポソーム溶解現象を阻止できることを見出し、本発明
を完成した。
すなわち、本発明は、リン脂質、ハプテン化リン脂質
及びコレステロールを主要構成成分とするリポソームの
表面に抗体又は抗原を固定し、かつ該表面のハプテン基
を還元して不活性化し、更にリポソーム内に親水性標識
物質を封入したことを特徴とする免疫分析用試薬を提供
するものである。
及びコレステロールを主要構成成分とするリポソームの
表面に抗体又は抗原を固定し、かつ該表面のハプテン基
を還元して不活性化し、更にリポソーム内に親水性標識
物質を封入したことを特徴とする免疫分析用試薬を提供
するものである。
本発明のリポソームは、従来一般に使用されているリ
ン脂質、コレステロールとハプテン化リン脂質によって
構成される。
ン脂質、コレステロールとハプテン化リン脂質によって
構成される。
ハプテン化リン脂質としては、ジチオピリジル（DT
P）−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン
（DPPE）等が挙げられる。
P）−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン
（DPPE）等が挙げられる。
本発明のリポソームの主要構成成分のリン脂質とコレ
ステロールは約1:1（モル比）が好ましい。またハプテ
ン化リン脂質はリン脂質１モルに対し0.005〜0.1モルが
好ましい。
ステロールは約1:1（モル比）が好ましい。またハプテ
ン化リン脂質はリン脂質１モルに対し0.005〜0.1モルが
好ましい。
リポソーム内に封入される標識物質は、親水性であっ
て、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でな
ければならない。斯かる物質としては、例えば、高濃度
では自己消光により蛍光は示さないが、低濃度（10-3M
以下）で非常に強い蛍光を発するカルボキシフルオレセ
インのような蛍光性化合物；リポソーム外で酸化反応に
より発光するルミノールやルシフェリンのような発光性
化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を有す
る吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の作用によ
り分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成をもたらす
グリコース及びシュークロースなどの糖類；テトラペン
チルアンモニウムのような比較的大きなイオン性化合
物；ニコチンアミドアデニジンヌクレオチド（NAD）の
ような補酵素類；メチルピオロゲンを初めとするラジカ
ル化合物などが望ましい。しかしながら、酵素類は本発
明においては標識物質として使用しない。これらの化合
物は、検出方法、感度及びリポソームの安定性等の因子
を勘案した上で、適宜に選択される。
て、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でな
ければならない。斯かる物質としては、例えば、高濃度
では自己消光により蛍光は示さないが、低濃度（10-3M
以下）で非常に強い蛍光を発するカルボキシフルオレセ
インのような蛍光性化合物；リポソーム外で酸化反応に
より発光するルミノールやルシフェリンのような発光性
化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を有す
る吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の作用によ
り分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成をもたらす
グリコース及びシュークロースなどの糖類；テトラペン
チルアンモニウムのような比較的大きなイオン性化合
物；ニコチンアミドアデニジンヌクレオチド（NAD）の
ような補酵素類；メチルピオロゲンを初めとするラジカ
ル化合物などが望ましい。しかしながら、酵素類は本発
明においては標識物質として使用しない。これらの化合
物は、検出方法、感度及びリポソームの安定性等の因子
を勘案した上で、適宜に選択される。
本発明の免疫分析用試薬は、例えば次の方法で製造さ
れる。まず、リン脂質、ハプテン化リン脂質、コレステ
ロール、更に必要に応じて、抗体又は抗原と結合し得る
官能基を有する化合物、例えばDPPE、ヒドラジン化合
物、ヒドロキシルアミン化合物、ヒドラゾン化合物を加
え、Vortexing法によってリポソームを調製する。具体
的には、上記混合物に溶媒を加えて反応させた後、溶媒
を留去し、吸引乾燥する。しかる後、壁面に薄膜が形成
されたフラスコ内に所定の標識物質の水溶液を加え、密
栓をして振とうし、リポソームの懸濁液を得る。
れる。まず、リン脂質、ハプテン化リン脂質、コレステ
ロール、更に必要に応じて、抗体又は抗原と結合し得る
官能基を有する化合物、例えばDPPE、ヒドラジン化合
物、ヒドロキシルアミン化合物、ヒドラゾン化合物を加
え、Vortexing法によってリポソームを調製する。具体
的には、上記混合物に溶媒を加えて反応させた後、溶媒
を留去し、吸引乾燥する。しかる後、壁面に薄膜が形成
されたフラスコ内に所定の標識物質の水溶液を加え、密
栓をして振とうし、リポソームの懸濁液を得る。
一方、抗体又は抗原は、過ヨウ素酸法の場合には、抗
体の分子中の糖鎖水酸基のみがホルミル基に酸化される
ような温和な条件で、過ヨウ素酸等を用いて酸化して修
飾抗体とする。またＮ−ヒドロキシスクシンイミドパル
ミチン酸エステル（NHSP）等の活性エステル法の場合に
は、抗原又は抗体と当該活性エステルをインキュベート
して修飾抗体とする。
体の分子中の糖鎖水酸基のみがホルミル基に酸化される
ような温和な条件で、過ヨウ素酸等を用いて酸化して修
飾抗体とする。またＮ−ヒドロキシスクシンイミドパル
ミチン酸エステル（NHSP）等の活性エステル法の場合に
は、抗原又は抗体と当該活性エステルをインキュベート
して修飾抗体とする。
次いで、このようにして調製したリポソームと修飾抗
体を緩衝液中で反応せしめれば、標識物質を内包し、表
面に抗体又は抗原が固定化されたマイクロカプセルが得
られる。
体を緩衝液中で反応せしめれば、標識物質を内包し、表
面に抗体又は抗原が固定化されたマイクロカプセルが得
られる。
最後に抗体（又は抗原）感作リポソームの表面を還元
処理すれば本発明の免疫分析用試薬が得られる。還元剤
としては、水素化ホウ素ナトリウム（NaBH4）、水素化
シアノホウ素ナトリウム（NaBH3CN）、水素化ホウ素リ
チウム（LiHB4）、ジメチルアミンボラン〔（CH3）2HNB
H3〕、トリメチルアミンボラン〔（CH3）3NBH3〕等を挙
げることができ、例えば、NaBH4の最終濃度0.1mg/mlに
おいて良好な還元効果が得られる。
処理すれば本発明の免疫分析用試薬が得られる。還元剤
としては、水素化ホウ素ナトリウム（NaBH4）、水素化
シアノホウ素ナトリウム（NaBH3CN）、水素化ホウ素リ
チウム（LiHB4）、ジメチルアミンボラン〔（CH3）2HNB
H3〕、トリメチルアミンボラン〔（CH3）3NBH3〕等を挙
げることができ、例えば、NaBH4の最終濃度0.1mg/mlに
おいて良好な還元効果が得られる。
本発明の免疫分析用試薬を用いる被検試料中の抗原又
は抗体の定量は例えば次のようにして行われる。まず、
該試薬、抗原又は抗体を含む試料及び補体を適当な緩衝
液（例えば、ゼラチン−ベロナール緩衝液）中で混合
し、抗原−抗体と補体との結合反応を引き起こさせる。
すると、斯かる反応量に比例して、リポソーム内から標
識物質が放出されてくる。次いで、この標識物質に応じ
た分析方法（例えば、標識物質が蛍光物質であれば、蛍
光分析法）により定量を行い、例えば、予め作成した検
量線により、試料中の抗体又は抗原の量を測定すること
ができる。
は抗体の定量は例えば次のようにして行われる。まず、
該試薬、抗原又は抗体を含む試料及び補体を適当な緩衝
液（例えば、ゼラチン−ベロナール緩衝液）中で混合
し、抗原−抗体と補体との結合反応を引き起こさせる。
すると、斯かる反応量に比例して、リポソーム内から標
識物質が放出されてくる。次いで、この標識物質に応じ
た分析方法（例えば、標識物質が蛍光物質であれば、蛍
光分析法）により定量を行い、例えば、予め作成した検
量線により、試料中の抗体又は抗原の量を測定すること
ができる。
定量操作において使用する補体は、格別限定されない
が、通常、モルモット血清が用いられる。しかし、ウサ
ギ、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。
が、通常、モルモット血清が用いられる。しかし、ウサ
ギ、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。
叙上の如く、ハプテン化リン脂質を構成成分としてリ
ポソームを調製した本発明免疫分析用試薬は、抗体又は
抗原の何れの固定化法によっても高い補体活性を示し、
高感度で被検試料中の抗原又は抗体を定量とすることが
できる。また本発明免疫分析用試薬は、リポソーム表面
のハプテン基が不活性化されているので、抗原抗体反応
非依存性のリポソーム溶解現象がなく、その結果高い補
体価を使用して高いマーカーリリースを得ることがで
き、低濃度の抗原又は抗体を高精度で測定することがで
きる。
ポソームを調製した本発明免疫分析用試薬は、抗体又は
抗原の何れの固定化法によっても高い補体活性を示し、
高感度で被検試料中の抗原又は抗体を定量とすることが
できる。また本発明免疫分析用試薬は、リポソーム表面
のハプテン基が不活性化されているので、抗原抗体反応
非依存性のリポソーム溶解現象がなく、その結果高い補
体価を使用して高いマーカーリリースを得ることがで
き、低濃度の抗原又は抗体を高精度で測定することがで
きる。
次に実施例を挙げて説明する。
実施例１ ヒトCRP抗原測定用リポソーム試薬の調製： （ｉ）マーカー封入リポソームの調製： ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPE:10mM,10
0μ）、コレステロール（Chol:10mM,100μ）、ジパ
ルミトイルホスファチジエタノールアミン（DPPE:1mM,1
00μ）、ジチオリジル化ジパルミトイルホスファチジ
ルエタノールアミン（DTP−DPPE:1mM,10μ）＝1:1:0.
1:0.01（モル比）をクロロホルム（又はクロロホルム／
メタノール）に溶解したものを10mナシ型フラスコに
とり、溶媒をエバポレーターで留去し、フラスコ内壁に
フィルム状に脂質薄膜を形成させる。この脂質薄膜を１
〜２時間真空乾燥した後、標識物質として0.2Mカルボキ
シフルオレセイン溶液（pH7.5）100μを添加し、ボル
テックスミキサーで５分間激しく撹拌する。次いで過剰
のカルボキシフルオレセインを遠心除去すれば、カルボ
キシフルオレセイン封入リポソームが得られる。この
際、遠心洗浄には0.01Mの炭酸緩衝液（0.15M NaCl含有,
pH9.2）を用い、カルボキシフルオレセインが除去でき
たなら、500μの炭酸緩衝液に懸濁しておく。
0μ）、コレステロール（Chol:10mM,100μ）、ジパ
ルミトイルホスファチジエタノールアミン（DPPE:1mM,1
00μ）、ジチオリジル化ジパルミトイルホスファチジ
ルエタノールアミン（DTP−DPPE:1mM,10μ）＝1:1:0.
1:0.01（モル比）をクロロホルム（又はクロロホルム／
メタノール）に溶解したものを10mナシ型フラスコに
とり、溶媒をエバポレーターで留去し、フラスコ内壁に
フィルム状に脂質薄膜を形成させる。この脂質薄膜を１
〜２時間真空乾燥した後、標識物質として0.2Mカルボキ
シフルオレセイン溶液（pH7.5）100μを添加し、ボル
テックスミキサーで５分間激しく撹拌する。次いで過剰
のカルボキシフルオレセインを遠心除去すれば、カルボ
キシフルオレセイン封入リポソームが得られる。この
際、遠心洗浄には0.01Mの炭酸緩衝液（0.15M NaCl含有,
pH9.2）を用い、カルボキシフルオレセインが除去でき
たなら、500μの炭酸緩衝液に懸濁しておく。
（ii）リポソームの抗原感作： ヤギ抗CRP抗体（IgG分画）を予め0.1M酢酸緩衝液（pH
4.0）に緩衝液を交換しておき、4.0mg/mlの抗体溶液と
する。そこに固体のメタ過ヨウ素酸ナトリウム（NaI
O4）を10mMになるように添加し、室温で30分間遮光して
反応させる。次いで、セファデックスＧ−25カラムを用
いてNaIO4を除去するが、この際に0.01M炭酸緩衝液（0.
15M NaCl,pH9.2）に緩衝液を交換すると共に、分光光度
計によりA280nmで抗体の溶出を確認する。
4.0）に緩衝液を交換しておき、4.0mg/mlの抗体溶液と
する。そこに固体のメタ過ヨウ素酸ナトリウム（NaI
O4）を10mMになるように添加し、室温で30分間遮光して
反応させる。次いで、セファデックスＧ−25カラムを用
いてNaIO4を除去するが、この際に0.01M炭酸緩衝液（0.
15M NaCl,pH9.2）に緩衝液を交換すると共に、分光光度
計によりA280nmで抗体の溶出を確認する。
次いで、先に得た抗体溶液（2mg/ml）500μを
（ｉ）で調製したリポソーム懸濁液500μに添加して
緩徐に15〜20時間撹拌し、抗体感作リポソームを調製す
る。
（ｉ）で調製したリポソーム懸濁液500μに添加して
緩徐に15〜20時間撹拌し、抗体感作リポソームを調製す
る。
（iii）抗体感作リポソームの還元処理： （ii）で得られた抗体感作リポソーム溶液1mに10mg
/mlの水素化ホウ素ナトリウム（NaBH4）を５〜20μ加
え、室温で１時間反応させる。次いで、未反応の抗体と
NaHB4を除去するために、ゼラチンベロナール緩衝液（p
H7.5）で遠心した後、前記緩衝液1mにリポソームを懸
濁して抗体感作リポソームを調製した。
/mlの水素化ホウ素ナトリウム（NaBH4）を５〜20μ加
え、室温で１時間反応させる。次いで、未反応の抗体と
NaHB4を除去するために、ゼラチンベロナール緩衝液（p
H7.5）で遠心した後、前記緩衝液1mにリポソームを懸
濁して抗体感作リポソームを調製した。
実施例２ 補体の非特異反応の測定： 希釈にはゼラチンベロナール緩衝液に0.5mM MgCl2及
び0.15mM CaCl2を添加した緩衝液（GVB ）を使用し
た。測定には、実施例１で調製したリポソーム試薬を10
00倍希釈して用いた。モルモット補体は同様にGVB で
２〜20CH50になるように希釈して用いた。測定は以下の
ように行った。
び0.15mM CaCl2を添加した緩衝液（GVB ）を使用し
た。測定には、実施例１で調製したリポソーム試薬を10
00倍希釈して用いた。モルモット補体は同様にGVB で
２〜20CH50になるように希釈して用いた。測定は以下の
ように行った。
96穴マイクロプレートにGVB で希釈したモルモット
補体（２〜20CH50）25μと前記リポソーム溶液25μ
を文注し、さらにGVB を50μ加え、37℃で１時間反
応させた。その後、補体反応を停止させるため10mM BDT
A含有ベロナール緩衝液100μを添加した。モルモット
補体価に依存してリポソームから溶出したカルボキシフ
ルオレセインの量を蛍光測定機（励起波長490nm,蛍光波
長530nm）により測定した。その時の相対蛍光強度の計
算は次式によって行われた。
補体（２〜20CH50）25μと前記リポソーム溶液25μ
を文注し、さらにGVB を50μ加え、37℃で１時間反
応させた。その後、補体反応を停止させるため10mM BDT
A含有ベロナール緩衝液100μを添加した。モルモット
補体価に依存してリポソームから溶出したカルボキシフ
ルオレセインの量を蛍光測定機（励起波長490nm,蛍光波
長530nm）により測定した。その時の相対蛍光強度の計
算は次式によって行われた。
相対蛍光強度（％） ＝｛（Ft−Ｆ）／（FT−Ｆ）｝×100 Ft:実測した蛍光強度 FT:検体の代わりに10％トライトンＸ−100溶液を添加
して得られた蛍光強度 F :検体の代わりにGVB を添加して得られた蛍光強度 その結果は第１図のとおりである。第１図から明らか
なように、NaBH4還元リポソームでは非還元リポソーム
に比較して、補体の非特異的マーカーリリースの減少が
認められた。また、その補体の非特異的マーカーリリー
スは、NaBH4の濃度に依存して減少した。また対照にSPD
P法で調製したリポソームの結果も示した。これらの結
果より、還元リポソームでは、高い補体価まで安定であ
り、測定の際に高い補体価を使用できることが示され
た。
して得られた蛍光強度 F :検体の代わりにGVB を添加して得られた蛍光強度 その結果は第１図のとおりである。第１図から明らか
なように、NaBH4還元リポソームでは非還元リポソーム
に比較して、補体の非特異的マーカーリリースの減少が
認められた。また、その補体の非特異的マーカーリリー
スは、NaBH4の濃度に依存して減少した。また対照にSPD
P法で調製したリポソームの結果も示した。これらの結
果より、還元リポソームでは、高い補体価まで安定であ
り、測定の際に高い補体価を使用できることが示され
た。
実施例３ CRP検量線の作成： 希釈には、GVB を用い、測定には実施例１で調製し
たリポソーム試薬を1000倍希釈して使用した。モルモッ
ト補体は、補体ブランクが相対蛍光強度10％以下になる
ような最高補体価を使用した（非還元リポソーム:4CH5
0,0.05,0.1mg/ml,NaBH4還元リポソーム:8CH50,0.2mg/m
l,NaBH4還元リポソーム:10CH50）。その際の希釈もGVB
を用いた。二次抗体はウサギ抗CRP抗体を100倍希釈し
て用いた。測定は次のようにして行った。
たリポソーム試薬を1000倍希釈して使用した。モルモッ
ト補体は、補体ブランクが相対蛍光強度10％以下になる
ような最高補体価を使用した（非還元リポソーム:4CH5
0,0.05,0.1mg/ml,NaBH4還元リポソーム:8CH50,0.2mg/m
l,NaBH4還元リポソーム:10CH50）。その際の希釈もGVB
を用いた。二次抗体はウサギ抗CRP抗体を100倍希釈し
て用いた。測定は次のようにして行った。
96穴マイクロプレートにGVB で希釈したヒトCRP抗原
溶液（0.2〜100ng/ml）25μと前記リポソーム溶液25
μを分注し、37℃で１時間反応させた。引き続き２次
抗体と補体をそれぞれ25μずつ添加し、更に37℃で１
時間反応させた。補体反応を停止させるために10mM EDT
A含有ベロナール緩衝液100μを添加した。蛍光測定及
び相対蛍光強度の計算は実施例２に従って行った。その
結果を第２図に示した。第２図よりNaBH4で還元処理を
したリポソームでは、非還元処理リポソームに比較して
高い補体価を用いて測定できるために高いマーカーリリ
ースが得られた。また対照としてSPDP法で調製したリポ
ソームのCRP検量線を付加した。このSPDP法リポソーム
での使用補体価は3CH50である。このSPDP法リポソーム
に比較してもNaBH4還元リポソームは高いマーカーリリ
ースを示した。
溶液（0.2〜100ng/ml）25μと前記リポソーム溶液25
μを分注し、37℃で１時間反応させた。引き続き２次
抗体と補体をそれぞれ25μずつ添加し、更に37℃で１
時間反応させた。補体反応を停止させるために10mM EDT
A含有ベロナール緩衝液100μを添加した。蛍光測定及
び相対蛍光強度の計算は実施例２に従って行った。その
結果を第２図に示した。第２図よりNaBH4で還元処理を
したリポソームでは、非還元処理リポソームに比較して
高い補体価を用いて測定できるために高いマーカーリリ
ースが得られた。また対照としてSPDP法で調製したリポ
ソームのCRP検量線を付加した。このSPDP法リポソーム
での使用補体価は3CH50である。このSPDP法リポソーム
に比較してもNaBH4還元リポソームは高いマーカーリリ
ースを示した。
実施例４ ヒト血清中のCRP抗原の測定： ヒト血清をGVB で２倍に希釈し、56℃で30分間非働
化した後、血清中のCRP抗原濃度が約１〜10ng/mlとなる
ように血清をGVB で希釈した。次いで実施例３で行っ
た測定方法に従い検体の相対蛍光強度を求め、その相対
蛍光強度に対応するCRP抗原の濃度を、実施例３で作製
した検量線から求めた。またSRIDによるヒト血清中CRP
抗原の測定は、Ｎ−イムノCRP「ニッスイ」のプレート
を用いて行った。
化した後、血清中のCRP抗原濃度が約１〜10ng/mlとなる
ように血清をGVB で希釈した。次いで実施例３で行っ
た測定方法に従い検体の相対蛍光強度を求め、その相対
蛍光強度に対応するCRP抗原の濃度を、実施例３で作製
した検量線から求めた。またSRIDによるヒト血清中CRP
抗原の測定は、Ｎ−イムノCRP「ニッスイ」のプレート
を用いて行った。
その結果を第３図に示した。第３図より、本発明試薬
を用いる方法、（LILA）とSRIDの相関では、LILAの検体
希釈倍数（100倍〜50000倍）を考る一次回帰式はＹ＝−
0.25＋1.33Xであり相関係数はｒ＝0.9756であった。
を用いる方法、（LILA）とSRIDの相関では、LILAの検体
希釈倍数（100倍〜50000倍）を考る一次回帰式はＹ＝−
0.25＋1.33Xであり相関係数はｒ＝0.9756であった。
第１図は、本発明のNaBH4還元リポソームと非還元リポ
ソームの補体に対する非特異的マーカーリリースの比較
を示す。第２図はNaBH4還元リポソームを用いてCRP抗原
を測定する際の検量線である。第３図はヒト血清中のCR
P抗原の測定におけるSRIDとLILAの相関図である。
ソームの補体に対する非特異的マーカーリリースの比較
を示す。第２図はNaBH4還元リポソームを用いてCRP抗原
を測定する際の検量線である。第３図はヒト血清中のCR
P抗原の測定におけるSRIDとLILAの相関図である。
Claims (1)
- 【請求項１】リン脂質、ハプテン化リン脂質及びコレス
テロールを主要構成成分とするリポソームの表面に抗体
又は抗原を固定し、かつ該表面のハプテン基を還元して
不活性化し、更にリポソーム内に親水性標識物質を封入
したことを特徴とする免疫分析用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20978889A JP2707334B2 (ja) | 1989-08-14 | 1989-08-14 | 免疫分析用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20978889A JP2707334B2 (ja) | 1989-08-14 | 1989-08-14 | 免疫分析用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0373855A JPH0373855A (ja) | 1991-03-28 |
| JP2707334B2 true JP2707334B2 (ja) | 1998-01-28 |
Family
ID=16578607
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20978889A Expired - Lifetime JP2707334B2 (ja) | 1989-08-14 | 1989-08-14 | 免疫分析用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2707334B2 (ja) |
-
1989
- 1989-08-14 JP JP20978889A patent/JP2707334B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0373855A (ja) | 1991-03-28 |
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