JPS61250560A - 免疫分析方法 - Google Patents
免疫分析方法Info
- Publication number
- JPS61250560A JPS61250560A JP9094085A JP9094085A JPS61250560A JP S61250560 A JPS61250560 A JP S61250560A JP 9094085 A JP9094085 A JP 9094085A JP 9094085 A JP9094085 A JP 9094085A JP S61250560 A JPS61250560 A JP S61250560A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- substance
- complement
- immunized animal
- liposome
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の技術分野〕
本発明は、試料中に存在する特定の抗原又は抗体を定量
分析するための免疫分析方法に関する。
分析するための免疫分析方法に関する。
近年ガンに関する研究が進展してくるにつれて各種の腫
瘍マーカーが見出されるようになった。
瘍マーカーが見出されるようになった。
例えばα−フェトプロティン（ＡＦＰ）、ガン胎児性抗
原ＣＣＥＡ） 、塩基性フェトプロティン（ＢＦＰ）お
よび膵ガン胎児性抗原（ＰＯＡ）などがその代表例とし
て挙げることができる。これらの腫瘍マーカーの濃度は
正常人の場合、非常に低い（例えばＣＥＡの場合：数ｎ
ｇ／ｍｌ以下）。一方、腫瘍患者の場合には正常人の１
０倍程度以上の値を示すことが多い。
原ＣＣＥＡ） 、塩基性フェトプロティン（ＢＦＰ）お
よび膵ガン胎児性抗原（ＰＯＡ）などがその代表例とし
て挙げることができる。これらの腫瘍マーカーの濃度は
正常人の場合、非常に低い（例えばＣＥＡの場合：数ｎ
ｇ／ｍｌ以下）。一方、腫瘍患者の場合には正常人の１
０倍程度以上の値を示すことが多い。
いずれにしても、腫瘍マーカーの分析定量には。
非常に高い検出感度が要求される。
この要求を満すために、従来は、放射性物質で標識化し
た抗原または抗体を用いる放射線免疫分析法（ＲＩＡ）
が開発された。しかしながら、ＲＩＡは取扱いが面倒で
廃棄処理も問題になる。そこで、放射性物質の代りに酵
素や螢光物質など種々の物質で標識化した抗原あるいは
抗体を使用する免疫分析法が提案されたが、これらにお
いても遊離抗体と結合抗体を何らかの方法で分離しなけ
ればならないという欠点を有していた。またｓ Ｒｏｓ
ｅｎｔｈａｌんＦ、Ｖａｒｇａｓ 、Ｍ、Ｇ、 ａｎｄ
Ｋｌａｓｓ Ｃ，Ｓ、 （１９７６） Ｃｌ１ｎ。
た抗原または抗体を用いる放射線免疫分析法（ＲＩＡ）
が開発された。しかしながら、ＲＩＡは取扱いが面倒で
廃棄処理も問題になる。そこで、放射性物質の代りに酵
素や螢光物質など種々の物質で標識化した抗原あるいは
抗体を使用する免疫分析法が提案されたが、これらにお
いても遊離抗体と結合抗体を何らかの方法で分離しなけ
ればならないという欠点を有していた。またｓ Ｒｏｓ
ｅｎｔｈａｌんＦ、Ｖａｒｇａｓ 、Ｍ、Ｇ、 ａｎｄ
Ｋｌａｓｓ Ｃ，Ｓ、 （１９７６） Ｃｌ１ｎ。
Ｃｈｅｍ、 ２２．１８９９に発表されたＥＭＩＴ法は
、分離工程の不要な均一系で測定できる画期的な手法で
あるが、原理的に高分子量のタンパク質抗原あるいは抗
体には適用できな−。
、分離工程の不要な均一系で測定できる画期的な手法で
あるが、原理的に高分子量のタンパク質抗原あるいは抗
体には適用できな−。
ところで、Ｈａｘｂｙ、Ｊ、Ａ、Ｋ１ｎ５ｋｙ、Ｃ，Ｂ
、 ａｎｄ Ｋ１ｎ５ｋｙＳ、 Ｃ，（１９６８）Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｆｆ、 ６！３００で、脂溶性の抗原
を膜内に取り込みグルコースを封入したリポソームを調
製し、抗原抗体反応によるリポソームの破壊に伴うグル
コースの流出量を測定することにより、抗体の定量を行
う手法が発表された。
、 ａｎｄ Ｋ１ｎ５ｋｙＳ、 Ｃ，（１９６８）Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｆｆ、 ６！３００で、脂溶性の抗原
を膜内に取り込みグルコースを封入したリポソームを調
製し、抗原抗体反応によるリポソームの破壊に伴うグル
コースの流出量を測定することにより、抗体の定量を行
う手法が発表された。
しかしながら、この手法では腫瘍マーカーを測定するた
めに、マーカー自身あるいはこれらのマーカーに対する
抗体、すなわちタンパク質である免疫グロブリンをリポ
ソーム上に担持させねばならない。
めに、マーカー自身あるいはこれらのマーカーに対する
抗体、すなわちタンパク質である免疫グロブリンをリポ
ソーム上に担持させねばならない。
また特開昭５６−１３２５６４ ＠免疫分析用生成物お
よび方法”においては、抗原あるいは抗体を担持し内部
に酵素を封入したリポソームを用いて免疫分析を行う方
法が開示されているが、そこでは、タンパク質の担持方
法としてグルタルアルデヒド等の二官能性架橋試薬を用
いる方法を提案している。本発明者らの研究によると、
このような架橋体の活性が低下し、抗原進体反応に仔ワ
リボンームの破壊が引起されなくなることが判明した。
よび方法”においては、抗原あるいは抗体を担持し内部
に酵素を封入したリポソームを用いて免疫分析を行う方
法が開示されているが、そこでは、タンパク質の担持方
法としてグルタルアルデヒド等の二官能性架橋試薬を用
いる方法を提案している。本発明者らの研究によると、
このような架橋体の活性が低下し、抗原進体反応に仔ワ
リボンームの破壊が引起されなくなることが判明した。
さらには、上述した方法等においてはリポソームの破壊
によって流出してくるグルコースや酵素の濃度を比色法
などで測定しなくては、抗原又は抗体の測定ができず反
応の系が複雑になってしまい、自動化には不向であった
。そこで本発明者らは、たとえば先に出願した（特願昭
５８−２２４５０９）ように上述した方法にかえてリポ
ソーム上に親水性の抗原または抗体を固定化し、内部に
カルボキシフルオレセイン等の標識物質を封入したリポ
ソーム試薬による測定を試みている。しかしながら、こ
のような分析方法では個々の被検物質に対応してそれぞ
れ異なりたりリポソーム試薬を用意しな停 ければならず煩雑さが典なうために、多種類の被検物質
に共通して用いることができるリポソーム試薬が望まれ
ていた。
によって流出してくるグルコースや酵素の濃度を比色法
などで測定しなくては、抗原又は抗体の測定ができず反
応の系が複雑になってしまい、自動化には不向であった
。そこで本発明者らは、たとえば先に出願した（特願昭
５８−２２４５０９）ように上述した方法にかえてリポ
ソーム上に親水性の抗原または抗体を固定化し、内部に
カルボキシフルオレセイン等の標識物質を封入したリポ
ソーム試薬による測定を試みている。しかしながら、こ
のような分析方法では個々の被検物質に対応してそれぞ
れ異なりたりリポソーム試薬を用意しな停 ければならず煩雑さが典なうために、多種類の被検物質
に共通して用いることができるリポソーム試薬が望まれ
ていた。
本発明は、上記の問題点に対してなされたものであり、
試料中に含まれた微量な被検物質を迅逮、簡便、高精度
に分析できる汎用性を有するリポノ−ム試薬を用いた免
疫分析方法を提供することを目的とする。
試料中に含まれた微量な被検物質を迅逮、簡便、高精度
に分析できる汎用性を有するリポノ−ム試薬を用いた免
疫分析方法を提供することを目的とする。
本発明の免疫分析用試薬におけるリポソームは、リン脂
質及び糖脂質の少なくとも一方とコレステロールとから
構成される。これらの構成比としてはリン脂質及び糖脂
質に対してコレステロールが１０〜５００モルチ含まれ
ることが安定なリポソームを得る上で好ましい。そして
リン脂質中の脂肪酸残基は、炭素原子数が１２〜１８で
あることが好ましく、更には偶数であることがより好ま
しい。
質及び糖脂質の少なくとも一方とコレステロールとから
構成される。これらの構成比としてはリン脂質及び糖脂
質に対してコレステロールが１０〜５００モルチ含まれ
ることが安定なリポソームを得る上で好ましい。そして
リン脂質中の脂肪酸残基は、炭素原子数が１２〜１８で
あることが好ましく、更には偶数であることがより好ま
しい。
またリポソーム内に封入される標識物質は、親水性であ
って、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質で
なければならない。かかる物質としては、例えば、高濃
度では自己消光により螢光は示さないが、低濃度（１０
Ｍ以下）で非常に強い螢光を発するカルボキシフルオレ
セインのような螢光性化合物；リポソーム外で酸化反応
により発光するルミノールやルシフェリンのような発光
性化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を有
する吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の作用に
より分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成をもたら
すグルコース及びシェークロースなどの糖類；テトラペ
ンチルアンモニウムのような比較的大きなイオン性化合
物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）
のような補酵素類；メチルビオロゲンを初めとするラジ
カル化合物などが望ましい。これらの化合物は、検出方
法、感度及びリポソームの安定性等の因子を勘案した上
で、適宜に選択される。
って、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質で
なければならない。かかる物質としては、例えば、高濃
度では自己消光により螢光は示さないが、低濃度（１０
Ｍ以下）で非常に強い螢光を発するカルボキシフルオレ
セインのような螢光性化合物；リポソーム外で酸化反応
により発光するルミノールやルシフェリンのような発光
性化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を有
する吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の作用に
より分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成をもたら
すグルコース及びシェークロースなどの糖類；テトラペ
ンチルアンモニウムのような比較的大きなイオン性化合
物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）
のような補酵素類；メチルビオロゲンを初めとするラジ
カル化合物などが望ましい。これらの化合物は、検出方
法、感度及びリポソームの安定性等の因子を勘案した上
で、適宜に選択される。
さらに、このような構成を有するリポソームに固定化さ
れる抗体は例えば以下のようにして作られる。すなわち
、まず被検物質を抗原として第１の免疫動物例えばヤギ
を用いて抗体を得る。この抗体を酵素処理により補体結
合部位を除去して部分化して、ｌ／ｃｘの抗体とする。
れる抗体は例えば以下のようにして作られる。すなわち
、まず被検物質を抗原として第１の免疫動物例えばヤギ
を用いて抗体を得る。この抗体を酵素処理により補体結
合部位を除去して部分化して、ｌ／ｃｘの抗体とする。
この第１の抗体は本発明の免疫分析方法においてリポソ
ーム試薬と同様にして試料中に混入される。そしてこの
第１の免疫動物の免疫グロブリンを抗原として、第１の
免疫動物とは異なる第２の免疫動物を用いて得られた抗
体を、やはり酵素処理により補体結合部位を除去して部
分化することにより第２の抗体を得る。この第２の抗体
を架橋剤を用いて標識物質を封入したリポソームに固定
化し、リポソーム試薬とする。一方、被検物質を抗原と
して第２の免疫動物によって得られた抗体を第３の抗体
とする。
ーム試薬と同様にして試料中に混入される。そしてこの
第１の免疫動物の免疫グロブリンを抗原として、第１の
免疫動物とは異なる第２の免疫動物を用いて得られた抗
体を、やはり酵素処理により補体結合部位を除去して部
分化することにより第２の抗体を得る。この第２の抗体
を架橋剤を用いて標識物質を封入したリポソームに固定
化し、リポソーム試薬とする。一方、被検物質を抗原と
して第２の免疫動物によって得られた抗体を第３の抗体
とする。
この第３の抗体も補体結合部位を有したまま第１の抗体
と共に試料中に混入される。すなわち本発明に係る免疫
分析方法に用いるリポソーム試薬には、被検物質に直接
対応する抗体が固定されているのではなく、他の免疫動
物の免疫グロブリンに対する抗体が酵素処理によりその
補体結合部位が除去されて固定化されるのでふる。これ
よりリポソーム試薬に汎用性が付与される。なぜならば
、リポソーム試薬には、同じ免疫動物による多種の抗体
と共通部分を有する免疫グロブリンを抗原とした抗体を
部分化した第２の抗体が固定化されているからであり、
被検物質を識別するのはその被検物質を抗原とした第１
の抗体及び第３の抗体だからである。よって、対象とな
る被検物質が異なる場合には、リポソーム試薬はそのま
まで、リポソーム試薬の調製に用いたのと同種の第１及
び第２の免疫動物による第１及び第３の抗体を調製すれ
ばよい。この第１の抗体を生み出した第１の免疫動物の
免疫グロブリンに対する抗体を部分化してなる第２の抗
体を固定化したリポソーム試薬と第１の抗体とは免疫動
物（第１の免疫動物）を共通にして結びつく。しかしな
がら第１の抗体及び第２の抗体は共に補体結合部位を有
していないので、このままでは補体は作用せず、その結
果リポソーム試薬が破壊されることはない。そしてさら
にリポソーム試薬に固定化された第２の抗体を生み出し
た免疫動物（第２の免疫動物）を共通にして被検物質を
抗原とした第３の抗体が、被検物質をはさんで第１抗体
及び第２抗体と結びつき、混入された補体と共にリポソ
ーム試薬に作用することにより、リポソーム試薬が破壊
されて標識物質が遊出される。この補体が働くのは第３
の抗体には補体結合部位が残されているからである。
と共に試料中に混入される。すなわち本発明に係る免疫
分析方法に用いるリポソーム試薬には、被検物質に直接
対応する抗体が固定されているのではなく、他の免疫動
物の免疫グロブリンに対する抗体が酵素処理によりその
補体結合部位が除去されて固定化されるのでふる。これ
よりリポソーム試薬に汎用性が付与される。なぜならば
、リポソーム試薬には、同じ免疫動物による多種の抗体
と共通部分を有する免疫グロブリンを抗原とした抗体を
部分化した第２の抗体が固定化されているからであり、
被検物質を識別するのはその被検物質を抗原とした第１
の抗体及び第３の抗体だからである。よって、対象とな
る被検物質が異なる場合には、リポソーム試薬はそのま
まで、リポソーム試薬の調製に用いたのと同種の第１及
び第２の免疫動物による第１及び第３の抗体を調製すれ
ばよい。この第１の抗体を生み出した第１の免疫動物の
免疫グロブリンに対する抗体を部分化してなる第２の抗
体を固定化したリポソーム試薬と第１の抗体とは免疫動
物（第１の免疫動物）を共通にして結びつく。しかしな
がら第１の抗体及び第２の抗体は共に補体結合部位を有
していないので、このままでは補体は作用せず、その結
果リポソーム試薬が破壊されることはない。そしてさら
にリポソーム試薬に固定化された第２の抗体を生み出し
た免疫動物（第２の免疫動物）を共通にして被検物質を
抗原とした第３の抗体が、被検物質をはさんで第１抗体
及び第２抗体と結びつき、混入された補体と共にリポソ
ーム試薬に作用することにより、リポソーム試薬が破壊
されて標識物質が遊出される。この補体が働くのは第３
の抗体には補体結合部位が残されているからである。
なお、本発明の免疫分析方法に用いるリボソーム試薬は
、そこに固定化される第２の抗体が、あらかじめ補体結
合部位が除去されているために、より長期間の保存にも
たえられる安定性を有している。
、そこに固定化される第２の抗体が、あらかじめ補体結
合部位が除去されているために、より長期間の保存にも
たえられる安定性を有している。
この第２の抗体をリポソームに固定化するには以下のよ
うな方法を用いる。まず、所望の脂質と架橋剤とを溶媒
中で反応せしめ、リポソーム上に固定化される第２の抗
体と結合し得る官能基を脂質分子に導入する。次いで、
得られた官能性脂質とコレステロール及び必要であれば
他の脂質の適当量をフラスコに入れ％溶媒を加えて溶解
・混合させた後、溶媒を留去し、吸引乾燥する。しかる
後、壁面に薄膜が形成されたフラスコ内に所定の標識物
質の水溶液を加え、密栓をして振とうし、リポソームの
懸濁液を得る。
うな方法を用いる。まず、所望の脂質と架橋剤とを溶媒
中で反応せしめ、リポソーム上に固定化される第２の抗
体と結合し得る官能基を脂質分子に導入する。次いで、
得られた官能性脂質とコレステロール及び必要であれば
他の脂質の適当量をフラスコに入れ％溶媒を加えて溶解
・混合させた後、溶媒を留去し、吸引乾燥する。しかる
後、壁面に薄膜が形成されたフラスコ内に所定の標識物
質の水溶液を加え、密栓をして振とうし、リポソームの
懸濁液を得る。
一方、リポソームに固定化される第２の抗体は。
必要ならば架橋剤により架橋基を導入した後、還元剤（
例えばジチオトレイトール； ＤＴＴ ）で処理して修
飾する。これら、リボンーム懸濁液と第２の抗体とを適
当な緩衝液中で反応せしめることにより、本発明に用い
られる免疫分析用のリポソーム試薬が得られる。
例えばジチオトレイトール； ＤＴＴ ）で処理して修
飾する。これら、リボンーム懸濁液と第２の抗体とを適
当な緩衝液中で反応せしめることにより、本発明に用い
られる免疫分析用のリポソーム試薬が得られる。
上記製造法における架橋剤としては、例えば、Ｎ−サク
シンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト（ＳＰＤＰ）、Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレ
イミドフェニル）プチレー） （ＳＭＰＨ）Ｎ−サクシ
ンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）アセテート
（ＳＭＰＡ）％Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイ
ミドフェニル）プロピオネート（ＳＭＰＰ） 、 Ｎ
−（γ−マレイミドブチリルオキシ）サクシンイミド（
ＧＭＢＳ） 、Ｎ −（ｅ−マレイミドカプグロイルオ
キシ）サクシンイミド（ＥＭＣ８）及びジサクシンイミ
ジルスペレート（ＤＳＳ）が挙げられる。
シンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト（ＳＰＤＰ）、Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレ
イミドフェニル）プチレー） （ＳＭＰＨ）Ｎ−サクシ
ンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）アセテート
（ＳＭＰＡ）％Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイ
ミドフェニル）プロピオネート（ＳＭＰＰ） 、 Ｎ
−（γ−マレイミドブチリルオキシ）サクシンイミド（
ＧＭＢＳ） 、Ｎ −（ｅ−マレイミドカプグロイルオ
キシ）サクシンイミド（ＥＭＣ８）及びジサクシンイミ
ジルスペレート（ＤＳＳ）が挙げられる。
例えば、ＳＰ、ＤＰは、次式：
で示され、−温和な条件下で反応して、第一アミノ基を
有する化合物どうしを結合する架橋剤である。
有する化合物どうしを結合する架橋剤である。
ファルマシア社から市販されている。該架橋剤は、例え
ば、タンパク質抗原を５ＰＤＰで処理し、ジチオトレイ
トール（ＤＴＴ）で還元した後、予め５ＰＤＰを作用さ
せたリポソームと反応させると、室温以下、数時間から
１日でリポソーム上に第２の抗体を固定化することがで
きる。
ば、タンパク質抗原を５ＰＤＰで処理し、ジチオトレイ
トール（ＤＴＴ）で還元した後、予め５ＰＤＰを作用さ
せたリポソームと反応させると、室温以下、数時間から
１日でリポソーム上に第２の抗体を固定化することがで
きる。
ＳＭＰＨは１次式：
で示され、 ５ＰＤＰと同様な反応で抵体を固定化でき
るが、最終生成・物中に−５−８−結合を含ます（−８
−結合のみａ１血清などの還元的雰囲気下でも安定であ
る。
るが、最終生成・物中に−５−８−結合を含ます（−８
−結合のみａ１血清などの還元的雰囲気下でも安定であ
る。
一方、定量操作に用いる補体は格別限定されないが、通
常補体価の高いモルモット血清が用いられる。しかし、
ウサギ、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。
常補体価の高いモルモット血清が用いられる。しかし、
ウサギ、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。
本発明に用いられる抗体の動物種は特に限定されないが
、第２の免疫動物としては、補体を取り込み易いウサギ
がよシ好ましい。
、第２の免疫動物としては、補体を取り込み易いウサギ
がよシ好ましい。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
り。
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
り。
実施例１
ウサギ抗−ヤギＩｇＧ （Ｆａｂ’特異的）抗体（第２
の抗体）を固定化したリポソーム試薬（ＲＡＧ Ｉ Ｆ
−リポソーム試薬〕を用いるヒトＩｇＧの測定囚用いた
試薬及びリポソームの調製 （１）試薬 ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コ
レステロール、ジパルミトイルホスファチジルエタノー
ルアミン（ＤＰＰＥ ）およびジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ）はシグマ社製のものを用いた。Ｎ−サクシンイミ
ジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート （Ｓ
ＰＤＰ）および５ａｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ｆｉｎｅ及
び５ｅｐｈａｄｅｘＧ−１５０ｆｉｎｅはファルマシア
社より購入した。他の試薬は市販品（特級）を精製せず
に使用した。なお、水は全てイオン交換水を用いた。
の抗体）を固定化したリポソーム試薬（ＲＡＧ Ｉ Ｆ
−リポソーム試薬〕を用いるヒトＩｇＧの測定囚用いた
試薬及びリポソームの調製 （１）試薬 ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コ
レステロール、ジパルミトイルホスファチジルエタノー
ルアミン（ＤＰＰＥ ）およびジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ）はシグマ社製のものを用いた。Ｎ−サクシンイミ
ジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート （Ｓ
ＰＤＰ）および５ａｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ｆｉｎｅ及
び５ｅｐｈａｄｅｘＧ−１５０ｆｉｎｅはファルマシア
社より購入した。他の試薬は市販品（特級）を精製せず
に使用した。なお、水は全てイオン交換水を用いた。
（２）リポソームの調製
ａ）ジチオピリジル−ＤＰＰＥ （ＤＴＰ−ＤＰＰＥ
）の調製密栓付三角フラスコに７０ ｍｇ ＯＤＰＰＩ
を分取し、２５ｍＡ’のクロロホルム／メタノール（５
：ｌ）溶液に溶解シ％ ６０μｌのトリエタノールアミ
ン及び５０ｍｇの５ＰＤＰを添加窒素置換した。室温で
１時間反応させた後、ロータリーエバポレーターで溶媒
を除去した。乾燥物を５ｍｌのクロロホルムダメ−２０
℃で行りた。
）の調製密栓付三角フラスコに７０ ｍｇ ＯＤＰＰＩ
を分取し、２５ｍＡ’のクロロホルム／メタノール（５
：ｌ）溶液に溶解シ％ ６０μｌのトリエタノールアミ
ン及び５０ｍｇの５ＰＤＰを添加窒素置換した。室温で
１時間反応させた後、ロータリーエバポレーターで溶媒
を除去した。乾燥物を５ｍｌのクロロホルムダメ−２０
℃で行りた。
ｂ）リポソームの調製
使用する脂質はすべてクロロホルムまたはクロロホルム
／メタノール（２／１ ）に溶解した。まず、５ｍＭＤ
ＰＰＣ（２００μｌ）、１０ｍＭ コレステ四−ル（１
００μｌ）及び１ｍＭＤＴＰ−ＤＰＰＥ（５０ａｔ）を
１０ｍｌのナシ型フラスコに入れ、更に２ｍｌのり四ロ
ホルムを加えて良く混合した。水浴中（約５０℃）でロ
ータリーエバポレーターにより溶媒を除去した。再び２
ｍｌのクロロホルムを添加し、十分攪拌後再度ロータリ
ーエバポレーターにより溶媒を蒸発させた。この操作を
数回繰り返すと、フラスコ壁面に薄膜が形成された。フ
ラスコをデシケータ−中に移し真空ポンプで約１時間吸
引し、溶媒を完全に除去した。次に、１００μノの０．
２Ｍカルボキシフルオレセイン（ＣＦ：イーストマン・
コダック社製、ｐＨ７，４）を添加し、フラスコ内部を
窒素で置換した後に密栓して％ ６０℃程度の水浴中に
約１分間浸漬した。続いて、 Ｖｏｒｔｅｘ ミキサー
を用い、壁面の脂質薄膜が完全に消失するまでフラスコ
を激しく振とうした。この操作により、リポソーム懸濁
液が調製された。ゼラチン−ペロナール緩衝液以下、Ｇ
■−と略記）を少量添加し、リポソームを完全に遠心チ
ェープに移した。４℃。
／メタノール（２／１ ）に溶解した。まず、５ｍＭＤ
ＰＰＣ（２００μｌ）、１０ｍＭ コレステ四−ル（１
００μｌ）及び１ｍＭＤＴＰ−ＤＰＰＥ（５０ａｔ）を
１０ｍｌのナシ型フラスコに入れ、更に２ｍｌのり四ロ
ホルムを加えて良く混合した。水浴中（約５０℃）でロ
ータリーエバポレーターにより溶媒を除去した。再び２
ｍｌのクロロホルムを添加し、十分攪拌後再度ロータリ
ーエバポレーターにより溶媒を蒸発させた。この操作を
数回繰り返すと、フラスコ壁面に薄膜が形成された。フ
ラスコをデシケータ−中に移し真空ポンプで約１時間吸
引し、溶媒を完全に除去した。次に、１００μノの０．
２Ｍカルボキシフルオレセイン（ＣＦ：イーストマン・
コダック社製、ｐＨ７，４）を添加し、フラスコ内部を
窒素で置換した後に密栓して％ ６０℃程度の水浴中に
約１分間浸漬した。続いて、 Ｖｏｒｔｅｘ ミキサー
を用い、壁面の脂質薄膜が完全に消失するまでフラスコ
を激しく振とうした。この操作により、リポソーム懸濁
液が調製された。ゼラチン−ペロナール緩衝液以下、Ｇ
■−と略記）を少量添加し、リポソームを完全に遠心チ
ェープに移した。４℃。
１５．００ Ｏｒｐｍで２０分間遠心し、遊離のＣＦを
除去した。上清が透明になるまでＧ１−を用いてこの操
作を繰り返した。最後に２ｍｌのＣ１−及び５μｊの１
０チＮａＮ３を加え、Ｖｏｒｔｅｘミキサーで懸濁させ
、窒素封入後、冷蔵庫に保存した。
除去した。上清が透明になるまでＧ１−を用いてこの操
作を繰り返した。最後に２ｍｌのＣ１−及び５μｊの１
０チＮａＮ３を加え、Ｖｏｒｔｅｘミキサーで懸濁させ
、窒素封入後、冷蔵庫に保存した。
Ｃ）ウサギ抗−ヤギＩｇＧ （Ｆ（ａｂ’）ｚ特異的）
抗体（ＲＡＧＩ）のＦ（ａｂ勺２化 ＲＡＧＩは、カッベル社より購入し、例えば免疫実験操
作法（１９７４）の第１１６６頁に示された常法に従い
ペプシンで補体結合部位を除去した。その後、 ５ａｐ
ｈａｄｅｘＧ−１５０のカラムでゲｋｃ１過後、濃縮し
てＲＡＧＩのＦ（ａｂ’）２画分を得た（約２ ｍｇ７
ｍｌ ）。
抗体（ＲＡＧＩ）のＦ（ａｂ勺２化 ＲＡＧＩは、カッベル社より購入し、例えば免疫実験操
作法（１９７４）の第１１６６頁に示された常法に従い
ペプシンで補体結合部位を除去した。その後、 ５ａｐ
ｈａｄｅｘＧ−１５０のカラムでゲｋｃ１過後、濃縮し
てＲＡＧＩのＦ（ａｂ’）２画分を得た（約２ ｍｇ７
ｍｌ ）。
ｄ） ＲＡＧＩＦ−リポソーム試薬の調製上記ＲＡＧＩ
のＦ（ａｂ’）ｚ（２ｒｎＡりに１０ｍｇの２−メルカ
プトエチルアミンを加え、窒素雰囲気下で３７℃９０分
間反応させた。反応後ｓ ５ｅｐｈａｄｅｘＧ−２５ｆ
ｉｎｅカラムを用いて、０．０ＩＭＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ
７，４５）で溶出させることにより部分化された第２の
抗体Ｆａｂ’を得た。これを前記リポソーム懸濁液４合
し、１晩室温で振とうすることによりＲＡＧＩＦ−リポ
ソーム試薬を調製した。
のＦ（ａｂ’）ｚ（２ｒｎＡりに１０ｍｇの２−メルカ
プトエチルアミンを加え、窒素雰囲気下で３７℃９０分
間反応させた。反応後ｓ ５ｅｐｈａｄｅｘＧ−２５ｆ
ｉｎｅカラムを用いて、０．０ＩＭＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ
７，４５）で溶出させることにより部分化された第２の
抗体Ｆａｂ’を得た。これを前記リポソーム懸濁液４合
し、１晩室温で振とうすることによりＲＡＧＩＦ−リポ
ソーム試薬を調製した。
（３）ＲＡＧＩＦ−リポソーム試薬を用いるヒトＩｇＧ
の測定 ヌンク社製のＵ塁マイクロタイタープレート（９６穴）
に、適当量のＧＶＢ＋（０，１ｍＭ ＭｇＣ１２及び０
．０３ｍＭＣａＣＡ２を含有しているＧ■−）で希釈し
たヒトＩｇＧを２５μｌずつ注入した。次いで、ヤギ抗
−ヒ） ＩｇＧ抗体を上記Ｃ）と同様にＦ（ａｂ勺２化
したもの（約２０μｇ／μｌ）を２５μ・ｌずつ添加し
、３７℃で３０分間放置した。次に、上記リポソーム試
薬をＧＶＢ＋で１００倍に希釈したものを５μｊずつ加
え、再び３７℃で３０分間インキエペートした。
の測定 ヌンク社製のＵ塁マイクロタイタープレート（９６穴）
に、適当量のＧＶＢ＋（０，１ｍＭ ＭｇＣ１２及び０
．０３ｍＭＣａＣＡ２を含有しているＧ■−）で希釈し
たヒトＩｇＧを２５μｌずつ注入した。次いで、ヤギ抗
−ヒ） ＩｇＧ抗体を上記Ｃ）と同様にＦ（ａｂ勺２化
したもの（約２０μｇ／μｌ）を２５μ・ｌずつ添加し
、３７℃で３０分間放置した。次に、上記リポソーム試
薬をＧＶＢ＋で１００倍に希釈したものを５μｊずつ加
え、再び３７℃で３０分間インキエペートした。
さらに、ウサギ抗−ヒトＩｇＧ抗体（Ｍｉｌｅｓ社製）
を１００倍にα♂で希釈したものと３ ＣＨ３０のモル
モット補体をそれぞれ２５μｌずつ添加し、３７°Ｃで
３０分間反応させた。
を１００倍にα♂で希釈したものと３ ＣＨ３０のモル
モット補体をそれぞれ２５μｌずつ添加し、３７°Ｃで
３０分間反応させた。
反応後、各ｗｅｌｌに１’ＯＯμＪの０．ＯＩＭ ＥＤ
ＴＡ−ペロナール緩衝液を加えて反応を停止し、プレー
ト用螢光分光度計（コロナ電気社製、 ＭＴＰ−１２Ｆ
）で各ｗｅｌｌの螢光を測定した（ Ｅｘ： ４９０ｎ
ｍ、Ｅｍ： ５２０ｎｍ）。なお、測定値は、抗体及び
補体の代わりに１０ ％ Ｔｒｉ ｔｏｎＸ−１００及
びＧ１−を２５ｔｔｌ及び５０μ！添加したｖｒｅ １
１の螢光と、ヒ）ＩｇＧＯ代わりに２５μｊのＧＶＢ＋
を添加したものの差を１００％とした相対値で表示した
。第１図に結果を示す。図からｂｌｙ為るようにおよそ
１０−６乃至１０−’ｇ／ｍＡ！ 範囲でヒ） −Ｉｇ
Ｇの定量が行なえることが確認できた。
ＴＡ−ペロナール緩衝液を加えて反応を停止し、プレー
ト用螢光分光度計（コロナ電気社製、 ＭＴＰ−１２Ｆ
）で各ｗｅｌｌの螢光を測定した（ Ｅｘ： ４９０ｎ
ｍ、Ｅｍ： ５２０ｎｍ）。なお、測定値は、抗体及び
補体の代わりに１０ ％ Ｔｒｉ ｔｏｎＸ−１００及
びＧ１−を２５ｔｔｌ及び５０μ！添加したｖｒｅ １
１の螢光と、ヒ）ＩｇＧＯ代わりに２５μｊのＧＶＢ＋
を添加したものの差を１００％とした相対値で表示した
。第１図に結果を示す。図からｂｌｙ為るようにおよそ
１０−６乃至１０−’ｇ／ｍＡ！ 範囲でヒ） −Ｉｇ
Ｇの定量が行なえることが確認できた。
実施例２
ＲＡＧＩＦ−リポソーム試薬を用いるヒトＡＦＰの測定
ヤギ抗−ヒトＡＦＰ抗体ＣＴａｇｏ社製）を実施例１と
同様にしてＦ（ａｂ’）ｚ化して第１抗体とした（約２
ｍｇ／ｍｌ ） 、また第３の抗体としてウサギ抗−
ヒ） ＡＦＰ抗体を用いた。これら第１及び第３の抗体
と実施例１で用いたのと同じウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体を
部分化してなるＦａｂ’を固定化したリポソーム試薬（
ＲＡＧＩＦ −ＩＪボソーム試薬）を用いて、実施例１
と同様の操作でヒ） ＡＦＰ （日本バイオテスト社製
）の測定をした。その結果１Ｏ−４乃至１０” ｇ／ｍ
ｌの範囲で定量できることが確ｌ！！！された。
同様にしてＦ（ａｂ’）ｚ化して第１抗体とした（約２
ｍｇ／ｍｌ ） 、また第３の抗体としてウサギ抗−
ヒ） ＡＦＰ抗体を用いた。これら第１及び第３の抗体
と実施例１で用いたのと同じウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体を
部分化してなるＦａｂ’を固定化したリポソーム試薬（
ＲＡＧＩＦ −ＩＪボソーム試薬）を用いて、実施例１
と同様の操作でヒ） ＡＦＰ （日本バイオテスト社製
）の測定をした。その結果１Ｏ−４乃至１０” ｇ／ｍ
ｌの範囲で定量できることが確ｌ！！！された。
実施例３
ＲＡＧＩＦ−リポソーム試薬を用いるヒト鳴の測定
ヤギ抗−ヒトＣＥＡ抗体ＣＭＢＬ社製）を実施例１と同
様にしてＦ（ａｂ’ ） ２化して第１の抗体とした（
約０．５ ｍｇ／ｍｌ ）実施例１と同様の操作でシ■
ＩＦ −リポソーム試薬を用いてヒトＣＥＡＣＤａｋｏ
社製）を測定した。なお、第１の抗体であるヤギ抗−ヒ
トＣＩＡ抗体（Ｆ（ａｂ’）２）及び第３抗体であるウ
サギ抗体−ヒトＣＥＡ抗体ＣＤａＫｏ社製）はそれぞれ
１０倍希釈のものを使用した。その結果１０−４乃至１
０−’ｇ／ｍＡ’の範囲でヒ） ＣＥＡが測定できるこ
とが確認された。
様にしてＦ（ａｂ’ ） ２化して第１の抗体とした（
約０．５ ｍｇ／ｍｌ ）実施例１と同様の操作でシ■
ＩＦ −リポソーム試薬を用いてヒトＣＥＡＣＤａｋｏ
社製）を測定した。なお、第１の抗体であるヤギ抗−ヒ
トＣＩＡ抗体（Ｆ（ａｂ’）２）及び第３抗体であるウ
サギ抗体−ヒトＣＥＡ抗体ＣＤａＫｏ社製）はそれぞれ
１０倍希釈のものを使用した。その結果１０−４乃至１
０−’ｇ／ｍＡ’の範囲でヒ） ＣＥＡが測定できるこ
とが確認された。
実施例４
ウサギ抗−ヤギＩｇＧ（Ｆ（ａｂ’ ） ２特異的）抗
体（第２の抗体）を固定化したリポソーム試薬（ＲＡＧ
Ｉ−リポソーム試薬〕を用いるヒ）ＩｇＧの測定（１）
ＲＡＧＩ−リポソームの調製 ２ｍｌ ＯＲＡＧＩに１０ｔｔｌの１０ ｍＭ ５ＰＤ
Ｐ （エタノール溶液）を加え、十分攪拌してそのまま
室温で３０分間反応させた。反応後、反応液を予め生理
食塩水で飽和させたセファデックスＧ−２５フアインの
ゲルを充填したカラム（ゲル体積：約１５ｍｌ ）に展
開し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５゜０．８５４
ＮａＣ１含有）で溶出させた。最初のタンパク質フラク
シ田ン（約２ｍＡりに更に２ｍ１ＩＱ酢酸緩衝液を加え
、窒素置換後、ジチオトレイトール（約３０ｍｇ）を添
加した。十分に攪拌して２０分間室温で反応させた。反
応後、予め０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液で飽和させた
セファデックスＧ−２５フアインのゲルを充填しである
カラム（ゲル体積：約３０ｍ１）に反応液を展開し、前
記ＨＥＰＥＳ緩衝液で溶出した。最初のタンパク質フラ
クシ曹ン（約２ｍｌ ）を集め、窒素置換後、使用する
まで冷蔵庫に保存した。
体（第２の抗体）を固定化したリポソーム試薬（ＲＡＧ
Ｉ−リポソーム試薬〕を用いるヒ）ＩｇＧの測定（１）
ＲＡＧＩ−リポソームの調製 ２ｍｌ ＯＲＡＧＩに１０ｔｔｌの１０ ｍＭ ５ＰＤ
Ｐ （エタノール溶液）を加え、十分攪拌してそのまま
室温で３０分間反応させた。反応後、反応液を予め生理
食塩水で飽和させたセファデックスＧ−２５フアインの
ゲルを充填したカラム（ゲル体積：約１５ｍｌ ）に展
開し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５゜０．８５４
ＮａＣ１含有）で溶出させた。最初のタンパク質フラク
シ田ン（約２ｍＡりに更に２ｍ１ＩＱ酢酸緩衝液を加え
、窒素置換後、ジチオトレイトール（約３０ｍｇ）を添
加した。十分に攪拌して２０分間室温で反応させた。反
応後、予め０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液で飽和させた
セファデックスＧ−２５フアインのゲルを充填しである
カラム（ゲル体積：約３０ｍ１）に反応液を展開し、前
記ＨＥＰＥＳ緩衝液で溶出した。最初のタンパク質フラ
クシ曹ン（約２ｍｌ ）を集め、窒素置換後、使用する
まで冷蔵庫に保存した。
実施例１で調製したリポソーム懸濁液（２ｍｌ）と第２
の抗体である上記修飾抗体とを混合し、室温で１晩反応
させ％ＨＥＰＥＳ緩衝液及びＧＶＢ″″で数回洗浄する
ことにより ＲＡＧＩ−リポソーム試薬を得た。
の抗体である上記修飾抗体とを混合し、室温で１晩反応
させ％ＨＥＰＥＳ緩衝液及びＧＶＢ″″で数回洗浄する
ことにより ＲＡＧＩ−リポソーム試薬を得た。
（２） ＲＡＧＩ−リポソーム試薬を用いると） Ｉｇ
Ｇの測定 実施例１と全く同様の操作でＲＡＧＩ−！Ｊボソーム試
薬を用いてヒ）ＩｇＧを測定した。結果を第２図に示す
０図かられかるように１０ 乃至１０ （ｇ／ｍｌ）
の範囲でヒトエｍｌの定量が行なえることが確認された
。
Ｇの測定 実施例１と全く同様の操作でＲＡＧＩ−！Ｊボソーム試
薬を用いてヒ）ＩｇＧを測定した。結果を第２図に示す
０図かられかるように１０ 乃至１０ （ｇ／ｍｌ）
の範囲でヒトエｍｌの定量が行なえることが確認された
。
本発明の免疫分析方法によれば、汎用性を有するリポソ
ーム試薬を用９ることができ、これより多種の被検物質
の定量がより容易に行なうことができる。
ーム試薬を用９ることができ、これより多種の被検物質
の定量がより容易に行なうことができる。
第１図及び第２図は本発明の免疫分析方法を用φて測定
を行なった結果を表わした特性図である。 代理人 弁理士 則 近 憲 佑 （ほか１名） 第 １ 図 ヒト１戸 濃度＜ ｐ ／ｍｔ ） 第２図
を行なった結果を表わした特性図である。 代理人 弁理士 則 近 憲 佑 （ほか１名） 第 １ 図 ヒト１戸 濃度＜ ｐ ／ｍｔ ） 第２図
Claims (8)
- （１）被検物質を抗原として第１の免疫動物により得ら
れた抗体から補体結合部位を除去して部分化した第１の
抗体と； リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方とコレステロール
とからなるリポソームの表面に、架橋法により、前記第
１０免疫動物の免疫グロブリンを抗原として第２の免疫
動物により得られた抗体から補体結合部位を除去して部
分化した第２の抗体を固定化し、さらに内部に親水性の
標識物質を封入してなる免疫分析用のリポソーム試薬と
； 被検物質を抗原として前記第２０免疫動物により得られ
た第３の抗体と； 補体とを、試料中に含まれた被検物質と反応させて前記
リポソーム試薬から遊出した標識物質を測定することに
より前記被検物質を定量することを特徴とした免疫分析
方法。 - （２）第１の抗体が酵素処理で補体結合部位を除去する
ことにより部分化されたことを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の免疫分析方法。 - （３）第２の抗体が酵素処理で補体結合部位を除去する
ことにより部分化されたことを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の免疫分析方法。 - （４）第１の免疫動物としてヤギ、第２の免疫動物とし
てウサギを用いることを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載の免疫分析方法。 - （５）架橋法に使用する架橋剤を、Ｎ−サクシンイミジ
ル３−（２−ピトジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤ
Ｐ）、Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェ
ニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ−サクシンイミジル
４（ｐ−マレイミドフェニル）アセテート（ＳＭＰＡ）
、Ｎ−サクシンイミジル４−（Ｐ−マレイミドフェニル
）プロピオネート（ＳＭＰＰ）、Ｎ−（γ−マレイミド
ブチリルオキシ）サクシンイミド（ＧＭＢＳ）、（ε−
マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド（ＥＭＣ
Ｓ）の中より選んだことを特徴とする特許請求の範囲第
１項記載の免疫分析方法。 - （６）リポソームを構成するリン脂質及び糖脂質に対し
て１０〜５００モル％のコレステロールを含むことを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫分析方法。 - （７）分析時に共に用いられる補体の活性（補体価）が
０．１〜１０ＣＨ＿５＿０であることを特徴とする特許
請求の範囲第１項記載の免疫分析方法。 - （８）標識物質が螢光性化合物、発光性化合物、吸光性
化合物、糖類、イオン性化合物、酵素、補酵素類または
ラジカル化合物であることを特徴とする特許請求の範囲
第１項記載の免疫分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9094085A JPS61250560A (ja) | 1985-04-30 | 1985-04-30 | 免疫分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9094085A JPS61250560A (ja) | 1985-04-30 | 1985-04-30 | 免疫分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61250560A true JPS61250560A (ja) | 1986-11-07 |
Family
ID=14012447
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9094085A Pending JPS61250560A (ja) | 1985-04-30 | 1985-04-30 | 免疫分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61250560A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988008982A1 (en) * | 1987-05-06 | 1988-11-17 | Teijin Limited | Method for immunoassay utilizing liposome and kit therefor |
| JPH01229971A (ja) * | 1988-03-10 | 1989-09-13 | Hitachi Ltd | 免疫分析用試薬及びそれを用いた免疫分析方法 |
| JPH01230621A (ja) * | 1988-03-10 | 1989-09-14 | Toyo Ink Mfg Co Ltd | 活性エネルギー線硬化性樹脂，その樹脂を含む硬化性被覆組成物および印刷インキ組成物 |
| JP2013028608A (ja) * | 2001-01-19 | 2013-02-07 | Cytos Biotechnology Ag | 分子抗原アレイ |
-
1985
- 1985-04-30 JP JP9094085A patent/JPS61250560A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988008982A1 (en) * | 1987-05-06 | 1988-11-17 | Teijin Limited | Method for immunoassay utilizing liposome and kit therefor |
| US5173406A (en) * | 1987-05-06 | 1992-12-22 | Teijin Limited | Liposome immunoassay method and kit therefor |
| JPH01229971A (ja) * | 1988-03-10 | 1989-09-13 | Hitachi Ltd | 免疫分析用試薬及びそれを用いた免疫分析方法 |
| JPH01230621A (ja) * | 1988-03-10 | 1989-09-14 | Toyo Ink Mfg Co Ltd | 活性エネルギー線硬化性樹脂，その樹脂を含む硬化性被覆組成物および印刷インキ組成物 |
| JP2013028608A (ja) * | 2001-01-19 | 2013-02-07 | Cytos Biotechnology Ag | 分子抗原アレイ |
| JP2015205881A (ja) * | 2001-01-19 | 2015-11-19 | サイトス バイオテクノロジー アーゲー | 分子抗原アレイ |
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